Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по ветеринарии
Молекулярно-генетические и иммунохимические методы в диагностике, инди-кации и идентификации возбудителей туберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота
Автореферат докторской диссертации по ветеринарии
|
Страницы: | 1 | 2 | 3 | |
СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТАХроматографическое фракционирование антигенов. Фракционирование проводили методом гель-хроматографии и ионообменной хроматографии
на базе ДЕАЕ-целлюлозы. Подготовка ДЕАЕ-целлюлозы проводилась по общепринятой методике. Использовали хроматографические колонки с внутренним объемом 300 см3. Параметры градиентного элюирования определялись опытным путем. Для гель-хроматографии использовали колонку 4,5 х 60 см с сефадексом G-100 и уравновешенную 0,05М Nа-фосфатным буфером (рН 6,5), содержащим 0,1М NaCl. Процесс элюирования фракций и регистрация результатов производился с помощью УФ-детектора UVICORD Ц2, сбор фракций осуществлялся на коллекторе фракций FRAC Ц100.
Проведение иммуноблотинга. Электроперенос белков фракционированных в ПААГ на нитроцеллюлозную мембрану проводили по методике, описанной Towbin et al. (1989). Полиакриламидный гель погружали в трис буфер рН 10,5 на 30 минут, нитроцеллюлозную мембрану выдерживали в трис-глициновом буфере рН 8,8 - 5 минут, по истечении этого времени собирали сендвич (фильтровальная бумага - гель - НЦМ - фильтровальная бумага) и помещали его между анодом и катодом. Перенос проходил в течение 2,5 часа при напряжении в 100 Vа и силе тока 100мА на пластинку с охлаждением при помощи хладагентов (Coolpack MC-3 Iaminarmedica).
Иммуноблот анализ проводили следующим образом: нитроцеллюлозную мембрану нарезали на полоски - стрипы, маркировали, помещали их в пластиковые канавки, вносили 2 мл ФСР-Т, выдерживали 5 минут, вносили по 10 мкл исследуемых сывороток на стрип, выдерживали 2 часа при комнатной температуре на шейкере, 3 раза промывали раствором ФСР-Т с 5 минутной инкубацией, после каждой промывки раствор аспирировали в дезинфекционную емкость с 6% перекиси водорода, вносили конъюгат в рабочем разведении, инкубировали 1 час при комнатной температуре на шейкере, стрипыа 3 раза промывали раствором ФСР-Т, вносили субстратный, инкубировали до развития цветного окрашивания 15-30 минут, 3 раза промывали дистиллированной водой и высушивали. Учет реакции проводили визуально и инструментально при помощи оптического сканирования и денситометрирования по интенсивности окрашивания с использованием компьютерной программы Image master, версия 1.
Получение иммунных сывороток против микобактериальных антигенов.а В качестве продуцентов гипериммунной сыворотки использовали кроликов. Иммунизацию животных проводили по методу, описанному Harboe N., Ingild A. (1977). Готовили раствор антигена в концентрации 2-4 мг/мл с неполным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1. На 1-й, 14-й, 28-й и 43-й день иммунизации кроликам вводили раствор антигена в объеме 1 мл. Инъекцию производили в утолщенный участок кожи над лопаткой в 8-10 точках. На 50-й день отбирали кровь из ушной вены. Через каждые шесть недель брали очередную порцию крови, причем животному вводили стандартную смесь антигена за 8-10 дней до отбора крови. Специфичность полученных антисывороток изучали в динамике в РСК и ИФА с антигеном из гомологичных и гетерологичных бактериальных клеток.
Выделение микобактериальных антигенов из тканей патологического материала крупного рогатого скота. Проводили обработку патологического материала, с целью выделения микобактериальных антигенов, по методу описанному Хазиповым Н.З., Тюриковой Р.П., Нуруллиным А.А. (1986).
