Geum.ru
Темы диссертаций по экономике » Математические и инструментальные методы экономики

ИССЛЕДОВАНИЕ РЕПАРАЦИИ ПОВРЕЖДЕНИЙ, ИНДУЦИРОВАННЫХ УЛЬТРАФИОЛЕТОВЫМ ОБЛУЧЕНИЕМ В ДНК ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ тема диссертации по экономике, полный текст автореферата



Автореферат



Ученая степень кандидат биологических наук
Автор Каролис, Гедиминас Каролис
Место защиты Вильнюс
Год 1975
Шифр ВАК РФ 08.00.13

Автореферат диссертации по теме "ИССЛЕДОВАНИЕ РЕПАРАЦИИ ПОВРЕЖДЕНИЙ, ИНДУЦИРОВАННЫХ УЛЬТРАФИОЛЕТОВЫМ ОБЛУЧЕНИЕМ В ДНК ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ"

--У;'-- ' - ;' НапрЭВаХрЗВОПИС

:: ИЛЬНЮСШИ ОРДЕНА нового.КРАСНСО ЗНАМЕНИ Х Х.-. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ иы; В.ГПСУКАСА ;

-Дарение *-Г а диыи нас Кародио

5 двк высших'-растешй:

03.00.13 - Генетике ; ^; \

диосвртацам на' соискание - зченой с тенен* кввдидата бнояогичесхмх.авзЕ

Вижьнвс--1975

НШДЮСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ШАИЕПЛ ГОСУДЯРСтШШЙ УНИВЕРСИТЕТ иил В.ШСУКАСА

На правах рукописи

ЦИЕШНИС Каршшс-Гвдииинас Харолао

ИССЛЕДОВАНИЕ РЕПАРАЦИЙ ПОВРЕЖДЕНИЙ, ИНДУЦИРОВАННЫХ УЛЬТРАФИОЛЕТОВЫМ ОБЛУЧЕНИЕН Б ДНК ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

03л00.15 - Генвшва

Авторвфв р а I дмссвртвцм на ооигквнив ученой степени кандидата биологических наув

; -.Длуаакл^., ^Дум.п;! йккш'Леь. 5 Иввиовс:^.; г, д. ,

кад;::::.! ..... л. 'и^шмсиа'

Ви/ыют - 1975

Работа виповова я Лаборатории молекулярной беодогив в генетики ВАСШЛ, г.ыос:;ва (заь.лаб.Есщд.бжл.наук В.Н.СОЙФЕР, научная консультант - академик ВАСХВИЛ и АН БССР Н.В.ТУРБИН).

Диссертация ваоисава ва русском языке* взлелона ва 133 -странице- г*атяяоггского текста, вклечоя таблиц я 30 рисунков. Ь сшсгб литературы 246 ввзвавиА*

Научшв руководители: кзнд.биол.заух В.Н."0ййЕР " канд.бисл.ваук И.1>*СЛАВБ11АС

Офнцисльнр* оппоненты: Лектор медицинских наук, профессор Д.Ц.ГОДЬДФАРБ (Косква) "кандидат биологических, нгув, доцем 8.РАНЧЯЛИС (Вильвюо).

Веду ада предприятие - кафедра генетики к селекции Биологического факультета Московского государственного университете им. ILB.Ломоносова.

Автореферат разозлен * Л3 " 1975 г.

Защита диссертации состоится j975 ri

в _ ч. во,засодьнии Ученого Совета Естестваяного факультета по биологическим наукам Вильнюсского Ордена Трудового u Краевого Знамени Государственного Университета нм.В.Квпсуяв-са (Литовская ССР, г^Вилънюс, з*.Чвргенко, 21/2?! I геологическая ауд.).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотекл Вжяъпюсского Государственного Университета (г.Внльнво, ус. Университете )i

Замечания и отзывы во автореферату просим направить.ло адресу: 2S203I, г.Вильнюс уЛврлеиио, 21/2^, Секретарю^ Ученого Совета Естественного факультета во биологическим наукам БГУ.

, *

Ученый Секретарь Совета: доц. Я.Груодева

ВВЕДЕНИЕ

Изучение проблемы ре пародии генеических повреждений i клене имеет первое те правое значение для выяснения молекулярных механизмов действия систем, определявизх направление s темпы кутзгеиеэа, поддерживающих стабильность генома и, следовательно* устойчивость организмов к различным неолэгопраят-нш! факторам внешней среды.

У прокариотов было открыто 2 основных типа репэрЕции: фотореактивация (кльг, 1949; Ковалев, 1Э49), тетювая репарациял 1.кпчав49ч экыщзиовнуъ репарацию ( noyco , nowerd-

Plonder , 1964; Sotlow , Carrier, 1S64 J ц ПОСТрвГЛИКвТИВ-

HJK репар^циг; ( Rupp Howar<-Flanuлre , 19бв ). КрОМв ТОГО,

ивъэстно, что ферменты темповой репарации прямо или опосредовано участвуют г процессе возникновения мутацлй ( witkin , 1968; СОИфЧ?* 1969), В процессе рекомбинации (Howard-Flandлr, 1968) н в контроле репликации ДНК.

