Geum.ru

Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации

Вид материалаДокументы

Содержание


6.2. Методики измерения легочной функции
6.2.1.2. Животные, оборудование и материалы
6.2.1.3. Метод введения животным наноматериалов
6.2.1.4. Проведение измерений
6.2.1.5. Анализ и интерпретация полученных данных
Подобный материал:
1   ...   7   8   9   10   11   12   13   14   ...   17

6.2. Методики измерения легочной функции

6.2.1. Методика измерения легочной функции in vivo – электроплетизмография


6.2.1.1. Принцип метода

Тест плетизмографии позволяет оценивать как аллерген-специфичную, так и неаллергическую бронхоконстрикцию у интактных животных. Этот тест предпочтителен для быстрого и повторного скрининга дыхательной функции. Принцип метода заключается в регистрации изменения давления при дыхании животного в ограниченном объёме окружающей его среды.

Для анализа влияния наноматериала на легочную функцию следует использовать одну из модификаций этого метода - плетизмографию всего тела. При этом животное целиком помещают в герметичную камеру, снабженную датчиками давления, и анализируют суммарный поток воздуха от носа и грудной клетки, которые приблизительно равны и разнонаправлены.


6.2.1.2. Животные, оборудование и материалы

6.2.1.2.1. Животные

Мелкие лабораторные животные (крысы и мыши) линейные (крысы линий Wistar, Sprague-Dawley и др.; мыши линий СВА, С57В1/6 и др.), так и нелинейные. В случае использования линейных животных необходимо указать линию животных.

Количество животных в группе зависит от целей исследования, но не должно быть менее 10 особей в группе. Разброс по исходной массе тела животных в группе не должен превышать ± 10 %. В течение всего эксперимента животные должны иметь свободный доступ к корму и питьевой воде (за исключением времени измерения физиологических параметров). Для унификации исследований животные на протяжении всего эксперимента получают полусинтетический рацион согласно МУ 1.2.2520-09 «Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов».

6.2.1.2.2. Оборудование

Плетизмограф для всего объема тела (Buxco Research Systems, США), оснащённой пневмотахографом Halcyon (Buxco Research Systems, США, europe@buxo.com). Компрессорный (струйный) небулайзер Comp AIR Pro (NE-C29-E) (Omron, Япония). Датчик давления (анализатор потоков) P23ID (Gould Statham Instruments, США) или аналогичный. Усилитель потенциалов по ГОСТ 26033-91 для выходного сигнала до 10В имеющий полосу частот от 10 Гц до 20 кГц. Аналого-цифровой преобразователь E14-440 (L-Card, Россия, внесен в Государственный реестр средств измерения под № 28131-04) или аналогичный (разрядность АЦП – 14 бит, максимальная частота преобразования – 400 кГц, диапазон входного сигнала: ± 10В; ± 2,5В; ± 0,625В; ± 0,156В). Частота опроса сигнала давления должна быть не менее 250-500 Гц. Компьютер IBM PC-совместимый по ГОСТ 27201-87. Регистрация и обработка экспериментальных данных проводятся с помощью специализированного программного обеспечения Powergraph (ООО «ДИСофт», Россия), MatLab (MathWorks, США) и SPSS 12 (SPSS Inc., США).

6.2.1.2.3. Материалы и реактивы

Физиологический раствор, приготовленный по ГОСТ 10444.1.

При получении аэрозоля наноматериала следует использовать физические методы диспергирования и дистиллированную воду в качестве носителя. Применение органических растворителей и детергентов не допускается. В исключительных случаях возможно введение наноматериала на носителе (дисперсионной среде), токсичность которой должна проверяться в отдельной серии тестов.

6.2.1.3. Метод введения животным наноматериалов

Поскольку метод плетизмографии позволяет оценить влияние наноматериалов на лёгкие и бронхи, предпочтительным является ингаляционный путь введения наноматериала.

Распыление наноматериала производится непосредственно в камере для проведения плетизмографии при помощи небулайзера.

Введение наноматериала животным может быть острым (однократная ингаляция в течение 1 часа), подострым (4 часа в день, 5 раз в неделю на протяжении 1-3 месяцев) и хроническим (4 часа в день, 5 раз в неделю на протяжении 6 месяцев). Концентрацию наночастиц в воздухе выражают в мг массы частиц в м3 воздуха или м2 суммарной поверхности частиц в м3 воздуха. Диапазон доз наноматериала в ингалируемой воздушной смеси определяется задачами конкретного исследования и может варьировать при остром воздействии от минимальной токсической дозы до 1 LD50 (при возможности её определения), при подостром воздействии - от минимальной токсической дозы до 1/5 LD50, при хроническом воздействии от 1/10 до 1/3 части минимальной токсической дозы. Контрольным животным вводят физиологический раствор в том же объеме и тем же способом, что и коллоидный раствор или дисперсию наноматериала.

6.2.1.4. Проведение измерений

Измерения легочной функции методом плетизмографии проводят

1) в режиме экспозиции, т.е. непосредственно после введения наноматериала;

2) ежедневно в течение 14 дней после введения наноматериала (при остром введении), на 7, 14, 28, 56 и 84 дни (при подостром введении), на 210, 240, 270, 300, 330 и 360 дни (при хроническом введении).

В ходе плетизмографии датчик давления (анализатор потоков) позволяет регистрировать периодические изменения давления, называемые респираторными волнами. Математическая обработка получаемых сигналов проводится с помощью программного обеспечения Powergraph и MatLab. Вычисляют следующие параметры:

1) Частота дыхательных движений

2) Дыхательный объем

3) Общий объем вдыхаемого воздуха

4) Минутная вентиляция

5) Время вдоха

6) Время выдоха

7) Пиковая скорость вдоха

8) Пиковая скорость выдоха и т.д.

6.2.1.5. Анализ и интерпретация полученных данных

Статистический анализ данных проводят с помощью программного обеспечения SPSS 12. Предварительную оценку характера распределения данных осуществляют с помощью теста Shapiro-Wilk. В соответствии с полученным результатом, при дальнейшей обработке применяют непараметрические критерии или критерии для нормально распределенных данных. Достоверность различий средних значений нескольких групп данных оценивают по критерию Friedman. При проведении обобщенной оценки достоверность различия средних значений для нескольких групп данных определяют по критерию Kruskal-Wallis, а для 2-х групп данных - по критерию Mann-Whitney. Для анализа различий между двумя группами данных применяют парный t-критерий Student или непараметрический критерий Wilcoxon. Корреляционный анализ проводят с использованием статистики Spearman. Выводы считают достоверными при допустимой вероятности ошибки менее 0,05. Данные представляют в виде среднего арифметического ± стандартное отклонение (SD). Расчёт LD50 и минимальной токсической дозы производится при предварительной оценке острой токсичности наноматериала согласно МУ 1.2.2520-09 «Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов».

Наноматериал признаётся безопасным по результатам тестирования при выполнении следующих критериев:

1) если основные параметры дыхательной функции: частота дыхательных движений и дыхательный объем находятся в пределах физиологической нормы (для крыс 70-90 мин-1 и 9-11 см3, соответственно);

2) если параметры дыхательной функции (частота дыхательных движений, дыхательный объем, общий объем вдыхаемого воздуха, минутная вентиляция, время вдоха, время выдоха, пиковая скорость вдоха, пиковая скорость выдоха и т.д.) у животных, подвергшихся воздействию наноматериала, не отличается достоверно от соответствующих параметров животных в контрольной группе.