Источники и пути образования оксида азота в организме
Дипломная работа - Биология
Другие дипломы по предмету Биология
} + NO-2 N2O3 + OH-2O3 NO + NO2
Кроме того, ионы NO-2 способны восстанавливаться до оксида азота в ходе окислительно-восстановительных реакций, акцептируя электроны с дезокси-форм гемсодержащих белков. Так, при взаимодействии NO с восстановленным гемоглобином происходит окисление Hb2+ до metHb и восстановление ионов NO-2 до NO:
2+ + NO-2 + 2H + metHb + NO + H2O
Нитритредуктазная активность также показана для миоглобина, цитохром-с-оксидазы и цитохрома Р-450.
Факт образования NO в биологических тканях из нитрит-аниона позволил предположить возможность существования механизма циклического превращения оксида азота в организме:
Arg NO NO-2/NO-3 NO
Данное положение нашло отражение в концепции цикла оксида азота в организме млекопитающих. При этом NO-синтазная компонента обеспечивает эндогенный синтез NO, NO-2, NO-3 в присутствии кислорода. В условиях гипоксии или функциональной нагрузки, при которой осуществляется активное потребление кислорода, NO-синтазный механизм ингибируется [10].
В то же время дефицит кислорода приводит к активации нитритредуктазной компоненты цикла. Считается, что циклизация метаболических путей обеспечивает высокую степень упорядоченности и связанности систем биохимических реакций. Таким образом, механизм циклических превращений для NO и других высокореакционных азотсодержащих соединений гарантирует не только их эффективную переработку, но и достаточно быстрое выведение путем превращения в менее активные вещества, например ионы NO-2 и NO-3[3].
Методы определения оксида азота
Описанные в литературе методы определения NO можно условно разделить на прямые (таблица 2) и косвенные (таблица 3). В число первых входят те, с помощью которых осуществляется непосредственная регистрация NO, либо его комплексов. Прежде всего, это метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) как средство изучения молекул с неспаренным электроном. Предложено использовать в качестве индикаторов NO регистрируемые методом ЭПР нитрозильные железосодержащие комплексы, устойчивые в биологически активных средах [1].
В живой ткани SH-содержащие белки, пептиды и аминокислоты образуют такие парамагнитные аддукты общего состава Fe(NO)2(SR)2, спектры ЭПР которых являются ассиметричными вариацией g-фактора от 2.01 до 2.05. однако из-за большого разнообразия естественных акцепторов NO и вариабельности их содержания, количественное определение этого радикала таким образом вряд ли возможно. В то же время гемопротеиды (гемоглобин, миоглобин, цитохром а3 и др.) образуют нитрозильные парамагнитные комплексы, имеющие широкий спектр ЭПР [1].
С разрешенной сверхтонкой структурой (СТС) в области значений g-фактора меньше 2. Анализ полученных спектров ЭПР свидетельствует о том, что структура указанных комплексов имеет ромбическую симметрию [13].
Таблица 3. прямые методы регистрации оксида азота[1].
Инструментальный методСоединение-индикатор/реакция-индикаторЧувствительностьЭПРFe-(NO)2-(SR)2ЭПРHb-Fe(II)-NO5 мкМЭПР(ДТК)2-Fe(II)-NO1 мкМЭПР, L-линияФьюзинит-NO1 мкМХемилюминесценцияNO + O3 = h? + NOx20 нМАмперовольтметрияNO + e = NOx10 нМ
Более перспективным представляется метод с использованием карбоксигемоглобина в качестве экзогенной спиновой ловушки оксида азота. На состояние Hb-Fe(II)-CO не оказывает влияния степень оксигенации среды, а поскольку прочность связывания NO с гемоглобином на три порядка больше, чем прочность связывания СО, то можно ожидать практически количественного образования нитрозил-гемоглобина. Следует, однако, отметить, что гемоглобин или его производные имеют ряд особенностей, ограничивающих применение их в качестве естественной или экзогенной спиновой ловушки. Проникновение крупных молекул в клетки к месту синтеза оксида азота крайне затруднено, поэтому включаться в комплекс и становиться ЭПР-видимой будет лишь часть оксида азота, не метаболизированная в период диффузии. Кроме того, недостаточно определены пути и скорости дальнейших превращений Hb-Fe(II)-NO в живой клетке [1].
При прямом определении NO методом ЭПР-спектрометрии перспективным представляется использование в качестве спиновой ловушки производных дитиокарбаминовой кислоты (ДТК). В организме они образуют ЭПР-видимые комплексы состава (ДТК)2-Fe-NO, включающие в себя свободное железо [14]. Эти комплексообразователи позволяют изучать образование оксида азота в тканях животных, в гомогенах, в культуре клеток и биологических жидкостях. Важно, что при оптимальных нетоксичных концентрациях ДТК их высокая скорость взаимодействия с NO существенно снижает вероятность реакции оксида азота с другими биомолекулами, в том числе с радикалами, и тем самым ограничивает влияние этих реакций на результаты ЭПР-спектрометрии [1].
Предложен оригинальный метод ЭПР-дозиметрии NO, в котором применена спиновая макроловушка - фьюзиниты. Это частицы размером 10 мкм, выделяемые из угля. Они обладают способность поглощать оксид азота с изменением характеристик собственного ЭПР-спектра. Не подвергаясь метаболизму, они не оказывают токсического действия на клетки, и после поглощения путем фагоцитоза могут быть использованы в качестве аналитического средства, специфического к оксиду азота [1].
Наиболее чувствительным среди методов определения NO в организме или в клеточных системах является электрохимический метод. Он основан на каталитическом окислении оксида азота полимерным металлопорфирином (полупроводником n-типа), которое протекает при 630 мВ. Диаметр электрода мо