З.Харм, Р.Троско, Э.Чу показали, что возникающие под действием совечасго света дииеры гаимна эффективДо усураня-вт^я репарационный ферментами в клетках бактерий и человека

( Harm,1969, 1970; Troftko, 1970t Chu et i 1970 Не С 0110л E-

Bo, что и растения, постоянно находящиеся пот воздействием ультрафиолетового облучения* дожны обладать зиеммой ре парирующих ферментов. Обнаружение у растений свойстве фотореактив

В8ЦКИ (Troako, Mansour, 1969 Salto, ./агЫл, 1969 ) П0Э1Ш1В

увидеть один из ппсо репетирующих ферментов* Д.угс1 тип репарация у рьотений Jux недавно обнаружен Хоулаидом ( how-

land лt AU, 1974, T97L ), К0ГД8 ОН П0К 1ЭаИ репарРЦНЮ pE3pdBQB

ДНК* вызванных у -лучами. Но фотореактивация - узко специе-яиаирогаияая системе репарации. С помощью фотореавтивациж происходит восстановление гглъко одного вида повреждения -димеров цивхобумногого типа. Другие типы повреждений (например* многообразные повреждения* индуцированные химичевжя-ми мутагенами) могут бить репарироганы системой ферментов темновой репарации*

t Исходя из этого, представляло интерес изучить вопрос о

существовании тэнновой реперации у растений. Хотя нервыл попытка обнаружить теивовую рвш рацию в высших растениях окончились неудачно (тго&ко, Menaour, 1968t Wollt, Scott, 1969) Paln&r , Wolff, 1973;' Wolff , C]sv,r, 1973 ) CJfflOCIBJDT ГрЯ

гриппы даннйх, свидетельствующих о впстэновятельвнх прсцео-свх, в -эгакно близких к энсодзнойной репарации. I. Эффект уменьшения аберра.пй и щгэций, вызванвых отдельно УФ- ш рентгеновыми лучами, а такзе пря совместной действии этих

фаВТОрОВ ( Sw ал б ОП,- 1948} Swamiriathan , JJatarejaii , 1939) Dan aal et Vi., 19t,^i Nlrula , 1963; Robbe lern , 196л ). . УВвЛИ-

чевцв выходе хромосомных в хрокзтндиых аберраций в условиях обработки кофейной Облученных растений ( Yaroamolo, Yamaguchl, 1969) Ahnetrm , Natarajan , 19,71;. SwutHnka, 2uk, 1974 )Х

3. Способное и. растений восстанавниват. векоочно повреждения, вызванные анилируощиш1 агентами (vлi*minлky лt 19721

1973g Glchnar Х< ei.л 1973; ZedraiU at atД 1973).

С цельь пряного доказательства существования многой репарации в высиих растениях мы исследовали khuqibsj воэгяк-я ob вняв дилеров ткиина в ДНЕ растение in vitro л in vivo и выцепленке динаров иа ДНЕ проростков чины (ычнуЩ ativa Ii.- ), подвертя}ти* 7Ф~обзчошнй'

Списог сокращений

УФ - ультрафиолетовые кучи

КНРФ - кнсхотонерасхворикея фракция Х

KPл - кислоторастворимая фракция

ЭДТА - этнлендиаминтетрауксусная кислота *

SSC - буферный раствор (0,19 II Naci, 0,015 II цитрат иатдея) TU - трииорп(яс?сиав кислота.

РЕЗУЛЬТАТЫ

I, Включение радиоактивного тиьидина в проростки ва ранних стадиях ра згч тая

Включение Н- и С^-тииидина и распределенного пророс/Ну исследовали на проростквд Citn-.Hu всШИв Ь. , БЦраЩИ-вавюихсг б течение 5 суток я теннотэ и за^и пере не санных в специально изготовленные микросоеды с годным раствором ти-шдинэ. В нужнее время отбирэ.-л проростки, оазрезели их ва сегменты* гомогенизировали в гомогенизаторе Уоринга в 10$ ХХУ на холоду, выделяли стандартным методе:! КНРй и КРФ и определяли иг радиоактивность. Использовали йэ-втил- и тимидин (20-40 шскэрч/цл, отачест.прэпарат).

В проростках, развивающихся в растворе Н^-пш* чииа 4,5; 5,5 и 6,5 суток, количество метки в отдельных частях пр-ростка изменяется закономерно по его длине: в корне при удалении от апикальной части проростка количество метни увеличивается, а в стеоле уменьшается. Эти данные справедливы как для кисяотпаерастзорииои, так и для кислоторастзоримой фракций. Увеличение удельной массы отдельных частей проростков хорошо коррелирует с увеличенной доли Н3~тишда та* включенного в .состав ДНК как в корнях, так и в стеблях п^орос"-ков. 91% метки КПРФ всего проростка приходится на долю корешка.

Прл повышении концентрации тимидика удалось под пси ть удельную активность ДНК рэститерьньк образцов, однако соотношение радиоактивности в форме Н3-тишцгкэ в ШФи КРФ осталась иеяцманныг: по длине всего пророотка. Для обеих концентров было о печено, что окоп 20^5 радиоактивного тимн-диаа, поглощенного ироросткаии, бпо сдсредото^ено в НРФ, прцчем в керне 30$ метки Сило включено в КН?Ф,.а в ывбл не эту фракцию пг ^о^игхь только около 10^ метки.

