Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии

Морфология органов иммуногенеза нерпы байкальской и экспериментальная оценка эффективности ее липидов при разных патологиях

Автореферат докторской диссертации по биологии

СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА

Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |

 

Развитие воспалительной реакции в пораженном месте протекает в несколько стадий. В экспериментах на крысах было установлено, что липосомальное средство с включением жира нерпы обладало выраженным противовоспалительным действием на всех стадиях процесса воспаления, проявляя антиульцерогенные свойства, антиэкссудативное действие и пролиферативную активность.

Кроме того, при воспроизведении моделей острого перитонита было выявлено, что применение липосом приводило к уменьшению отека в брюшной полости за счет стимулирования грануляции тучных клеток, а также снижения проницаемость сосудов перитонеальной полости.

В опыте по воспроизведению острого адреналинового отека легких у мышей была выявлена значительная противоотечная активность исследуемых липосом, что выражалось в увеличении продолжительности жизни животных и уменьшении легочного коэффициента.

Как известно, мембраны играют ключевую роль как в структурной организации, так и в функционировании всех клеток. В зависимости от жирно-кислотного состава фосфолипидного бислоя мембран форменных элементов крови может меняться деформируемость и пластичность эритроцитов и тромбоцитов. На текучесть мембран в значительной мере оказывает влияние степень ненасыщенности высших жирных кислот. Известно, что ?-3 ПНЖК в значительно большей степени влияют на повышение текучести, чем ПНЖК ряда ?-6.

В экспериментах in vitro нами была установлена выраженная мембраностабилизирующая активность липосом, содержащих ПНЖК жира нерпы. Как показали исследования, липосомы оказывали протекторное действие на мембраны эритроцитов при их повреждении на моделях перекисного и осмотического гемолиза.

3.3.2. Биологическая активность липосом на основе липидов печени нерпы

С целью усиления фармакологических свойств липосом и более полного использования липидного сырья байкальской нерпы яичные фосфолипиды были заменены на фосфолипиды, выделенные из печени нерпы (Патент РФ №2308940). Преимуществом жира, содержащегося во внутренних органах, перед покровным, является наличие в нем фосфолипидов. Содержание фосфолипидов в печени нерпы составляет 4.7% от сухого остатка. Жирнокислотный состав липидов печени нерпы включает в себя более 25 ПНЖК, на их долю приходится 35.7% (в том числе эйкозапентаеновой - 0.44%, докозагексаеновой - 6.73%). При этом соотношение жирных кислот семейства ?-6/?-3 составляет 3.19:1, что позволяет отнести печень байкальской нерпы к числу перспективных источников биологически активных веществ (Кабирова И.Р., 2005).

В проведенных экспериментах было выявлено, что включение в состав липосом липидов печени нерпы приводило к усилению их иммуномодулирующей активности по сравнению с липосомами на основе яичных фосфолипидов. Причем максимальное увеличение иммуностимулирующего действия липосом на основе липидов печени было обнаружено в отношении антителообразования у спленоцитов (рис. 8).

Рис. 8. Сравнительная оценка иммунобиологической активности липосом

на основе различных фосфолипидов. За 100% приняты показатели иммунитета интактной группы животных

Проведенные исследования по оценке противовоспалительных свойств при воспроизведении двух моделей острого перитонита у крыс показали, что липосомы на основе фосфолипидов печени с добавлением жира нерпы, оказывали более сильное действие по сравнению с липосомами, полученными на основе яичных фосфолипидов, а также по сравнению с липосомами с добавлением рыбьего жира.

Установлено, что показатели стабилизации мембран эритроцитов под воздействием липосом из липидов печени при воспроизведении перекисного и осмотического гемолиза были достоверно выше (на 50% и 37.5% соответственно), чем в аналогичных опытах при введении липосом на основе яичных фосфолипидов, используемых в той же концентрации, что и фосфолипиды печени нерпы. Влияние липосом, полученных из фосфолипидов печени нерпы с жиром нерпы, на предотвращение осмотического гемолиза было достоверно эффективнее (на 26.5%) по сравнению с действием липосом с фармакопейным препаратом - рыбьим жиром, взятым в тех же концентрациях.

Известно, что в регуляции клеточных функций ведущее место играют про- и антиокислительные процессы. В эксперименте на лабораторных животных показано, что длительный холодовой стресс у крыс сопровождался накоплением МДА в крови и печени, а также повышением редокс-коэффициента (соотношения окисленного глутатиона к восстановленному) в крови. Выявлено, что введение экспериментальным животным липосомальной формы ПНЖК нерпы приводило к замедлению процессов ПОЛ в тканях крыс, при этом способствовало восстановлению глутатиона в крови и повышению активности основных ферментных биоантиоксидантов (каталазы, супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы).

