Иммуноблотинг при диагностике губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота
Информация - Сельское хозяйство
Другие материалы по предмету Сельское хозяйство
пе блотинг аналогичен твердофазным иммунологическим тестам. После повторного отмывания лист нитроцеллюлозы помещают в кассету с рентгеновской плёнкой для авторадиографии. На проявленной плёнке видны полосы локализации антигена, связавшего меченые антитела. Метод более удобен при использовании конъюгатов с ферментом.
Принцип диагностики ГЭ КРС с помощью иммуноблотинга
Патологическая изоформа прионного белка (PrPSc) в отличие от всех остальных белков мозга устойчива к протеиназе К. Это свойство используется для его выделения: после обработки протеиназой К в пробе остаётся только PrPSc, если проба положительная, либо не остаётся никаких белков, если проба отрицательная.
Для определения молекулярной массы белков пробы после обработки протеиназой К проводят их электрофорез в агаровом или полиакриламидном геле. Скорость перемещения белков в геле при электрофорезе зависит от их заряда и молекулярной массы. С целью упрощения иммунодетекции разделённые в электрофорезе белки переносят из гелей на мембрану при помощи процедуры блотинга. Принцип её заключается в том, что белки извлекаются из геля под действием электрического поля и сразу же адсорбируются на мембране.
Для определения иммунологических свойств перенесенных на мембрану белков проводят обработку мембраны антителами, специфичными к PrPSc, затем промывают антивидовыми антителами, мечеными ферментом. При нанесении на мембрану субстратной смеси она разлагается ферментом с образованием окрашенного или люминесцирующего продукта реакции, в зависимости от вида применяемых ферментов и субстратных смесей. Если на мембране присутствует PrPSc, происходит связывание с ним вначале первых, а затем вторых антител. При разложении ферментом, коньюгированным со вторым антителом субстратной смеси, окрашенный, либо люминесцирующий продукт реакции образуется в месте расположения прионного белка.
Таким образом, PrPSc выявляется в иммуноблотинге с учётом трёх характеристик: устойчивости к протеиназе К, определённого размера молекул при электрофорезе (27-30 kDa) и связывания со специфическим антителом.
Техника постановки иммуноблотинга состоит из следующих этапов:
отбор проб;
гомогенизация пробы;
ферментное разрушение пробы;
электрофорез;
блотинг;
обработка антителами;
проявление реакции;
учёт реакции;
интерпретация результатов.
Техника постановки иммуноблотинга
Отбор, гомогенизация и ферментное разрушение пробы.
Отбор проб. Для диагностики губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота используется продолговатый мозг животных. Отбор проб производится через отверстие затылочной кости с помощью специальной ложечки.
Гомогенизация. Кусочек продолговатого мозга из области задвижки массой 0,45-0,7 г помещают в 50 мл пробирку и с помощью весов определяют точный вес пробы. К кусочку мозга добавляют 10-кратный объём буфера для гомогенизации. Затем проба гомогенизируется в течение 1 мин при помощи гомогенизатора при 20000 об/мин.
Ферментное разрушение. В связи с тем, что прион PrPSc устойчив к протеиназе К, важным моментом является его ферментация. Для этого в 96-луночный планшет с объемом лунки 0,2 мл для ферментного разрушения вносят по 100 мкл каждого гомогената, добавляют 10 мкл протеиназы К (20 ЕД/мл) и хорошо перемешивают пипетированием. Ферментное разрушение проводят при 48С в течение 40 мин. После инкубации добавляют 10 мкл останавливающего раствора для остановки протеолитической реакции.
Электрофорез.
Принцип электрофореза белков в геле основан на явлении пространственного разделения белков при их движении в электрическом поле. Белки, как биополимеры, обладающие зарядом, перемещаются в электрическом поле в направлении противоположно заряженного полюса. При этом скорость миграции белков в геле зависит от их заряда и молекулярной массы. Поскольку эти характеристики различны у разных белков, методом электрофореза можно добиться разделения сложной белковой смеси на отдельные белки.
Денатурация. Денатурация белков приводит к нарушению вторичной и третичной структур белка, разворачиванию" молекулы. При этом заряд белка, его линейные размеры и, следовательно, скорость миграции белков в геле становятся прямо пропорциональны их молекулярной массе, что даёт возможность точно её определить, сравнивая электрофоретическую подвижность исследуемого белка с электрофоретической подвижностью белков с известной молекулярной массой. Для этого к разрушенным протеиназой К пробам добавляют PAGE-буфер по 100 мкл на лунку с целью подготовки проб для электрофореза, хорошо перемешивают пипетированием и инкубируют при 96С в течение 5 мин. Контрольный образец инкубируют при 65С в течение 2 мин. Старые пробы, которые уже были проинкубированы при 96С в течение 5 мин, также инкубируют при 65С в течение 2 мин.
Состав буфера для подготовки проб для электрофореза (40 мл):
Нанесение исследуемых проб на гель.10 мкл контрольного образца наносят на первую дорожку геля. На остальные дорожки наносят по 10 мкл исследуемых проб. Внутреннюю и наружную камеры электрофоретической камеры заполняют буфером для электрофореза NuPAGE MOPS/SDS и добавляют 500 мкл антиоксиданта (NOVEX) только во внутреннюю камеру (рис.7).
Состав буфера для электрофореза:
Электрофорез. Электрофорез проводят при 200 V в течение 30 мин, пока краска не окажется на расстоян?/p>