Geum.ru

Кариопатические и патоморфологические изменения под действием продуктов метаболизма паразитов и влияние на репродуктивную функцию домашних плотоядных

Вид материалаАвтореферат

Содержание


Результаты исследований
Таблица 1 Виды гельминтов и простейших, выявленные у собак
Название возбудителя
Подобный материал:
1   2   3   4   5   6

Для обнаружения антител к возбудителю токсоплазмоза собирали сыворотку крови домашних и содержащихся в приюте собак и кошек и исследовали с помощью иммуноферментной тест – системы «ИФА – анти-Тох. g – Cate - Dog» (Казанская ГАВМ), предоставленной профессором Р.Х. Равиловым. Таким образом, было обследовано 218 животных.


Обнаружение антител к антигенам лямблий проводили у собак с помощью диагностического набора (Вектор-Бест). В качестве конъюгата использовали антитела диагностические против IgG сыворотки крови собаки, меченные пероксидазой хрена (Медгамал) в титре 1:4000.

Гистологические исследования.

От абортировавших или оперированных по поводу овариогистеректомии кошек и собак собирали плоды, плаценты, матку и яичники. От экспериментальных белых мышей и лабораторных крыс собирали печень, селезенку, костный мозг, участки тонкого кишечника, семенники, матки, яичники, плаценты. Собранный материал промывали, фиксировали 10%-ным раствором нейтрального формалина с целью уплотнения. Далее производили вырезку кусочков и проводку их по спиртам возрастающей крепости с целью обезвоживания по общепринятой методике. После проводки кусочки заливали в парафин и изготавливали блоки 2х2см. С полученных блоков на микротоме-полуавтомате делали срезы толщиной 4-5 микрон. Их помещали на предметное стекло и окрашивали гематоксилином и эозином (обзорная методика) и по ван Гизон с целью выявления степени развития склеропластических процессов в органах. Просмотр готовых препаратов производили с помощью микроскопа фирмы “Leica” и “Zeiss” при увеличении окуляра х10, с объективами х4; х40 и х100 с подробным описанием имеющейся морфологической картины в органах. Оценивали дисциркуляторные, дистрофические, склеропластические, воспалительные, гиперпластические, регенераторные процессы в органах.

В семенниках описывали состояние сперматогенного эпителия, наличие митозов и степень выраженности сперматогенеза. В плаценте животных оценивали четыре группы основных процессов: инволютивные, компенсаторные, дисциркуляторные и воспалительные. В костном мозге – степень развития каждого ростка гемопоэза с выявлением возможных нарушений морфогенеза клеток. В органах РЭС (печень, селезенка) производили оценку морфологии и локализации клеток макрофагально-гистиоцитарного ряда с целью выяснения их структурно-функциональной принадлежности (воспалительный или иммунокомпетентный генез). Для этого использовали иммуногистохимический метод с антителами S-100 и CD99. Иллюстративный раздел работы выполнен с использованием цифровой видеокамеры “Sony” на компьютере “Pentium-III” и Toshiba. Наиболее интересные и показательные фрагменты микропрепаратов фотографировали и сохраняли в памяти компьютера.

Получение материала из гельминтов, приготовление соматического экстракта и его биохимический анализ

Для паразитологического исследования использовали свежемороженую рыбу, приобретенную в различных торговых точках города. После размораживания тушки рыбы вскрывали по общепринятой методике. Обнаруженных гельминтов извлекали, подсчитывали их количество (интенсивность – ИИ и экстенсивность инвазии - ЭИ). Выделенных личинок нематод фиксировали в жидкости Барбагалло для последующего определения и описания. Определение принадлежности выделенных личинок проводили с применением ключа, основанного на морфологических особенностях этих паразитов (Гаевская А.В., 2005). Часть гельминтов фиксировали в 10%-ном формалине и проводили гистологическое исследование по описанной выше методике. Жизнеспособность анизакисов устанавливали с помощью температурного теста в растворе искусственного желудочного сока.

Извлеченных из тушек рыбы личинок A.simplex 3-й стадии тщательно многократно промывали проточной водой, затем обрабатывали растворами антибиотиков (пенициллин, стрептомицин и нистатин), стерильным физиологическим раствором и замораживали. После многократного замораживания и оттаивания личинок гомогенизировали, заливали стерильным забуференным физиологическим раствором (рН 7,2) и экстрагировали при температуре +4°С в течение 18 часов. После этого раствор сливали и процедуру повторяли. Полученный антиген хранили в замороженном состоянии при температуре -10°С.

