Структурно-функциональная организация палеоамигдалы: фундаментальные закономерности и прикладные аспекты 03. 00. 25 гистология, цитология и клеточная биология

Вид материала

Закон

Содержание Гистохимические методы Электронная микроскопия. Иммуноцитохимические методы. Исследование экспрессии Апоптозные клетки выявляли методом Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии Поведенческие методики.

Подобный материал:

• Структурно-функциональная характеристика нонапептидергической гипоталамо-гипофизарной, 343.48kb.
• Закономерности дегенерации и адаптации сетчатки глаз при экспериментальных ретинопатиях,, 745.16kb.
• Эндоскопические аспекты ранней диагностики и лечения больных с острым билиарным панкреатитом, 436.22kb.
• Ультраструктурная и цитохимическая характеристика макрофагов, инфицированных рнк-содержащими, 636.4kb.
• Влияние биологически активных клеточных компонентов растений на структурные изменения, 324.85kb.
• Экспериментальное обоснование применения нейропептидов в комплексной терапии острого, 259.86kb.
• Цитологические особенности вторичных миелодисплазий при лимфомах 03. 00. 25 гистология,, 526.98kb.
• Морфофункциональная характеристика пульпы зуба и оценка иммунного статуса при кариесе,, 552.48kb.
• Международная научная конференция «Фундаментальные и прикладные аспекты воспаления», 27.32kb.
• Лимфоидные органы и миокард в системе мать-плод при вибрации, воздействии кадмием, 640.36kb.

Подсчет количества нейронов, содержащих ядрышки, и глии (40 крыс при изучении морфогенеза палеоамигдалы, материал для исследования брали на 21-й, 24-й, 28-й и 31 дни жизни) проводили в поле зрения микроскопа МБИ-11 (ЛОМО, Россия) на 10 микронных срезах при увеличении в 600 раз (объектив 40, окуляр 15), площадь поля зрения при этом составляла 0,035 мм². На основании полученных данных определяли величину глиального индекса. Подсчет апоптического индекса (АИ) производили по формуле предложенной (Rakic, Zecevic, 2000), вводя в нее суммарное количество клеток, содержащихся в трех следующих друг за другом срезах.

Идентификацию структур палеоамигдалы при выполнении иммуноцитохимических реакций проводили в срезах, окрашенных толуидиновым синим, по Нисслю, на основании критериев, разработанных для высокоинформативных срезов этого образования мозга (Акмаев, Калимуллина, 1993). Подсчет количества нейронов в цитоархитектонических (окрашенных по Нисслю) и иммуноцитохимических препаратах (с положительной реакцией), проводили с объективом 40 в поле зрения микроскопа, площадь которого составляла 35000 мкм². В дорсомедиальном ядре, имевшем площадь 218600 мкм², количество нейронов подсчитывали в шести полях зрения, в заднем медиальном ядре - 5107x10² - в семи полях зрения, в медиальной части заднего кортикального ядра (8164 x10²) и в латеральной части заднего кортикального ядра (12242 x10²) число нейронов подсчитывали в одиннадцати полях зрения.

Гистохимические методы. Изучение содержания нуклеиновых кислот проведено на 20 (5 самцов, по 5 самок на стадиях метэструс, диэструс, эструс) половозрелых крысах линии Вистар с массой тела 200-250 г. Мозг фиксировали в 10% -ном формалине, заливали в парафин и готовили 7-10 мкм фронтальные срезы, которые окрашивали галлоцианином с хромовыми квасцами по Эйнарсону (Луппа, 1980). Число «темных» и «светлых» клеток в структурах палеоамигдалы подсчитывали в пяти полях зрения у каждого животного. Активность сукцинат-дегидрогеназы определяли визуально в приготовленных в криостате срезах толщиной 5 мкм, приготовленных по общепринятой методике (Луппа, 1980) у 15 половозрелых крыс (5 самцов, по 5 самок на стадиях эструса и метэструса).

