Иммуноблотинг при диагностике губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота

Информация - Сельское хозяйство

Другие материалы по предмету Сельское хозяйство

?и 1-2 см от края геля.

Блотинг.

Подготовительные этапы:

необходимо смочить PVDF-мембрану (Millipore, Immobilon-P, 0,45 мкм) метанолом в течение нескольких секунд, затем поместить в буфер для блотинга на 10 мин;

камеру для блотинга следует наполнить охлаждённым (+4 С) буфером для блотинга.

 

Состав буфера для блотинга (10х):

Трис 30,28 гГлицин144,13 гДистиллированная водадо 1000 мл

Перед использованием к 100 мл 10х буфера для блотинга добавляют 900 мл дистиллированной воды и 100 мл метанола. Хранят при + 4 С.

Сборка сэндвича" для блотинга:

на губку помещают лист фильтровальной бумаги, смачивают его бидистиллированной водой, и наверх кладут мембрану;

извлекают гель из рамки, удаляют его верхнюю часть, содержащую прорези, и нижнюю часть ниже фронта краски. Гель аккуратно помещают на мембрану, избегая попадания пузырьков воздуха между ними. До 6 гелей может быть помещено на 1 мембрану размером 15 х 18 см;

наверх на гели кладут смоченный бидистиллированной водой лист фильтровальной бумаги, затем - губку;

Собранный сэндвич помещают в пластиковую кассету, закрывают её и помещают в камеру для блотинга. Кассету следует вставлять таким образом, чтобы PVDF-мембрана была обращена к положительному полюсу, а гели - к отрицательному (рис.9).

Блотинг проводят при 150 V в течение 1 часа при +4 С при постоянном охлаждении.

Окраска белков. Мембрану удаляют и окрашивают связавшиеся с ней белки при помощи Ponceau S. Затем мембрану промывают буфером TBST до исчезновения красной окраски.

Состав буфера TBST:

NaCl8,0 гKCl0,2 гТрис3,0 гДистиллированная вода до 1000 млТвин-200,5 млбуфера TBST доводят до 7,4 при помощи соляной кислоты.

Обработка антителами.

Блокирование. Для блокирования неспецифически связывающих участков мембраны её инкубируют с блокирующим буфером (5% раствор сухого молока в фосфатном буфере) в течение 0,5 часа при комнатной температуре с постоянным помешиванием на качающейся платформе.

Обработка первыми антителами. После блокирования неспецифически связывающих участков мембраны на неё наносят сыворотки, специфичные к прионному белку. Для этого используют:

поликлональные антисыворотки к тканям мозга крупного рогатого скота;

-моноклональные антитела - 6Н4, SAF 70, F89/160.1.5.

Применение поликлональных антител снижает чувствительность реакции и ее специфичность из-за наличия в ней антител к тканям мозга, которые взаимодействуют с неразрушенными протеиназой К отдельными белками мозга крупного рогатого скота.

Для постановки реакции более эффективно использовать моноклональные антитела. Для этого 10 мкл мышиных моноклональных антител растворяют в 50 мл TBST (разведение 1: 5000). В полученный раствор антител помещают мембрану и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа (или 12-18 часов при +4 С) с постоянным помешиванием на качающейся платформе. Мембрану промывают TBST 3 раза по 5 мин.

Детекцию реакции можно проводить путем использования антимышиных антител, меченных щелочной фосфатазой или пероксидазой хрена.

Обработка коньюгатом со щелочной фосфатазой.10 мкл антител козла против иммуноглобулинов мыши, меченных щелочной фосфатазой растворяют в 50 мл TBST (разведение 1: 5000). В полученный раствор антител помещают мембрану и инкубируют при комнатной температуре в течение 0,5 часа с постоянным помешиванием на качающейся платформе. Мембрану промывают TBST 5 раз по 5 мин.

Обработка коньюгатом с пероксидазой хрена. Проводится аналогично обработке коньюгатом со щелочной фосфатазой.

Проявление реакции.

Нанесение субстратной смеси для индикации щелочной фосфатазы. Мембрану помещают на 5 мин в 50 мл люминесцентного буфера. Растворяют 100 мкл CDP-Star (12,5 мМ, 50-кратный концентрат) в 5 мл люминесцентного буфера. Мембрану помещают на стекло, на её поверхность наносят 5 мл раствора CDP-Star, распределяют его равномерно по всей поверхности мембраны и инкубируют 5 мин при комнатной температуре. С поверхности мембраны удаляют субстрат при помощи мягкой ткани. На мембрану в темноте или при красном свете накладывают рентгеновскую плёнку, помещают в светонепроницаемую кассету и выдерживают при комнатной температуре примерно 5 мин. Рентгеновскую плёнку проявляют и проводят интерпретацию полученных результатов.

Нанесение субстратной смеси для индикации пероксидазы хрена. Реакция визуализируется путем нанесения на мембрану субстратной смеси (раствор диаминобензидина 0,5 мг/мл и перикиси водорода 0,5 мг/мл в фосфатном буферном растворе pH 7,4) до появления полос. Реакция останавливается промыванием мембраны водой. После высушивания мембраны на воздухе проводится учет результатов.

Фосфатный буферный раствор 0,1 М, рН 7,4:

NaCl 8,0 гKH2PO4 0,2 гNa2HPO4 2,8 гKCl0,2 гВода дистиллированная До 1000 мл

Учёт и интерпретация результатов

 

При использовании конъюгата со щелочной фосфатазой. Контрольный образец даёт на рентгеновской плёнке тёмную линию в районе 32-35 kDa, отрицательные пробы не дают сигнала, либо наблюдается темная чёрточка протеиназы К в районе 31 kDa, положительные пробы дают тёмную линию в районе 27-30 kDa.

При использовании конъюгата с пероксидазой. После обработки субстратной смесью мембрана приобретает светло-коричневую окраску за счёт взаимодействия с субстратной смесью неспецифически связавшегося с мембраной конъюгата. Маркеры молекулярной массы видны в виде белых полос на светло-коричневом фоне. Контрольный образец даёт на мемб?/p>