Контроль на стерильность. Для обнаружения контаминации бактериями, грибами и микоплазмами пробу экстракта из личинок анизакид высевали на МПА, МПБ и МППБ по одной пробирке. Для выявления грибковой контаминации антиген высевали на агар Сабуро в две чашки Петри. На микоплазменную контаминацию пробу антигена высевали на универсальной плотной среде для выделения микоплазм (ООО «Научно-производственная фирма Диагност-Мед») согласно инструкции в две чашки Петри. Посевы на МПА, МПБ и МППБ выдерживали в течение 10 суток при +37°С, посевы на полужидком агаре – 14 дней при +37°С, и на среде Сабуро – 15 дней при +23°С. При обнаружении хотя бы одного из контаминантов партию экстракта считали нестерильной и в дальнейшей работе не использовали.

Определение содержания белка. Концентрацию белка в полученном экстракте определяли на биохимическом полуавтоматическом анализаторе StatFax 1904+ (AWARENESS technology inc) с использованием набора реактивов Spinreact, S.A. согласно инструкции, при длине волны 540 нм. В качестве контроля использовали фосфатно-солевой буферный раствор.

Для сравнения кариопатического и антигенного действия белкового экстракта из личинок анизакид с антигенами других гельминтов готовили соматические экстракты из Diphyllobothrium latum, Hydatigera taeniamorfis, Toxocara canis. Проводили их биохимический анализ на биохимическом анализаторе StatFax 1904+ с помощью набора реактивов Spinreact, S.A. согласно инструкции: аспартат-аминотрансфереза, аланин-аминотрансфераза, щелочная фосфатаза, триглицериды.


Получение экскреторно-секреторного антигена T. canis

В качестве антигена также использовали метаболиты, полученные при культивировании яиц и личинок T.canis. Для этого выделенных от спонтанно зараженных животных гельминтов обрабатывали по описанной выше методике. Самок нематод вскрывали, извлекали матку с яйцами, которые культивировали в жидкой питательной среде 199 с добавлением 5% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (Perbio) при температуре +37°С в течение 7 дней. Метаболиты личинок собирали, очищали центрифугированием и замораживали при температуре -10°С для дальнейшего использования. Контроль на стерильность и определение содержания белка проводили с помощью методов, описанных ранее.


Изучение кариопатических свойств антигенов гельминтов

Для изучения кариопатического действия антигенов гельминтов проводили однократное внутрибрюшинное введение нелинейным белым мышам-самцам массой 18-20г 100 мкг белка-антигена. Контрольной группе животных внутрибрюшинно вводили 0,1мл забуференного физиологического раствора. Количество животных в каждой группе составило 12. Убой мышей проводили через 4; 12; 24; 48 и 72 часа после введения материала.

Для выявления протективного действия на клетки красного костного мозга витаминов-антиоксидантов группе мышей в течение пяти дней перорально вводили масляный раствор «Аевит» в терапевтической дозе, затем также проводили внутрибрюшинное введение белкового экстракта в дозе 100 мкг.

Для определения эффективности термической обработки пробу антигена-экстракта A.simplex обрабатывали с помощью СВЧ-нагревания в бытовой микроволновой печи в течение 1 мин. Также применяли обработку белкового экстракта 15-минутным кипячением на водяной бане. Обработанные таким образом антигенные продукты использовали для введения мышам-самцам по описанной выше схеме. После этого по стандартной методике проводили гистологическое исследование печени, селезенки, красного костного мозга и семенников. Также из красного костного мозга грудины и семенников готовили мазки-отпечатки, которые фиксировали по Май-Грюнвальду, а затем окрашивали азур-эозином по Романовскому. При микроскопировании подсчитывали количество делящихся клеток, учитывали форму, размеры и окраску ядер. Отмечали количество цитопатических и кариопатических нарушений в опытных и контрольных группах животных.

Оплодотворяющая способность мышей-самцов после внутрибрюшинного введения соматического антигена из личинок анизакид

Для выявления действия антигена-экстракта из личинок анизакид на функцию размножения проводили внутрибрюшинное введение самцам мышей массой 22-24г данного антигена как описано выше. К каждому самцу подсаживали по 4 взрослых интактных самки и оставляли на 3-4 дня. Контролем служили самки того же возраста, подсаженные к интактным самцам. С этого дня начинали отсчет сроков беременности. Кормление и содержание опытных животных оставалось неизменным на протяжении всего эксперимента. Затем самцов отсаживали, а самок содержали до 20 дня беременности, после чего подвергали эвтаназии методом цервикальной дислокации под эфирным наркозом. Извлекали матку с яичниками. В яичниках подсчитывали количество желтых тел, в матке – количество плацент и плодов. Выявляли предимплантационную и постимплантационную смертность плодов. Штангенциркулем определяли диаметр плаценты и краниокаудальную длину плодов, массу плацент и плодов определяли на весах ВЛКТ-500g-М. Проводили внешний осмотр плодов на наличие уродств (отсутствие глаз, пальцев, расщепление неба и т.д.).

