Влияние гуминовых кислот как стимуляторов роста растений на характер белкового и углеводного обмена растений пшеницы in vitro
Дипломная работа - Биология
Другие дипломы по предмету Биология
ллилитрами 80% этанола, нагретого до 70С. Экстракт вместе с растительными остатками помещали в центрифужные пробирки и центрифугировали в течение 5 минут при 5000 оборотах/мин. Надосадочную жидкость сливали в мерную колбу на 25 мл, так чтобы не попали растительные остатки. К осадку, который остался в центрифужных стаканах, приливали 5 мл 80% этанола (нагретого), тщательно перемешивали и вновь центрифугировали. Данную операцию повторяли 5-6 раз, до полного извлечения сахаров и доведения до метки.
Брали вытяжку сахара (1 мл) и разбавляли 1 мл спирта (80% нагретого).
Из полученного соотношения вливали в пробирку 1 мл 5% фенола (свежеприготовленного). И осторожно в центр пробирки приливали 2 мл Н2SO4 концентрированной. Через 30 минут определяли оптическую плотность при 440 нм.
Содержание сахаров расiитывается по заранее построенным калибровочным кривым, для которых используют стандартные растворы сахаров. Калибровочная кривая состоит из смеси глюкозы, фруктозы и сахарозы в соотношении 1: 1: 1.
2.4 Выделение суммарных белков
Для выделения всех белковых веществ использовали щелочные растворы, в которых большинство белков довольно хорошо растворяются.
Для извлечения белков из свежего растительного материала навеску листьев, стеблей промораживали в холодильнике (1 сутки). Затем измельчали в гомогенизаторе или растирали iетырехкратным (по массе) количеством буфера (рН=10,0). Гомогенат промораживали в холодильнике, и, после оттаивания, встряхивали на механической мешалке в течение 1-2 часов, затем центрифугировали в течение 5-10 минут при 3000 об/мин. Жидкость над осадком сливали, а остатки клеток вновь гомогенизировали или растирали в ступке с прокаленным песком. Затем гомогенат снова встряхивали с буферным раствором в течение 20-30 минут и опять центрифугировали. Такую экстракцию проводили 5-6 раз. Общий объем экстракта доводили буферным раствором до 25 мл [7].
Боратный буфер (рН=10,0):
Раствор 5: NaOH 0,1Н
Раствор 8: тетроборат Na 0,05М (12,367 г Н3ВО3 + 100 мл 1Н раствора NaOH в 1 л).41 мл раствора 5 доводили до 100 мл раствором 8.
Определение содержания белка по биуретовой реакции [10].
Биуретовый реактив: растворяли в 250 мл воды 0,75 г CuSO45H2O и 3 г виннокислого натрия-калия (NaKC4H4O64H2O), затем при энергичном помешивании добавляли 150 мл 10 % -го раствора NaOH, свободного от Na2CO3, и 1 г KI для предотвращения самопроизвольного восстановления; объем раствора довели водой до 1 л.
К 1мл исследуемого раствора, содержащего 1-10 мг белка, прибавляли 4 мл биуретового реактива, перемешивали и оставляли стоять 30 минут при комнатной температуре. По истечении времени колориметрировали при ?=540 нм против воды. Содержание белка расiитывали по калибровочной кривой, составленной для альбумина: в серию пробирок вливали 0,1; 0,25; 0,5; 0,75 и 1,0 мл 1 % -го водного раствора яичного альбумина, содержащего от 1 до 10 мг белка, доводили объем раствора дистиллированной водой до 1 мл, перемешивали, добавляли в каждую пробирку по 4 мл биуретового реактива, перемешивали и через 30 минут колориметрировали.
2.5 Спектрофотометрический метод определения содержания зеленых пигментов
Содержание зеленых пигментов определяли спектрофотометрическим методом по молярным коэффициентам экстинции.
Для этого, определенную навеску сырого растительного материала заливали 5 мл.96% этанола и ставили на водяную баню (t=70 C) на 30 минут. После бани, полученный раствор помещали в холодильник на ночь для получения более полной экстракции хлорофилла [8].
Определение оптической плотности экстракта осуществляли на спектрофотометре (СФ-16), обладающем достаточной разрешающей способностью. Для вычисления концентрации пигментов, использовали формулы:
Ca = [13,7 (D665-D750) - 5.7 (D649 - D750)] V/m
Cb= [25.8 (D649-D750) - 7.6 (D665 - D750)] V/m,
где концентрации Са - концентрация хлорофилла а (мкг/мл), Сb - концентрация хлорофилла b (мкг/мл), D - оптическая плотность раствора при заданной длине волны, V - обьем навески (мл), m - масса навески (мкг) [25].
Глава 3. Результаты и обсуждение
Для построения калибровочных графиков измеряли оптическую плотность гуминовых кислот. Для этого брали 1 г коммерческого гумата "Гумат+С" (г. Иркутск), растворяли в 200 мл дистиллированной воды. Готовили ряд разведений, на основе которых строили калибровочный график при длинах волн 440 нм и 490 нм.
Рис.1. Калибровочный график измерения оптической плотности при длине волны 440
Рис.2. Калибровочный график измерения оптической плотности при длине волны 490
График показывает, что рабочий диапазон позволяет определить концентрацию гумата в пределах от 0 до 0,16 г/л.
Для извлечения гуминовых кислот из отработанного компоста после выращивания грибов (Agaricus bisporus) навеску 1 г растворяли либо в 50 мл 0.1 н раствора NaOH, либо в 50 мл дистиллированной воды. Экстракцию проводили на водяной бане в течение 1 часа. Суспензию центрифугировали при 5000 оборотах в течение 15 минут. Гомогенат анализировали на ФЭКе при длинах волн 440 нм и 490 нм.
Проростки растений, в зависимости от срока выращивания и концентрации гумата, даны в приложении.
Ростовые показатели растений представлены на рис.3 и рис.4
Рис.3. Общая масса растений пшеницы
Рис.4. Масса надземной части растений пшеницы
На рис.3 и рис.4 видно, что наибольшая масса растений пшеницы на 45 сутки вегетации, а наименьшая - на 14 сутки. За исключением растений, выращенных на среде