2; Получение высококеченвЖ растений

Ила полу .|чв_, в достаточное стелой:: мечеиой ДНК растений использовали семема <щны иосевЕ I мпугив л^а ь.). Семена скарифицир^^л^, заначивали в во;.э I ио в стер и ль-

. ХХ 6 -

г. их условиях, отдегзли ."вро^ыш и ломевдали в чешках Па три в соад Уайта с цобавкаии пеницьягчна, вдеи^зина и Н3-аетил или 2С1^-тищд,;аа. Из четырах-Пятидневные проростков гомогенизировавши в видком азоте, *ыдепяли ДНК по cxeufi fiapiiypa (wir-mur , 19614 ) с римвнгниен буфера измененного состава и дополотого эй проыеку точной депротеичи^пвв пронвзой (ЮО ыг/кл). По спектрам поглощения контролировала чистоту препаратов. Определяли количество выделенной дНК, изнуряли ее радиоактивность а подсчитывали индекс ыечания ДНЕ (рвсп/мян на ккг ДНК). в которой определяли количество димеров (А/т вьпляли в темноте. ДПК из КНРФ выделяли по Спирину Велоэерскьау (1959).

' }ровни ьхлючения радисзктивного тимг.дина в ДНК растений -сэ могли удовлетворить нас в пзве мзучеюш киввмка димвриэа-кии растительной ДНК. Дело в той, что мшары тикша, как правилол образуются в других изученных организмах в количестве 0,5 - от всего содержания ^мкиа Для получения достоверных дагп 'пс при хроматогря^ичеснои равделетш гидролззтов ДНК радиоактивность, приходящаяся на димерную область, дожна составлять около ста иилупьсов в иицуту*. Следовательно, суммарно ' радиоактивность образцов гидролиаятов ДНК, наносимых на хрома-тогремму, дожна, был*. составлять ынимт ческолько десятков тысяч импульсов в кинуту. Для этого nj*.ne было получить растительную ДНК с удельной активность насколько сот распадов/шш на 1 шг\

Гвэультатн предыдущих опытов показал, что для получения высокомеченой ДНК растений при переносе, материала s радиоактивную среду можно не докидаться, когда зародыши начнут рост, а сразу помещать отделенные от семядолей зародыши в раствЬры л меткой* Это давал возможность, во-первых, добиться того^ чтобы помещенные в радиоактивную среду ненабухшие эародчищ васасывааи метку сраву с начала набухания, во-вторых, удаление семядолей устраняло засасывание метки se в эмОрионзльвке ткани корней, а в первые семя дольше листья к повволияо метить зародыши в минимальных объемах среды, что в несколько раз уменьшило количество используемых радиоактивных препаратов, в-трет^их, с сеыядолякк возможно удалялась часть пула

свободного тимидина. Использование среда Уайта, предназначенной для культуры ткана й, с добавка ид еденозииа увеличило уровень включения метки и позволило получить ДНК с удельно? активность 900-2500 ^асп/мин.мкг 2IHKV причем в корне она быда г 3 раза вше, чей в стебле*

si Изучение систем хрома тогрз^м радиоактивных: тииияовш: д- меров в связи со спецификой их обнаружения г растительной ДНК

Искусственные тишговие динары получала ив 2С**-тимиди-fi и тнгодва по ръкжерсу и Гэрг-дсу ( зеииега ,. uerends , st-s). Дилеры гидролисовали в 85% муравьиной кислоте, очияэли гт принесен тимина, спектрофотометрачески определяли (SP-8000) чистоту препарата, спектры поглощения в коэффициенты подвижное ги из бумажных хроиетогрв'шах г> пяти системах растворителе Ч. чепользоваш следующие системы растворителей: для одномерной хроматографии: (I) бутано.*! - уксусная кислота - вода (80:12:30), (П) бутаиол -вода (80:14), (I) насыщенный сульфат аммония - IU ацетат натрия - изопропанол (W:?:I) (растворители пропускали .дан, два или три pasa)* Для ги.унврной хроматографии: "[ГУ) I растворитель в первом, Ш - Хчо втором вытравлении, (У) П растворитель с первом, Ш во втором направление. В первом направлении растворитель пропускали -3 раза, во втором - IЧ раоо. иону диыеров определяли по свидетелям. В качеств, свидетелей использовали искусственно пригиховленные 2С^ч*тишшОБые диеры в ч основ&.шя. Pactio-аоа.ени" пятен опре *,еяяли nv aor:i оценив при 260 ни. Для яод- , счёта радиоактивности димерную и тиминоьне зови разрезали не св^мент^ размеров 1x2 cu (для чдаоыерых хроиатограмм) н Ixl cu (для даумернчх xvouatorpauu). Эщав материала -ims л I La воды. Элюат заливали диоксавовт! сщштнлятооом и подсчитывали радиоактивность. Днмеры в ЕРФ определяли хроцато-графией на колонке со смолой Doi.ex xs по методу Севигучи И соавторов (sakiguchi ot'el., 1970 ) с использовэанеи кол-ве к тора $рак:дЬ - увикордом ( ькв Ц.офильгроваиную черев нитроцопплоаные фил:.тр^ КРФ обессяввали я освобождала от свободного радиоактивного тихидива фильтрованием черев ysi-

траиви(рвл1| |Ла';о им-оз (тк ро ), В 8ГМ0Сферв ВЗОТв При Х давлении 45 дси не установке г-,м-20? (аонсоп ), хроматогра-фировала на.широкой Румааной хроматоггамме с последующей алюпяей димврной зоны водой и повториш анализом на одномерной хроматографе в И растворителе.