На модели экспериментальной гиперхолестеринемии было выявлено, что введение крысам разработанных липосом способствовало регуляции липидного состава крови животных, при этом происходило понижение уровня как общего холестерина, так и холестерина липопротеинов низкой и очень низкой плотности с одновременным повышением уровня холестерина липопротеинов высокой плотности. Тем самым, коррекция дислипидемического состояния сопровождалась снижением риска атерогенности и агрегационного состояния тромбоцитарной системы крови.

3.4. Фармакотерапевтическая эффективность

ипосомальной формы липидов нерпы

В опытах по воспроизведению токсического гепатита у крыс была установлена выраженная холеретическая активность липосом, приготовленных на основе фосфолипидов печени байкальской нерпы, что выражалось в ускорении желчевыделительной функции печени крыс и повышении общего количества выделенной животными желчи. Наряду с ускорением холереза под влиянием липосом отмечены позитивные изменения и в биохимическом составе желчи, выражавшиеся в повышении концентрации общих желчных кислот и содержания билирубина в секретируемой желчи. Следует отметить, что липосомы проявляли выраженное гепатопротекторное действие, начиная с 7-х суток наблюдения, тогда как положительное действие фармакопейного препарата сравнения Холосас проявлялось только с 14-ти суток.

Липосомы широко применяют в лечебных мазях и косметике. С целью изучения ранозаживляющего действия липосом было разработано трансдермальное средство, содержащее липосомы с ПНЖК жира нерпы (Патент РФ на изобретение №2417075). Учитывая основные патогенетические факторы развития раневых повреждений, были использованы модели линейной и плоскостной кожно-мышечной раны, а также модель химического ожога кожи. Животным опытных групп после операции на рану накладывали гель, приготовленный на основе полиэтиленгликоля (ПЭГ) и содержащий липосомы. Установлено положительное влияние липосомального средства на укрепление межклеточных структур при регенеративных процессах в поврежденных тканях, выражавшееся в увеличении прочности рубца на разрыв после лечения гелем линейной раны. Выраженное ранозаживляющее действие липосом проявлялось и в существенном уменьшении площадей плоскостной и постожоговой ран (рис. 9) в ранние сроки эксперимента, и в положительной динамике структурной реорганизации новообразованной после асептического повреждения ткани, и в ускорении процессов заживления ран по срокам эпителизации.

Рис. 9. Изменение площадей плоскостной и постожоговой ран и прочности рубца после линейной раны при воздействии геля с липосомами

Результаты исследования разработанной лекарственной формы в течение 4 месяцев на присутствие патогенных и условно патогенных микроорганизмов позволяют расценить испытуемое средство как микробиологически безопасное согласно требованиям, предъявляемым к парфюмерно-косметической продукции по действующим СанПиН 1.2.681-97.

Исследованиями эффективности липосом при формировании адаптационного ответа крыс к длительному холодовому стрессу было выявлено увеличение физической выносливости животных в тесте плавания до изнеможения. При этом наступало снятие психо-эмоционального напряжения, проявлявшееся повышением мотивационных характеристик поведения и уровня ориентировочно-исследовательского поведения, а также снижением уровня тревоги, страха, неуверенности в тестах Открытое поле и Т-образный лабиринт.

3.5. Транспортная способность липосом на основе липидов нерпы

Известно, что липосомы являются эффективной транспортной системой для различных биологически активных соединений (Каплун А.П., 1999).

Вычисления модифицированным методом мечения красителем (Heiati H. et al., 1996) объема внутренней водной фазы в разработанных липосомальных структурах позволили заключить, что внутрь липидных везикул, содержащих триацилглицеролы жира нерпы, включалось от 14.7% до 49.9% водного компонента от исходно взятого. В проведенных экспериментах были использованы суспензии, состоящие из липосомальных структур на основе вторичных липидов нерпы с заключенными внутрь и не включившимися в липосомы водными растворами пептидного биорегулятора или растительных экстрактов.

Были проведены эксперименты по исследованию иммунобиологической активности липосомальных средств, содержащих в своем составе жир байкальской нерпы, с включением активной фракции тимуса крупного рогатого скота и противовоспалительного пятикомпонентного фитосбора.

Результаты исследований показали (рис. 10), что полученные комплексы с липосомальными структурами стимулируют функциональную активность перитонеальных макрофагов, Т-лимфоцитов и антителообразующих клеток в иммунологических тестах с моделируемой супрессией. При этом выявлено, что применение как пептидного биорегулятора, так и фитосбора в комплексе с липосомами способствует усилению иммуномодулирующих свойств исследуемых биологически активных средств.