Морфологические изменения плаценты белых крыс при пероральном введении личинок анизакид, контроль эмбрионального развития

Для определения влияния экскреторно-секреторных и соматических продуктов личинок Anisakidae на эмбриональное развитие плодов использовали половозрелых нелинейных лабораторных крыс-самок (Rattus norvegicus) массой 120-150г. Отобранных беременных животных распределяли на несколько групп. Животным первой, второй и третьей групп перорально вводили личинок анизакид в растворе антибиотиков в дозе соответственно 10, 50 и 100 экз. на животное. Сроки введения составляли 1-2 день, 7-8 день и 13-14 дни беременности, которые являются критическими сроками эмбриогенеза крыс (соответственно образование зиготы, закрытие невропора и активного органогенеза). Животным четвертой группы выпаивали только антибиотики на 0,9%-ном стерильном растворе хлорида натрия в те же сроки. Самки пятой группы служили интактным контролем. Кормление и содержание подопытных животных оставалось неизменным на протяжении всего эксперимента.

Самок подвергали эвтаназии на 20 сутки под воздействием эфира методом декапитации. При вскрытии извлекали матку с плодами и яичники. В яичниках подсчитывали количество желтых тел, в матке – количество плацент и плодов. Определяли предимплантационную и постимплантационную смертность. С помощью штангенциркуля измеряли диаметр плаценты и краниокаудальную длину плодов, массу плацент и плодов определяли на весах ВЛКТ-500g-М. Проводили внешний осмотр плодов на наличие уродств.

Оценка действия личинок анизакид при пероральном введении самцам крыс на гематологические показатели и гистологическую картину

Патоморфологическое действие соматических продуктов личинок анизакид изучали на 60 самцах нелинейных лабораторных крыс, массой 120 – 150г. Подопытных животных распределяли на несколько групп по принципу аналогов. Животным опытных групп перорально инокулировали нежизнеспособных личинок анизакид в дозах 5; 10; 25; 50 и 100 штук на голову, соответственно. Шестая группа служила интактным контролем.

Для определения динамики изменения клеточного иммунного ответа на 3; 5 и 10 сутки проводили исследование периферической крови для подсчета лейкограммы. Кровь для анализа брали из когтя, готовили тонкие мазки, которые фиксировали по Май-Грюнвальду и окрашивали по Романовскому.

Инвазированную рыбу делили на три группы в зависимости от индекса зараженности (интенсивности инвазии - ИИ). Рыбу, инвазированную менее чем 10 личинками (партия 1), 10-50 личинками (партия 2) и рыбу, инвазированную более 50 личинками (партия 3) измельчали на мясорубке до состояния однородного фарша. Опытным группам животных в течение 10 дней скармливали рыбный фарш, подогретый до комнатной температуры, животные контрольной группы находились на обычном рационе.

На десятые сутки крыс декапитировали под эфирным наркозом. Семенники, печень, селезенку, желудок и участок тонкого кишечника фиксировали 10%-ным нейтральным формалином для гистологического исследования. В эти же сроки отбирали кровь из сердца для проведения биохимического анализа по основным показателям: общий белок, глюкоза, мочевина, креатинин, альфа-амилаза, общий билирубин, АлАТ, АсАТ и щелочная фосфатаза.

Оценка действия термически обработанной рыбы на гематологические показатели и гистологическую картину при пероральном введении самцам крыс

Мясо инвазированной анизакидами путассу обрабатывали кипячением (варкой) при температуре 100°С в течение 20 минут, другую партию рыбы обрабатывали в бытовой микроволновой СВЧ-печи в течении 10 минут. Полученные продукты скармливали крысам самцам 10 дней с проведением гематологического, биохимического анализа крови и гистологического исследования тонкого кишечника, печени, селезенки, семенников. Также готовили мазки-отпечатки красного костного мозга грудины и семенников по описанной выше методике для определения уровня кариопатических изменений в данных органах, вызванных термически обработанной рыбой.