Первые моде ль "не хроиатограммы ичрояизэтов облученной меченой ДНК указали на трудности р .еденная тшашових диме-ров* Ыа одномерных н двуиьрных хрокзтогрэтжвх у точки старта и в блаалежащй области накапливались неидеитифицировевньк радяоактавные проекты., которые не позволяли достоверно о.п-ре^лить количество динаров. Освободиться от этих примесей удалось, протекая растворитель несколько ^аэ, Часть приме-'сей оставалось в зоне с ш о-од , часть уходила вниз с фронтом растворителя. В связи с этим мы проделал модельные опыты с искусстве ниши дамбрами ткшшь, чтобы определить коэффициенты подвижности после вэедого пропускания для одномерных и двумерных хронатограмы, так как в гитературе таквг данные отсутствовали (таби.1).

Таблица I.

Коэффициенты хроиатогрэ фяче ск от о разделения к! , димепоэ тииина*

растворитель Коэффициенты

однократное пропускание двухкратное пропускан"л трехкратное \ пропускание ,

1 I 0,24 0,44 , 0,56 |

! П 0,1л 0,25 ' 0,34 I

, Ш 0,63 0,?Э 0,Е '

* Бумага Ватиад К I (whatmen , Анпшя). u

Использовать I растворитель невозможно из-за плохого разделения динаров тимина к цитозинэ. Даже ри незначительной передаче' радиоактивности цитоэину. возможны артефакты. Это ис-кгпшет П растворитель (рис.1). На двумерных хрокатограинах горошего разделение димеров удолось( достичь, применяя У систему (рне.2).

Без предварительной очистки КРФ из меченых проростков точно определи количество не удается. На колонка

со сколов ьствхгхе этому препятствуют неидентифицированные принеся, сходящие с колонки перед динерайи, на бумажных хроаатограимах свободный пул радиоактивного шин дива и соли Для преодоления этях трудностей бы* разработан процесс пред

''Ч С> ср О СП ||

Рже Л. Положение димеров 2С1 -тииива и 2С-1-тиыина на ра-диохроцатограше после оду о-, двух- и трехкртного пропускания растворителя по сравнения с полок-ниек

четырех оснований (П растворитель} а - гуанин, С- цитоаин, А - адьила, I- тимии. Границы пятен обозначены юнтураш. В верхней'части рисунка указано распределение радиоактивности на радиохрома тограме дилера ишяа я гииив (второй ш-к).

............ т^с творив ль проиунен 1 раа

Ч - - - - растворитель пэопуцеа 2 раа

Ч----Ч растворител_ про.^ущен й раза

В кинеГ *;астД рсувка украано положение йснований на хроматограмиах, выявленное умгахв1шскишм; Кг I - одчокрйтяое 7ропусяаши, Ч Z - дьувратвол 16 В - трегаоатноа '

Рис. 2; Часть двумерной хрома тог рэшы динаров 2С^-тимина, кедашвризован.чого 2С*^-тишна в четырех оснований при двукратное разгонке в обоих направлениях в У.зи-стаме раотгорителей. Распределение радиоактивности указано для дшзрной-области в правом верхнем углу, для тимнна в нижнеи Чести хроматограммы.Ковтуры пя-- тен оснований-гияваенвые с помово>ы ультрахемископа, указаны пунктиром для случав .разгонки в первом па-правлении, спмшоя влиаявй - после разгонки во втором направлении. По вертикали и горизонтали указаны воэф-' фициепты . Размеры целого тшста 50x27 сМ.*

верительной очистки КРФ. Нейтрализованнуп КРФ, профильтровал' ную через нитроцешолозный фильтр HAwp оогзоо (с диаиетрок пор 0,45у*. ), допонительно5 профильтровали через улитраивм-брани 'о1апо им-05 (аш1соп , С.Ш.А.). Это иеибраны аадчраивают все растворенные вещества, иолек^кярннй вес которых вше 5и0. Таким образом достигали двух целей: ^бессон вали раствор и на 4/3 Ъсвобсждздк его от свободного тинидина кислотный гидролизат проверяли на хронатогранме во П растго-рителе1. Проверка пиказала, что в нем присутствует только ти-шдин. Подготовленную растворимая дрэкцию, <:к онце н трир ов зн-нуи до минимального обмена, выпаривали досуха, гидролиз овал в У55& муравьиноЧ кислоте и наносили "пшрог.ш стартом" - полоской (10x0,5 см) на лист хроматографической бумаги (50x27 см) на расстоянии 7 с от верхнего края листа. По правому крап износили свидетель (искусственные дичеры такт-з и цито-

зич). Растворите,л пропускали 3 раза. Путем подсчета радиоактивности в зоне пропуск а е.; я свидетеля ояредегчпи дииернув зону. Из полученной хроматограшы вырезали дкмерную зону и разгоняли в иердвндоыуляряос направленна в воде месколько рвг (обычно до 8), Пюле-этого элюировали материал водой (в течение ночи - 2-5 ыл раствора). Полученный элюат выпаривали над водяной баней до минимального объема, смешивали с муравьиной кислотой и,наносили на полоску хроматографической бумаги (48x2 см) для повторной хроматографии во П растворителе с однократной разгонкой. На повторных хронаготргимах присутствовали лишь-радиоактивные пики тииновьи дииеров,возводя вие точно по; .зчитать ко диче сю димеров^

4. Изуэчие ьинетики У0-динвр"Зации пи^-хмиди новых ос..овьяиа 3 р^стительь^й ДНК

~ля количественной огчнки влияния УФ-облучения на ДНК растений до изучили кинетику Уф-димервзации ял>инндиноь в ДНК Удельная радиоактивность ДШ,, использованной в этих опытах, была равна 60 расп/ш"в на мкг ДНК (Н3-нетия-тиии-даи, отечестинний препарат). Под действием У^-обиуч^яки Х было обпзружеио воэаь.шовеяиь диме|">в танине и снепаньых № мерог танина и цитозяка (табл.2)

Таблица 2.

