Методические рекомендации к определению и выведению гемограммы у животных
Методическое пособие - Разное
Другие методички по предмету Разное
о предметного стекла, на котором приготовляют мазок. Обычно это достигается подбором или обламыванием углов шлифованного стекла.
Рис. 1. Приготовление мазка крови.
Поверхностью предметного стекла, зажатого в левой руке, осторожно, но быстро касаются выступившей из прокола капли крови, стараясь сделать это ближе к среднему пальцу и, сейчас же, приведя стекло в горизонтальное положение, прикладывают к его поверхности узкое ребро того стекла, которое держат в правой руке. Приложенное ребро должно лежать перпендикулярно к длинным граням предметного отекла, а самое приложенное стекло нужно наклонить в сторону капли под углом в 4050. Держа это стекло, таким образом, осторожно двигают его в сторону капли до соприкосновения с нею. Как только капля, коснувшись подвижного стекла, разойдётся по линии соприкосновения стёкол, верхнее наклонное стекло быстрым, но ровным движением направляют обратно, в сторону большого пальца, сохраняя всё время прежний угол наклона в 4050. Полученный таким способом мазок высушивают на воздухе и на нём пишут иглой название или номер животного, его пол ((J или Q), и дату взятия крови.
Можно изготовлять мазки и на покровных стёклах. Для этого одним покровным стеклом берут очень маленькую каплю крови и прикладывают к нему другое покровное стекло так, чтобы углы одного стекла легли на середину рёбер другого. Как только капля крови разойдётся тончайшим слоем между обоими стёклами, последние параллельным
движением в противоположные стороны разводятся, и, таким образом, получаются два мазка.
В. ФИКСАЦИЯ МАЗКА
Чтобы закрепить все форменные элементы крови в препарате с максимально возможным сохранением их структуры и подготовить мазки к последующей окраске, существуют различные методы фиксации мазков. Наибольшее практическое значение имеют:
1. Фиксация абсолютным метиловым спиртом. Это лучший метод фиксации. Сухие мазки на 3 минуты погружаются в абсолютный метиловый спирт или на то же время спирт наливается на мазок, вполне покрывая препарат. Через 3 минуты мазки вынимают (или сливают с них спирт) и просушивают на воздухе.
2. Фиксация абсолютным этиловым спиртом, смешанным с равным количеством эфира. Фиксация длится 1030 минут в обычных сосудах для гистологических растворов. Этот способ значительно хуже, так как даёт много артефактов.
В. ОКРАСКА МАЗКА. ОСНОВНОЙ МЕТОД ОКРАСКИ ПО РОМАНОВСКОМУ
Посредством окраски препарата наиболее отчетливо выявляется тончайшая структура, как ядра, так и цитоплазмы. Принцип современных методов окраски мазков крови открыт в 1891 г. Д. Л. Романовским и заключается в избирательном поглощении (химическом и коллоидальнохимическом) веществами клетки трёх красящих веществ азура метиленовой синьки и эозина. Азур (красная из метиленовой синьки) имеет амфотерноосновную реакцию, метиленовая синька щелочную, эозин кислую.
Ядро клетки, богатое нуклеопротеидами и нуклеотидами, базофильно, т. е. окрашивается основными красками с избирательным поглощением а з у р а.
Цитоплазма молодых клеток, относительно богатая нуклеиновыми кислотами (нуклеотидами), также, хотя и в меньшей степени, базофильна. При этом избирательно поглощается преимущественно метиленовая синька. Цитоплазма же многих зрелых клеток крови (прежде всего нейтрофилов) ацидофильна (оксифильна).
Лимфоциты сохраняют базофилию цитоплазмы на всех стадиях развития, избирательно поглощая метиленовую синьку. Наличие базофилии молодой цитоплазмы, указывающее на относительное богатство её нуклеиновыми кислотами, связано с сохранением способности молодых клеток к интенсивному синтезу белков.
Лимфоциты сохраняют эту способность на весь онтогенез.
Базофилия гранул базофилов определяется наличием в них кислой слизи (мукоитиносерная кислота).
В лабораторной практике чаще всего пользуются следующими способами окраски по методу Романовского.
Окраска раствором Гимза
Краска Гимза, применяемая при окраске по методу Романовского, представляет собой комбинацию метилен-азура (азур II) и эозина (В, жёлтого). Она состоит из азура II*3,0, эозина В 0,8, химически чистого глицерина 250,0 и метилового спирта 250,0.
Эта краска обычно отпускается готовой. Очень многое в успехе окрашивания определяет безупречное качество раствора краски, а последнее в высшей степени зависит от реакции воды.
Для приготовления рабочего раствора краски употребляется дважды дистиллированная вода. Обычно она имеет рН=5,4, т. е. слишком кисла, и даёт слабую, плохую окраску. Поэтому такую воду нужно подщелочить, прибавив к 23 л воды несколько капель 1-процентного раствора соды. Лучшим рН воды следует считать 6,86,9 (до 7,1). При более щелочной реакции воды мазки получаются более синими (даже эритроциты).
Практически пригодность воды к окраске определяют по растворению в ней гематоксилина. В 10 см3 дистиллированной воды (лучше всего в часовом стёклышке) кладут пинцетом несколько крупинок гематоксилина. Не ранее как через 1 минуту и не позже 5 минут вода должна окраситься в ясный слабофиолетовый цвет. Более раннее и интенсивное окрашивание указывает на сильно щелочную реакцию, более позднее на кислую.
Если нет очень хорошего гематоксилина, то реакцию воды, подщелачиваемой раствором соды, можно определить, пользуясь в качестве индикатора нейтральной красной. В два химических стакана (или колбы Эрленмейера) наливают по 200 см3 дистилл