Генетика и биохимия микробного синтеза полигидроксиалканоатов
Курсовой проект - Биология
Другие курсовые по предмету Биология
±алансированном росте. Таким образом, синтез полимера, например, в R.eutropha начинается, когда ингибируются активности ферментов ЦТК (цитратсиназы и изоцитратдегидрогеназы). Это приводит к увеличению внутриклеточной концентрации ацетил-КоА, восстановленных пиридиннуклеотидов, снижению концентрации свободного кофермента А и окисленных форм нуклеотидов. Сходный контроль ферментативной активности на уровне метаболитов был подтверждён на рекомбинантном штамме E.coli, трансформированном генами синтеза полимера из R.eutropha.
На первых порах в R.eutropha было обнаружено две ?-кетотиолазы. Уровень ферментативной активности кетотиолаз в клетках, выращенных в условиях лимитирования роста азотом или углеродом, одинаков (0,20 и 0,27 U/мг белка, соответственно). Это позволило авторам сделать вывод о конститутивной природе фермента. Было установлено, что две кетотиолазы отличаются субстратной специфичностью. Так ?-кетотиолаза А активна с ацетоацетил-КоА и 3-кетопентаноил-КоА и является главным претендентом на участие в синтезе субстратов для ПГА. Субстратная специфичность ?-кетотиолазы В оказалась более широкой, фермент активен с длинноцепочечными 3-кетоацильными производными КоА от 4 до 10 атомов углерода. Было высказано предположение, что эта кетотиолаза является ферментом ?-окисления жирных кислот. Участие кетотиолазы В в синтезе субстратов для образования полимера было подтверждено на рекомбинантных штаммах Escherichia coli, дефектным по генам, ответственным за деградацию жирных кислот и транспорт пропионата, и содержащим оперон синтеза полимера из A.eutrophus без гена кетотиолазы (phaA). В дальнейшем из R.eutropha были клонированы три последовательности, кодирующие три ?-кетотиолазы. Было установлено, что ?-кетотиолаза, кодируемая phaA геном, является ?-кетотиолазой А и высокоактивна с ацетоацетил-КоА. Вторая ?-кетотиолаза, являющаяся продуктом bktB гена, отвечает преимущественно за синтез кетовалерил-КоА и в меньшей степени - кетогексаноил-КоА, а также, возможно, соответствует ?-кетотиолазе В и участвует в ?-окислении коротко- и среднецепочечных жирных кислот. Функция третьей кетотиолазы пока до конца не выяснена, но она также активна с ацетоацетил-КоА как субстратом. Участие ?-кетотиолазы В в синтезе полимера было подтверждено в работе. Авторы установила, что в условиях блокирования ?-окисления жирных кислот в клетках R.eutropha создается пул среднецепочечных 3-гидроксикислот, служащих субстратом для синтеза ПГА. В результате клетки накапливают гетерополимерные ПГА с включением гидроксигексаноата до 7-10 мол.%.
Известно, что пул ацетил-КоА (основного субстрата ?-кетотиолазы) формируется в клетках R.eutropha в результате катаболизма жирных кислот, аминокислот и углеводов. В условиях дефицита азота в среде в клетках синтезируется гомополимер оксимасляной кислоты. Синтез гетерополимерных ПГА обычно наблюдается при добавлении в среду жирных кислот или других альтернативных ко-субстратов. Однако, мутант A.eutrophus с измененным анаболизмом разветвленных аминокислот синтезировал многокомпонентные ПГА без добавок в культуральную среду жирных кислот. Это объясняется тем, что при катаболизме валина, треонина и изолейцина образуется пропионил-КоА, вступающий в реакцию конденсации с ацетил-КоА, при этом в кетотиолазной реакции образуется 3-кетовалерат-КоА, восстанавливающийся далее до соответствующей гидроксикислоты - субстрата ПГА-синтазы.
Таким образом, в R.eutropha обнаружено, по крайней мере, три кетотиолазы, отличающейся своей специфичностью к субстратам. Продукты всех кетотиолаз используются в синтезе ПГА. Фермент играет ведущую роль в клеточном метаболизме, так как именно он, реагируя на уровень ацетил-КоА и КоА в клетке, включает синтез запасного материала - ПГА.
На втором этапе синтеза ПГА происходит восстановление продуктов, полученных в кетотиолазной реакции, до гидроксикислот. Это реакция катализируется вторым ферментом биосинтетического пути ПГА - ацетоацетил-КоА-редуктазой. В R.eutropha обнаружено две редуктазы - НАДН - и НАДФН-зависимые. В синтезе полимера участвует только НАДФН-зависимая ацетоацетил-КоА редуктаза. Фермент отличается высокой специфичностью к длине цепи кетоацил производных КоА и активен с 3-гидроксиацил-КоА с длиной цепи от 4 до 6 атомов углерода. Высокая специфичность редуктазы из R.eutropha к длине цепи субстрата была подтверждена в более поздних работах с рекомбинантными штаммами Е. coli. Критическим фактором, определяющим активность фермента, является соотношение НАДФН/НАДФ. При высоких значениях этого соотношения активность фермента возрастает. Установлено, что скорость синтеза полимера в R.eutropha, выращиваемого на различных источниках углерода, строго зависит от концентрации в клетке НАДФН. Эти данные подтверждают ранее выдвинутое предположение о том, что редуктаза определяет скорость синтеза полимера в клетке.
Третьим ключевым ферментом биосинтеза, определяющий тип ПГА, является ПГА - синтаза.
Таким образом, в синтезе полигидроксиалканоатов участвуют три фермента. Первые два отвечают за синтез субстратов, причем кетотиолаза включает синтез полимера. ПГА - синтаза определяет количество и качество синтезированного ПГА.
1.3 Свойство и структура ПГА - синтазы, выделенной из R.eutropha
В настоящее время выделено и охарактеризовано более 50 структурных генов синтаз из разных микроорганизмов. ПГА - синтаза из R.eutropha состоит из одного типа субъедениц с молекулярной массой около 64 кДа и кодируется геном phbC. В клетке ПГА - синтаза находится в дву?/p>