УФ-дмеризеция пирим>.динов ДНК ^ины

1л Радиоактивность в г.имерной области Сишт/нин)** - Радио- ! $t/X

Димеоы fy димеьы й; ность в тт/т

s к ps Общая фон Чисто ди-ljp-ная Осщая Фон Чисто ди-мерная тимино-504 облаг ти (имп/ шн) &) (%) л

t 0 42 10 . 32 . S3 . 28 5 1?9779 0,025 0,004 |

0,5 159 7 15? 99 17 $2 I0663I 0,143 0,077 '

I 270 98 232 71 16 55 78382 0,296 0,070 !

1 3 228 5 223 S6 0 36 30686 0,727 0,Ш ,

l 5 731 II 720 123 5 118 57946 1,21(3 0,204 t

1 & l 1154 16 1138 III 7 104 878W 1,296 0,118 i 1

s - лампа БУФ-15, расстояние 18 см ДНЧ в 0,I s se. 250 мкг/ыл. - Одномерная хроматеграмма, П растворитель, 3 раза,

Димеров ЦТ типа возникало в несколько раз маь^ше, чем ликеров типа ТТ, Кинетика возникновения обоих тиков дилеров подчиняема одноударной зависимости (рис*3а>. Максимальное число ГЭмеризуемых тиминовых остатков у чиЪы приближается к

5. Изучение кинетики дкмаризации хинина в ДНК растительных клети In vivo

.Для о (Нарушения вырезания димэров из ДНК Уф-обдученных проростков надо было выбрать биологически оправданную дозу облучаьия. Для такого выбора недостаточно данных по кинетире УФЧДИмери88ЦВГ i.i Vitro , потому что в клетках монет происходить рассеивание " ' . части падающего на них коротковонового света и поглощение части УФ-дучей пигментаы и клеткеаи эпидермиса. В связи с этим была научена кинетика Уф-димериэр-ции тимивовых остатков в .ДНК " vivo * (рис.36).

m vivo - уровень диыеризации лиримидиновых оснований примерное 2 раза меньше уровня* который наблюдается in vitra. Мак'каальное число димермэуемых ти айнов пв данном случае с оста-

Для вечевия зародыпей использовали 2С**-тииидин (50 мккюри/ыл, отечественный препарат).

f2J i s е т v

Лом pfruf4ti#isAH и. I

fO 0 JO 40

Д.О! ' oAyWtHU*, Milл

Рис.5'.-Жине гика Уо-дииеризвциа та мина б ДНК - n vitrt-( ск. стр. 12).

О Х fn vivo:

4-дневные проростки о<* печали 3-1Ш дампа ки БУФ-15 с расстояния 10 си. Сразу посла облучения пророста замораживали жидки:, эзотои и выделяли ДНК. Количэ-ь ство диыерм в кислотных гидролиэатах ДН2 подсчитано на одномерной хроматограмме (Q растворитель, З-крзтная разгонка).

6. Выщепленив димвроч тимиаа из ДНК облученных проростков

Посла из7чания кинетики УС^-диквризация гиынна мы выбрали дозу облучения, при которой образуется около 0,15? .дишров, т.?, такое минимальное количество^ которое исключало бы количественные ошибки при низком уровне вырезания

димеров иа ДНК и в то же1 время'обеспечивало бы достоверное ореде-.еясе оставшихся дилеров при высоких уровнях вырезания. Еародаа^ метили Н3-ы9тп-тииидинйм (60-80 мнкюри/иа, отечественный препарат). При инк;;бации Уф-облученных проростков в теплоте в среде Уайта без Н3-тиыадина происходило вырезание димеров ткшна из ДНК (табл.З),

Таблица S.

УФ-дкнериьация тимина в ДНК проростков чины и вырезание димеров из ДНК во время инкубации в темноте

Бремя инкjбашни Я*'С л в сЗдуччиия,

Ра ди ой к г: is н о с ть**,

дкшв риал область

тиии новая осласть

Число дкмаоов в ДНК Доля ' вырезан-1 них ИЗ f Ш да- | мзров,

.0,014 0 1

0,007 0 \

о,оп 0 1

0,123 0 '

0,043 65 '

0,037 70 ,

0,081 I

0,061 50 1

0,071 43 '

Контроль (баз оолученЕ.))

То же . О

Х ' 2 б 12 28 46

24 20 246 92 65 458 ZW 215

322999 173993 19У468 212097 №47' 566199

* 2 лищщ БУФ-15, расстояние 20 см.

й одномерная хроматографа (П вастеоритс ль, 3-х кратное пропускание).

Основывась на яолуетшх данных, в последующих эксш.-риментах '.ш изучала процесс выреиния тиминовых димеров только до б-г о часа инкубирования в темноте.' В гччестве ра-дноактиг юй метки >> этол сорви опытов Дспользовали С^^-тчца-дин (26-30 MKKwp^/ыл, удельная радиоактивность чв шсюри/uM, <npua eis \ фраыдая)', а анализ вырезание проводили с помощью одномерной (П растворитель, * раза) и двумерной (У си-стека) хромо тог рефш п бувгв (табл.4).