Для анализа брали 1-2 г лимфатических узлов (средостенных, заглоточных, брыжеечных и др.) и растирали их кварцевым песком в ступке. Разрушенную ткань суспендировали в гипотоническом растворе NaCl состоящем на 20 % от 0,05 %-го раствора MgCl2 и тщательно перемешивали. К полученной смеси добавляли равный объем физиологического раствора и перемешивали еще 10 мин. Суспензию сливали в узкогорлую колбу на 50 мл, добавляли 1 мл углеводорода (керосин), закрывали плотно резиновой пробкой и энергично встряхивали 10-15 минут. Добавляли в колбу дистиллированной воды до горлышка и оставляли смесь при комнатной температуре на 2 часа. По истечении этого времени с поверхности жидкости отбирали сливкообразный слой, помещали его в центрифужную пробирку, центрифугировали при 8000 об/мин 20 минут. Жидкую фазу сливали, а плотную (пленку) заливали, двойным объемом ацетона и выдерживали при 370С 30-40 минут. После центрифугирования при 4000 об/мин 20 минут ацетон сливали. Этот процесс повторяли дважды. Выделенные фракции после высушивания при комнатной температуре обрабатывали ДМСО и исследовали в ИФА.
Постановка иммуноферментного анализа. Иммуноферментный анализ (ИФА) по определению специфических антител к микобактериям осуществляли в непрямом варианте на полистироловых планшетах для иммунологических реакций по методу, описанному Woller A. et al. (1976).
В лунки планшета вносили по 100 мкл растворов антигенов в 0,01 М карбонатном буфере (рН 9,6) и инкубировали 16-18 часов при комнатной температуре. После 3-х кратного промывания раствором для промывки в лунки вносили по 100 мкл исследуемых и контрольных сывороток разведенных в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) с рН 7,3. Инкубировали 1 час при 370С и промывали 3-4 раза. После этого в лунки вносили по 100 мкла конъюгата, разведенного в том же буфере. Инкубировали планшет в течение 30 мин при 370С, промывали лунки планшета не менее 5 раз и вносили в каждую лунку по 100 мкл раствора субстрата. После выдерживания планшет в течение 15 минут при 370С, реакцию останавливали добавлением 50 мкл 2н раствора серной кислоты в каждую лунку.
Учет результатов реакции ИФА проводили на вертикальном сканирующем спектрофотометре. Для оценки результатов реакции использовали коэффициент специфичности (К), который равняется отношению величины оптической плотности исследуемой пробы (ОП0) на величину оптической плотности контрольной пробы (ОПк). Положительно реагирующими считали пробы с К более 2 при разведении 1:200.
Выделение циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). Циркулирующие иммунные комплексыа были выделены методом преципитации в полиэтиленгликоле (ПЭГ).а Пробы смешивали в соотношении 1 : 1 с 7% раствором ПЭГ-6000 в 0,1М боратном буфере (рН 8,8), перемешивали и инкубировали при +4оС в течение 72-х часов. Преципитат осаждали центрифугированием при 5000g в течение 20 минут и трижды промывали десятикратным объемом ПЭГ в концентрациях: 3,5%, 7% и 10,5% в боратном буфере. Выделенные иммунные комплексы растворяли в физиологическом растворе и изучали их активность в ИФА. Комплексы разбивали с предварительной инкубацией проб при 50оС в течение 2 часов.
Результаты исследований подвергали математической обработке на ПК с использованием программного комплекса Microsoft Excel 2000. Уровень достоверности полученных данных определяли по критерию Стьюдента.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Микобактериальные антигены и их свойства
Получены ДМСО антигены из автоклавированных клеток M.bovis, M.avium, M.scotochromogenes, M.nonchromogenes, M.phlei, а также из живых микобактериальных культур M.bovis-14, M.bovis BCG, M.tuberculosis, M.intracellulare, M.avium, M.phlei. Оптимизирована техника выделения антигенных препаратов. Установлено, что наиболее специфичныеа антигены получаются при вторичной обработке микобактерий с 10% -й ДМСО.
