Выделение чистых культур дрожжевых грибов из шишек хмеля
Дипломная работа - Биология
Другие дипломы по предмету Биология
?одную воду, в которую иногда добавляют поверхностно-активные вещества (например, Твин-80, 1капля на 0,5 л), 0,5%-ный раствор NaCl в дистиллированной воде (при выделении психрофильных дрожжей).
Высев на плотные питательные среды из подготовленной суспензии делают пипеткой, внося в каждую чашку по 0,5 мл или по одной капле измеренного объема. Чашек берут всегда не менее трех для каждого разведения, чтобы получить среднее число колоний на одной чашке.
После посева чашки инкубируют 24 ч в обычном положении, чтобы агар адсорбировал жидкость, а за тем перевертывают во избежание попадания на поверхность капель конденсата с крышки.
При инкубировании посевов большое значение имеет поддержание определенной температуры. Преобладающее число видов дрожжей относится к группе мезофильных микроорганизмов с температурными границами роста от 2 5 до 30 37С и оптимумом при 26 28С. Среди дрожжей нет истинных термофилов, для роста которых требуются температуры выше 50С. При выращивании дрожжей при температуре 40 45С необходимо добавлять в среду олеиновую кислоту.( Жвирблянская А.Ю., Исаева В.С.)
Подбор температурных условий при выделении дрожжей зависит от источника выделения и целей исследования. Из теплокровных животных и из различных органов человека и связанных с ним субстратов дрожжи выделяют при 37С, если хотят найти патогенные формы, и при 28С в случае поиска сапрофитных видов. Если дрожжи растут при 37С, то требуется соблюдать осторожность, так как среди них могут быть патогенные Cryptococcus neoformans или Candida albicans (=Syringospora albicans).
Посевы из материала, где предполагается наличие психрофильных дрожжей, инкубируют в холодильнике при температуре 4 5С.( Коновалов С.А. 1967).
Сроки инкубирования непосредственно зависят от температуры. При 37С инкубируют не более 4, а в холодильнике не менее 14 сут. Если дрожжи дают визуально заметный рост при 4 5С в течение 7 10 дней, то их относят к истинным психрофилам при условии, что выше 20С они не растут. Температурный оптимум таких дрожжей находится обычно в диапазоне от 10 до 15С. Психротолерантные дрожжи вырастают при 5С в течение 2 3 недель, а психрофобные при температуре ниже 30С не растут совсем. В посевах из почвы, инкубируемых при низких температурах, удается учесть в 2 3 раза больше дрожжей, чем при 28С, так как росту дрожжевых колоний при этом не мешают грибы с быстро распространяющимся мицелием. Учет опытов в этих случаях следует производить дважды через две недели и через месяц.
Стандартные полноценные питательные среды. Эти среды применяют с целью наиболее полного учета и выделения большинства видов дрожжей. Наиболее широко используемой полноценной средой для выращивания дрожжей является солодовое сусло. В его состав входят глюкоза, фруктоза, сахароза, мальтоза, мальтотриоза и мальтотетраоза, а также небольшое количество пентоз арабиноза, ксилоза и рибоза. Азотные компоненты составляют 6 7% сухих веществ (СВ), среди них аммонийного азота 2,18 2,44 мг на 100 мл. В сусле имеются аминокислоты, все основные витамины группы В и минеральные вещества, содержание которых зависит от используемой воды.( Бабьева И.П., Голубев В. И.).
Сусло получают с пивоваренных заводов неохмеленное, после фильтрации. Его разводят водопроводной водой до концентрации 6 8% СВ.
Для приготовления сусла в лаборатории используют ячменный солод крупного помола с высокой осахаривающей способностью. В 1 л воды вносят 250 г солода и нагревают до 50С. Через 30 мин постепенно поднимают до 62,5 63С и не снижают до исчезновения реакции на крахмал (йодная проба). Полученное сусло отделяют от дробины путем фильтрации через марлю и вату, разбавляют водой до нужной концентрации, разливают по колбам и стерилизуют при 112С 30 мин. Если рН ниже 5,5, то сусло подщелачивают 10%-ным раствором соды или едкого кали до получения рН 5,6 6,0. Сусло очищают от примесей кизельгуром или отстаиванием в холодильнике с фильтрацией. Для приготовления плотных сред к суслу перед стерилизацией добавляют 2% агара или 20% желатины.( Быков В. А.).
Сусло-агар можно приготовить из сухого солодового экстракта, 20 г порошка растворяют в 400 мл горячей дистиллированной воды, содержащей 12 г агара, и стерилизуют при 121С 15 мин.
Из синтетических сред наиболее часто для дрожжей используют агар Сабуро, называемый также глюкозо-пептонной средой, со следующим составом(в г на 1 л водопроводной воды): глюкоза 40, пептон 10, агар 20.
Глюкозо-аммонийная среда содержит (в г на 1 л водопроводной воды) следующие вещества: Глюкоза ? 20,0; (NH4) 2SO4 ? 5,0; KH2PO4 ? 0,85; K2HPO4 ? 0,15; MgSO4 ? 0,5; NaCl ? 0,1; CaCl2 ? 0,1; Агар ? 20,0;
Для обогащения факторами роста к этим средам добавляют иногда дрожжевой (0,2%) и мясной (0,3%) экстракты и виноградный сок (3%).
Дифференциальные среды. Их используют при выделении дрожжей из субстратов, сильно загрязненных другими микроорганизмами. Для подавления роста сопутствующих микроорганизмов к указанным выше питательным средам добавляют различные ингибиторы. Рост большинства бактерий и актиномицетов подавляется при низком значении рН среды, поэтому чаще всего среды для выделения дрожжей подкисляют до рН 4,5 путем добавления к ним органических кислот. Для синтетических сред наиболее применима соляная кислота, для сусловых молочная, лимонная или винная. Для подкисления заводского солодового сусла (6 8% СВ) обычно требуется 3 4 мл/л концентрированной молочной кислоты. Кислоты добавляют в жидкую или расплавленную агаровую среду после стерилизации, непосредственно перед засевом или п