Полученные в этой сэрии опытов данные подтвердили вывод

< * Таблица А.

Вырезание динаров гвшнэ из ДНК проростков чины в те киоте и исчезновение динаров тиминз нз

1 № ЮТшга \ I 1. 3 Длительность инкубирования в темноте * Контроль (без обличения) Вид6 1 хроматографии Одшжерия. Двдгериэя Радиоактивность иип/нин Содержа- 1 Доля ди-вие ди- |мйров, Среднее 1 по < всем I опыта и |

^Х.эраэа обзегь 14 10 тиминовая область 1Ьц25 127802 леров (ТТ/Т), % 0,011 " 0,008 ВЦрОЗЭН-ных иэ ЛИС, %

1 I 1 2 1 3 , 4 Без инкубации (сразу после облучения) Одаомаргэя 0 Двумерная >< 852 258 825 34 567330 252700 444972 8016 0,150 о,ш 0, *85 0,247 -

1 I 1 3 1.ЧЭС в тошюте Одномернал ^у корная 845 70'; 548У20 Ь85795 и, 154 0,182. 0 1,6 0,3 1

| I 1 2 1 3 4 часа в темноте Одномерная я Дв^ерпся 532 13? 755 тт '167 ПО 472814 0,126 0,036 с, 160 16,0 22,6 1й.5 1

< I 1 2 ! 3 1 4 6 чзс. г теаноха Сдноиерная в Двуиернзя и 580 124 496 86 492290 155820 Ь93387 24991 0,118 0,091 0,125 .0,1л 2")0 18,1 32,4 41.7 28,4 '

I 1 2 6 час. в^ свету Одномерная Двумерна^ 62 63 98559 38323 0,063 " 0,164 "3,3 33,6 Си,5

л существовании явления вырезания дииеров тимина из ДНК ия-тактаыж проростков чины, подвергнутых ультрафиолетовому облучению. илоть до 6-го чг за инкубирования сохраняется одно-ударная кинетика выреэчния,димероз (рио.5).

Рис.5. Кинетика выщеплеяяя димеров пшина из ДЫ проростков

чину при инкубкрованчи их после Уф-облучения в темнота.

В .(летках проростков чины удается также обнаружить ис-че^новенп дииеров тамина изДС при освещении ироросгсов види"ым сватом. Для изучения это,, о :роцееса (по своей природе являющегося, "О-ри^иком;/, фотореактивацией) часть материла пос;.л ультрафиолетового облучения оставляли в течение 6 часов -на свету (одна шклесцентвав лампа) а затем в этих пророот-ках ачаниаировзли процентное содержание димерсш -гшшна со иа-иду, .писанному выше. Данн-е этой серии опытов привадааы в табл.4 (две последних строчки). Было устаповлено, что около 40% всех ьоэцкшр^ 'в ДНК*димеров исчезло (возмгтно, восстановилось в к зоыерное состояние) пусс освещения чидвмш светом. В^хьо подчеркнуть, ,то иэ свету происходят устрвкетк большее числа чмеров гинина, чем в теме .те. 0?чэь:о в обоих случаям устранении подвергается менее пох^доны : сех возникших в ДЕК дииеров.танина. Напомшпг, ч^о я в другой исследованной системе клеток высших организмов (клетки млех питавших) отмо-

чеяо .тана:л выадвление тшь около /юловины (иногда до 70$)

всех ВОЗНИКЛИ* ДИМбрОЦ тииина ( Setjow , Carrier , 1968; Regan et el., i960 ).

Хотя ДНК виделяли стандартно or опыте к опыту (об этом свидетельствовали спектр поглощения), и известно, что степень димериэеции, определенная в выделенной по Шрмуру полимерной ДНК и в КНРФ практически ")дйизновв" у прокариотов ( Maeelt е. al,j 1973 ), Мы Проверили Нв ЗСВИС:Т ЛИ КеОЛЮДЭв-мое уменьшение количества димеров от метода видиления ДНК* На примере jcpc итографичегного анализа кислотныл гядро/лэз- ; тов полимерной ДШ;, с одной стороны, и Д1Г% Д валенной из КНРФ, с другой сторона, было показано уменьпенме количества Ликеров в ДНК проростков, инкубированных после УФ-об лучения в темноте.

7* Ане ли- нэколевгя змеров в си е ли хоре с ri эриаои '

фракции клеток проростков, инкубироьаннгтс в темноте после Уф-облучелия.

Тивиновые димары в предварительно неочищенной КРФ из проростког^ инкубированных в темноте после Уф-облучения, были обнаружены с помочь двумерна б^кавной хроматография и с помощьо колоночной хрыат аграфии (смола dowm ixe в первом случае количественному определений препятствовало. Соль вое количество гс^-химичииа из свсЗодяого пула во второй -неидентифищфованные радиоактивные, примеси, сходящие с колонки непосредственно перед дииерныик фракциями Точьо определить количество тиииновшг дямеров удалое на повторных хрома-тограммах КРФ (в эяюентах дииарньк зон вырезанных из хрома-тограмм). Данные этих экспериментов представлены в таблице 5*

Дилеры обнаружены также и в контрольных КРФ. Разница между количеством динаров в опыте и в контроле практически равна тому количеству дииергв,. которое в соответствии с Si вырезания вырезания определен для полимерной ДНК и КНР? предполагалось обнаружить в КРФ пр оив ку Си р ованн ьо. проростков. Присутствие димерсв тимина в КРФ иеинкуби^ованных проростков Можно обтяснитв вкладом неoneпифических процессов поверхлост-ных тканей, репарацией под луч од или ооразове'нием димеров ив

свободного пуда таиидиаа.