3.1.1. Электрофоретическая подвижность и характеристика антигенных компонентов микобактерий
Проводили сравнительное изучение электрофореграмм клеточных лизатов,а ДМСО-антигенов живых микобактерий, а также автоклавированных культур M.bovis, M.avium, M.scotochromogenes, M.nonchromogenes, M.phlei.
Установлено, что электрофоретические фракции клеточных лизатов и ДМСО-антигенов живых микобактериальных культур в основном расположены в диапазоне от 10 до 125 кД, а их количество варьирует в зависимости от вида микобактерий. Интенсивно выраженные белковые компоненты расположены в диапазоне от 16 до 69 кД и количество их в этом диапазоне максимальное.а Антиген-экстракты автоклавированных микобактерий имеют четко обозначенные фракции, большая часть которых располагается в диапазоне молекулярных масс 46,5 кД - 38,5 кД. Электрофореграммы ДМСО-антигенов автоклавированных микобактерий на 12 - 16 фракций содержат меньше чем у ДМСО-антигенов и клеточных лизатов живых культур. Видимо, в процессе автоклавирования часть белковых фракций, в частности, обладающие высокими молекулярными массами, денатурируют. Полученные результаты соответствуют имеющимся литературным данным. Так, по данным Власенко В.В. (1999), при нагревании антигенов при 1000С в течение 60 минут денатурируются групповые антигены, а видоспецифические сохраняются.
3.1.2. Иммуноблот анализ сероактивных компонентов микобактериальных антигенов
Выявление белкового спектра после фракционирования антигенных препаратов в ПААГ и изучение серологической активности электрофоретических компонентов проводили также после переноса белков на мембранные фильтры методом иммуноблот анализа. Использовали гипериммунные кроличьи антисыворотки к ДМСО-антигенам, а также сыворотки крови от больных туберкулезом людей и животных.
Иммуноблоты ДМСО-антигенов автоклавированных микобактерий с гипериммунными сыворотками против гомологичных антигенов показали, что большинство сероактивных фракций располагаются в диапазоне от 20 до 65 кД. Количество иммуногенных фракций у разных антигенов по-разному, при этом - мажорных 5-6, а минорных до 10. Большинство общих для всех видов микобактерий антигенных фракций лежат в диапазонах 40-60кД и 20-35 кД. Полученные результаты могут быть использованы в дифференциальной диагностике туберкулеза.
Учитывая тот факт, что одной из основных проблем в диагностике туберкулеза крупного рогатого скота является дифференциация неспецифических туберкулиновых реакций, проводили иммуноблотинг ДМСО-антигенов микобактерий с антисывороткой к антигену M.bovis, полученной на кроликах. Аналогичные работы проводились и другими исследователями. Например, по данным Ахметова Т.М. (1990) в клеточном лизате и ДМСО-антигене живых клеток M.bovis сероактивными с родственной антисывороткой оказалось 7 фракций, среди которых специфической является фракция с молекулярной массой 30кД.
Иммуноблот анализ ДМСО-антигенов автоклавированных микобактерий проводился впервые. ДМСО-антигены живых и автоклавированных клеток M.bovis по молекулярным массам сероактивных компонентов не совпадают. Фракции с молекулярными массами 20, 30, 45, 50, 97 кД антигена автоклавированных культур являются общими для всех исследованных видов микобактерий: M.avium, M.scotochromogenes, M.nonchromogenes. Фракция с Мм 60 кД является характерной только для антигена M.bovis. Однако, на иммуноблотах антигенов с сыворотками от больных туберкулезом людей такая сероактивная фракция обнаружена и у антигена M.tuberculosis.
Сведений об использовании антигена 60 или А 60 в серодиагностике туберкулеза достаточно много. По данным некоторых исследователей А60 является общим к большинству видов микобактерий, включая M.tuberculosis, M.bovis и M.avium. Однако в своих исследованиях мы у антигена M.avium сероактивную фракцию Мм 60 не обнаружили.
