Генетика и биохимия микробного синтеза полигидроксиалканоатов
Курсовой проект - Биология
Другие курсовые по предмету Биология
тся синтез полимера, растворимая форма фермента переводит мономер-КоА в олигомер, далее фермент-олигомерный комплекс образует мицеллу с локализацией фермента на поверхности. Гидрофобные участки полимерной цепи находятся внутри мицеллы и отделены от цитозоля. В этих условиях происходит быстрое удлинение полимерной цепи и формируется гранула. Размер гранул зависит от количества ПГА-синтазы в клетке, так как концентрация фермента может определять количество зарождаемых гранул.
Рис.4 Механизм формирования гранул ПГА.
Прежде всего, растворимая ПГБ-синтаза взаимодействует с возрастающими концентрациями 3-оксибутирил-КоА в цитоплазме, приводя к праймингу фермента известным механизмом. В течение начальной лаг-фазы оксибутират олигомеры формируются медленно и вытесняются из фермента. С увеличением длины олигомера затем формируются мицеллы. Мицелло-подобные частицы дают границу раздела фаз с полимеразой, расположенной внутри. Фермент затем быстро продолжает ПГБ-синтез, вытесняя большее количество ПГБ в возрастающую гранулу.
1.4 Организация генов биосинтеза ПГА
полигидроксиалканоат фермент биосинтез ген
В последние годы в результате достижений в области молекулярно-генетических исследований и детального исследования системы синтеза полигидроксиалканоатов появились перспективы для получения рекомбинантных штаммов как более эффективных продуцентов биополимеров. На этом пути, ориентированном на получение высокопродуктивных биосинтетиков ПГА с использованием разнообразных источников углерода, возможны два направления. Первое предполагает интродукцию субстрат-утилизирующих генов в бактериальные штаммы, синтезирующие ПГА для расширения их трофического потенциала. Второе использует гены системы синтеза ПГА для интродукции их в быстрорастущие микроорганизмы, не синтезирующие полигидроксиалканоаты, но характеризующиеся широким органотрофным потенциалом. К настоящему моменту гены синтеза ПГА клонированы из нескольких десятков бактерий, что позволило получить разнообразные в таксономическом отношении продуценты полимеров, а также организмы, обладающие способностью синтезировать совершенно новые типы ПГА.
Первый phb ген, выделенный из бактерии Z. ramigera, был интересен для биополимерной инженерии тем, что продуцировал P(3HB) и внеклеточный полисахарид. При использовании анти-тиолазных антител phbA ген, несущий в Z. ramigera генную библиотеку, был обнаружен в Escherichia coli и впоследствии клонирован. Установили, что phbA и phbB гены формируют оперон, в то время как phbC расположен в другом месте на хромосоме Z. ramigera. Клонирование phbA и phbB облегчило расшифровку закодированных кетоацил-КоА - тиолазы и ацетоацил-КoA - редуктазы, благодаря тому что выяснили кинетическую и механистическую характеристики этих ферментов. Начиная с первоначального открытия этих phb генов, было установлено, что многие гены кодировали ферменты, участвующие в метаболизме ПГА, которые были клонированы из различных организмов. Учитывая разнообразие путей биосинтеза P(3HB), не удивительно, что местоположение pha значительно изменилось. В Acinetobacter spp., Alcaligenes latus, Pseudomonas acidophila, и R. eutropha, phbCAB гены находятся в тандеме на хромосоме, хотя не обязательно в том же самом порядке. В Paracoccus denitrificans, Rhizobium meliloti, и Z. ramigera, оперон phbAB и ген phbC локализованы не сцепленно. ПГА-полимераза в Chromatium vinosum, Thiocystis violacea, и Synechocystis - это фермент состоящий из двух субъединиц, кодирующийся phbE и phbC генами. В этих организмах, phbAB и phbEC находятся в одном локусе, но ориентированы в разных направлениях. Рhb локализован в C. vinosum, P. acidophila, R. Eutropha, Rhizobium meliloti, и T. Violacea; все они имеют дополнительный ген, phbF, функция которого в метаболизме ПГА до настоящего времени не известна, в то время как часть гена, кодирующая белок гипотетически гомологичный к E. сoli, кодировала белок YfiH, расположенный в P. acidophila, R. eutropha, и Z. ramigera в генах P(3HB) - полимеразы. В Methylobacterium extorquens, Nocardia corallina, Rhizobium etli, Rhodococcus ruber, и Rhodobacter sphaeroides, был идентифицирован к настоящему времени только ген кодирования ПГБ - полимеразы. Ген синтеза ПГА-полимеразы в Aeromonas caviae - это уникальная сторона биосинтетического фермента ПГА, кодирующегося геном phaJ. В среднецепочечном ПГА, производящегося из P. okovorans и P. aeruginosa,оперон pha содержит два phaC гена отделенных от phaZ, который кодирует внутриклеточную ПГА - деполимеразу. Две ПГА полимеразы на 50 - 60 % идентичны в их первичной структуре и имеют очень похожую специфичность к субстрату.
Первые ПГА, выделенные из бактерии, использовали такой путь метаболизма, который не был направлен на воспроизведение генетической информации. Наиболее вероятно, что формирование ПГА в этих организмах не было основным путем метаболизма, а происходило только в результате побочных реакций.
В течение развития, phaC иногда объединялся с генами типа phbAB или phaJ, которые кодируют мономер, или с генами, вовлеченными в другие аспекты метаболизма PHA, типа phaZ. Активное давление на выборочные гены происходит тогда, когда проведено кластеризование pha генов в опероне в некоторых организмах (как в P.acidophila, R.eutropha, Acinctobacter, Alcaligenes latus, и Aeromonas caviae) или как отдельные транскрипционные модули в других (как в Z. ramigera, P. denitrificans, Rhizobium meliloti, C, vinosum, T. violacea, P. oleovorans, P. putida, и возможно в других микроорганизмах, для которых не были идентифицированы тиолазные и редуктазные гены). Вторая эволюционная сила, должна была, воздействовать на pha гены, так как некоторые из них, но не все, а только структурированые в различных местоположениях, содержат phbF и phbP гены или гомологи yfiH. Вопрос о том, была л