Получение гипериммунных сывороток к антигенам анизакид

Гипериммунную сыворотку получали при введении трем кроликам соматического антигена, приготовленного из личинок A.simplex. Кроликов породы серый великан живой массой 3 кг внутримышечно иммунизировали возрастающими дозами соматического антигена с полным адъювантом Фрейнда (Диаэм, США) по методике Бережко В.К. и др. (2008) по схеме три цикла трехдневной иммунизации с трехдневными перерывами. Затем через 28 дней проводили реиммунизацию для повышения активности гипериммунных сывороток. Общая доза антигена по белку составила 10,0 мг. Кровь для исследования собирали из локтевой вены через семь дней после завершения иммунизации.

Реакция иммунодиффузии гипериммунных сывороток с антигенами анизакид и экстрактом из мышечной ткани рыбы

Реакцию иммунодиффузии (РИД) проводили в 1,2%-ном агаровом геле (Difco) на физиологическом растворе (Гусев А.И., Цветков В.С., 1961). Реакцию проводили в штампе «семерка», где в центральную лунку вносили экстракт из анизакид, а в периферийные – гипериммунные сыворотки в нативном состоянии, а также в разведениях 1/1; 1/2; 1/4 и 1/8.

Также проводили РИД с сыворотками крови гипериммунизированных кроликов и термически обработанными антигенами A.simplex.

Для выявления возможных соматических и экскреторно-секреторных антигенов личинок анизакид в мышечной ткани замороженной рыбы проводили РИД, где в качестве антигена использовали экстракт из рыбы.

Статистическая обработка результатов

Фактический материал, полученный при проведении исследований, обрабатывали методом вариационной статистики. Показатели считались достоверными при значениях p≤0,05 (по t-критерию Стьюдента).
    1. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Анализ зараженности плотоядных гельминтами и простейшими

В настоящее время в г. Перми содержится несколько тысяч домашних собак и кошек, имеется и большое количество бездомных животных. Результаты паразитологического обследования представлены в таблицах 1 и 2.

В период нашей работы было обследовано 228 служебных собак. Из них 125 собак принадлежали питомнику Зонального кинологического центра при ГУВД г. Перми, 85 собак - колониям общего режима и 18 собак - питомнику при Пермском колледже юстиции. Все собаки содержатся в обустроенных вольерах, кормление осуществляется два раза в день специально приготовленными или промышленными кормами Royal Canin, профилактическая дегельминтизация проводится согласно планам 2-3 раза в год отечественными препаратами. При клиническом осмотре у большинства собак не выявляли серьезных нарушений в состоянии здоровья.

Содержание животных, принадлежащих частным лицам, отличается значительным разнообразием. Большинство владельцев предпочитает использовать для кормления своих питомцев натуральные продукты. При этом мясо и рыбу зачастую скармливают в сыром виде.


Таблица 1

Виды гельминтов и простейших, выявленные у собак


Название возбудителя
Собаки, принадлежащие частным лицам

Служебные

собаки

Собаки из

приюта


Всего

К-во
%
К-во
%
К-во
%
К-во
%

Toxocara canis
132
10,38
8
3,51
57
27,67
197
11,55

Toxascaris leonina
12
0,94
5
2,19
10
0,49
27
1,58

Ankilostoma caninum
49
3,85
2
0,88
14
6,80
65
3,81

Uncinaria stenocephala
15
1,18
1
0,44
9
4,37
25
1,47

Strongyloides vulpis
16
1,26
1
0,44
2
0,97
19
1,11

Spirocerca lupi
0
0
0
0
1
0,49
1
0,06

Dirofilaria repens
9
0,71
0
0
0
0
9
0,53

Trichocephalus vulpis
3
0,24
0
0
0
0
3
0,18

Diphyllobothrium latum
21
1,65
0
0
2
0,97
23
1,35

Dipylidium caninum
18
1,42
0
0
12
5,83
30
1,76

Mesocestoides lineatus
0
0
0
0
4
1,94
4
0,23

Taenia sp.
4
0,31
0
0
0
0
4
0,23

Isospora canis
85
6,68
12
5,26
23
11,17
120
7,03

Sarcocystis spp.
43
3,38
1
0,44
0
0
44
2,58

Neospora caninum
0
0
0
0
4
1,97
4
0,23

Cryptosporidium spp.
11
0,86
2
0,88
4
1,97
17
1,0

Lamblia spp.
3
0,24
0
0
0
0
3
0,13

Отрицательно
906
71,07
196
85,96
64
31,06
1166
68,34

Всего
1272
100
228
100
206
100
1706
100