M.Amadori, S.Tameni et al., (1997), утверждают, что крупный рогатый скот, инфицированный M.bovis, имеет тенденцию к более выраженному иммунному ответу к антигенам c молекулярными массами 27, 60, 74кД. По результатам иммуноблота мы также обнаружили, что в ДМСО-антигене автоклавированных M.bovis присутствуют сероактивные фракции с Мм 27 и 74кД. Однако они являются общими для всех исследованных видов микобактерий и относятся к минорным фракциям.
На иммуноблотах ДМСО-антигена M.bovis с сыворотками от коров, реагирующих на ППД туберкулин, из 12а проб только 3 реагировали, образуя мажорные фракции с антигеном Мм 60. Еще у 3 проб - минорные фракции в этой области. Остальные пробы проявили на иммуноблотах фракцииа различной интенсивности в диапазоне 20-30 и 70-200 кД, что больше соответствует иммунным сывороткам против микобактерий птичьего вида и нехромотогенной группы.
Таким образом, иммуноблот анализ ДМСО-антигенов автоклавирован-ных микобактерий, успешно может быть использован в прижизненной диагностике и дифференциальной диагностике туберкулеза крупного рогатого скота, а также туберкулеза у людей.
3.1.3. Антигенные свойства ППД туберкулинов иа ДМСО-антигенов
На первом этапе работы проводили фракционированиеа и изучение антигенных свойств фракций ДМСО-антигенов и ППД-туберкулинов.
Для фракционирования микобактериальных антигенов выбрали ионообменную хроматографию на базе ДЕАЕ-целлюлозы. С каждого антигена получены более 100 фракций. Градиентное элюирование фракций антигенов с увеличением ионной силы раствора давало на регистраторе до 5 малых пиков, градиентное элюирование с увеличением рН раствора дало также до 5 малых и от одного до 3-х больших пиков.
Изучение специфичности полученных больших пиков в реакциях ИФА, с гипериммунными кроличьими сыворотками, показало наличие между ними выраженных перекрестных реакций. Следовательно, эти пики хроматограмм представляли собой неспецифические, балластные белковые фракции антигенов. Наибольшей активностью в ИФА обладали пики, полученные при градиентной элюции, связанной с увеличением ионной силы раствора. Наиболее специфичными у антигенов M.bovis является 25-я; M.scotochromogenes - 31-я; M.nonchromogenes - 38-я; M.avium - 46-я фракция. Они позволяли дифференцировать иммунные сыворотки к гомологичным микобактериальным антигенам в ИФА с коэффициентом специфичности более 5.
Секретируемые белки микобактерий играют важную роль в защитном иммунитете. Они связаны с клеточной стенкой и входят в состав пептидогликанового комплекс и могут быть использованы для идентификации микобактерий в двухмерном электрофорезе культуральной жидкости и методом вестерн-блоттинга (Ohara N,а H.Kitaura et al., 1995).
Если учесть, что ППД-туберкулины представляют собой культуральные белки, то сравнительное изучение иммуногенности фракций ДМСО-антигенов и ППД-туберкулинов представляют собой определенный практический интерес. В этих целях использовали гельфильтрацию на сефадексе G-200.
По данным Новак Д.Д., Шакенов Б.Н. (2005), при разделении ППД-туберкулина для млекопитающих методом последовательной хроматографии на двух марках сефадексов (G-50 и G-150) полного отделения специфических компонентов не происходит. Авторы проводили групповое разделение и получили 2 основные фракции. В нашем случае также получились 2 большие группы полипептидов, но с фракционированием внутри каждой группы.
Молекулярныеа веса полученных фракций составили: для фракций ДМСО - антигена от 10 до 100 кД ППД-туберкулина для млекопитающих - от 4 до 55 кД и для ППД-туберкулина для птиц - от 4 до 60 кД.
