Генетика и биохимия микробного синтеза полигидроксиалканоатов
Курсовой проект - Биология
Другие курсовые по предмету Биология
ся при переработке полигидроксиалканоатов, которые хорошо формуются из растворов и расплавов. Гомогенный полигидроксибутират по механическим свойствам сходен с полипропиленом и полистерином, однако обладает лучшими газобарьерными свойствами (например, по отношению к кислороду) и большей устойчивостью к ультрафиолету, характеризуется также хорошей водостойкостью и теплоустойчивостью, при этом проницаемость водяного пара через него втрое ниже по сравнению с полипропиленом [1].
Температура плавления ПГА=180 ?, - 200 ?, 50-80%, 100-800 кДа. Преимущества разработки ПГА заключается в том, что они нетоксичны и биосовместимы; разрушаются в биологических средах до конечных продуктов (СО2 и Н2О); обладают антиоксидантными свойствами и пьезоэлектрическим эффектом; термопластичны, перерабатываются в изделия (пленки, полые формы, нити) из порошков, растворов и расплавов; не требуют технологических добавок; подлежат стерилизации общепринятыми методами; для синтеза используют доступные и дешевые отечественные реагенты.
Основное ограничение для коммерческой эксплуатации бактериального ПГА - высокая промышленная стоимость относительно этого для получения нефтяных товарных пластмасс, типа полиэтилена. Именно в этой перспективе синтез ПГА в генетически проектируемых предприятиях был замечен как перспективный подход для производства разлагаемых микроорганизмами полимеров на крупном масштабе и за низкую цену [15].
Среди охарактеризованных к настоящему времени полигидроксиалканоатов выделено несколько групп полимеров. Основные структуры ПГА можно иллюстрировать следующей схемой, показанной на рис.1:
n=1 R= водород поли (3-гидроксипропионат)
R= метил поли (3-гидроксибутират)
R= этил поли (3-гидроксивалерат)
R= пропил поли (3-гидроксигексаноат)
R= пентил поли (3-гидроксиоктаноат)
R= нонил поли (3-гидроксидодеканоат)
n=2 R= водород поли (4-гидроксибутират)
n=3 R= водород поли (5-гидроксивалерат)
Рис.1. Основные типы структуры полигидроксиалканоатов
1.2 Метаболические пути синтеза
На примере наиболее изученного из ПГА - полимера ?-оксимасляной кислоты установлено, что пути его синтеза практически одинаковы у различных микроорганизмов (Alkaligenes, Azotobakter, Pseudomonas).
Рис.2. Биосинтез P (3HB-4HB) в рекомбинантном E. coli при использовании гетерологичных генов от Clostridlum kluyveri.
HB мономер в синтезе P (3HB-4I IB) получен из сукцината. В сукцинате преобразовывают 4HB-CoA ферменты, которые образовывают дугу закодированный генами от грамположительного, строго анаэробного C. kluyveri микроба.
В биосинтезе полигидроксиалканоатов ключевыми являются три фермента: ?-кетотиолаза, ацетоацетил-КоА-редуктаза и ПГА-синтаза, которые кодируются соответственно генами phbA, phbB, phbC (Рис.3). Регуляция процесса синтеза ПГА может осуществляться на нескольких уровнях: на уровне экспрессии генов специфическими факторами среды (например, недостаток питательных элементов) или на уровне регуляции активности ферментов специфическими клеточными компонентами, являющимися их субстратами или ингибиторами. Возможен смешанный тип регуляции активности ферментов, участвующих в метаболизме ПГА. В самых первых работах, посвященных изучению механизма синтеза ПГА, было показано, что регуляция синтеза ПГА у R.eutropha осуществляется метаболитами на ферментативном уровне при ведущей роли внутриклеточной концентрации свободного коэнзима А, который ингибирует кетотиолазную реакцию у A.eutrophus, у Azotobacter beijerinckii, а также у Zoogloea ramigera. Установлено, что синтез ПГА стимулируется высокой внутриклеточной концентрацией НАДФН и высоким соотношением НАДФН/НАДФ.
Рис.3. Схематичное изображение генов ферментов синтеза ПГА и продуктов их экспрессии.
?-кетотиолаза является первым ферментом синтеза полимера и катализирует конденсацию двух молекул ацетил-КоА, фермент также катализирует последнюю реакцию в процессе эндогенной деградации полимера. Таким образом, этот фермент играет ключевую роль в циклическом метаболизме полимера. Активность фермента не ингибируется физиологическими концентрациями метаболитов клетки, но реакция конденсации резко снижается при накоплении свободного КоА. Эффект ингибирования свободным КоА синтеза полимера является очень важным аспектом метаболической регуляции клетки, так как в условиях повышенных концентраций свободного КоА субстраты используются главным образом в биосинтетических реакциях, приводящих к синтезу белков, нуклеиновых кислот и других первичных макромолекул. При этом ацетил КоА используется в основном цикле трикарбоновых кислот (ЦТК), где на первом этапе цикла цитратсиназа высвобождает свободный КоА. В этих условиях внутриклеточная концентрация свободного кофермента значительно выше, чем в условиях несбалансированного роста. В результате высокий уровень КоА ингибирует активность ?-кетотиолазы и в конечном итоге,- синтез полимера. О регуляторной роли ЦТК в направлении потоков ацетил КоА в клетке свидетельствуют данные, полученные на мутанте R.eutropha, лишенного изоцитратдегидрогеназной активности, который синтезирует со значительно большей скоростью, чем дикий штамм. Вместе с тем, показано, что активность первых двух ферментов ЦТК ингибируется повышенными концентрациями восстановленных никотинамидных нуклеотидов при нес?/p>