Источники и пути образования оксида азота в организме
Дипломная работа - Биология
Другие дипломы по предмету Биология
жет достигать 0,2 мкм, что позволяет измерять внутриклеточное производство оксида азота. Поскольку время ответа электрода составляет около 10 мс, часть радикалов, вступающая в очень быстрые реакции (например, с супероксид-радикалом), не может быть зарегистрирована [15]. С помощью этого методы были проведены измерения содержания оксида азота в крови человека [1].
Хемилюминесцентный метод основан на регистрации фотонов, излучаемых в реакции NO с озоном. Несмотря на высокую чувствительность, применение его к биологическим объектам затрудняется сложным этапом доставки радикала в анаэробную газовую фазу. Кроме того, на выход люминесценции оказывают влияние аммиак, олефины, окислы серы и другие продукты, выделяющиеся в результате биологической активности организма и часто содержащиеся в стенках аппаратуры [1].
Среди непрямых методов определения NO (таблица 3) наиболее распространенным методом оценки его синтеза является реакция на нитрит-анион с использованием реагента Грисса (раствор сульфаниламида и N-(1-нафтил) -этилендиамида в 2,5%-ной ортофосфорной кислоте), которая дает окрашенный дазопродукт с максимумом поглощения при 548 нм. Обычно отношение содержания NO-2/NO-3 у млекопитающих составляет 1 : 10. и хотя содержание нитрит-аниона менее подвержено влиянию состава питания, при необходимости более полного определения продукции оксида азота измеряют и содержание нитрат-аниона. Для этого NO-3, выделяющийся в культурную среду или биологические жидкости, восстанавливают металлическим кадмием, импрегнированным медью, или ферментативно, нитратредуктазой [1].
Таблица 4. косвенные методы определения оксида азота [1].
Соединение-индикаторПринцип определенияМетод регистрации, чувствительностьМетгемоглобинHb-Fe(II)-O2 + NO = =Hb-Fe(III) + NO-2Фотометрия, 2 нмИминонитроксид (ИН)Нитронил нитроксид+NO = =ИНЭПРНитрит-анионNO-2 + реагент Грисса = диазопродуктФотометрия, 1 мкмНитрит-анионФТИО* + NO = NO-2То жеНитрат-анионNO-3 + Cd = NO-2 NO-3 + нитратредуктаза = =NO-2То жеНитрит-анионNO-2 + S2O-4 = NO+Hb-Fe(II) = Hb-Fe(II)-NOЭПР, 1 мкмЦитруллин3H-L-аргинин + NOc = 3H-L-цитруллинВРЖХ, радиометрия; 0,1 мкмцГМФNO + 3Н-ГМФ + ГЦ = =3Н-цГМФХроматграфия, радиометриябис-Формазан (БФ)ТНС* + NOc + НАДФ.Н = =БФГистохимияНАДФ.ННАДФ.Н + L-аргинин + NOc = НАДФ.НФлуорометрия* ФТИО - 2-(4-карбокифенил)-4,4,5,5-тетраметилимидазолин-3-оксид-1-оксил;
ТНС - тетразолий нитросиний;
ГЦ - гуанилатциклаза.
Высокую чувствительность имеет метод, основанный на фотометрии метгемоглобина, образующегося в результате окисления оксигемоглобина NO. Применения двухволновой спектрофотомерии дает возможность определять до 2 нМ оксида азота [9]. В качестве субстратов также могут быть использованы дезокси- и карбоксигемоглобин. Серьезным недостатком, ограничивающим применение этих методик, является необходимость очистки исследуемых объектов от эндогенного гемоглобина, а также соединений, способных его окислять[1].
Как известно, оксид азота образуется из L-аргинина в эквимолярном отношении с L-цитруллином. На этом основан радиометрический метод определения NO по появлению L-цитруллина, меченного радиоактивной меткой, происходящей из L-аргинина. В определенных условиях для оценки синтеза цитруллина может быть полезной колориметрическая реакция на карбаминогруппу. Другой необходимый компонент синтеза NO - НАДФ.Н. разница в скорости его окисления в присутствии и в отсутствии ингибитора NO-синтазы может служить показателем синтеза NO. Подобный метод применяется в гистохимии, где регистрируется НАДФ.Н-зависимая диафоразная активность NO-синтазы в присутствии и в отсутствии ее ингибиторов [1].
В качестве показателя синтеза NO в клеточных экстрактах также используется универсальная способность этого радикала увеличивать активность гуанилатциклазы в 10-50 раз. Ряд методов основан на измерениях физиологических реакций, инициируемых NO, таких как релаксация сосудов, ингибирование адгезии тромбоцитов и др. [1].
Некоторые производные NO также проявляют NO-подобную физиологическую активность, поэтому помимо биотестов были предложены инструментальные методы их определения (хемилюминесценция с предварительным фотолизом образцов) [1].
Участие оксида азота в биохимических процессах
Механизм действия NO
Низкомолекулярный газ NO легко проникает через клеточные мембраны и компоненты межклеточного вещества, однако время его полужизни (в среднем не более 5с) и расстояние возможной диффузии (небольшое, в среднем 30 мкм) ограничиваются высокой реакционной способностью молекулы и ее взаимодействием со многими возможными субстратами [2].
Действие, оказываемое NO на клетки, во многом зависит от количества газа. В небольших количествах, продуцирующихся обычно конститутивными формами NO-синтазы, эффект NO в основном связан с влиянием на гемовую группу растворимой (цитозольной) формы гуанилатциклазы. Активированный фермент синтезирует циклический гуанозин монофосфат (цГМФ) - активный внутриклеточный посредник, регулирующий работу мембранных ионных каналов, процессы фосфорилирования белков (через протеинкиназы), активность фосфодиэстеразы, а также др. реакции [2].
В больших концентрациях, образующихся, как правило, индуцибельной изоформой NO-синтазы, NO может оказывать на клетки токсический эффект, связанный как с прямым действием на железосодержащие ферменты, так и с образованием сильного окислителя, очень реакционного и токсичного свободнорадикального соединения пероксинитрита [14]. Пероксинитрит (ONOO-) образуется при взаимодейс