Методом непрямого твердофазного ИФА определяли специфичность каждой фракции.а Наибольшей специфичностью обладали фракция №16 ДМСО-антигена М.Bovis, фракции №14 и 15 ППД-туберкулина для млекопитающих и фракция №18 ППД-туберкулина для птиц. Коэффициенты специфичности этих фракций со специфическими антителами составили от 3,5 до 3,8 и показывали перекрестные реакции с К не более 2. Молекулярные массы у них составляет около 15 кД, т.е. они представляют собой низкомолекулярные белки, полипептиды.
Таким образом, гель-хроматография позволяет избавиться от балластных белков и выделить специфичные, иммуногенные фракции антигенов. Полученные специфичные фракции ППД-туберкулинов могут быть использованы в дифференциальной диагностике туберкулеза животных.
Против ДМСО-антигенов и ППД туберкулинов получали гипериммунные сыворотки на кроликах. Специфичность антисывороток изучали в ИФА против гомологичных антигенов. Результаты показали, что иммунизация животных ППД-туберкулинами не позволяет получать специфичные иммунные сыворотки. Антисыворотки, против ДМСО антигенов микобактерий, хотя и обладали специфичностью, между некоторыми видами наблюдались значительные перекрестные реакции.
При иммунизации кроликов против гомологичных микобактериальных антигенов образуются различные по специфичности антитела. Наиболее специфичные антитела образуются в более поздних сроках иммунизации, в нашем случае на 170 день. В начальных стадиях иммунизацииа титры неспецифических антител примерно на одном уровне со специфическими.
3.2. Иммуноферментный анализ для выявления микобактериальных антигенов в патологическом материале
Огромный практический интерес представляет возможности иммуноферментного анализа при обнаружении и типизации микобактериальных антигенов в патологическом материале. ИФА является потенциально ценным для ускоренного обнаружения микобактерий и их антигенов в тканевых пробах при отрицательных результатах гистологических исследований. Разноречивые литературные данные о диагностической ценности ИФА связано качеством используемых антигенов и низкой специфичностью применяемых иммунных сывороток.
3.2.1. Иммуносорбентная очистка иммунных сывороток
Разработана технология повышения специфичности иммунных сывороток к микобактериальным антигенам. Для этой цели использовали белково-глутаральдегидный иммуносорбент, приготовленный на основе методик Avrameas S., Ternynck T. (1969), Friemel H. (1984). На белково-глутаральдегидный метод очистки иммунной сыворотки против M.bovis получено удостоверение на рационализаторское предложение № 314-91 от 5.03.1991. По этому методу берутся целые микробные клетки всех видов, кроме тех, против которых истощается сыворотка. Предварительно микобактериальную массу отмывали от питательной среды и обрабатывали ацетоном (см. Получение антигена). После подсушивания микробных клеток на воздухе протирали их в ступке и отбирали в химический стакан на 50 мл навеску 500 мг., добавляли из расчета 1:4 бычий сывороточный альбумин. Полученную массу растворяли в 25 мл 0,1 М фосфатного буфера с рН 7,0. К раствору по каплям, при постоянном перемешиванииа добавляли 7,5 мл 2,5% раствора глутарового альдегида. Через 3 часа при комнатной температуре образуется гель. Гель гомогенизировали в 200 мл 0,2 М фосфатного буфера с рН 7,3. Полученную суспензию центрифугировали 15 мин при 1000 g. Частицы белка отмывали фосфатным буфером до тех пор, пока оптическая плотность смыва при 280нм не стало менее 0,01. Затем гель трижды суспендировали в 200 мл 0,1 М глицин-НCl буфере с рН 2,8 и вновь в 200 мл фосфатного буфера. Процесс повторяли до тех пор, пока оптическая плотность смыва при 280 нм не стала равной нулю. Отмытый гель переносили в центрифужную пробирку и добавляли соответствующее количество антисыворотки. После перемешивания в течение 30 мин при комнатной температуре оставляли на 2 часа в термостате при 370С. Надосадочной фракцией повторяли эту процедуру со свежим иммуносорбентом 5 раз.