Авторадиография с ³Н-уридином. ³Н-уридин (удельная радиоактивность 28 Ки/мМ) вводили внутрибрюшинно в дозе 160 МБк/г (20 крыс, 5 самцов и по 5 крыс на стадиях эструса, метэструса и диэструса) за один час до фиксации материала, которую проводили 12 ч в смеси формалин-спирт-ледяная уксусная кислота в холодильнике. Готовили парафиновые срезы толщиной 5 мкм, депарафинировали их и покрывали фотоэмульсией типа ПР-2М с экспозицией 1 месяц. После проявления и фиксации автографов препараты окрашивали гематоксилином и эозином. Интенсивность включения изотопа оценивали по числу зерен восстановленного серебра на единицу площади объекта (100 μ²) в десяти полях зрения с учетом фона вне среза.

Электронная микроскопия. Материал для электронно-микроскопического исследования модулирующего действия половых стероидов был взят у 12 крыс (по 3 самки на стадиях эструс, метэструс и диэструс, а также у 3 самцов). Стадии эстрального цикла определяли по цитологической картине влагалищных мазков. Кусочки ткани, содержащие структуры палеоамигдалы, извлекали из головного мозга под контролем микроскопа с помощью специального устройства, описанного в патенте РФ № 1679246. Материал фиксировали погружением в охлажденный 2,5%-ный раствор глютаральдегида на фосфатном буфере (рН 7,4) и постфиксировали в 2%-ном растворе OsO4, обезвоживали в этаноле и заливали в эпон-812. Срезы готовили на ультратоме LKB III, контрастировали цитратом свинца (Reynolds, 1963) и анализировали в электронном микроскопе JEM 200 ЕХ (75 кВ). 12 особей было использовано для исследования палеоамигдалы у крыс с абсансной эпилепсией (по три самца линии WAG/Rij и Wistar половозрелого возраста) и смешанной конвульсивной эпилепсией (по три самца линии WAG/Rij до- и после аудиогенной стимуляции).

Иммуноцитохимические методы. Выявление CART-пептида проводили на приготовленных в криостате фронтальных срезах мозга толщиной 30 микрон, после перфузии его 1М фосфатным буфером (PBS, рН=7,4) и 4% раствором параформальдегида на 0,1 М PBS. Исследования проведены на белых половозрелых крысах линии Вистар (7 самок на стадии эструс, 7 самок на стадии метэструс, 7 самцов). Использовали первичные поликлональные rabbit-anti-CART (55-102) антитела (H-003-62, Phoeniх Pharm., Incorp, Belmont, CA, США) и вторичные goat-anti-rabbit антитела, конъюгированные с авединовым комплексом (ABC-kit 689321, ICN Biomedicals Inc., США). Визуализацию прореагировавших первичных антител производили при помощи диаминобензидинового хромогена (DAB, Sigma, США). Срезы закрепляли на стеклах с полилизиновым покрытием и высушивали при комнатной температуре. После обработки в спиртах и ксилоле срезы заключали под покровное стекло с помощью канадского бальзама.

Исследование экспрессии ER beta в нейронах палеоамигдалы на стадиях эстрального цикла – проэструс и метэструс проведены на 14 крысах линии Вистар в возрасте шести месяцев. Головной мозг фиксировали в 4% параформальдегиде на 0,1 M фосфатном буфере (PBS, pH 7,3-7,4), заливали в парафин и готовили фронтальные срезы толщиной 5 мкм, которые помещали на предметные стекла, покрытые L-лизином. Для проведения иммуноцитохимической реакции применяли первичные антитела к ERβ (polyclonal rabbit, Upstate) в разведении 1:100 в 1% растворе нормальной козьей сыворотки при температуре 4⁰С во влажной камере. Связывание первичных антител определяли путем инкубации срезов со вторичными антителами в течение двух часов при комнатной температуре (goat antirabbit IgG,Vector Elite kit, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) в разведении 1:500 in 1% растворе нормальной козьей сыворотки и авидин-биотиновым комплексом (Vector Laboratories, CA). Для визуализации реакции использовали DAB (Sigma, USA).

Апоптозные клетки выявляли методом TUNEL. Головной мозг фиксировали в 4% параформальдегиде на 0,1 M фосфатном буфере (PBS, pH 7,3-7,4), заливали в парафин и готовили фронтальные срезы толщиной 5 мкм, которые помещали на предметные стекла, покрытые L-лизином. Для выявления TUNEL-окрашенных структур использовали набор реактивов ApopTag In Situ Apoptosis Detection Kit (фирма Chemicon).

Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) определяли содержание моноаминов (норадреналина, дофамина и серотонина) и их метаболитов - 3,4-диоксифенилуксусной кислоты (ДОФУК) и 5-оксииндолуксусной кислоты (5-ГИУК) в палеоамигдале и обонятельных луковицах Общее количество использованных крыс линии Вистар половозрелого возраста составило 70 (30 самцов и 40 самок).

Материал для исследования брали от 3-4 крыс, умерщвленных передозировкой эфирного наркоза. После декапитации извлекали из черепа головной мозг и под контролем микроскопа на толстом фронтальном срезе (1-1,5 мм) из нативного мозга на льду выделяли область палеоамигдалы, а также основную обонятельную луковицу вместе с добавочной. Образцы, взятые из правого и левого полушария у 3-4 крыс, взвешивали (в среднем, вес навески был 25-30мг) и анализировали в одной пробе.

После взвешивания, изъятые из мозга кусочки, гомогенизировали в 20 объемах холодной 0,1М перхлорной кислоты (Sigma, USA) и 1пг/50 мкл дигидроксибензиламина гидробромида (ДГБА, Sigma, USA) в качестве внутреннего стандарта путем механического растирания в гомогенизаторе с тефлоным пестиком в течение пяти минут. Гомогенизат микропипеткой переносили в эпендорф и центрифугировали (при -20⁰С) в течение десяти минут при 6000 оборотов в минуту. Образовавшийся супернатант переносили микропипеткой в эпендорфы, снабженные специальными насадками (наборы для микрофильтрации фирмы «Биохром», Россия). Диафрагма насадки, отделяющая ее полость от эпендорфа, имела отверстия, которые мы закрывали при анализе каждой пробы сменяющимися фильтрами с величиной пор 0,02 мкм. После этого проводили повторное центрифугирование в течение трех минут. Очищенные, таким образом, супернатанты в эпендорфах помещали в специально сконструированные боксы со льдом и сразу же анализировали. Количественно содержание определяемых моноаминов и их метаболитов определяли на основании зависимости площади пика соединения от концентрации стандартного образца. Расчет содержания моноаминов в пробах осуществляли в пикограмм на мг ткани, при математической обработке их переводили в нг на мг ткани. Вычисляли и величины катаболических коэффициентов ДФ/ДОФУК и 5-ГИУК/С.

Поведенческие методики. При изучении механизмов развития наркотической зависимости регистрировали поведение двух групп крыс инбредной линии Вистар, имеющих модификацию аллельной структуры локуса TAG 1 A DRD₂. Одна группа крыс была гомозиготна по аллелю А₁, (А₁/А₁), другая по аллелю А₂ в этом же локусе - А₂/А₂. До начала эксперимента с принудительной наркотизацией с целью выявления различий между экспериментальными группами крыс (А₁/А₁ и А₂/А₂) в питьевом режиме и ориентировочно-исследовательской деятельности регистрировали среднесуточное потребления воды на протяжении одной недели, а также изучали их поведение в тесте «открытое поле».

«Открытое поле» представляло собой квадратную освещенную в центре арену, разделенную на 16 равных частей. Крысу в начале тестирования в открытом поле помещали в один из периферических квадратов и наблюдали за ее поведением в течение пяти минут. На протяжении сеанса тестирования определяли время, затрачиваемое крысой на груминг (чесательный рефлекс), пребывание в состоянии неподвижности, а также регистрировали латентный период до пересечения первого квадрата (амбуляции). Также подсчитывали количество эпизодов груминга, число пересеченных квадратов поля в центре и на его периферии, сумма которых характеризовала общую двигательную (горизонтальную) активность крысы. Исследовательскую деятельность крыс определяли подсчетом количества вертикальных стоек, которые крысы совершали в центре и на периферии поля. Сумма совершаемых крысой стоек на периферии и в центре поля характеризовала общую исследовательскую деятельность. Вегетативные реакции крыс регистрировали на основании учета числа уринаций и болюсов.