Таблица 5

Распределение радио-ктивнисти в равных фракциях

проростков

I I I I I I

Фракция

1 ДНК из КК.Ф Ч

Радиоактивность (расп/шн)

Облученные проростки

сеэ инкубации

1023431

над уль^эмеыбраной

под ультоанемОаной иыч>5

1404889

148377-'л'

Облученал проросткиинкубированные 6 часов в те и но те

1046209

1338519

1622528

, Беев материал

2507204

?.670783

'ТТ в КРФ

5732475

6423180

1 % вырезанных иь ДН" диие-' ров, накопленных в КРФ (______________

8* ИнтиОированлэ оксимочевиной роста проростков " и синтеза ДШ

ДНК цпцащзди в водные растворы оксииочевины. в нужные ' интервалы впей..ни отбирали пробы, определяли длину и вео проростков, Из пчраленьных проб выделяли ДНК я определяли вн-декз печения. Попечение семян чины в О,XII раствор оксииочевины резко понижает их всхслесть, прч воздействии 0,054 раствора отлечается незначительное ингибированиа прорастагчя, более разбавленные растворы практичаски не окааали влияния на вс^о-: I эсть. Развитие проростков,, перенесенных изводив растворы оксимо левины, ингибирова леюь концентрапчяш - ЮН

(рис.6).\Пов14внив крнцевтрацгя оксииочевины от 10""3У до 5.10Щ*М в сред для роста приводит ж прогрессивному у ценно-

' Рис.б. Влияние оксимочевивы не рост проростков чини.

А - корни, В - стебли*

нив включения 2с1''-тикидине в корни (рис.7) и сильно икгибиру-<Д от синтез ДНК в кр.un* высших растений, росвих в растворах агента. Лишь I5-5fS ИХ по сравнении с контролем синтезирует-

2000 1500

10~*M 1{Г*М

Контроль

Ряс.7 Заияние оксимочевииы на включение 2С1* тиоддииа в JUK

корне3 чины.

ся в:тих условиях. Совпадение концентраций, вызывающих инги-бироваиио синтез^ НЕС, и кинетики эгого процесса с концентрациям и кинетикой ингибированьи развита" пророотков позволяет сделать вывод, что причин? подзпе^чя роста обусловлена пряным влиянием оксимочечины ня синтез ДЫК.

9. Иг;чание реп-ративного (непланового) синтеза ДНК

3 проросли сра?7 после облучения вводили оксимоч евину я радиоактивный 2С*^-тимидин '$ ыккюри/ыл, удельная :>эдь оакт"в-вость 48 шюри/мМ (* eis. ), вакууминфильтрандей и инкубировали проростки в темноте, пооле чеги выделяли ДКГ* У измеряли индекс мечвЕЯ.

Ериа В nptpOCKX _othyr,i eai.va L. . СущвСТВувТ рвиЛ-рвция- то пдсле облучении п^и инкубировании проростков в тонной г".ры дожны удаляться, а бреш в iUJC застраиваться, Вели репликативный синтез инггоироврть, то, следовательно, :жжочение меченого тимдиаа в теку ДНК следует рассыетри-

1 2 J ч

Ряс' 8* Включение гс^-мкидина в ДНК пророс*кав посла

УФ-облучения.

гс^-тинидиЕ инфильт^мак вакуумом в -суточные прп-ioctkb. После этого проростки облучены 2-мя лапаш БУФ-i, 5,5 ш. с расстояния 20 cu и проинкубированы 18 часов в темноте.

I - контроль, 18 часов после инфильтрации, C^-тиии-див, без оксимочевинн, не облученные (9бС*Зб расп/миЕ на ыкг ДНК);

* Z - до инфильтрация сутки г овсишлевине

Инфильтрация 2С1^-тииидииа с окснаочевиноИ *-1(Г211, яеоблученные (200*9 расп/мин на шг ДНК)! 8 - то же, после инфильтрации, облучение УФ-светом

(240*11 расп/мин на мкг ДНК); 4 - то же, что плюс инфильтрация 5-брондсзскснури-дияа - (122*6'расп/мин ча ккг ДНК),

взть как так называемый нема новый, т.о. ре па ративный синтез,

Нэ рис.8 приведены данные одного из опытов по изучению непланового синтеза. В этих опыте:: отмечено увеличение включения печеного кмидина в ДНК после облучения в присутствии оксииочевины, что мы рассматриваем как н-пзновый синтез.

Известно, что синезеленые водоросли после облучения способны включать ZC^-ТИЫИВ В тшополисахариды ( Shelakov at ai., 1975 ). Чтобы проверить, действительно ли в наших опы-сзх гс^-^кмидин включася после облучения в ДНК,' мы гчдроли-вовали ДНК (с.;оло 50 ukv), гидролизатм проанализировали аэ С/махных хроматограммах. Анализ показал, что радиоактивность протестует только в таил нов ой пике.

в а в о д f

2. Изучена динамика включения и характер распределения Н3-тимйдинз в проростках citrutiue л<*uzu и Не основе этого отработаны условия для получения высокомеченой растительной ГНК. '

Х 2. Изучено несколько систем растворителей для бумажной хроматографии радиоакиввнх тишновы.. дииеров и подобран реви;; их хроматографии и очистке в связи с э спецификой обнаружила гомеров пиримиднновых 'сноз.зй в кислотных гндродиватах растительной ДНК.

С. Исследована кинетика Уф-дамеризации пиримндноэдх оо-ОваниГв растительной ДК in vitro л in vivo.

4. Ио^аэани, удаление УФ-индучарованных ти^иновых динаров m ДНК Уф-0ьлученных проростков во время и-кубеции их темноте* Ьссдедолаие кинетика вырезания. Количественно сходню вечеавовеь.е дикеоов тимина из ДНК обнаружено пои вцд-ржиэа-нии проростков в течение б часоа в- свету.

Показана, что наряду с уиевиен>.ем количества тжмито-вых дииеров в JtiiK' происходит их накоплени* в хислотораствори-мой фракции/ " "

б. Иаучвио ингибирующие деЗс-вие оксимочевины на рост грориткбв и синив ДиГ, определен диапазон концентраций оксимочевины, вызывающих эи кнгмоврованне. .

Показано увеличение включения С^-гиыидина в ДНК (возможно отражающее неплановый- синтез) Дроро'стков, инкубируемых носке УФ-оолучения в темноте "я уоловпх ш^гибированчя норма льной репликации охсимочевиной.

8 Обсуждается предполоаьлие о том, что вирезаике динаров из ДНК, выход их в КРФ и возможное существование непланового синтеза являотсл результатом терновой репарации эк^.ци знойного типа. 1

Материалы диссертации отражены в сведущих ' публикациях; ' i

I. Включение На-гииидина в проростки citruiiuл. duii на

рбННИХ стадиях развития. -Lfetuvo gen*Uk4| ir elekclninkn гл-Хp. :koni. tez. к., 1972. р.2-3, Авт.: В.СоПфер, Ю.Ти?ов, | К.Циеминис. - На литзв.яз. '

2* Подавление роста и. развития l^opoctkob чины ингибтором синтезе ДНК оксимочевиной. - пД&г.з.ВАС2НШГ, 1979, т. 10, с*8-9. Авт.; К.К.Циеминис, В.Н.СоЙфвр,

а, Ингибировагаае оксимочевиной синтеза ДНК ъ клятвах корней проростков чина. - "Довл.АН СССР", 1973, т.213, te б,

с.IX43-I450. вт.: В.Н.Сойфер, К.К.Циеминио, Н.В.Турбин.

4. Выделение полимерной FHK из растений.- uлtuvo* ел1Шц ir

", ХХl*kcinlnkii reap. kon. t*z*. К., 1972, p.l-2. АВТ. B.K,COfliep,

К.Циеминис, В.Дорохов, Ю.Титов* - На латов.яз.

5. Прямое изучение синтезл. ДНК в проростках ячменя в норме при облучении гемме-луч а ми и при постлучетюй обработке кофейной, "Дока.ВАШШ", 1975, т.И, с .'8-Ю. Авт.; В.Н.С^фер, Н-А. Картель, К.К.Цие"нис, А.А.АгрэновсвнЗ.

б. Методы исследования димеров тимина in vivo в ДОС бактерий

И растений. - I-lлtuvs> genetlk^ ir Хlakclntnlot r*p. kon. 1 txi.

ki, 1973, 0,2-3. Авт.; К.К.Циеминио, В.Н.Сойфер, И.Ю.Славвч нас, А.Аграновский. - На литоэ-на;

7* Вырезание докеров юшина из ДНК проростков ь&1Ну-

:ти Иул!,, ОбЛуЧвННЫХ у 71ЪТрафЙОв1'07>ЫМ СВОТОМ. -Ыл-

/ог звпвИкч г г л1ксЕптк1| гее р. коп!. (ехАв . К. ,1973, р.3-5. Авт.: В.Н.Сойфер, К.К.Циеминнс. - На литов.яв.

8. Вкличение Но- и С1^ тишина и тимидина в ДНК на ранних стадиях развития растений и получение высокомеченой ДИК

"растений. - "физиои-эгия растений", 1974, т.21, й 5, с.946-951. Авт.: В.Н.Сойфер, К.Г.К.Циеминис, Ю.В.Титов.

9. Дшеризация тимина ультрафиолетовым светом в ДНК раоти-телуных клеток и вырезание динаров иа ДНК. в темдоте. Структура ^ функции нуклеиновых кислот. Материалы симпозиума, посвященного памяти А.Н.Ьзло-арского. 11., 1974,

с.07. Авт.:В.Н.Сойфер, К К.:1ившвис.

Ю. Темновая репарация в высаях растениях. "Докл.АН СССР", 15'.'4, т.215, Й 5, с, 1261-126^. Авт.: В.Н.Сойфер, К.К. Циеминис.

Цатериалы диссертации были доложены ня:

I* Республиканских научных нонэрекциях генетиков к селекционеров Литры, Каунас, 1972, 1973^

2* 2-ом всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы ге- * певческих процессов! гутэгенеэ и репарация", Москва, 1973 (тезиса, г-тр.88-89). . (

% В ей всесоюзной конференции "Проблемы ф ото эн арг ежических ------.:роцес л ра^тени-". Ама-Ата, 1974 (теаисы, стр.183134/.

. 4. 2-йм всесоюзном совещании ВАСХНШ по молекулярное био" л огни, Одессе; 1974.

Тчгрдфмм Х.АСУЧИЛ

- 1л- Хщм^ОО,

Похожие диссертации