Качество полученных антисывороток изучали в ИФА. В результате проделанной работы нам удалось в несколько раз повысить специфичность иммунных сывороток. Перекрестные реакции между различными видами антисывороток в ИФА на гомологичные микобактериальные антигены наблюдали только в разведениях 1:100 - 1:150, в то время как специфические сыворотки против соответствующих антигенов работали при иммуноферментном анализе, в разведениях свыше 1:30000.
Применение антисывороток к ДМСО-антигенам, истощенных белково-глутаральдегидным иммуносорбентом в ИФА, позволяло дифференцировать микобактериальные антигены с коэффициентами специфичности от 3,6 до 4,5, что является достаточно высоким показателем позволяющим использовать их при типизации этих штаммов.
3.2.2. Тест-система иммуноферментная для типизации микобактерий в патологическом материале
Известно, что чувствительность и специфичность иммуноферментного анализа могут существенно изменяться при варьировании условий проведения эксперимента. Поэтому выбор оптимальной концентрации реагентов и определение основных условий для постановки реакции ИФА, обеспечивающих достижения максимальной точности и чувствительности анализа, имеет важное значение (Дзантиев Б.Б., 1979, Miller D.A., Williams E.D, 1980а и др.).
Исходя из имеющихся данных, указывающих на то, что адсорбция на полистирол определяется количеством и строением молекулы используемого антигена, было проведено исследование по определению оптимальной концентрации ДМСО-антигена при адсорбции в лунки иммунологического планшета. Установлено, что максимальная величина коэффициента специфичности отмечается при адсорбции антигена в концентрации 2 мкг/мл. Для полного представления возможностей ИФА при выявлении микобактерий M.bovis в патологическом материале определили чувствительность метода, что составляет 100 микробных клеток на мг ткани.
Результаты работ по изучению возможностей использования ИФА для выявления возбудителя туберкулеза крупного рогатого скота в патологическом материале, а также по определению чувствительности метода проверялись межвузовскими комиссионными испытаниями (акт от 05.01.90). В опытах использовали кроличьи гипериммунные сыворотки к ДМСО-антигенам истощенные белково-глутаральдегидным иммуносорбентом. В качестве испытуемого материала брали ткани заглоточных, средостенных и брыжеечных лимфоузлов от заведомо здоровых и больных туберкулезом коров.
Комиссия заключила, что антиген, полученный из инактивированной бактериальной массы M.bovis, позволяет получать видоспецифическую сыворотку, пригодную для выявления возбудителя туберкулеза в патологическом материале крупного рогатого скота методом ИФА. Метод иммуноферментного анализа с использованием иммунной сыворотки к антигену M.bovis пригоден для обнаружения и типизации возбудителя туберкулеза в патологическом материале крупного рогатого скота.
На основании полученных результатов сконструирована тест-система иммуноферментная для индикации и дифференциации микобактерий в патологическом материале. Тест-система состоит из следующих компонентов: планшеты полистироловые для иммунологических реакций; положительные контрольные антигены - ДМСО-антигены M.bovis, M.avium, M.scotochromogenes, M.nonchromogenes, M.phlei; положительные сыворотки - кроличьи антисыворотки против указанных микобактерий; отрицательная сыворотка; компоненты буферных растворов для разведения реагентов тест-системы; конъюгат, антивидовой иммунопероксидазный против антител кролика; ортофенилендиамин и стоп-реагент. Разработаны методические рекомендации по приготовлению реагентов тест-системы, постановке реакции, оценке и интерпретации результатов анализа, которые утверждены на научно-техническом Совете КВИ (протокол №5 от 22.05.92).
Апробируя данную методику, проводили исследование патологического материала от 69 голов крупного рогатого скота, убитых на Казанском мясокомбинате. 33 пробы получены от реагирующих и 36 проб от нереагирующих на ППД туберкулин, но имеющие высокиеа титры сывороточных антител против M.bovis в ИФА.