Рис. 10. Иммунобиологическая активность липосомальной формы противовоспалительного фитосбора. За 100% приняты показатели иммунитета интактной группы животных

Установлено, что противовоспалительная активность комплексного фитосбора при включении его в липосомальные структуры, содержащие жир байкальской нерпы, повышалась по сравнению со свободной формой растительного средства.

Аналогичные результаты были получены при исследовании мембраностабилизирующей активности экстракта какалии копьевидной. Способность к восстановлению мембран эритроцитов у растительного средства повышалась на 7.5% в случае перекисного гемолиза и на 18% в случае осмотического гемолиза при включении его в липосомальные средства.

Показано, что включение экстракта какалии копьевидной в липосомальное трансдермальное средство, содержащее ПНЖК нерпы, способствовало повышению ранозаживляющего действия фитоэкстракта (по сравнению с линиментной формой растительного средства на основе вазелина). При этом применение липосомальной формы растительного средства сопровождалось и восстановлением показателей иммунитета у животных с раневым повреждением.

Введение экстракта черных листьев бадана толстолистного (ЭБТ) в липосомальной форме сопровождалось положительной динамикой показателей неспецифической адаптации организма к холодовому воздействию.

Таким образом, показано, что при включении ПНЖК в липосомальные структуры сохраняется функция липосом как контейнеров для транспортной доставки биологически активных веществ и лекарственных средств, обуславливая пролонгированное действие последних и увеличивая их фармакологическую эффективность.

4. Выводы

1. Структура органов иммуногенеза (тимуса, селезенки, брыжеечного лимфатического узла) и лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистой оболочкой пищеварительного тракта, байкальской нерпы (PusasibiricaGmel.) соответствует общим закономерностям строения аналогичных органов человека и других млекопитающих.
2. Отличительные особенности микротопографии и клеточного состава органов иммунной системы байкальской нерпы касаются отдельных деталей структуры органов иммунной системы. Тимус, в отличие от тимуса человека, имеет 4 доли, а длина пакетов брыжеечных лимфатических узлов достигает 8 см. Отмечено более интенсивное развитие лимфоидных структур в кишечнике байкальской нерпы по сравнению с человеком и другими животными.
3. Характерной чертой микроскопического строения исследованных органов является обильное разрастание соединительной ткани в виде мощных трабекул (в тимусе, селезенке, лимфатическом узле) или отдельных пучков коллагеновых волокон внутри пейеровых бляшек и лимфоидных структурах в стенке прямой кишки. В селезенке нерпы слабо развиты периартериальные лимфоидные муфты; количество лимфоидных узелков в органе небольшое, но они большие с крупными центрами размножения. У пейеровых бляшек узкая мантия и слабо развитая межузелковая зона. Крипты в прямой кишке проникают глубоко в скопления лимфоидной ткани. В тимусе отмечено наличие большого количества макрофагов в корковом веществе, особенно у молодых животных.
4. С возрастом изменения, происходящие в строении органов лимфопоэза байкальской нерпы, отвечают общим для всех млекопитающих закономерностям онтогенетического развития органов иммунной системы. Во всех изученных органах с возрастом происходит разрастание соединительной ткани, сопровождающееся склерозированием кровеносных сосудов. С увеличением возраста в лимфоидных органах байкальской нерпы наблюдается превалирование функции гуморального иммунитета с одновременным снижением клеточного иммунитета. В красной пульпе селезенки с возрастом отмечается компенсаторное увеличение содержания малодифференцированных (бластов и больших лимфоцитов) и делящихся клеток. В мозговом веществе тимуса, в мякотных тяжах лимфатических узлов и в пейеровых бляшках повышается количество плазматических клеток, а в прямой кишке их доля снижается.
5. Для всех структур лимфоидной ткани свойственно относительно небольшое содержание макрофагов (за исключением тимуса), число которых с возрастом уменьшается. На фоне общего снижения доли макрофагов в мозговом веществе тимуса и в собственной пластинке слизистой оболочки прямой кишки наблюдается увеличение числа эозинофилов. В отличие от человека и лабораторных животных, уровень деструкции клеток в органах иммуногенеза нерпы с возрастом практически остается без изменений.

6. Под воздействием биогенных факторов окружающей среды оценена степень напряженности лимфоидных структур пищеварительного тракта байкальской нерпы. Выявлено что в прямой кишке при глистной инвазии нарушается целостность эпителиального покрова, развиваются микроэрозии, в основании крипт эпителий уплощается, принимает синцитиальный вид, что благоприятствует выходу лимфоцитов. Общее число лимфоцитов и малодифференцированных клеток в лимфоидных узелках при этом увеличивается, а содержание макрофагов и плазматических клеток сокращается. В собственной пластинке слизистой оболочки прямой кишки нерпы вдвое увеличивается доля эозинофилов и в 3 раза - макрофагов. Количество лимфоцитов и плазматических клеток уменьшается.