При убое 33 голов крупного рогатого скота из группы положительно реагирующих на туберкулин, у 18 обнаружены характерные для туберкулеза патологоанатомические изменения, а при анализе методом ИФА патматериала дополнительно было выявлено еще 5 голов животных больных туберкулезом. В 5 случаях из тканей органов, с выраженным туберкулезным процессом, не удалось выделить микобактериальный антиген.
12 проб сыворотки крови этих же 33 животных показали отрицательные результаты при иммуноферментном анализе сывороток крови. Результаты паталогоанатомического исследования и ИФА патматериала показали отсутствие возбудителя туберкулеза в 10 из них. В двух случаях были обнаружены характерные для туберкулеза патологоанатомические изменения в средостенных лимфоузлах.
При убое 36 голов нереагирующих на туберкулин коров, но имеющих высокие титры специфических антител против M.bovis при ИФА, у 18 голов обнаружены характерные для туберкулеза изменения в лимфоузлах. В 11 случаях без видимых патологоанатомических изменений реакция в ИФА на обнаружение антигена M.bovis была положительной. Полученные данные подтверждены бактериологическими исследованиями в Республиканской ветеринарной лаборатории.
3.3. Иммуноферментный анализ для выявления специфических антител при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота.
Изучая эффективность ИФА, и определяя его место в комплексе диагностических мероприятий при туберкулезе, исследовали пробы сывороток крови коров из различных по эпизоотической ситуации хозяйств.
Всего исследовано 3723 пробы, в том числе из благополучных по туберкулезу хозяйств - 1063, из неблагополучных - 2670. В 23 хозяйствах, где за последние три года не выявлено ни одного животного реагирующего на туберкулин, результаты иммуноферментного анализа были отрицательными.
2425 проб сыворотки крови из неблагополучных хозяйств были исследованы иммуноферментным методом в сравнении с результатами аллергической пробы у тех же животных, в том числе 643 проб - ота реагирующих и 1782 - от не реагирующих на туберкулин животных.
При иммуноферментном анализе проб сывороток крови от реагирующих на туберкулин коров, в 297 обнаружены противотуберкулезные антитела в высоких титрах, а в 346 пробах получены отрицательные результаты (46,2% и 53,8% соответственно).
При анализе методом ИФА для выявления антител в пробах сывороток крови от нереагирующих на туберкулин коров получены следующие результаты: 158 проб (8,86%) - с положительной реакцией, 1624 проб (91,14%) - с отрицательной реакцией.
Для определения степени достоверности полученных данных производился контрольный убой животных и бактериологические исследования в Республиканской ветеринарной лаборатории.
Результаты патологоанатомических исследований 36 коров нереагирующих на туберкулин, но положительные в ИФА,а показали, что у 18 голов имеются характерные для туберкулеза изменения в лимфоузлах. Результаты патологоанатомического исследования и бактериоскопии патматериала от 12 коров реагирующих на туберкулин, но отрицательные в ИФА подтвердили аотсутствие возбудителя туберкулеза в 10 из них.
Таким образом, нашими исследованиями установлено, что иммуноферментный анализ сывороток крови животных дает дополнительную информацию к аллергическим исследованиям. Повышается эффективность диагностических мероприятий, что выражается в увеличении достоверности выявления больных туберкулезом животных до 93%.
На основании полученных результатов приготовлен Набор препаратов для выявления антител к возбудителю туберкулеза крупного рогатого скота методом ИФА, который предназначен для исследования сывороток крови животных с целью выяснения эпизоотической ситуации по туберкулезу в хозяйствах.
Набор препаратов включает в себя все необходимые компоненты для постановки ИФА и 5 планшетов с адсорбированными на них антигенами M.bovis. К набору препаратов прилагается упаковочный лист и наставление по применению. Срок хранения иммунологических планшет определен экспериментально и составляет 1 год при 40С.
На основании приказа по Казанскому ордена Ленина ветеринарному институту им.Н.Э.Баумана от 16.01.91 за № 2 пригодность Набора препаратов для выявления антител к возбудителю туберкулеза крупного рогатого скота методом ИФА проверялась межвузовским комиссионным испытанием.
На основании анализа результатов комиссионных испытаний, комиссия заключила, что предлагаемый авторами Набор для выявления антител к возбудителю туберкулеза крупного рогатого скота методом ИФА пригоден по своему целевому назначению и метод ИФА может служить для получения дополнительной информации к аллергической диагностике туберкулеза крупного рогатого скота.
3.3.1. Дифференциальная диагностика туберкулеза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа.
Разработан способ получения микобактериальных антигенов для прижизненной дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций вызванных атипичными микобактериями методом ИФА (ДМСОм-антиген). Предлагаемый нами модифицированный способ получения антигенов позволяет избавиться от большинства неспецифических белковых фракций. Об этом свидетельствует и результаты электрофоретического фракционирования белковых компонентов. На диск-электрофорезе в 12,5% ПААГ,а аДМСО-м антигены показали четко обозначенные фракции, большая часть которых располагается в диапазоне молекулярных масс 30 - 50 кД. Электрофореграммы окрашивали азотнокислым серебром. В электрофореграммах окрашенных кумасси G 250 четко выраженных белковых фракций антигенов выявить не удалось.
В целях производственного испытания эффективности полученных антигенов в дифференциальной диагностике туберкулеза крупного рогатого скота проводили ИФА для выявления антител в сыворотках крови, реагирующих на туберкулин коров, из различных хозяйств РТ. Всего исследовано 852 пробы. Для подтверждения полученных данных совместно с ГУВ РТ и Республиканской ветеринарной лабораторией были проведены дополнительные лабораторные исследования.
В пробах сывороток крови коров из 5 хозяйств (Урожай, Яш-Куч, Чачаклинский, Акбаш, Каракашлы), благополучных по туберкулезу крупного рогатого скота, не обнаружены антитела против ни одного вида микобактериальных антигенов. Следовательно, причиной положительных туберкулиновых реакций животных являются не микобактерии туберкулеза, что подтверждался лабораторными исследованиями.
В ряде благополучных по туберкулезу хозяйств, в сыворотках крови коров обнаружены в высоких титрах антитела против атипичных микобактерий.
В КП Алан Тюлячинского района причиной туберкулиновых реакций животных являлась зараженность микобактериями птичьего вида. Парааллергические реакции на туберкулин, обусловленные сенсибилизацией организма атипичными микобактериями, аналогичным способом было установлено ещё в 3-х хозяйствах л(Камско-Устьинский Камско-Устьинского, КП Уют Сабинского, Нижнекамский Нижнекамского районов).
В 4-х хозяйстваха (КП Память Ленина Буинского, КП Южный Бавлинского, КП Овощевод и КП Зеленодольский Зеленодольского районов) проведенные исследования показали, что в основе туберкулиновых реакций у животных лежит паразитарные заболевания. Однако большая часть положительных в ИФА проб реагировали скотохромогенной группы микобактерий.
Подтверждая наши результаты бактериологическими методами был установлен туберкулез крупного рогатого скота в 6 хозяйствах (Волга, Искра Буинского, Красный Октябрь Новошишминского, АПХ им.Горького Камско-Устьинского, Ерсубайкино Альметьевского и в совхозе-техникуме Чистопольского районов).
В 3-ха хозяйстваха (Екатериновский, Агроснаб, Нур Спасского района) несколько проб сывороток крови положительно реагировали с антигеном M.bovis, однако результаты наших исследований не нашли подтверждения.
В целом, обобщая полученные результаты, можно сказать, что иммуноферментный анализ с использованием микобактериальных антигенов, полученных по нашему способу, успешно может быть использован в прижизненной дифференциальной диагностике туберкулеза крупного рогатого скота. Специфичностьа составляет более 90%.
|
Страницы: | 1 | 2 | 3 | |
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по ветеринарии