7. В брыжеечных лимфатических узлах животных, в кишечнике которых были обнаружены микроорганизмы, патогенные для белых мышей, в 1.5 раза увеличивается площадь лимфоидных узелков с центрами размножения и в 8 раз сокращается площадь, занимаемая лимфоидными узелками, не содержащими центров размножения. На цитологическом уровне происходит значительное уменьшение числа бластов и больших лимфоцитов (в 4 раза), исчезают митотически делящиеся клетки, в два раза увеличивается содержание плазмобластов, макрофагов, усиливается деструкция клеток.

8. Установлены иммуномодулирующая, противовоспалительная и мембраностабилизирующая активности липосомальной формы покровного жира нерпы в модельных экспериментах по воспроизведению иммунодефицитного состояния, воспалительных процессов в тканях лабораторных животных и деструкции мембран эритроцитов.

9. Замена яичных фосфолипидов на липиды печени нерпы, содержащие оптимальное соотношение ?-6/?-3 ПНЖК, в рецептуре липосом приводит к усилению их иммунобиологической и мембраностабилизирующей активности. Выявлена антиоксидантная активность липосом на основе липидов печени нерпы, проявляющаяся в повышении уровня и активности антиокислительных ферментов. Липосомы проявляют выраженный противовоспалительный эффект при воспроизведении острого перитонита и гиполипидемическую активность на модели гиперхолестеринемии.

10. Установлена фармакотерапевтическая эффективность липосомальных средств, содержащих ПНЖК жира нерпы. Применение липосом способствует усилению секреции и улучшению биохимического состава желчи экспериментальных животных с токсическим гепатитом. В условиях длительного холодового стресса введение животным исследуемых липосом приводит к повышению физической работоспособности, улучшению психо-эмоционального состояния и стимуляции ориентировочно-исследовательского поведения, что указывает на адаптогенные свойства разработанного средства.

11. На моделях раневых повреждений у крыс при применении ранозаживляющего геля, содержащего липосомальную форму липидов нерпы, отмечено ускорение по сравнению с контролем развития грануляционной ткани и созревания рубца после линейных кожных ран, а также ранняя эпителизация раневых дефектов при заживлении плоскостных кожно-мышечных ран и химических ожогов кожи.

12. При использовании в липосомальных структурах ПНЖК липидов нерпы сохраняется функция липосом как контейнеров для транспортной доставки биологически активных средств. При включении пептидного биорегулятора и растительных средств в липосомы, содержащие липиды нерпы, повышается их фармакологическая и фармакотерапевтическая эффективность. В экспериментах на животных выявлено усиление иммунокорригирующих свойств активной фракции тимуса крупного рогатого скота при включении в липосомальные структуры. Включение комплексного противовоспалительного фитосбора в липосомы, содержащие жир нерпы, повышает его иммуномодулирующую и противовоспалительную активности. Отмечено ускорение протекания регенеративных процессов в ранах при применении липосомальной формы экстракта какалии копьевидной по сравнению со свободной формой растительного средства. Липосомальная форма экстракта из черных листьев бадана толстолистного оказывает более выраженное стресспротекторное действие, чем его свободная форма.

5. Практические предложения

1. Данные по гистоморфологическому исследованию органов иммунной системы байкальской нерпы рекомендовать в качестве биоиндикаторных характеристик экосистемы озера, используя их как исходную базу данных для оценки степени влияния различных внешних факторов на иммунную систему организма, проводимой в рамках биологического мониторинга.

2. Регистрируемую динамику изменений морфофункциональных показателей иммунной системы байкальской нерпы использовать для характеристики состояния экосистемы Байкала при разработке мер по сохранению биоразнообразия озера.

3. Разработанные липосомальные средства на основе биологически активных липидов байкальской нерпы рекомендовать фармацевтической промышленности для создания новых высокотехнологичных лекарственных средств, а также биологически активных добавок к пище и кормам с использованием наноразмерных систем.

4. Липосомальное ранозаживляющее средство рекомендовать к внедрению в производство трансдермальных препаратов нового поколения в виде гелей и мазей, обладающих высокой эффективностью.

5. Сведения по морфологии и клеточному составу органов иммуногенеза байкальской нерпы использовать в учебном процессе при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий на биологических, охотоведческих и ветеринарных факультетах и написании учебников, учебных пособий и справочных руководств по видовой и возрастной сравнительной морфологии животных для студентов вузов.

СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА

Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |

     Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии