Книги, научные публикации
Pages: | 1 | ... | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | ... | 13 | СПРАВОЧНИК Лабораторные методы исследования в клинике Под редакцией профессора В.В.Меньшикова МОСКВА ДМЕДИЦИНА" 1987 ББК 53.4 М51 УДК 61б-074/-078:061.6 В. В. МЕНЬШИКОВ, Л. Н. ДЕЛЕКТОРСКАЯ, Р. П. ...
-- [ Страница 9 ] --заниженных результатов. Входящий в эту же В клинической лабораторной диагностике группу глюкозооксидазный метод, основанный чаще всего глюкозу определяют в крови, взятой на окислении перекисью водорода фенолфта- из пальца, в этом случае предварительное уда лина, имеет то преимущество, что нуждается ление белка абсолютно необходимо. Но если только в одном реактиве Ч глюкозооксидазе, анализировать сыворотку без гемолиза и жел зато метод более трудоемок. тухи, то многие методы позволяют обходиться Особый вариант ферментативных методов Ч без депротеинизации.
ферментные электроды, которые представляют Определение глюкозы в моче имеет лишь собой чувствительные электрохимические дат- вспомогательное значение, поэтому обычно ог чики, содержащие иммобилизованные ферменты. раничиваются лишь ее качественным исследо Существует два варианта электродов для опре- ванием. При количественном определении обыч но используют ортотолуидиновыи метод или ко часов после приготовления начинает выпа поляриметрический, основанный на измерении дать осадок, это значит, что ортотолидин недо вращения плоскости поляризации. статочно чистый и его надо перекристаллизо Как видно из краткого обзора методов, нет вать. 9. Калибровочные растворы глюкозы. Глю однозначности в том, какой метод или даже козу предварительно высушивают при 37С и какая группа методов должна быть принята хранят в эксикаторе. Сначала готовят основной в качестве унифицированной. Наибольшее прак-' раствор с концентрацией 50 ммоль/л, для чего тическое значение имеет определение глюкозы 180 мг вещества растворяют в 20 мл насыщен для выявления и контроля за лечением сахар- ного раствора (примерно 0,3 %) бензойной кис ного диабета, однако даже наименее точный с лоты. Из этого раствора готовят рабочие калиб аналитической точки зрения феррицианидный ровочные растворы, содержащие 3;
6;
9;
12;
15;
редуктометрическии методе успехом применялся 18 и 21 ммоль/л, для чего берут 0,6;
1,2;
1,8;
на протяжении многих лет;
при правильном его 2,4;
3;
3,6 и 4,2 мл основного раствора и доводят использовании и интерпретации результатов он насыщенным раствором бензойной кислоты до может применяться в КДЛ. объема 10 мл. Эти растворы содержат глюкозу Унификация методов. В качестве унифици- в тех же концентрациях, в которых она бывает рованных сейчас приняты три метода. Наиболее в крови, что облегчает расчеты при калибровке.
точный глюкозооксидазный унифицирован в Ход о п р е д е л е н и я. В центрифужные 1974 г.;
менее удобный в работе ортотолуидино- пробирки вносят 1,1 мл раствора хлорида нат выи метод унифицирован в 1972 г., тогда же рия, 0,4 мл раствора сульфата цинка и 0,4 мл унифицирован феррицианидный метод (Хаге- 0,3 н. раствора NaOH, перемешивают;
при этом дорнаЧИенсена), который хотя и дает несколь- образуется очень тонкий гель гидрата окиси ко завышенные результаты, но везде может быть цинка, в него выпускают 0,1 мл крови или калиб ровочного раствора, снова перемешивают и че налажен.
Унифицированный глюкозооксидазный ме- рез 10 мин центрифугируют при 3000 об/мин в тод по окислению о-толидина. Пр и н ц и п. течение 10 мин.
Глюкозооксидаза окисляет глюкозу с образова- К 1 мл надосадочной жидкости добавляют нием перекиси водорода, которая под действием 3 мл рабочего реактива и осторожно перемеши пероксидазы окисляет ортотолидин (Н N-СНз- вают. Постепенно начинает развиваться окрас ХС Н -С Н -СН -NH ) с образованием синего ка, которая при обычной комнатной температуре 6 3 6 3 3 хромогена. Обе реакции протекают одновре- достигает максимума через 13Ч15 мин, а затем менно при рН 4,8. постепенно уменьшается. Фотометрируют всегда Ре а к т ив ы. 1. Натрия хлорид 9 г/л (изо- через один и тот же промежуток времени после тонический раствор): готовят, растворяя 0,9 г добавления рабочего реактива в кюветах с дли NaCl в 100 мл воды. 2. Цинка сульфат, 50 г/л: ной оптического пути 1 см с красным светофильт 5 г сульфата цинка (ZnSO4) растворяют в воде, ром (длина волны 625 нм) против холостого объем доводят до 100 мл. 3. Натр едкий, опыта, который ставят одновременно с рабочими 0,3 моль/л: готовят, растворяя 1,2 г NaOH в пробами, но вместо крови берут физиологиче 100 мл воды, концентрацию проверяют титро- ский раствор хлорида натрия. При приготовле ванием (она должна быть 0,3 н.). 4. Ортотоли- нии калибровочного графика вместо проб крови дин, 1 % раствор: 1 г препарата растворяют берут 0,1 мл соответствующего калибровочного в 100 мл абсолютного спирта. Раствор можно раствора.
хранить в холодильнике в склянке с притертой Ра с ч е т можно проводить по правилу про пробкой несколько месяцев. Имеющийся в про- порций или по калибровочному графику, для по даже препарат можно очистить перекристалли- строения которого на одной оси откладывают зацией, для чего его растворяют в абсолютном концентрацию глюкозы (ммоль/л), а на другой спирте, добавляют воду и выпавшие кристаллы величину экстинкции.
отсасывают на фильтре, затем сушат над хлори Пр и м е ч а н и я. 1. Можно сначала вы дом кальция. 5. Ацетатный буферный раствор пустить кровь из пипетки в изотонический рН 4,8: смешивают 4 части 0,25 н. уксусной кис раствор хлорида натрия, а затем добавить лоты (проверить титрованием!) и 6 частей 0,25 н.
растворы сульфата цинка и NaOH. 2. При ацетата натрия (содержит 34 г CH3COONa систематической работе нет необходимости ХЗН2О в 1 л). 6. Глюкозооксидаза Ч сухой пре постоянно строить калибровочный график по парат активностью 3000 ед/мг или больше.
всем точкам, достаточно ежедневно обраба 7. Пероксидаза из хрена. Желательно исполь тывать холостую пробу и 2Ч3 точки в диапа зовать кристаллический препарат фирмы Реа зоне 3Ч9 ммоль/л, а полный калибровочный нал (Венгрия): 1 мг растворяют в 5 мл ацетат график строить лишь при смене реактивов ного буфера (реактив 5), в холодильнике можно или налаживании методики.
хранить несколько дней. 8. Рабочий реактив:
в 80 мл ацетатного буфера растворяют 2 мг глю- Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы натощак:
козооксидазы и 1 мг пероксидазы, прибавляют 3,5Ч5,7 ммоль/л (60Ч100 мг в 100 мл).
1 мл 1 % раствора ортотолидина, перемешивают Л и т е р а т у р а. Лаб. дело, 1976, № 6, и доводят объем буферным раствором до 100 мл.
373Ч374.
Рабочий реактив должен быть прозрачным, бес цветным или иметь слабо-зеленый оттенок, в Глюкозооксидазный метод по окислению фе этом случае он устойчив при хранении на холоду. нолфталина. Пр и н ц и п. Белки осаждают Если же окраска интенсивна или через несколь- трихлоруксусной кислотой, рН безбелкового раствора с помощью фосфата натрия доводят и обрабатывают ее так же, как и надосадочную до точки, близкой к оптимому действия глюкозо- жидкость. В калибровочный опыт вместо над осадочной жидкости берут по 1 мл различных оксидазы, и проводят ферментативную реакцию.
Образующаяся перекись водорода в присутст- калибровочных растворов (реактив 6). Расчет вии ионов меди окисляет фенолфталин до фенол- проводят по калибровочному графику или по фталеина, который в нейтральной области бес- правилу пропорций.
цветен, а в щелочной области окрашен в крас ный цвет. Поэтому перед фотометрированием П р и м е ч а н и я. 1. Фенолфталин можно добавляют щелочь. синтезировать из недефицитного фенолфта Р е а к т и в ы. 1. Трихлоруксусная кислота, леина, который широко используется в ла раствор 50 г/л. При титровании щелочью кон- бораториях в качестве кислотно-основного центрация кислоты должна быть 0,3 н. 2. Натрия индикатора. Для этого в колбу вместимостью фосфат двузамещенный, 0,25 моль/л. Готовят, 1 л с обратным холодильником помещают растворяя 9,7 г Na HPO -2H O или 18 г 5 г фенолфталеина, 250 мл 20 % раствора 2 4 Nа HPO -12Н О в воде, объем доводят до КОН и 2,5 г цинковой пыли, а также несколь 2 4 200 мл. При добавлении 2 мл этого раствора ко стеклянных бусинок для равномерного к 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты рН кипения. Раствор становится темно-красного должен быть в пределах 5,0Ч6,0. 3. Раствор цвета, его кипятят до тех пор, пока он не глюкозооксидазы. Содержит около 3000 ед. в станет слабо-розовым или совсем не обесцве 1 мг. Готовят, растворяя соответствующее коли- тится, обычно на это уходит 1 рабочий день.
чество сухого препарата в 10 мл воды. Допуска- Еще горячий раствор фильтруют через стек ются значительные колебания активности фер- лянный фильтр и добавляют 100 мг трилона.
мента, поэтому обычно нет необходимости прове- К охлажденному прозрачному раствору в рять качество препарата. 4. Фенолфталин, 0,5 % большом химическом стакане добавляют не раствор. Готовят, растворяя 75 мг вещества большими порциями при постоянном переме в 15 мл 0,1 н. NaOH, раствор должен быть бес- шивании 5 н. НС1 до тех пор, пока реакция цветным или слегка розоватым, окрашенные не станет сильнокислой (по конго красному растворы для работы непригодны. Для увеличе- или универсальной индикаторной бумажке), ния стойкости реактива к нему добавляют 3 мг на это идет около 200 мл кислоты. Выпавший трилона (натриевой соли этилендиаминтетраук- осадок отфильтровывают на бюхнеровской сусной кислоты), который, связывая соли тяже- воронке и высушивают, желательно в ваку лых металлов, препятствует самоокислению фе- уме.
нолфталина кислородом воздуха. 5. Рабочий 2. Можно избежать удаления белков реактив. Готовят в день определения, смешивая осаждением, если анализировать кровь, вы 30 частей 0,3 н. NaOH, 2 части 0,5 % раствора сушенную на фильтровальной бумаге. Для фенолфталина (реактив 4) и 1 часть 0,12 % этого 0,02 мл исследуемой крови в виде плот раствора сульфата меди (120 мг CuSO - ного узора выпускают на фильтровальную Х5Н О растворяют в 100 мл воды). 6. Калибро- бумагу, высушивают на воздухе, вырезают вочные растворы. Глюкозу высушивают при и замачивают на 10Ч15 мин в 1 мл 5 % 37 С и хранят в эксикаторе. Сначала готовят трихлоруксусной кислоты. Фильтр с пятном раствор с концентрацией 50 ммоль/л, для чего крови удаляют, а экстракт обрабатывают 180 мг препарата растворяют в 20 мл 5 % три- так же, как и безбелковый фильтрат. В ка хлоруксусной кислоты. Разведением этого рас- честве холостого опыта используют 1 мл 5 % твора в 50 раз той же 5 % трихлоруксусной кис- трихлоруксусной кислоты, в которой был за лотой получают раствор, содержащий 1 ммоль/л. мочен такой же по размеру кусочек фильтро Берут 0,6;
1,2;
1,8 и 2,4 мл раствора 1 ммоль/л вальной бумаги. Если окраска в холостом и объем каждой порции доводят до 10 мл, добав- опыте оказывается значительной, фильтро ляя нужное количество 5 % трихлоруксусной вальную бумагу предварительно вымачивают кислоты. Получаются растворы, содержащие 60;
в горячей 5 % уксусной кислоте, а затем 120;
180 и 240 мкмоль/л. При построении калиб- высушивают.
ровочного графика окраска проб, в которых Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы те же, что и обрабатывались эти растворы, будет соответст в предыдущем методе.
вовать концентрации 3;
6;
9 и 12 ммоль глюкозы в I л крови. Ли т е р а т у р а. Балаховский И. С., На Ход о п р е д е л е н и я. 0,03 мл крови вы- точин Ю. В. Пробл. космич. биол., 1973, т. XXII, ливают в 1,5 мл 5 % трихлоруксусной кислоты, с. 43;
Городецкий В. К-, Селиванов И. А. При перемешивают и центрифугируют. К 1 мл про- кладная биохимия и микробиология, 1969, т. 5, зрачной надосадочной жидкости добавляют 2 мл № 3, 353.
0,25 моль/л фосфата натрия и 2 капли (при мерно 0,1 мл) раствора глюкозооксидазы. Пере- Купрометрический метод с использованием мешивают и оставляют при комнатной темпера- мышьяково-медного реактива (метод Сомоги Ч туре на 1 ч, затем добавляют 2 мл рабочего реак- Нельсона). Пр инцип. Глюкоза восстанавли тива и еще через 30 мин фотометрируют в кю- вает ионы двухвалентной меди, которые в свою вете с длиной оптического пути 1 см при длине очередь восстанавливают мышьяково-молибде волны 520 нм (зеленый светофильтр). новую кислоту с образованием молибденовой Одновременно ставят холостой опыт, в кото- сини, которая придает раствору устойчивое ок рый берут 1 мл 5 % трихлоруксусной кислоты рашивание.
Р е а к т и в ы. 1. Натрия фосфат двузаме- 5.5.2. Углеводные компоненты щенный. Вместо 28 г безводной соли (Nа2НРО4> гликопротеидов можно взять 70,5 г ее гидрата (Na2HPO4 Х 12Н2О). 2. Калий, натрий виннокислый (сегне- Вещества, содержащие белковый и углевод това соль). 3. Безводный сульфат натрия. ный компоненты, называются гликопротеидами.
Вместо 80 г безводной соли (Na2SO4) можно Различают собственно гликопротеиды и протео взять 180 г ее кристаллического гидрата гликаны. В первую группу входят белки, содер (Na2SO4-10Н2О). 4. Меди сульфат CuSO4- жащие относительно короткие (не больше'15Ч 5Н2О. 5. Щелочной медный реактив: ра- 20 моносахаридов) углеводные цепи, в которых створяют 28 г двузамещенного фосфата нат- нет периодически повторяющихся олигосаха рия и 40 г сегнетовой соли в 600Ч700 мл воды ридных последовательностей. Вторую подгруппу и добавляют туда 100 мл 1 н. NaOH. Отдельно составляют протеогликаны или гликозаминпро растворяют 8 г сульфата меди в 80 мл воды и теогликаны, которые иногда называют амино приливают, перемешивая, к предыдущему рас- полисахаридами, или мукополисахаридами. Они твору. Затем к смеси добавляют 80 г безводного значительно богаче углеводами,, каждая угле сульфата натрия, доводят объем до 1 л водой и водная цепь состоит из повторяющихся дисаха оставляют на 2Ч3 дня при 37 С, после чего ридных фрагментов, содержащих аминосахар и фильтруют. Хранят в темноте, желательно в по- уроновую кислоту или галактозу. Углеводные лиэтиленовом флаконе, так как стекло может компоненты протеогликанов называют гликоза выщелачиваться, нарушая кислотность среды. миногликанами (ГАГ).
6. Аммоний молибденовокислый ((NH4)5Mo7O24- Гликопротеиды. Большинство белков плазмы ХH2O). 7. Натрий мышьяковокислый двуза- крови содержит хотя бы некоторое количество мещенный (Na2HAs5O4-7H2O). 8. Мышьяково- углеводов, поэтому формально относятся к гли молибденовый реактив: при легком подогрева- копротеидам. Однако практически сывороточ нии растворяют 25 г молибденовокислого аммо- ными гликопротеидами обычно называют лишь ния в 450 мл воды, затем добавляют 21 мл кон- небольшую группу белков, особенно богатых центрированной серной кислоты и перемеши- углеводами, куда входят трансферрин, гаптогло вают. К этому раствору добавляют 3 г двузаме- булин, макроглобулин и т. д. Содержание их щенного мышьяковокислого натрия, растворен- увеличивается при воспалительных процессах, ного в 25 мл воды. Хорошо перемешивают и в связи с чем их называют белками острой фазы оставляют стоять на 1Ч2 сут в темном месте и определяют в тех случаях, когда надо выявить при 37 "С. Реактив должен быть зеленоватого воспалительный процесс или оценить его актив цвета. К нему добавляют несколько капель ность. При этом возможно несколько подходов:
0,05 н. перманганата калия (0,79 % раствор 1) определение индивидуальных гликопротеидов КМпО4), так, чтобы раствор стал золотисто- острой фазы посредством специфических энзи желтым. Хранить в посуде из темного стекла. матических или иммунологических методов;
9. Вольфрамовокислый натрий, 10 %. 10. Серная 2) выявление электрофоретических фракций, кислота, 0,66 н. 11. Калибровочные растворы особенно богатых гликопротеидами;
3) опреде глюкозы те же, что и в глюкозооксидазном ме- ление суммы углеводов, связанных с сывороточ тоде определения глюкозы по окислению орто- ными белками. Последний подход и рассматри толидина. вается в настоящем разделе.
Из более чем 100 известных природных са Ход о п р е д е л е н и я. К 1,5 мл воды до- харов и их производных с белками бывает свя бавляют 0,1 мл крови, перемешивают и прили- зано лишь около 10. В состав гликопротеидов вают сначала 0,2 мл 10 % раствора вольфрамо- входят следующие углеводы: I) гексозы Ч глав вокислого натрия, а затем 0,2 мл 0,66 н. серной ным образом галактоза и манноза, в очень не кислоты. Перемешивают и через несколько ми- значительных количествах и глюкоза;
2) пен нут центрифугируют. К 0,5 мл прозрачной над- тозы Ч ксилоза и арабиноза;
3) дезоксисахара осадочной жидкости добавляют 0,5 мл щелоч- фукоза и рамноза;
4) аминосахара Ч ацетил ного медного реактива и ставят на кипящую во- глюкозамин и ацетилгалактозамин;
5) нейрами дяную баню на 20 с. Затем охлаждают 1 мин в новая кислота и ее уксуснокислые эфиры, кото воде комнатной температуры и добавляют 0,5 мл рые называются сиаловыми кислотами.
мышьяково-молибденового реактива и 7,5 мл, О количестве сывороточных гликопротеидов можно судить, определяя любой из этих компо воды.
Перемешивают и фотометрируют в кювете нентов, но по практическим соображениям в кли с длиной оптического пути 1 см при длине волны нической практике находит широкое применение 700 нм против холостого опыта, при постановке лишь определение связанных с белком гексоз и которого вместо крови берут 0,1 мл воды. Одно- сиаловых кислот;
методы определения фукозы, временно обрабатывают калибровочные пробы, аминосахаров и нейраминовой кислоты извест в которые вместо крови берут калибровочные ны, но не получили такого широкого распростра растворы. Расчет можно: проводить по кали- нения из-за сложности и трудоемкости.
бровочному графику или по правилу про- Многие богатые углеводами белки обладают порций. выраженными кислотными свойствами, раство Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы и к л и н и - римы в хлорной и трихлоруксусной кислотах ч е с к о е з н а ч е н и е те же, что и в глюко- и составляют группу серомукоидов, диагности зооксидазном методе, т. е. 3,5Ч5,7 ммоль/л ческое значение которых примерно такое же, (60Ч100 мг в 100 мл). как гликопротеидов. О количестве серомукоидов можно судить по содержанию белкового или уг- карбазоловая реакция интенсивнее развивается леводного компонента, но последний путь на- с глюкуроновой кислотой, чем с идуроновой.
дежнее. Содержание в плазме гексоз, связанных На этом основан простой метод, позволяющий с белком, свидетельствует об общем количестве судить об относительном содержании дерматан гликопротеидов, а определение гексоз, которые сульфатов по так называемому коэффициенту растворимы в хлорной кислоте и нерастворимы К/О, который рассчитывают путем деления в фосфорновольфрамовой, служит показателем содержания ГАГ, определенного по карбазоло количества серомукоидов. вой реакции, на их содержание, определенное Большинство цветных реакций на сахара по реакции с орцином;
разумеется, оба резуль может быть также использовано для определе- тата должны быть выражены в молях. Для ния углеводных компонентов гликопротеидов. чистого образца дерматансульфата этот коэф Из них наиболее подходящим для определения фициент равен 0,67, для прочих ГАГ (за ис гексоз орциновый метод, а для определения ключением, конечно, кератансульфата) он сиаловых кислот Ч резорциновый метод и метод выше.
с уксусно-сернокислым реактивом. Увеличение экскреции ГАГ с мочой служит Хотя клиническая трактовка результатов признаком повреждения соединительной ткани определения перечисленных выше веществ во вследствие иммунного процесса, воспаления или многом схожа, содержание отдельных углевод- же врожденного дефекта обмена. При приобре ных компонентов изменяется не всегда строго тенных заболеваниях (ревматизм, склеродер параллельно, так как индивидуальные белки мия) увеличение коэффициента К/О характерно острой фазы содержат их в разных количествах для более тяжелых, деструктивных процессов, и все зависит от того, какой конкретный протеид в то время как при преобладании фибротиче преимущественно изменился. По этой причине ских, склеротических и дистрофических процес в клинике, в частности в ревматологической, сов коэффициент падает, видимо, потому, что стремятся одновременно определять несколько появляются гетерогенные Протеогликаны с высо различных показателей. ким содержанием идуроновой кислоты.
Протеогликаны. Этими соединениями очень Унификация методов. В 1972 г. унифициро богато межклеточное вещество соединительной ваны резорциновый метод определения сиало ткани, патологические процессы в которой отра- вых кислот и определения связанных с белками жаются на обмене углеводного компонента Ч гексоз и гексоз, связанных с серомукоидом гликозаминогликанов (ГАГ) и содержании их орциновым методом.
в моче. Протеогликаны весьма гидрофильны, они способны впитывать большое количество Л ит е р а т у р а. Астахова Т. А, Балаба воды, чем и определяется их более старое назва- нова Р. М. Гликозаминогликаны мочи при ние мукополисахариды. Гистохимически они системной склеродермии.Ч Тер. арх., 1980, выявляются по способности к метахроматиче- № 12, с. 100^104;
Видершайн Г. Я. Биохимиче ской окраске, т. е. окрашиванию в цвет, отлич- ские основы гликозидозов.Ч М.: Медицина, ный от цвета красителя. 1980.
ГАГ состоят из повторяющихся дисахарид ных единиц, каждая из которых содержит аминосахар и уроновую кислоту или галактозу;
5.5.3. Сиаловые кислоты другие углеводы (фукоза, сиаловые кислоты, манноза и ксилоза) присутствуют лишь в Унифицированный резорциновый метод.
ничтожных количествах. При определении ГАГ Пр и н ц и п. При нагревании гликопротеидов в крови или в моче их обычно сначала выделяют, плазмы с трихлоруксусной кислотой отщепля используя способность образовывать осадки ются сиаловые кислоты, которые в свою очередь с четвертичными аминами, содержащими длин- гидролизуются с образованием свободной ней ную углеводную цепь, в частности с цетилтриме- раминовой кислоты и уксусной кислоты. Резор тиламмонием, а затем определяют углеводный цин в присутствии солей меди дает с нейрамино компонент специфической реакцией в карбазо- вой кислотой синее окрашивание.
лом или орцином. Результаты определения ГАГ Ре а к т ив ы. 1. Меди сульфат, 0,1 моль/л:
карбазоловым и орциновым методом очень часто растворяют 624 мг сульфата меди (медный купо не совпадают, что имеет определенное диагнос- рос, CuSO -5Н O) в 25мл воды. 2. Резорцин 4 тическое значение. 2 г/л. Резорциновый реактив готовят, растворяя Известно 7 типов ГАГ, из них 5 содержат 200 мг резорцина в 10 мл воды, затем добавляют в своем составе глюкуроновую кислоту, шес- 80 мл концентрированной НС1 (отн. плотность той Ч идуроновую кислоту, называемую также 1,19) и 0,25 мл раствора сульфата меди, после галактуроновой, а седьмой Ч галактозу. Глюку- смешивания общий объем доводят до 100 мл роновую кислоту содержит гиалуроновая кисло- водой. Реактив годен к употреблению через 4 ч та, хондроитин-4-сульфат (хондроитинсуль- после приготовления, при хранении в холодиль фат А), хондроитин-6-сульфат (хондроитин- нике стоек. 3. Экстрагирующий реактив: смеши сульфат С), гепарин и гепарансульфат;
вают 85 мл бутилацетата и 15 мл бутилового дерматансульфат (хондроитинсульфат В) со- спирта. 4. Трихлоруксусная кислота, 50 г/л.
держит идуроновую кислоту, а кератосульфат 5. Калибровочные растворы. Основной раствор или кератансульфат Ч галактозу. Глюкуроно- содержит 0,5 мг кристаллической ацетилней вая кислота в реакции с орцином дает такое же раминовой кислоты (мол. масса 309) в 1 мл воды.
окрашивание, как и идуроновая, в то же время Из него готовят калибровочные растворы.
док отмывают, растворяют в щелочи и опреде Основной ляют в нем гексозы по реакции с орцином.
Соответствует раствор Содержание Во- Количество гексоз характеризует общее содер концентрации ацетил в плазме жание гликопротеидов.
нейрами МЛ Серомукоиды Ч это особый вид гликопротеи КИСЛОТЫ мкг НМОЛЬ мг/л ММ ОЛЬ /Л дов, которые растворимы в хлорной кислоте, но нерастворимы в фосфорновольфрамовой кисло те. Для их определения остальные белки 0,1 0,9 50 162 200 0, осаждают хлорной кислотой;
добавляя к надоса 0,2 0,8 100 324 400 1, дочной жидкости фосфорновольфрамовую кис 0,3 0,7 150 485 600 1, лоту, осаждают серомукоиды, осадок отмывают, 0,4 0,6 200 647 800 2, растворяют в щелочи и определяют содержание 0,5 0,5 250 809 1 000 3, гексоз по реакции с орцином. Количество гексоз характеризует общее содержание серомукоидов.
Ре а к т и в ы. 1. Орциновый реактив. Гото Ход о п р е д е л е н и я. К 0,1 мл плазмы или вят смешиванием двух реактивов: А Ч серная сыворотки приливают 1,9мл раствора трихлор- кислота и Б Ч раствор орцина, 16 г/л. Реактив уксусной кислоты, ставят на 7 мин на кипящую А готовят, осторожно добавляя к 40 мл воды водяную баню для гидролиза, затем охлаждают 60 мл концентрированной серной кислоты;
реак и фильтруют через бумажный фильтр. К 0,5 мл тив Б готовят, растворяя 1,6 г орцина в 100мл прозрачного фильтрата добавляют 0,5 мл воды воды. Оба реактива стойкие. Непосредственно и 1 мл резорцинового реактива, закрывают перед определением смешивают 7,5 мл реактива стеклянными пробками и ставят на водяную А и 1 мл реактива Б. 2. 96 % этиловый спирт кипящую баню еще на 15 мин. После этого (этанол). 3. Натр едкий, 0,1 н. раствор. 4. Хлор охлаждают, добавляют 3 мл экстрагирующего ная кислота, 0,6 моль/л, содержит 6 % HCIO4.
реактива, встряхивают и оставляют на 15 мин 5. Фосфорновольфрамовая кислота, 50 г/л.
для расслоения фаз. Окраска переходит в верх- Готовят, растворяя 5 г ее в 100 мл 2 н. НС1.
ний слой, который отсасывают и фотометрируют 6. Калибровочный раствор, содержащий 45 мг при длине волны 575Ч590 нм в кювете с длиной галактозы и 45 мг маннозы в 100 мл воды.
оптического пути 0,5 см против холостого опыта, Сахара высушивают в эксикаторе над фосфор при постановке которого к 1 мл воды добавляют ным ангидридом. В связи с тем, что оба вещест 1 мл резорцинового реактива. Остальные про- ва имеют одинаковую молекулярную массу, цедуры те же, что и в основном опыте. Для получается раствор, содержащий смесь гексоз построения калибровочного графика берут но в общей концентрации 5 ммоль/л.
1 мл калибровочных растворов, приготовленных Оп р е д е л е н и е об ще г о к о л и ч е с т согласно таблице, добавляют по 1 мл резорцино- ва с в я з а н н ы х с б е л к а м и г е кс оз.
вого реактива и обрабатывают так же, как К 0,1 мл исследуемой сыворотки или плазмы в основном опыте. приливают 5 мл 96 % этилового спирта, переме Р а с ч е т проводят по калибровочному гра- шивают и центрифугируют 5 мин. Осадок тща фику. тельно взбалтывают в 5 мл 96 % этанола, снова Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы. В норме центрифугируют и.удаляют надосадочную содержание сиаловых кислот составляет жидкость. Осадок растворяют в 1 мл 0,1 н.
2,0Ч2,33 ммоль/л независимо от того, выра- NaOH, добавляют 8,5 мл орцинового реактива, жаются результаты определения в свободной перемешивают и ставят на водяную баню при нейраминовой кислоте или же в ее ацетилиро- 80 С точно на 15 мин;
следует избегать попада ванной форме Ч сиаловых кислотах. При выра- ния прямого дневного света. Охлаждают в тем жении результатов в весовых единицах содержа- ноте в холодной воде и фотометрируют в кювете ние нейраминовой кислоты составляет 620Ч с длиной оптического пути 1 см при длине волны 730 мг/л. 560 нм против холостого опыта, при постановке которого берут вместо осадка, растворенного Ли т е р а т у р а. Svennerholm L. The quan в щелочи, воду или 0,1 н. NaOH.
t i t at i ve esti mati ng of cerebrosides in nervous По с т р о е н и е к а л и б р о в о ч н о й tissue.Ч J. of Neurochemistry, 1956, vol. 1, к р и в о й. 0,05Ч0,3 мл. основного калибровоч № 1, p. 42Ч53.
ного раствора доводят водой до объема 1 мл, К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Содержа- приливают 8,5 мл орцинового реактива и обра ние сиаловых кислот возрастает при самых батывают дальше так же, как и опыт. Окраска разнообразных воспалительных процессах, а раствора, в который взято 0,3 мл калибровоч также при опухолях, инфаркте миокарда. В це- ного раствора, соответствует окраске опытной лом диагностическое значение такое же, как пробы, в которую взята сыворотка, содержащая и остальных гликопротеидных показателей. 15 ммоль/л гексоз. Окраска раствора, в кото рый взято 0,2 мл калибровочного раствора, соответствует содержанию 10 ммоль/л гексоз 5.5.4. Связанные с белком гексозы и т. д.
Оп р е д е л е н и е г е кс оз, с в я з а н Унифицированный орциновый метод. н ых с с е р о му к о и д о м. К1 мл сыворотки Пр и н ц и п. Гликопротеиды осаждают вместе или плазмы добавляют 1 мл воды и после пере с белками сыворотки или плазмы спиртом, оса- мешивания осторожно по стенке приливают 2 мл 0,6 н. хлорной кислоты, перемешивают и остав- крепкой серной кислоты. Глюкуроновая кислота ляют стоять 10 мин, после чего центрифугируют дает такое же окрашивание, как и галактуроно 10 мин при 4000 об/мин. Надосадочную жид- вая (идуроновая) кислота при обработке орци кость сливают в чистую пробирку, добавляют новым реактивом, но с карбазоловым реактивом 2 мл 5 % раствора фосфорновольфрамовой идуроновая кислота дает окрашивание на 21 % кислоты, перемешивают и центрифугируют. менее интенсивное, чем глюкуроновая кислота.
Надосадочную жидкость удаляют, к осадку Ре а кт ив ы. I. Раствор цетавлона. Водный добавляют 2 мл 96 % этилового спирта, снова раствор цетилтриметиламмонийбромида, 25 г/л.
перемешивают и центрифугируют 10 мин при 2. 95 % этиловый спирт, насыщенный хлоридом 4000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют, натрия при комнатной температуре. 3. Карбазо осадок растворяют в 1 мл 0,1 н. NaOH, прили- ловый реактив. Раствор карбазола 1 г/л в этило вают 8,5 мл орцинового реактива. Дальнейшее вом спирте. 4. Орциновый реактив: 0,2 г орци определение проводят так же, как определение на растворяют в 100 мл концентрированной общего количество связанных с белками гексоз. серной кислоты х. ч., отн. плотности 1,84. Реак По с т р о е н и е к а л и б р о в о ч н о г о тив может храниться до 2 нед в посуде из тем г р а фи к а. 0,05Ч0,5 мл калибровочного ного стекла в холодильнике. 5. Серная кислота раствора доводят водой до объема 1 мл и прили- х. ч. 6. 1 н. NaOH. 7. 2 н. HCI. 8. Универсальная вают 8,5 мл орцинового реактива;
дальнейшее индикаторная бумага. 9. Калибровочные раство определение проводят так же, как и в опыте. ры глюкуроновой кислоты в воде, содержащие Окраска раствора, в который взято 0,5 мл калиб- 5Ч100мг/л.
ровочного раствора, соответствует содержанию Ход о п р е д е л е н и я. Выд е л е н и е гексоз, связанных с серомукоидом 2,5 ммоль/л.
ц е т а в л о н о в ых о с а д к о в. Собирают су Окраска раствора, в который взято 0,4 мл точную мочу, отдельные порции до объединения калибровочного раствора, соответствует содер- хранят в холодильнике. Если плотность мочи жанию в сыворотке 2 ммоль/л связаных с серо- ниже 1,020, для исследования берут 30мл, мукоидом гексоз и т. д.
в противном случае берут 15 мл и добавляют 15 мл воды. Перед отбором пробы суточное Пр и м е ч а н и е. Препараты орцина обыч количество мочи тщательно перемешивают и не но нуждаются в дополнительной очистке.
фильтруют. Добавлением 2 н. НС1 под контро Для этого препарат нагревают на водяной лем рН метра или индикаторной бумаги кислот бане при 60Ч65 С, при этом образуются ность исследуемой пробы доводится до рН 5,0.
два слоя Ч собственно расплавленный орцин Затем добавляют 1 мл раствора цетавлона и и вода, нагревание продолжают до тех пор, оставляют на ночь в холодильнике. На следую пока вся вода не испарится. Осадок при щий день центрифугируют при комнатной тем нагревании растворяют в минимальном коли пературе 15 мин при 2000 об/мин. Надосадочную честве бензола, добавляют активированный жидкость осторожно удаляют, а пробирки остав уголь, перемешивают, в горячем виде ляют в перевернутом положении на 1 мин, чтобы фильтруют и охлаждают. При этом выпадают с осадка успела стечь жидкость. Осадок дважды кристаллы орцина. Перекристаллизацию промывают порциями по 5Ч10 мл 95 % этило повторяют дважды.
вого спирта, насыщенного хлоридом натрия, Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы. Общее ко каждый раз тщательно измельчая осадок палоч личество гексоз, связанных с белками сыворотки кой и центрифугируя его. Отмытый осадок раст или плазмы, составляет в норме 5,8Ч6,6 ммоль/л, воряют в 1,5 мл воды, подщелоченной 2 каплями из них с серомукоидом связано 1,2Ч1,6 ммоль/л.
1 н. NaOH, затем объем доводят до 5 мл. Если Кл и н и ч е с к о е з на ч е ние. Самые раз раствор окажется мутным и его оптическая нообразные воспалительные процессы приводят плотность будет выше 0,7, то добавляют еще к увеличению содержания связанных с белками 5 мл воды, доводя суммарный объем до 10 мл.
или серомукоидом сыворотки гексоз. Наиболь Осадок, не растворившийся в щелочи, удаляют.
шее диагностическое значение имеет их опреде Цв е т н а я р е а к ц и я с к а р б а з о л о м ление для выявления вяло текущих воспали (п о Д и ш е). К 1 мл растворенного цетавлоно тельных процессов, повышение этих показате вого осадка приливают при охлаждении 6 мл лей свидетельствует об активации процесса, концентрированной серной кислоты, нагревают даже если клинические симптомы еще не про на кипящей водяной бане 20 мин, охлаждают явились. Чаще всего связанные с белками гексо до комнатной температуры и добавляют 0,2 мл зы исследуют ревматологи.
карбазолового реактива. Появляется розовое окрашивание, которое усиливается на протяже 5.5.5. Гексуроновые кислоты нии 2 ч, а потом в течение 1 ч остается стабиль ным. Фотометрируют через 2 ч в кювете с длиной Содержание гексуроновых кислот, входящих оптического пути 1 см при длине волны 540 нм в состав гликозаминогликанов мочи, опреде- против холостого опыта, при постановке кото ляется карбазоловым и орциновым методами. рого вместо цетавлонового осадка берут воду.
Пр и н ц и п. Гликозаминогликаны мочи Цв е т н а я р е а к ц и я с о р ц и н о м (по осаждаются в виде комплексов с цетилтриметил- Св е нне р х о л ь му ). К 2 мл растворенного аммонийбромидом, осадки отмывают и раство- цетавлонового осадка добавляют 4 мл орцино ряют в слабой щелочи. Входящие в состав ГАГ вого реактива и оставляют на 15 мин, затем тща гексуроновые кислоты определяют по цветным реакциям с орцином и карбазолом в присутствии Очистку орцина см. с. 237, левая колонка.
тельно перемешивают и ставят еще на 20 мин 5.5.6. Гликозилированный гемоглобин в водяную баню при 80 С;
охлаждают на льду и фотометрируют при длине волны 505 нм Белки, в том числе гемоглобин, если их дли в кювете с длиной оптического пути 1 см против тельное время выдерживать в растворе, содер холостого опыта, при проведении которого к 2 мл жащем глюкозу или другой редуцирующий растворенного цетавлонового осадка добавляют моносахарид, присоединяют ее остатки за счет вместо орцинового реактива 4 мл серной кисло- химических, неэнзиматических процессов. Чем ты из той же самой партии, которая была выше концентрация глюкозы в растворе и чем использована для приготовления реактива 4;
длительнее инкубация, тем больший процент холостую пробу обрабатывают так же, как молекул гемоглобина гликозилируется, поэтому опытную. содержание гликозилированного гемоглобина (Gly-Hb) характеризует средний уровень кон По с т р о е н и е к а л и б р о в о ч н о г о г р а фи к а. При построении калибровочных центрации глюкозы в крови за время жизни графиков для карбазоловой и орциновой реак- молекулы гемоглобина. Лечение диабета прово ций используют одну и ту же серию калибровоч- дят с помощью лекарств, понижающих содержа ных растворов, содержащих 5Ч100мкг глкжу- ние глюкозы в крови лишь на ограниченный роновой кислоты в 1 мл воды. Калибровочные промежуток времени, очень важно подобрать пробы обрабатывают так же, как и опытные. такие схемы терапии, которые позволили бы По калибровочному графику вычисляют содер- добиться стойкой нормализации гликемии. Ис жание глюкуроновой кислоты в микрограммах следование гликозилированного гемоглобина в 1 мл растворенного цетавлонового осадка. оказывается ценным лабораторным показате Эту величину делят на 1,5;
3 или 6 в зависи- лем, характеризующим некоторый средний уро мости от того, какому количеству мочи соответ- вень глюкозы в крови на протяжении длитель ствует 1 мл растворенного осадка. ного промежутка времени, который соизмерим Окончательный результат выражают в мил- с длительностью полужизни молекулы гемогло лиграммах за сутки. Можно выражать его и в бина (3Ч4мес). Количество гликозилирован миллиграммах на 1 г креатинина, для этого ного гемоглобина выражают в молярных про концентрацию гексуроновых кислот (мг/л) центах, т. е. в количестве остатков моносахарида, делят на концентрацию креатинина (г/л). Для которые приходятся на 100 молекул гемоглоби пересчета результатов в молекулярные вели- на. Его уровень повышается при сахарном чины найденное количество делят на молекуляр- диабете и характеризует степень его компенса ную массу глюкуроновой кислоты, т. е. на 196;
ции, уменьшается он при омоложении популя в связи с тем что молекулярные массы глюкуро- ции молекул гемоглобина, что бывает при актив новой и идуроновой кислот одинаковы, расчеты ном синтезе гемоглобина, например при регене совпадают. Для вычисления коэффициента рации после кровопотерь.
К/О количество гексуроновых кислот, опреде- Методы определения. Для определения ленное карбазоловым методом, делят на гликозилированного гемоглобина предложено их количество, определенное орциновым ме- много способов, включающих хроматографию тодом. или электрофорез на различных фазах. Хими ческие методы заключаются в том, что связь Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы. Выведение между молекулой белка и моносахаридным гексуроновых кислот у детей 10Ч15 лет состав остатком разрушается гидролизом и освободив ляет 5Ч10 мг/л, у взрослых 2,4Ч3,9 мг/л, или шиеся молекулы моносахарида определяются по около 2 мг на 1 г креатинина. Коэффициент цветной реакции. Результаты определения во К/О в норме близок к единице.
многом зависят от выбранного метода. Наиболее Л и т е р а т у р а. Меркурьева Р. В., Гу- точными в настоящее время считаются хромато сев М. Р. Сравнительная оценка методов опре- графические методы, но они трудоемки и тре деления гликозаминогликанов мочи.Ч Лаб. де- буют специальной аппаратуры и реактивов.
ло, 1974, № 3, с. 162Ч 166;
DiFerrante N., Rich С. Поэтому в настоящем справочнике приводится The determination of acid aminopolysaccharide in относительно менее точный химический метод, urine.Ч J. Lab. and Clin. Med., 1956, vol. 48, № 3, который, однако, проще и может быть выполнен p. 491Ч499;
Dische Z. A specific color reaction в КДЛ.
for glucuronic acid.Ч J. Biol. Chem., 1947, Метод по реакции с тиобарбитуровой кисло vol. 71, p. 725Ч730. той. Пр и н ц и п. Эритроциты отмываются от белков плазмы и глюкозы;
содержащийся в них Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Увеличение Гликозилированный гемоглобин гидролизуется содержания в моче гексуроновых кислот бывает нагреванием со щавелевой кислотой, при этом из при приобретенных заболеваниях, поражающих остатков моносахарида образуется 5-оксиметил соединительную ткань,Ч ревматизме, склеро- фурфурол, количество которого определяется по дермии. Уменьшение коэффициента К/О в этом цветной реакции с тиобарбитуровой кислотой.
случае характерно для более тяжелых, деструк- Одновременно определяют концентрацию гемо тивных процессов. Значительное увеличение глобина в гемолизате, результаты выражают имеет место также при врожденной патологии Ч процентами молекул гемоглобина, которые мукополисахаридозах;
в этом случае увеличение гликозилированы.
коэффициента К/О характерно для болезни Ре а к т и в ы. 1. Кислота щавелевая, Гурлера, а уменьшение этого коэффициента Ч 0,5 моль/л: растворяют 22,5 г Н2СгО4 в 0,5 л для болезни Хантера. воды. Реактив стоек. 2. Кислота щавелевая, 0,2 моль/л: готовят из 0,5 моль/л, смешивая в кювете с длиной оптического пути 1 см при 40 мл реактива Г и 60 мл воды. 3. Трихлор- длине волны 443 нм против холостого опыта, уксусная кислота, 400 г/л (40%);
хранят в окраска стабильна на протяжении по крайней холодильнике. 4. Натрия хлорид, 9 г/л (изото- мере 2 ч.
нический раствор). 5. Тиобарбитуровая кислота, На всю серию определений ставят один 50 ммоль/л: растворяют 0,72 г тиобарбитуровой холостой опыт. Для этого смешивают остатки кислоты примерно в 80 мл воды, доводят рН до нескольких гемолизатов и из верхнего слоя 6,0, добавляя 1 н. едкий натр;
переливают в мер- отбирают 1 мл, в нем проводят гидролиз и ную колбу и доводят объем водой до 100 мл. осаждение белков трихлоруксусной кислотой;
6. Реактивы, необходимые для определения так же как и в опыте, отбирают 1,5 мл надоса гемоглобина в гемолизате. 7. Калибровочный дочной жидкости, но к ней добавляют вместо раствор 5-оксиметилфурфурола: 126мг неокра- раствора тиобарбитуровой кислоты 0,5 мл воды.
шенного препарата растворяют в 100 мл Смесь инкубируют вместе с пробами 30 мин при 0,25 моль/л раствора щавелевой кислоты;
полу- 40 С.
чается раствор, содержащий 10 ммоль/л. Его Для построения калибровочного графика к разводят в 100 раз тем же раствором щавелевой 1 мл калибровочного раствора, содержащего кислоты;
получается раствор с концентрацией 5-оксиметилфурфурол в концентрации 12,5Ч 100 мкмоль/л. Из него путем соответствующего 100 мкмоль/л, добавляют 0,5 мл воды и 1 мл разведения 0,25 моль/л щавелевой кислотой раствора трихлоруксусной кислоты, из пробы готовят серию калибровочных растворов с кон- отбирают 1,5мл, к которым добавляют 0,5мл центрациями 12,5Ч100 мкмоль/л. Хранят в раствора тиобарбитуровой кислоты и ставят замороженном состоянии при Ч20 С. Вместо цветную реакцию, инкубируя на водяной бане калибровочного раствора 5-оксиметилфурфуро- при 40 С в течение 30 мин, так же как и в основ ла можно использовать растворы фруктозы, ном опыте. Калибровочные пробы фотометри которые готовят точно так же, только для исход- руют против холостой калибровочной пробы, ного раствора с концентрацией 10 ммоль/л в которую вместо калибровочного раствора берут 180 мг фруктозы, которые растворяют 5-оксиметилфурфурола берут 1 мл раствора ща в 100 мл раствора щавелевой кислоты велевой кислоты 0,25 моль/л.
0,25 моль/л.
Для выполнения расчета сначала вычисляют Хо д о п р е д е л е н и я. Кровь для исследо- содержание гликозилированного гемоглобина в вания берут, используя в качестве антикоагу- 1 л эритроцитов, для этого содержание 5-окси лянта этилендиаминтетрауксусную кислоту или метилфурфурола, вычисленное по калибровоч ее соли. В 10 мл изотонического раствора хлори- ному графику, умножают на 15 (разведение да натрия выливают 0,3Ч0,5 мл цельной крови, при получении гемолизата). Затем вычисляют перемешивают и центрифугируют. Надосадоч- содержание гемоглобина в той же эритроцитяр ную жидкость удаляют, к осадку эритроцитов ной массе, умножая содержание его в гемолиза снова добавляют 10 мл изотонического раствора те на 15;
чтобы перевести полученный результат хлорида натрия, перемешивают и снова центри- в ммоль/л, его делят на 64. Чтобы количество фугируют. Отмытые эритроциты могут хранить- гликозилированного гемоглобина выразить в ся в ожидании анализа при Ч4 С до 15 дней. молярных процентах, его содержание в эритро Взвесь плотноупакованных эритроцитов в цитарной массе, выраженное в ммоль/л, делят количестве 0,1мл переносят в 1,4мл воды на содержание гемоглобина в тех же единицах и перемешивают, в растворе определяют гемо- и умножают на 100. Для расчета можно вос глобин любым методом. При этом надо иметь пользоваться формулой:
в виду, что концентрация гемоглобина в раство ре примерно в 7 раз меньше, чем в цельной крови, т. е. около 20 г/л. Результаты выражают в мо лях на 1 л. где Гли-НЬ Ч содержание оксиметилфурфурола К 1 мл гемолизата добавляют 0,5 мл щаве- в гемолизате (ммоль/л);
НЬ Ч содержание левой кислоты 0,5 моль/л и закрывают пробирку гемоглобина в гемолизате (г/л).
плотной резиновой пробкой, в которую вставле Пр и м е ч а н и е. В данном методе после на тонкая игла для инъекций. Закрытую пробкой гидролиза и осаждения белков трихлоруксус пробирку ставят на кипящую водяную баню и ной кислотой раствор оказывается слегка окра через 10 мин вынимают иглу, а плотно закрытую шенным, поэтому вводят специальную холо пробирку продолжают нагревать при 100 С стую пробу. Ее оптическая плотность очень еще 5 ч. После этого охлаждают в ледяной воде мало варьирует от одного гемолизата к дру и добавляют I мл охлажденной на льду трихлор гому, поэтому можно ставить только одну уксусной кислоты. Тщательно перемешивают и пробу на всю серию.
осадок отделяют центрифугированием в течение 10 мин при l000g. К 1,5мл надосадочной жид- 'Согласно данным автора метода, содержание кости добавляют 0,5 мл раствора тиобарбитуро- 5-оксиметилфурфурола в калибровочном растворе вой кислоты и помещают на 30 мин в водяную может быть рассчитано по формуле:
баню при 40 С, после этого фотометрируют где Е443 Ч оптическая плотность при длине См. с. 107. волны 443 нм.
Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы. Содержа- формамида. 4. 5 % трихлоруксусная кислота ние гликозилированного гемоглобина, опреде- (0,3 н.).
ленное этим методом, 4,5Ч6,1 молярных %, Ход о п р е д е л е н и я. 0,02 мл крови выли коэффициент вариации методики, по данным вают в 1 мл 5 % трихлоруксусной кислоты, через авторов, 5,7 %. несколько минут центрифугируют. К 0,2 мл безбелкового фильтрата прибавляют 0,1 мл Ли т е р а т у р а. Standefer J. С., Eaton R. Р. смеси медного купороса и фосфорной кислоты Evolution of colorimetric method for determina- и 2,5 мл концентрированной серной кислоты.
tion of glycosilated hemoglobin.Ч Clin. Chem., Энергично встряхивают и точно через 3 мин ста 1983, № 1, vol. 29, p. 135Ч137. вят ровно на 3 мин в кипящую водяную баню, затем еще 3 мин охлаждают в ледяной воде.
Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Количество Добавляют 1 каплю раствора параоксидифени гликозилированного гемоглобина Ч важный по- ла в диметилформамиде, эта капля должна казатель эффективности лечения диабета. Чем сразу попасть в центр пробирки;
встряхивают ближе к норме его содержание, тем лучше и оставляют стоять 10 мин при комнатной темпе подобрана терапия. ратуре. После этого нагревают на кипящей водяной бане 1' / 2Мин, охлаждают в воде и фотометрируют при длине волны 565 нм.
Одновременно ставят холостой опыт, в кото 5.5.7. Молочная кислота рый вместо безбелкового фильтрата берут 5 % раствор трихлоруксусной кислоты, и калибро Метод по реакции с параоксидифенилом.
вочные опыты, в которые берут растворы три Пр и н ц и п. Из молочной кислоты в присут хлоруксусной кислоты, содержащие в 0,2 мл ствии серной, фосфорной кислот и солей меди 2Ч20 нмоль молочной кислоты или молочно образуется уксусный альдегид, который, реаги кислого лития;
их обрабатывают так же, как руя с параоксидифенилом (С6Н5С6Н4ОН), дает опытные. Окраска калибровочной пробы, в кото фиолетово-окрашенные продукты. Реакция рую взято 2 нмоля молочной кислоты, соответ очень чувствительна, поэтому надо строго вы ствует пробе с содержанием 0,5 ммоль/л;
соот держивать все условия выполнения исследова ветственно окраска пробы, содержащей 20 нмоль, ния.
соответствует концентрации 5 ммоль/л.
Ре а к т и в ы. 1. Концентрированная серная Но р ма л ь н ые в е л и ч и н ы. В хорошо кислота, выдерживающая пробу Саваля. От ее артериализованной крови содержание молочной качества зависит возможность выполнения кислоты должно быть ниже 1 ммоль/л.
анализа, иногда качество кислоты можно улуч Ли т е р а т у р а. Балаховский И. С., Нато шить, нагревая ее и по каплям добавляя в чин Ю. В. Проблема космической биологии.Ч нагретую кислоту перекись водорода. 2. Смесь М.: Наука, 1973, т. XXII, с. 32.
из 3 г медного купороса (CuSO4-5H2O) и 9 мл ортофосфорной кислоты. Должен образоваться К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Любая гомогенный раствор, на что уходит некоторое форма гипоксии Ч при наркозе, физической время. 3. 1,5 % раствор параоксидифенила нагрузке, местном нарушении кровообраще (С6Н5С6Н4ОН) в диметилформамиде. Раство- ния Ч приводит к увеличению содержания мо ряют 15 мг параоксидифенила в 1 мл диметил- лочной кислоты в крови.
5.6. ЛИПИДЫ Липиды нерастворимы в воде, поэтому протеидов низкой плотности (LDL), которые в плазме крови они присутствуют только в содержат апопротеиды группы В, при электро составе липопротеидов, которые образуют устой- форезе попадают главным образом в (3-полосу.
чивые коллоидные растворы и по многим свой- Самые мелкие частицы у липопротеидов высо ствам близки к белкам. Для каждого липопро- кой плотности (HDL), в состав которых входят теида специфична его белковая часть Ч апо- апопротеиды А, при электрофорезе они попада протеид, которая и определяет свойства ком- ют в а-полосу.
плекса в целом и его клинико-физиологическое Поскольку современная лабораторная диаг значение. Липидная часть менее специфична, ностика не располагает простыми и надежными так как разные липопротеиды содержат одни методами количественного определения индиви и те же липидные вещества, но в разных соотно- дуальных липопротеидов по их апопротеидам, шениях. Исследовав липидный состав плазмы, приходится использовать косвенные методы;
можно лишь приблизительно оценить ее лиио- электрофоретическое исследование, осаждение протеидный состав. гепарином и определение содержания отдельных Различают три группы, или семейства, липо- липидов.
протеидов. Наиболее крупные частицы у хило- В плазме крови человека присутствуют микронов и липопротеидов очень низкой плот- четыре основных класса липидов: 1) холестерин ности (VLDL), они богаты триглицеридами, и его эфиры;
2) триглицериды;
3) фосфолипиды;
содержат апопротеиды, обозначаемые латин- 4) неэтерифицированные жирные кислоты ской буквой С. Менее крупные частицы у липо- (НЭЖК). Первые три класса веществ образуют комплексы с апопротеидами и входят в состав чивость остатков жирных кислот, образующих липопротеидов, НЭЖК главным образом адсор- эфиры, осложняет анализ.
бированы на альбумине. Наибольшее клини- В эритроцитах, так же как и в других клет ческое значение имеет определение холестерина ках, содержится лишь свободный холестерин, и триглицеридов Ч клиническое значение НЭЖК количество которого значительно отличается от значительно скромнее;
фосфолипидам крови содержания в плазме, поэтому, хотя и прослежи сейчас также не придают большого клиниче- вается общий параллелизм между его содержа ского значения. нием в плазме и цельной крови, практически для исследования пригодна лишь плазма или сы Для определения холестерина используются обычно характерные для него цветные реакции, воротка.
триглицериды определяют по количеству входя- Методы определения. Самым точным мето щего в их состав глицерина, НЭЖК Ч титро- дом определения холестерина считается фер метрическим методом, а фосфолипиды Ч по ментативный, основанный на действии холесте входящему в их состав фосфору. В настоящем риноксидазы, в результате чего образуются разделе рассматриваются лишь методы опреде- холестенон и перекись водорода. Оба эти ления холестерина, триглицеридов и НЭЖК;
вещества могут быть определены сравнительно определение фосфолипидов излагается вместе простыми методами: холестенон Ч по измене с методами определения фосфорных соединений. нию светопоглощения при длине волны 240 нм, Перспективен метод инфракрасной спектроско- перекись водорода Ч теми методами, которые пии, позволяющий одновременно определять используются при определении глюкозы. Слож концентрацию нескольких различных липидов. ность ферментных методов определения холесте Сложноэфирная связь, соединяющая остат- рина в первую очередь определяется дефицитом ки жирных кислот с глицерином в триглицери- соответствующих ферментов, которые трудно дах и фосфолипидах, а также участвующая очистить от каталазы, разрушающей перекись в образовании эфиров холестерина, очень водорода, а также тем, что фермент активен нестойка, она разрушается в щелочной среде, лишь в отношении свободного холестерина, а также под влиянием присутствующей в плаз- поэтому эфирносвязанный холестерин должен ме диацилглицеролипазы, которая активируется быть предварительно гидролизован. Преиму гепарином, вероятно, и под действием других щество ферментного метода состоит в том, что он гидролитических ферментов. Поэтому кровь для может быть применен непосредственно к сыво исследования липидов необходимо брать с со- ротке или плазме без предварительного разру блюдением ряда предосторожностей: лучше шения липопротеидных комплексов. В условиях всего анализировать плазму, полученную с лаборатории лечебного учреждения можно на ЭДТА (трилоном Б) в качестве антикоагулянта;
ладить такое определение холестерина только получение плазмы должно проводиться по с помощью выпускаемых промышленностью возможности на холоду, а хранение должно наборов реактивов, поэтому в справочнике эти быть ограниченным по времени. методы не приводятся.
При окислении холестерина, так же как и при его дегидратировании, могут образовываться самые разнообразные окрашенные или флюо 5.6.1. Холестерин и его эфиры ресцирующие продукты. На этом основано не Находящийся в тканях свободный (неэтери- сколько цветных реакций на холестерин. Из них фицированный) холестерин входит в состав в аналитических целях широкое распростране клеточных мембран. Переходя в плазму крови, он ние получили две: Либермана Ч Бурхарда и там этерифицируется, образуя сложные эфиры ЗлаткисаЧЗака. Первая из них заключается с жирными кислотами, источником которых слу- в том, что в сильно кислой среде в присутствии жит фосфатидилхолин (лецитин). Реакция пере- уксусного ангидрида от холестерина отщепляет этерификации ускоряется плазмаспецифическим ся вода и образуется окрашенное в зеленовато ферментом фосфатидилхолинхолестеринацил- синий цвет соединение, содержащее несколько трансферазой, которая вырабатывается пе- сопряженных двойных связей, предположитель ченью. При заболеваниях печени, когда нару- но бисхолестадиенилмоносульфоновую кислоту.
шена выработка фермента, количество эфиров Реакция может протекать в самых разнообраз холестерина в плазме крови уменьшается. Среди ных растворах, содержащих, помимо уксусного жирных кислот, которые соединяются эфирной ангидрида, уксусную и серную кислоты, а также связью с холестерином, больше всего линолевой органические растворители, лишь бы среда была (18:2), олеиновой (18:1) и пальмитиновой (16:0) абсолютно безводной. Протеканию реакции спо кислот. В меньших количествах присутствуют собствуют арилсульфоновые кислоты Ч сульфо и другие жирные кислоты с 16Ч20 атомами угле- салициловая, паратолуенсульфоновая, диметил рода;
соотношение их может сильно варьировать бензолсульфоновая. Эфиры холестерина в этих и зависит главным образом от состава поступаю- условиях расщепляются и окрашивание разви щих с пищей жиров. Помимо холестерина, в вается, но реакция идет медленнее, чем со сво организме, в частности в плазме крови, присут- бодным холестерином. Реакция ускоряется при ствуют в небольших количествах продукты его повышении температуры, яркий свет разрушает неполного биосинтеза и распада, растительные окрашенные продукты. Помимо холестерина, стероиды из пищи, сульфитированныо производ- ряд других родственных продуктов дает такое ные и т. д. Присутствие этих производных, хотя же окрашивание, но в связи с тем что в биологи и в небольших количествах, так же как и измен- ческих жидкостях их мало, реакция оказывается достаточно специфичной для холестерина, ловым спиртом быстрее и эффективнее, поэтому превосходя в этом отношении другие химические она рекомендована в унифицированных методах.
реакции. Наиболее вероятная причина завышен- Поскольку холестерин обычно определяют в тех ных результатов Ч присутствие билирубина или же случаях, что и триглицериды, желательно гемоглобина. использовать реактив, одинаково хорошо Другая цветная реакция, получившая широ- экстрагирующий оба вещества, например смесь кое распространение в медицинской практике, гексанЧизопропиловый спиртЧсерная кислота.
называется реакцией ЗлаткисаЧЗака. Она В целом при ручной работе экстракционные основана на том, что при окислении холестерина методы оказываются точнее и надежнее.
хлорным железом в концентрированной серной В некоторых случаях, например при проведе кислоте развивается красно-фиолетовое окра- нии эпидемиологических исследований, жела шивание. Эта реакция в 4Ч5 раз чувствитель- тельно анализировать высушенный материал, нее, чем реакция ЛиберманаЧБурхарда, но который удобно пересылать и хранить. Для менее специфична, поскольку более широкий этого плазму крови высушивают на фильтро круг веществ, в частности витамин А, дает такое вальных бумажках;
сложность анализа в этом же окрашивание, как и холестерин. Как и в случае определяется тем, что прочность связи случае реакции ЛиберманаЧБурхарда, эфирно- холестерина с белками увеличивается и прихо связанный холестерин дает окрашивание, но дится предварительно обрабатывать белково медленнее, чем свободный. липидный комплекс щелочью, которая гидроли Присутствующие в плазме крови эфиры зует большинство сложноэфирных связей.
холестерина образуются непосредственно в Унификация методов. Учитывая разнообра плазме в результате переноса остатков жирных зие как возможностей, так и потребностей лабо кислот фосфатидилхолинов (лецитина) на сво- раторий различных лечебных учреждений, бодный холестерин. Эта реакция ускоряется унифицировано несколько методов определения плазмаспецифическим ферментом ЛХАТ, кото- холестерина. Для небольших лабораторий не рый вырабатывается печенью. При ее пораже- специализированных лечебных учреждений нии синтез фермента нарушается и количество подходит унифицированный в 1972 г. метод эфиров холестерина уменьшается. Поэтому определения общего холестерина по реакции степень этерификации холестерина имеет опре- с уксусным ангидридом, а также унифициро деленное клинико-диагностическое значение. ванный в 1972 г. прямой метод определения об Для ее определения чаще всего используют щего и эфирносвязанного холестерина по реакции способность свободного холестерина образовы- с хлорным железом. Для более крупных лабора вать нерастворимые соединения с дигитонином, торий лечебных учреждений кардиологического томатином, пиридинсульфатом и другими веще- или эндокринологического профиля более подхо ствами, по большей части гликозидами;
исполь- дит унифицированное в 1979 г. определение зуют также хроматографическое разделение общего и свободного холестерина по реакции свободного и эфирносвязанного холестерина, с хлорным железом после экстракции изопропа существуют и так называемые кинетические нололом.
методы, которые основываются на том, что сво- Общий холестерин. Унифицированный метод бодный холестерин образует цветное окраши- по реакции с уксусным ангидридом (метод вание, значительно быстрее, чем его эфиры. Илька). Пр и н ц и п. Присутствующий в плаз Для рядовых лабораторий, где работа выпол- ме или сыворотке крови холестерин и его эфиры няется вручную, хроматографические методы дают цветное окрашивание при обработке слишком громоздки, кинетические мало надеж- смесью уксусного ангидрида, серной и уксусной ны, поэтому практически пригодны лишь методы кислот.
с осаждением дигитонином. При определении Ре а к т и в ы. 1. Ледяная уксусная кислота.
эфиров холестерина всегда надо иметь в виду, 2. Концентрированная серная кислота. 3. Уксус что эти соединения непрочные, легко гидроли- ный ангидрид. 4. Абсолютный этиловый спирт.
зуются в щелочной среде.
5. Кислотная смесь: в сухую колбу наливают Присутствующие в плазме крови белки и 10 мл ледяной уксусной кислоты и 50 мл уксус пигменты мешают количественному определе- ного ангидрида, затем при постоянном переме нию холестерина посредством цветных реакций, шивании и охлаждении добавляют 10 мл кон обуславливая дополнительное окрашивание или центрированной серной кислоты. Смесь должна мутность раствора, поэтому наиболее точные быть бесцветной или слегка желтоватой, хра методы предполагают выделение холестерина нить в холодильнике в темной склянке с притер путем экстракции различными комбинациями той пробкой. 6. Калибровочный раствор:
смесей этилового и изопропилового спирта, 232 мг холестерина растворяют в 2Ч3 мл хлоро эфира, ацетона и т. д. и омыление (гидролиз) форма и доводят до объема 100 мл абсолют эфиров щелочью. В последние годы, особенно ным этиловым спиртом. Приготовленный после появления автоанализаторов, разработа- раствор содержит холестерин в концентрации ны достаточно совершенные прямые методы, т. е. 6 ммоль/л.
без предварительного выделения холестерина Ход о п р е д е л е ни я. К2,1 мл кислотной путем экстракции. Более старые, классические смеси медленно по стенке пробирки добавляют методы определения холестерина предусматри- 0,1 мл плазмы или сыворотки без признаков вали использование в качестве экстрагентов гемолиза, перемешивают встряхиванием и ста смесей спирт Ч эфир или спирт Ч петролейный вят на 20 мин в термостат или водяную баню при эфир, но оказалось, что экстракция изопропи- 37 С, затем фотометрируют в кювете с длиной оптического пути 0,5см против реактива при ны 530 нм в кювете с длиной оптического пути длине волны 625 нм. 1 см против холостого опыта, в который берут По с т р о е н и е к а л и б р о в о ч н о й 1,3мл уксусной кислоты, 0,05мл исследуемой к р и в о й и р а с ч е т. К 0,05Ч0,2 мл калибро- сыворотки или плазмы и 1 мл концентрирован вочного раствора добавляют такое количество ной серной кислоты.
кислотной смеси, чтобы общий объем был 2,2 мл, Для приготовления калибровочного графика перемешивают и выдерживают 20 мин при 37 "С, вместо исследуемого материала берут 0,05Ч так же как и опытные пробы, а затем фотомет- 0,2 мл калибровочного раствора, к которому рируют. Окраска калибровочной пробы, в кото- добавляют уксусную кислоту до суммарного рую взято 0,05 мл калибровочного раствора, объема 1,35мл, а затем добавляют 1 мл цвет соответствует содержанию холестерина в плазме ного реактива. Проба, в которую взяли 0,05 мл 3 ммоль/л, пробы, в которую взято 0,1 мл,Ч калибровочного реактива, по окраске соответст содержанию 6 ммоль/л и т. д. вует опытной пробе с содержанием холестерина в исследуемом материале 3 ммоль/л;
проба, Пр и м е ч а н и я. 1. Попадание воды приво в которую взяли 0,1 мл калибровочного раство дит к помутнению раствора. 2. Следы гемо ра, соответствует содержанию холестерина лиза или желтушность исследуемой плазмы 6 ммоль/л и т. д. Расчет проводят по калибро или сыворотки служат причиной завышенных вочному графику.
результатов. 3. Можно использовать для Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы см. табл. фотометрии и кюветы с длиной оптического пути 1 см, тогда количество кислотной смеси Ли т е р а т у р а. Zlatkis A., Zak В., удваивают, а количество исследуемого мате- Boyle A. J. Lab. Cl i n. Med., 1957, vol. 50, №2, риала остается прежним. p. 318;
Rosenthal N. I. et al. J. Lab. Clin. Med., 1953, vol. 41, p. 486.
Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы см. табл. 42.
Ли т е р а т у р а. Пса S. Zschr. ges. inn.
Med., 1962, В. 17, H. 2, S. 83.
5.6.2. Экстракционные методы Унифицированный метод по реакции с хлор- определения холестерина и его эфиров ным железом (метод ЗлаткисЧЗака). Пр и н цип. Содержащийся в плазме или сыворотке Унифицированный метод по реакции с хлор крови свободный и эфирносвязанный холесте- ным железом после экстракции изопропанолом.
рин окисляется хлорным железом в присутствии Пр и н ц и п. Холестерин и его эфиры экстраги уксусной, серной и фосфорной кислот с образо- руют из плазмы или сыворотки изопропанолом.
ванием ненасыщенных продуктов, окрашенных Для определения общего содержания холестери в красно-фиолетовый цвет. Фосфорная кислота на он весь окисляется хлорным железом в повышает стойкость реактива, содержащего растворе уксусной, серной и фосфорной кислот хлорное железо. с образованием ярко окрашенных красно Ре а к т ив ы. 1. Ледяная уксусная кислота. фиолетовых продуктов. Для определения сво Для проверки качества реактива к 2Ч4 мл бодного холестерина он осаждается в виде уксусной кислоты добавляют несколько кристал- комплекса с дигитонином, осадок промывается лов перманганата калия, перемешивают. На ацетоном и содержание холестерина опреде протяжении 40 мин раствор не должен менять ляется по той же цветной реакции.
окраски. Кислоту, которая не выдерживает Ре а к т ив ы. 1. Изопропиловый спирт (изо этого испытания, можно очистить, прокипятив пропанол). 2. Уксусная кислота ледяная.
с хромовым ангидридом и затем подвергнув 3. Ортофосфорная кислота;
содержит 85% перегонке. 2. Серная кислота концентрирован- Н3РО4. 4. Серная кислота концентрированная.
ная. 3. Железо хлорное FеСl3-6Н2О. 4. Орто- 5. Железо хлорное, раствор в фосфорной фосфорная кислота;
содержит 85% Н3РО4. кислоте: 2,5 г FeCI3-6H2O растворяют при 5. Раствор хлорного железа: 2,5 г хлорного нагревании примерно в 80 мл ортофосфорной железа растворяют в 80 мл ортофосфорной кислоты, объем доводят ортофосфорной кисло кислоты, нагревая до полного растворения той до 100мл. 6. Цветной реактив: к 8 мл препарата, затем охлаждают и доводят объем раствора хлорного железа осторожно при пере до 100 мл ортофосфорной кислотой. 6. Цветной мешивании приливают серную кислоту до сум реактив: к 8 мл раствора хлорного железа марного объема 100 мл. 7. Дигитонин, раствор добавляют серную кислоту так, чтобы суммар- 10 г/л: 1 г дигитонина растворяют при нагрева ный объем был 100 мл. 7. Калибровочный нии в 50 мл этилового спирта, добавляют 50 мл раствор холестерина в уксусной кислоте: воды и через некоторое время, после охлажде 116 мг холестерина растворяют в 100 мл ледяной ния, фильтруют. 8. Ацетон. 9. Калибровочный уксусной кислоты. Раствор содержит холестерин раствор: 38,7 мг холестерина растворяют в в концентрации 3 ммоль/л. 100мл изопропанола, получают раствор, содер Ход о п р е д е л е н и я. К 1,3мл уксусной жащий 1 ммоль/л;
его разводят в 5 раз изопро кислоты осторожно добавляют 0,05 мл плазмы панолом, получая раствор, содержащий или сыворотки без следов гемолиза, перемеши- 200 мкмоль/л.
вают, а затем добавляют 1 мл цветного реакти- Ход о п р е д е л е н и я. К 0,2 мл исследуе ва, хорошо перемешивают встряхиванием и мой плазмы или сыворотки добавляют при оставляют на 30 мин при комнатной темпера- постоянном встряхивании 4,8 мл изопропанола, туре, после чего фотометрируют при длине вол- тщательно перемешивают и через 10 мин центрифугируют 5 мин, отсасывают надосадоч- 15 мин фотометрируют при длине волны 560 нм ную жидкость (экстракт);
1 мл экстракта в кюветах с длиной оптического пути 0,5см используется для определения общего холесте- против холостой пробы, в которую берут 1 мл рина, а 2 мл Ч для определения свободного изопропанола, 2 мл уксусной кислоты и 2 мл холестерина. цветного реактива.
Для определения общего холестерина к 1 мл Ка л и б р о в к а и р а с ч е т. Для калибров экстракта добавляют 2 мл уксусной кислоты, ки к 1 мл калибровочного раствора добавляют тщательно перемешивают, а затем добавляют 2 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл цветного 2 мл цветного реактива, опять перемешивают и реактива и через 10Ч15 мин фотометрируют оставляют стоять 10Ч15 мин. Фотометрируют в в таких же условиях, как и опытные пробы.
кювете с длиной оптического пути 0,5 см при При расчете количества общего холестерина длине волны 560 нм против холостой пробы, калибровочная проба соответствует содержанию в которую берут вместо экстракта плазмы 1 мл 5 ммоль/л холестерина, а при расчете содержа изопропанола. ния свободного холестерина Ч 2,5 ммоль/л.
Для определения свободного холестерина к 2 мл экстракта добавляют 1 мл раствора Ли т е р а т у р а. Сентебова Н. А. Предло дигитонина, закрывают пробкой и оставляют жения по унификации методов определения на 30 мин, после чего 10 мин центрифугируют. свободного и этерифицированного холестерина Надосадочную жидкость осторожно удаляют в сыворотке крови.Ч Лаб. дело, 1976, № 6, и выбрасывают, к осадку добавляют 3 мл аце- с. 375Ч380;
Leffler H. Amer. J. Clin. Pathol., тона, перемешивают и снова центрифугируют 1959, vol. 31, p. 310Ч313.
5 мин. Надосадочную жидкость удаляют и оставляют пробирки открытыми на несколько Но р м а л ь н ые в е л и ч и н ы. Содержа минут для испарения остатков ацетона. К сухо- ние общего холестерина составляет 3,9Ч му осадку добавляют 1 мл изопропанола и 2 мл 6,5 ммоль/л (150Ч250 мг в 100 мл), из них уксусной кислоты, перемешивают и затем добав- 70% этерифицированный, а 30% свободный.
ляют 2 мл цветного реактива, при этом осадок Более подробная возрастная норма приведена должен полностью раствориться. Через 10 Ч в табл. 40.
Т а б л и ц а 40. Верхние границы содержания холестерина в сыворотке здоровых мужчин в зависи мости от возраста (по данным Института кардиологии АМН СССР) Возрастные группы (годы) 10Ч19 20Ч29 30Ч39 40Ч49 50Ч59 60 и более Содержание холестерина, ммоль/л 5,5 5,84 6,18 6,54 6,88 7, Триглицериды, ммоль/л 1,53 1,82 2,21 2,71 3,27 3, Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Повышение Ре а к т и в ы. 1. Бумага для высушивания содержания холестерина свидетельствует об крови. Используют хроматографическую бумагу угрозе развития атеросклероза;
чаще всего или беззольные фильтры. Если при постановке холестерин увеличен при II типе гиперлипо- холостого опыта выясняется, что в бумаге протеидемии, повышается он также при диабете содержатся вещества, дающие цветную реакцию и нефритах. Понижение1 содержания холестери- с уксусным ангидридом, ее обрабатывают в на чаще всего бывает при гипертиреоидизме. аппарате Сокслета на протяжении 1Ч2 рабочих дней метанолом и дихлорметаном. 2. 0,3 н.
Определение холестерина в биологическом раствор едкого натра (NaOH). 3. Смесь материале, высушенном на бумаге. Пр и н - дихлорметан-метанол 2:1. В день определения цип. При проведении эпидемиологических смешивают 2 объема дихлорметана и 1 объем исследований возникает необходимость пересы- метанола (метилового спирта), готовят в таком лать пробы, собранные для исследования;
в этом количестве, которое будет израсходовано за случае удобно предварительно высушивать их I рабочий день. Вместо дихлорметана можно на бумаге, так как это не только упрощает брать хлороформ. 4. Кислотная смесь: готовят пересылку, но и обеспечивает консервацию. в день определения путем смешивания 2,5 мл Пробы биологического материала Ч кровь, концентрированной серной кислоты, 25 мл уксус плазму, сыворотку Ч наносят на специально ного ангидрида и 50 мл хлороформа. 5. Кали отмытую фильтровальную бумагу и высушивают бровочный раствор, 3 ммоль/л. Готовят, раство на воздухе. Липопротеидный сгусток высушен- ряя 58 мг холестерина в 50 мл хлороформа.
ного материала растворяют в щелочи, затем Хо д о п р е д е л е н и я. На сухую фильтро разделяют в смеси хлороформЧметанол на вальную бумагу наносят микропипеткой иссле липидную и водорастворимую фракции. Липид- дуемый материал так, чтобы определенный ную фракцию выпаривают и в сухом остатке участок бумажки был равномерно смочен, и определяют холестерин по цветной реакции дают высохнуть на воздухе. На краю бумаги, с уксусным ангидридом. В процессе обработки не смоченной плазмой, карандашом записы щелочью эфиры холестерина разрушаются. вают номер пробы, фамилию и другие паспорт ные данные. Проба высыхает на воздухе электрофоретической подвижностью в и пре-в обычно за 2Ч3 ч, после чего ее можно пересы- осаждаются гепарином в присутствии солей лать по почте, упаковывать в конверт и т. д. марганца и удаляются центрифугированием, Ножницами аккуратно вырезают пятно высу- при этом хиломикроны всплывают, образуя шенного биологического материала, удаляя пленку. В растворе остаются только а-липо поля, на которых сделаны записи, бумажку протеиды, в которых содержание холестерина разрезают на несколько кусочков и кладут в определяют любым из описанных методов.
колбочку или стаканчик, куда наливают также Ре а к т и в ы. 1. Марганца хлористого 1,5мл 0,3 н. NaOH и оставляют на несколько 1 моль/л раствор: 197,90 г МnСl2-4Н2О раство часов, желательно на ночь. Если исследуют ряют в воде и объем доводят в мерной колбе до кровь, полноту смывания легко контролировать 1 л. Препарат гигроскопичен, поэтому лучше по виду бумажки;
если исследуется сыворотка, сразу приготовить большое количество раство то конец растворения сгустка не виден, ра, который разливают в несколько флаконов и поэтому лучше оставить ее стоять на большее используют по мере надобности. 2. Гепарин Ч время. После этого добавляют 15 мл смеси фармакопейный раствор, содержащий 5000 ЕД метаноЧдихлорметан или метаноЧхлоро- в 1 мл. Разные препараты несколько отличаются форм, при этом образуется однородный раствор, по осаждающим свойствам, поэтому рекомен который перемешивается легкими покачивания- дуют сделать запас из одной партии и всегда ми. Для расслоения добавляют 3 мл воды и им пользоваться.
слегка перемешивают стеклянной палочкой, Ход о п р е д е л е н и я. В пробирку, уста внизу оказывается бесцветная неводная фаза, новленную в штативе на ледяной бане, поме а наверху водная, которая может быть окрашен- щают сначала 1 мл исследуемой плазмы или ной, если высушивалась кровь или гемолизиро- сыворотки, затем 0,04 мл препарата гепарина, ванная сыворотка. Нижнюю фазу отсасывают перемешивают, после чего добавляют 0,04 мл тонкой пипеткой, выпаривают в токе воздуха, 1 М раствора марганца хлорида, снова тща к сухому остатку прибавляют 3 мл кислотной тельно перемешивают и оставляют стоять на смеси и оставляют в темноте на 30 мин, после льду еще на 30 мин. Центрифугируют 30 мин чего фотометрируют при длине волны 625 нм. при 2500 об/мин желательно при температуре Одновременно ставят холостой опыт, в кото- 4Ч6 С. Пробирки из центрифуги надо выни рый вместо высушенного материала берут кусоч- мать осторожно, так как легко взмутить осадок., ки той же самой фильтровальной бумаги, на Нижний слой содержит осажденные в-липо которой высушивали плазму;
обычно исполь- протеиды, верхний Ч растворенные а-липопро зуют обрезки от фильтров. Если холостой опыт теиды, над которым может плавать еще кольцо дает заметную величину порядка 0,05Ч0,1, хиломикронов. Пипеткой с тонким носиком осторожно отсасывается слой, содержащий надо фотометрировать на трех длинах волн (525, 625 и 725 нм) и результаты рассчитывать по а-липопротеиды, который используют для опре формуле: деления холестерина любым из описанных выше методов.
Если сыворотка хилезная, сверху может быть большой слой хиломикронов, из-под кото В Противном случае достаточно фотометриро рого трудно взять пробу. В этом случае реко вать против холостого опыта.
мендуют повторить определение, взяв несколько По с т р о е н и е к а л и б р о в о ч н о й миллилитров сыворотки и соответственно увели к р и в о й и р а с ч е т. Для построения калибро чив другие реактивы, при этом прозрачный вочной кривой в три пробирки вносят 0,1;
0, слой оказывается больше и из него легче взять и 0,3 мл калибровочного раствора, содержащего пробу.
3 ммоль холестерина в 1 л хлороформа, т. е.
Калибровку проводят так же, как и в методе в первую пробирку берут 0,3 мкмоля, во вторую определения холестерина, с той разницей, что 0,6 мкмоля, а в третью 0,9 мкмоля. Калибровоч содержание холестерина а-липопротеидов зна ные растворы выпаривают и ставят цветную чительно ниже, чем общего, поэтому калибровоч реакцию так же, как и в опыте. По полученным ный раствор должен соответствовать содержа точкам строят калибровочную кривую, учиты нию 1Ч2 ммоля холестерина в 1 л.
вая, что первая точка соответствует содержа Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы. 0,9Ч нию холестерина в крови 3 ммоль/л, вторая Ч 1,9 ммоль/л.
6 ммоль/л, а третья Ч 9 ммоль/л.
Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Содержа Н о р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы :
ние холестерина а-липопротеидов в крови здоро 2,5Ч4 ммоль/л (100Ч160 мг в 100 мл) в цельной вых людей мало меняется с возрастом и не крови.
подвержено колебаниям вследствие различных Ли т е р а т у р а. Балаховский И. С., Нато других причин. Величины ниже 0,9 ммоль/л чин Ю. В. Проблемы космической биологии.Ч свидетельствуют о нарушении липидного обмена М.: Наука, 1973, т. 22, с. 36Ч56.
и угрозе развития атеросклероза. Повышение содержания холестерина а-липопротеидов, как 5.6.3. Холестерин а-липопротеидов и.повышение общего холестерина в результате увеличения этой фракции, является доброка Определение после осаждения в-липопротеи- чественным состоянием.
дов гепарином в присутствии солей марганца. Ли т е р а т у р а. Титов В. Н., Брснер Е. Д., Пр и н ц и п. Липопротеиды, обладающие Задоя А. А. и др. Метол и диагностическая значимость исследования содержания холесте- Унификация методов. В 1974 г. был унифи рина в а-липопротеидах.Ч Лаб. дело, 1979, цирован широко распространенный в то время, № 1, с. 36Ч41. но трудоемкий метод определения триглице ридов, предложенный Карлсоном. Трудоемкость его была вызвана тем, что липидный экстракт, 5.6.4. Триглицериды содержащий Триглицериды, очищался адсорб цией на кремниевой кислоте от фосфолипидов, Триглицериды или нейтральные жиры пред- а формальдегид, образовавшийся при окисле ставляют собой сложные эфиры глицерина и нии глицерина, определялся по реакции с хро трех остатков жирных кислот, чаще всего мотроповой кислотой, которая идет только в с 16 или 18 атомами углерода. Точный состав определенных условиях. Разработанные затем жирнокислотных остатков может колебаться методы избирательной экстракции триглицери в определенных пределах и зависит главным дов позволяют за один этап получать доста образом от характера питания. Поэтому говорят точно чистый экстракт. Метод упростился так о триглицериде не как об индивидуальном же благодаря использованию менее капризной химическом веществе, а как о группе родствен- реакции на формальдегид с ацетилацетоном.
ных соединений. Это осложняет выражение На этом основан метод, унифицированный результатов анализа в весовых единицах, т. е. в 1979 г.
в г/л или мг/100мл, так как существующие Условия взятия материала для исследова аналитические методы позволяют определять ния. В связи с тем что Триглицериды Ч нестой количество молекул триглицеридов, но молеку- кие соединения, легко разрушающиеся под лярная масса в разных образцах может быть влиянием сывороточных ферментов, исследова несколько отличной. Другая аналитическая ние предпочтительнее делать в плазме, получен сложность вызвана нестойкостью сложноэфир- ной с использованием трилона, так как гепарин ной связи, которая легко распадается в щелоч- тоже активирует липазу. Хранение пробы не ной среде, а также под действием ферментов сколько дней, особенно если туда попадут сыворотки или микроорганизмов. микроорганизмы, также может быть причиной Методы определения. Не существует хими- заниженных результатов.
ческих реакций, специфичных для молекулы Унифицированный метод по реакции с аце триглицерида в целом;
их количество опреде- тилацетоном после экстракции смесью гептана ляют чаще всего по содержанию глицерина, и изопропилового спирта. Пр и н ц и п. Три который образуется при щелочном или фермен- глицериды экстрагируются смесью гептана и изо тативном гидролизе. Этот путь связан с той труд- пропилового спирта, в которую переходят толь ностью, что глицерин входит также в состав ко неполярные липиды, а более полярные фосфолипидов, поэтому определение должно фосфолипиды остаются в водной фазе. Тригли начинаться с выделения фракции нейтрального цериды омыляются (гидролизуются) щелочью, жира, свободной от фосфолипидов, или нужно глицерин окисляется йодной кислотой до форм проводить гидролиз очень специфическим фер- альдегида, который определяется по цветной ментом, который бы отщеплял глицерин только реакции с ацетилацетоном.
от триглицеридов, но не от других соединений. Ре а кт ив ы: 1. Гептан. 2. Изопропило Очень точный и удобный ферментативный вый спирт.(изопропанол) 3. 0,08 н. серная метод заключается в том, что фосфоэнолпиро- кислота (примерно 2,2 мл концентрированной виноградная кислота в присутствии АДФ и H2SO4 на 1 л воды). 4. Едкое кали, 6,25 моль/л:
ферментов глицерокиназы и пируваткиназы фос- 17,8 г K.ON растворяют в 50 мл, осторожно форилирует глицерин, при этом освобождается добавляя гранулы щелочи в воду, охлаждая и пировиноградная кислота, количество которой перемешивая. 5. Уксусная кислота, 50 г/л.
определяют по ее способности окислять НАД-Н 6. Йодная кислота: растворяют 0,6 г HIO4-2H2O в присутствии лактатдегидрогеназы, при этом (перйодная кислота) в 100 мл 5 % уксусной поглощение света с длиной волны 330Ч340 нм кислоты. 7. Аммония ацетат 2 моль/л: раство падает. Для реализации этого метода необхо- ряют 154 г ацетата аммония во воде, объем димы три фермента и три кофактора, поэтому доводят до 1 л. 8. Ацетилацетоновый реактив:
он может быть налажен только в тех лаборато- 1,5 мл ацетилацетона (СН3СОСН2СОСН3) риях, где имеются соответствующие наборы разводят раствором уксуснокислого аммония до реактивов заводского изготовления. суммарного объема 200 мл. Хранят в сосуде Химические методы основаны также на оп- из темного стекла. 9. Калибровочный раствор ределении глицерина, который окисляют йод- триолеина, 2 ммоль/л. Содержит 170 мг три ной кислотой до формальдегида, способного олеина в 100 мл изопропилового спирта. Мож давать темно фиолетовое окрашивание с хро- но использовать и другие калибровочные раст мотроповой кислотой или желтое с ацетилаце- воры, перечисленные в примечании.
тоном. Последняя реакция имеет то удобство, что образующееся вещество можно определять Пр и ме ч а н и е. Если использовать для не только спектрофотометрически, но и флюоро- калибровки раствор триолеина в изопро метрически. Заслуживает внимания и весьма пиловом спирте, то после экстракции и рас перспективный метод, основанный на измере- слоения объем верхней фазы в калибровоч нии светопоглощения в инфракрасной области;
ных пробах оказывается больше, чем в его преимущество Ч можно одновременно опре- опытных, что приводит к заниженным делять несколько липидных соединений. результатам анализа. Чтобы избежать этой ошибки, рекомендуют калибровочный рас- К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Наиболь твор готовить по следующей прописи: 510 мг шее значение имеет определение триглицеридов триолеина растворяют в 100 мл изопро- для типирования эссенциальных гиперлипиде пилового спирта, получается исходный мий, II частности дифференцирования типа ПА калибровочный раствор с содержанием (изолированная гиперхолестеринсмия) и ПБ 6 ммоль/л, из которого готовят по мере не- (увеличение содержания и холестерина, и три обходимости рабочий калибровочный рас- глицеридов). Кроме того, повышение содержа твор с содержанием 1,2 ммоль/л, разводя 1 ния триглицеридов бывает при нефротическом объем исходного калибровочного раствора синдроме, переломах костей, гипотиреозе и ал 4 объемами воды. коголизме, но большого диагностического зна чения при этих заболеваниях не имеет. В прак Ход о п р е д е л е н и я. К 0,5 мл сыворот тическом отношении надо всегда помнить о ки или плазмы добавляют 2 мл гептана, 3,5 мл существовании алиментарной гипертриглицери изопропилового спирта и 1 мл 0,08 н. серной демии.
кислоты, перемешивают и через 5 мин центри фугируют. Из верхнего (гептанового) слоя от бирают 0,4 мл, добавляют 2 мл изопропилового 5.6.5. Инфракрасная спирта и 1 каплю 6,25 н. КОН. Перемешивают, спектрофотометрия липидов закрывают пробкой и нагревают на водяной бане 10 мин при 70 С. После охлаждения добав Пр и н ц и п. Холестерин, его эфиры и ляют 0,2 мл перйодатного реактива и 1 мл аце триглицериды экстрагируются из исследуемой тилацетонового реактива, после перемешивания плазмы или сыворотки смесью гексан Ч изопро снова закрывают пробкой и нагревают еще пиловый спирт Ч серная кислота, в которую 10 мин при 70 С. Развивается желто-зеле фосфолипиды не переходят. Растворитель вы ное окрашивание, интенсивность которого изме паривают, а исследуемые вещества растворяют ряют, фотометрируя при длине волны 425 нм в четыреххлористом углероде;
инфракрасный в кюветах с длиной оптического пути 0,5 см спектр этого раствора снимается. Все липиды против холостой пробы, которую ставят так же, имеют характерные пики поглощения в инфра как и опытную, но вместо исследуемого мате красной области спектра, поэтому не требуется риала берут 0,5 мл воды.
проведения дополнительных химических реак Калибровочную пробу ставят так же, как и ций. Пики поглощения триглицеридов и холе опытную, но вместо сыворотки или плазмы бе стерина пересекаются, поэтому расчет проводят рут 0,5 мл калибровочного раствора и 0,5 мл по эмпирически подобранным формулам, кото воды;
развивающаяся окраска соответствует рые позволяют исключать взаимную интерфе окраске опытной пробы, в которую взята плаз ренцию определяемых веществ.
ма с содержанием триглицеридов 2 ммоль/л.
Р е а к т и в ы. 1. Гексан. 2. Изопропиловый Расчет проводят по правилу пропорций или по спирт (изопропанол). 3. Смесь гексан Ч изо калибровочному графику. Если используется пропиловый спирт Ч 0,1 н. серная кислота калибровочный раствор, уже содержащий воду 6:9:1. Готовят в день определения, смешивая (см. примечание), то при постановке калибро 6 объемов гексана, 9 объемов изопропилового вочного опыта берут 0,5 мл рабочего калибро спирта и 1 объем 0,1 н. серной кислоты. 4. Че вочного раствора, а воду не добавляют.
тыреххлористый углерод. 5. Натрия хлорид.
Ли т е р а т у р а. Gottfried S. P., Rosenberg Ход о п р е д е л е н и я. К 0,2 мл иссле В. Clin. Chem. 1973. vol. 19, № 9, p. 1077Ч1078.
дуемой сыворотки или плазмы крови прибав ляют 2 мл экстрагирующей смеси и энергично Пр и ме ч а н и е. При отсутствии три встряхивают. Добавляют в пробирку щепотку олеина или трибутирина для калибровки натрия хлорида, при этом на дне образуется, можно использовать растительное масло, густая белая масса, над которой плавает про принимая, что образующие его триглицери зрачная жидкость. Верхний слой осторожно ды имеют ту же молекулярную массу, что и переливают в сухую пробирку, где выпаривают триолеин. Можно проводить калибровку, ис в токе азота или воздуха. Сухой остаток может пользуя раствор глицерина в этаноле, в этом храниться неограниченно долго. Его раство случае его непосредственно добавляют к ряют в 1 мл четыреххлористого углерода и щелочному раствору едкого кали.
снимают спектр поглощения в инфракрасной Ли т е р а т у р а. Carlson L. A. Atheroscle области в кювете с длиной оптического пути rosis Research, I 1963, vol. 3, p. 334Ч336.Ч Лаб.
1 мм против аналогичной кюветы, заполненной дело, 1976, № 6, с. 375Ч376.
четыреххлористым углеродом. При работе на Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы. В целом приборе фирмы К. Цейс-10 в диапазоне нормальной величиной содержания триглицери- 1000Ч2000 см~' работают с призмой NaCL, дов в плазме крови считают 0,55Ч1,65 ммоль/л а в диапазоне 2000Ч3500 см- с призмой LiF.
(50Ч150 мг в 100 мл), но, так же как и для Расчет проводят по эмпирической формуле:
холестерина, верхняя граница нормальных ве личин у мужчин зависит от возраста, особен ностей жизни и т. д. В качестве ориентира верх ней границы возрастной нормы для мужчин можно принять данные Института кардиоло гии АМН СССР (см. табл. 42).
где ХОЛ и ТГ Ч концентрации холестерина и центрифугируют. Отбирают 1,8 мл верхней фа триглицеридов (моль/л) в исследуемой плазме зы и добавляют к ней 0,5 мл раствора дифенил или сыворотке, а Е Ч величины экстинкции при карбазида, через 15 мин фотометрируют при соответствующих волновых числах, выражен- длине волны 550 нм в кюветах с длиной опти ных в см (читается лобратные сантиметры). ческого пути 1 см против холостого опыта, в При работе на других типах приборов или который берут 1,8 мл экстракционной смеси, переюстировке прибора формулу для расчета к которой добавлено 0,5 мл Дифенилкарбазида.
желательно проверить путем сопоставления Расчет проводят по калибровочной кривой, результатов вычисления по ней с результата- для построения которой используют рабочие ми химического определения холестерина и три- калибровочные растворы, содержащие 400Ч глицеридов в гексан-изопропаноловом экстрак- 1000 мкмоль жирной кислоты в 1 л хлорофор те. ма;
0,05 мл рабочего калибровочного раствора обрабатывают так же, как и исследуемую плаз му или сыворотку.
5.6.6. Неэтерифицированные жирные кислоты Пр и м е ч а н и е. Основной источник оши Колориметрический метод определения мед- бок при определении неэтерифицированных ных солей. Пр и н ц и п. При нейтральных и жирных кислот (НЭЖК), или, как их иногда слабощелочных значениях рН медные соли называют, свободных жирных кислот жирных кислот экстрагируются из водных рас- (СЖК), связан с тем, что в процессе полу творов различными неводными растворителями чения сыворотки или при ее хранении проис (в данном случае смесью хлороформ Ч геп- ходит гидролиз нейтральных жиров (тригли тан Ч метанол), в то же время в этих условиях церидов) и фосфолипидов и появляется ионы меди остаются в водной фазе. Поэтому дополнительное количество НЭЖК, ко количество меди, перешедшее в органическую торые неотличимы от уже существовавших фазу, отражает содержание неэтерифицирован- в плазме. Поэтому желательно исследовать ных (свободных) жирных кислот (НЭЖК). не сыворотку, а плазму, полученную на хо Медь определяют по цветной реакции с 1,5-ди- лоду без гепарина.
фенил-карбазидом.
Р е а к т и в ы. 1. Хлороформ. 2. Гептан.
Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы неэтерифи 3. Метиловый спирт (метанол). 4. Экстракцион цированных жирных кислот в плазме: 400Ч ная смесь. Смешивают 250 мл хлороформа, 800 мкмоль/л.
250 мл гептана и 12 мл метилового спирта.
5. Меди нитрат 0,5 моль/л: готовят растворе- Л и т е р а т у р а. Прохоров М. Ю., Тиу нием 24, 16 г Сu(NО ) -ЗН О в 200 мл воды. нов М. П., Шакалис Д. А.ЧЛаб. дело, 1977, 3 2 № 9, 535Ч536.
6. Триэтаноламин, 1 моль/л: готовят, растворяя 29,8 г триэтаноламина в воде (примерно 20, мл), объем доводят водой до 200 мл. 7. Едкий К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Увеличе натр, 1 н. раствор. 8. Натрия хлорид, насыщен- ние количества НЭЖК обусловлено приемом ный водный раствор. 9. Медный реактив. В день пищи, а также различными факторами, стиму определения смешивают 10 мл раствора меди лирующими липолиз (гепарин, адреналин и нитрата, 10 мл раствора триэтаноламина и различные близкие ему по химической структу 6 мл 1 н. NaOH. Объем доводят до 100 мл насы- ре или физиологическому действию вещества).
щенным раствором хлорида натрия, после чего Обычно если содержание глюкозы в кропи устанавливают рН 8,0, добавляя нужное коли- возрастает, содержание НЭЖК уменьшается.
чество 1 н. NaOH. 10. Дифенилкарбазида спир- Количество их возрастает при атеросклерозе, товой раствор: 100 мг 1,5-дифенилкарбазида после инфаркта миокарда.
растворяют в 25 мл этилового спирта, непосред о ценно перед употреблением добавляют 0,24 мл 5.6.7. Липопротеиды триэтаноламина. 11. Калибровочный раствор.
Для его приготовления можно использовать различные жирные кислоты с длинной цепью, Определение фракций методом дискэлектро но удобнее всего работать со стеариновой кис- фореза в полиакриламидном геле. Пр и н ц и п.
лотой, так как она при комнатной температуре Предварительно окрашенные липопротеиды существует в твердом состоянии (температура сыворотки подвергают электрофорезу в на плавления 70 С). Исходный раствор с концент- правлении сверху вниз в колонке, заполненной рацией 10 ммоль/л готовят, растворяя 284,5 мг четырьмя слоями полиакриламидного геля.
в 100 мл хлороформа, из него готовят рабочие Нижний слой геля самый мелкопористый, верх калибровочные растворы, содержащие 400Ч ний самый крупнопористый. Липопротеиды в 1000 мкмоль/л, путем разведения хлорофор- зависимости от размера их молекул задержи мом. ваются в разных участках геля.
Ход о п р е д е л е н и я. К 0,05 мл сыво- Р е а к т и в ы. 1. ТРИС Ч трис(оксиметил) ротки или пл.азмы добавляют 3 мл экстракцион- аминометан. 2. Акриламид. 3. N, N'-метилен ной смеси и 0,9 мл медного реактива, закры- бисакриламид (МБА). 4. N, N, N', N' -тетраме вают пробирку пробкой (лучше всего полиэти- тилэтилендиамин (ТЕМЕД). 5. Рибофлавин.
леновой) и встряхивают 3 мин, после чего 6. Сахароза. 7. Глицин (аминоуксусная кисло та, гликокол). 8. Судан черный Ч насыщенный спиртовой раствор. Растворяют 100 мг в 5 мл Расположение Нижний 2-й 3-й Верх этилового спирта. 9. Аммония персульфат (ам- слоя геля снизу снизу ний моний надсернокислый), 0,14 % раствор. Раст- Высота слоя 22 14 14 воряют 140 мг (NH ) S O в 100 мл воды. Го- геля, мм 4 2 2 ден пря хранении в холодильнике в течение не 8,9 8,9 8,9 6, рН дели. 10. Электродный трисглициновый буфер, Концентрация рН 8,3: в 1 л воды растворяют 0,6 г ТРИС и полиакрилами 2,88 г глицина;
с помощью НС1 или едкого нат 10 5 3 Да, % ра устанавливают рН 8,3. 11. Трис-буфер рН Раствор А (ре- 1 1 1 Ч 8,9 Ч раствор А: к 36,6 г ТРИС добавляют актив 11) * около 40 мл воды, 48 мл 1 н. НС1 и 0,23 мл Раствор В (ре- Ч Ч Ч ТЕМЕД;
после растворения объем доводят до актив 12) 100 мл водой и устанавливают рН 8,9. 12. Трис Раствор С (ре- 2,8 1,36 Ч Ч буфер рН 6,7, раствор В: к 5,98 г ТРИС добав актив 13) ляют около 40 мл воды, 48 мл I н. HCI и 0,46 мл Раствор D (ре- Ч Ч 2 ТЕМЕД, доводят объем до 100 мл и устанавли- актив 14) вают рН 6,7. 13. 28 % раствор акриламида Ч Раствор Е (ре- Ч Ч 1 реактив С: 28 г акриламида и 0,735 г МБА актив 15) растворяют в воде и доводят объем до 100 мл.
Раствор F (ре- Ч Ч 4 14. 10 % раствор акриламида Ч реактив D:
актив 16) 10 г акриламида и 2,5 г МБА растворяют в Раствор пер- 4 4 Ч Ч воде и объем доводят до 100 мл. 15. Раствор сульфата ам рибофлавина Ч реактив Е: 4 мг рибофлавина мония (реак растворяют в 100 мл воды. 16. 40 % раствор тив 9) сахарозы Ч реактив F: 40 г сахарозы раство Воды 0,2 1, Ч ряют в воде и доводят объем до 100 мл.
Ход о п р е д е л е н и я. Определение про водят в аппарате для вертикального электро * Раствор для полимеризации готовят, смешивая фореза любой конструкции. Он представляет указанные количества объемов исходных растворов.
собой пластмассовый штатив с вертикально укрепленными стеклянными трубками длиной 70 мм и диаметром 6Ч7 мм, в которых собствен- мешивают и оставляют на 1 ч в темноте. После но и проводится электрофорез. Нижние концы этого 0,03Ч0,05 мл осторожно наносят на по трубок погружены в электродный буферный верхность уже сформированного в трубке геля раствор, соединенный с положительным элект- и дают впитаться в течение нескольких минут, родом источника тока, а верхний конец зали- заполняют трубку доверху электродным буфе вают таким же раствором, подсоединенным к ром и проводят электрофорез в течение 1 ч в отрицательному электроду. затемненном помещении при силе тока 4Ч5 мА Перед началом работы в трубках форми- на трубку.
руются столбики четырехслойного геля, причем Оц е н к а р е з у л ь т а т о в. На самом в нижнем слое концентрация акриламида са- верху трубки, на старте, расположена полоса мая высокая и условия полимеризации подо- хиломикрон и остатки не прореагировавшей браны так, чтобы размер пор был наимень- с липидами краски. Медленнее всего в этой шим;
чем выше расположен слой геля, тем системе движутся пре-в-ЛП, полоса которых больше размер его пор. Нижние три слоя назы- расположена в 3 % геле. На границе 3 % и ваются разделяющими, в них рН 8,9, самый 5 % гелей оказывается две полосы (Will, а на верхний слой геля концентрирующий, его рН границе 5 % и 10 % гелей Ч две полосы а-ЛП, 6,7. Для формирования столбика геля трубку еще ниже расположен альбумин, на котором устанавливают вертикально, нижний конец адсорбированы неэтерифицированные жирные герметично прижимают к резиновой пластине и кислоты, обычно отличающиеся по цвету от шприцем с длинной иглой последовательно липопротеидов.
заливают растворы, подлежащие полимериза- Предложено много разных способов коли ции, которые готовят как указано справа. чественно выражать результаты электрофоре тического разделения липопротеидов в геле После того как залит очередной раствор, акриламида, используя для этого различные который должен полимеризоваться в гель, на варианты денситометрии и элюции, но для него сверху наносят несколько капель воды, практической лаборатории, которая занимает под слоем которой гель и полимеризуется. Это ся фенотипированием гиперлипидемий, доста обеспечивает горизонтальную поверхность. Два нижних слоя полимеризуют в темноте при ком- точно визуальной оценки;
констатации увели натной температуре, два верхних Ч при осве- чения количества хиломикрон, вi- или пре-в фракции.
щении лампой дневного света на расстоянии 30Ч40 см. Л и т е р а т у р а. Маграчева Е. Я. Разде Ход о п р е д е л е н и я. К 0,3 мл иссле- ление липопротеидов сыворотки крови методом дуемой сыворотки добавляют 0,15 мл раствора дискового электрофореза в полиакриламидном Судана черного, 0,15 мл раствора сахарозы и геле.Ч Вопр. мед. химии, 1973, т. 19, №. 6, 0,05 мл трис-буфера рН 6,7, после чего пере- с. 652Ч655.
растворителя и наоборот;
это очень затрудняет 5.7. Гормоны точный отбор аликвоты из какой-либо фазы.
Если вещество плохо экстрагируется, часто ис Определение гормонов в методическом отно пользуют повторную экстракцию тем же раство шении наиболее сложный раздел клинической рителем, а затем оба экстракта смешивают.
биохимии, которым занимаются лишь специаль Очень важно проводить экстракцию так, ные лаборатории или отделения больших клини чтобы не образовалась стойкая эмульсия, кото ческих лабораторий, так как для выполнения рая препятствует разделению фаз. Часто это большинства гормональных методов необхо зависит от не поддающихся учету примесей, мы определенные условия, в том числе исполь поэтому надо встряхивать очень осторожно, в зование радионуклидов. В справочнике, который то же время достаточно энергично, чтобы насту рассчитан на рядовые КДЛ лечебных учрежде пило равновесие;
в этих случаях определить ний, приводятся лишь некоторые, относительно нужную границу помогает только опыт. Обра более простые, химические методы определе зованию эмульсии в какой-то мере препятствует ния гормонов, их метаболитов и близких им увеличение содержания соли в растворе, биологически активных веществ. Для специа эмульсию можно попытаться разделить центри лизированных лабораторий можно рекомендо фугированием, но это не всегда помогает.
вать вышедшее в 1980 г. справочное пособие Некоторые авторы рекомендуют проводить А. Г. Резникова Методы определения гормо экстракцию в делительных воронках, но в усло нов (Киев, Наукова думка).
виях клинической практики, когда жизнь вы В клинической эндокринологии все боль нуждает максимально экономить время и реак шее распространение получает метод конку тивы, они неудобны. Лучше экстрагировать в рентного связывания (так называемое радио конических колбах или в пробирках с пришли Химмунное определение), область применения фованными стеклянными или полиэтиленовыми которого, однако, значительно шире, чем опре пробками. Если работают с колбами, надо деление гормонов, поэтому он вынесен в спе использовать мешалки, лучше всего магнит циальный раздел '.
ные, в этом случае один лаборант может одно временно обрабатывать несколько проб, в то же время удобно дозировать степень переме 5.7.1. Экстракция и очистка шивания. При работе с пробирками их встря растворителей хивают вручную или на встряхивающем (шют тель) аппарате, пробирки удобны тем, что если Многие методы определения гормонов вклю- образуется эмульсия, ее можно постараться разрешить центрифугированием.
чают схожие способы экстракции и нуждаются в растворителях примерно одинаковой степени После экстракции один слой отделяют от чистоты. Чтобы не повторяться при описании другого, обычно значительно легче отсосать каждого метода;
ниже приводятся общие све- верхний слой и количественно перенести его в дения по этим вопросам. чистую посуду, чем нижний. Удобно отсасы Экстракция. Для экстракции используют вать пастеровской пипеткой с грушей, перенося не смешивающиеся с водой растворители, в верхний слой небольшими порциями, при этом, которые переходят экстрагируемые вещества. если по ошибке будет захвачена небольшая В целом чем больше в экстрагируемом ве- порция нижнего слоя, ее легко вернуть на мес ществе полярных кетоновых, альдегидных и то. Работа с грушей требует определенной точ спиртовьц групп, тем лучше оно переходит в ности движений, которая вырабатывается со не смешивающиеся с водой полярные раство- временем;
начинающим можно рекомендовать рители Ч высшие спирты, этилацетат и т. д., укрепить пипетку в штативе строго вертикаль чем меньше полярных групп, тем больше подхо- но и соединить верхний конец резиновой или дят неполярные растворители (гексан, хлоро- лучше хлорвиниловой трубкой со шприцем, форм, дихлорметан);
эфир занимает промежу- который укреплен на том же штативе. Надо не точное положение. Эффективность экстракции забывать смазывать поршень шприца специаль часто зависит также от рН водного раствора ной смазкой или вазелином.
и его ионной силы (содержание солей). Эффек- Если верхний слой для дальнейшей работы тивнее всего экстракция происходит, если пер- не нужен, например при промывании хлоро воначально образуется одна фаза, которая за- формного экстракта, его иногда отсасывают тем разделяется на две добавлением избытка пастеровской пипеткой, подсоединенной к водо одного из ингредиентов, на такие условия струйному насосу, при этом весь слой сразу же удается подобрать не всегда, значительно чаще удаляется в канализацию. Это ускоряет работу, просто встряхивают две несмешивающиеся но имеет тот недостаток, что, если ошибочно жидкости. Надо иметь в виду, что объемы засосана порция нижней фазы, ее спасти уже фаз после экстракции очень часто не соответ- невозможно.
ствуют объемам взятых растворов или раство- Очистка этанола. Абсолютный этанол гото рителей, так как вместе с экстрагируемым ве- вят из 90Ч96 % этилового спирта кипячением с СаО или ВаО на водяной бане с электроподо ществом в другую фазу часто переходит и часть гревом с обратным холодильником до тех пор, пока точка кипения не станет 78,3 С при нор мальном барометрическом давлении. Дла обна ружения альдегидов к 5 мл этанола добавляют См. с. 30.
0,2 мл раствора калия перманганата, содер- Очистка этилацетата. Несколько раз про жащего 200 мг в I л (1:5000);
раствор не дол- мывают яркоокрашенным водным раствором жен обесцвечиваться на протяжении 20 мин, перманганата калия. Промывание повторяют изменение окраски указывает на присутствие до тех пор, пока раствор не перестанет приобре альдегидов. Пищевой спирт обычно содержит тать фиолетовый оттенок, затем отмывают во больше альдегидов, чем гидролизный. дой 3Ч5 раз, осушают безводным сульфатом Для удаления альдегидов можно использо- натрия и перегоняют.
вать два способа: с 2,4-динитрофепилгидрази ном и с серебра нитратом. В первом случае 5.7.2. 17-Кетостероиды к 1 л этилового спирта добавляют 2 г гидро хлорида 2,4-динитрофенилгидразина и 0,5 мл концентрированной НС1, закрывают пробкой Унифицированный метод по цветной реакции и оставляют стоять 2 сут в темноте, затем пере- с метадинитробензолом. Пр и н ц и п. Эфиры гоняют. При очистке с помощью серебра нитра- 17-кетостероидов (17-КС) с глюкуроновой и та в 100 мл горячего этанола растворяют 7 г серной кислотами гидролизуют нагреванием в AgNO3 и добавляют туда 15 г едкого кали, кислой среде в присутствии формальдегида, раствор выливают в 4 л подлежащего очистке который уменьшает образование темноокра этилового спирта. Выпадает темный осадок, шенных продуктов. Кетостероиды экстраги который постепенно оседает на дно. Через сут- руют эфиром и определяют по цветной реак ки его отделяют декантацией или фильтрова- ции с метадинитробензолом. Побочные окра нием, этанол перегоняют, отбрасывая первую и шенные продукты, мешающие фотометрирова последнюю порции. нию, удаляют избирательной экстракцией.
Очистка хлороформа и дихлорметана (ме- Ре а к т и в ы. 1. НС1 концентрированная.
тиленхлорида). Для определения гормонов луч- 2. Уксусная кислота ледяная. 3. Формальдегид, ше всего использовать хлороформ марки для водный раствор: 50 мл имеющегося в продаже наркоза, содержащий небольшое количество 40 % раствора формалина смешивают с 250 мл спирта, что делает его более стабильным. Для воды. 4. Едкий натр, 100 г/л: 10 г NaOH раст очистки хлороформа или дихлорметана других воряют в 50Ч60 мл воды, после охлаждения марок, а также для регенерации тех порций объем доводят водой до 100 мл. 5. Этиловый растворителя, которые уже один раз использо- эфир, свободный от перекисей. 6. Хлороформ вались для экстракции гормонов, их взбалты- очищенный. 7. Этиловый спирт 50 %. Смеши вают с концентрированной серной кислотой на вают равные объемы этилового спирта и воды.
протяжении 1 или 2 рабочих дней, при этом 8. Этиловый спирт абсолютный. 9. Едкое кали, серная кислота темнеет тем скорее, чем более раствор 5 моль/л в метаноле: растворяют 28 г загрязнен растворитель. Встряхивание надо КОН в дважды перегнанном метиловом спир проводить в темноте;
удобно пользоваться маг- те, объем доводят до 100 мл и немедленно нитной мешалкой, закрывая колбу светонепро- фильтруют (в противном случае раствор может ницаемым колпаком. После этого кислоту отса- потемнеть) и проверяют концентрацию титро сывают, хлороформ или дихлорметан промы- ванием 0,1 н. кислотой, используя в качестве вают водой, а затем на протяжении нескольких индикатора метиловый оранжевый. Хранят в часов концентрированным раствором аммиака, темной склянке в холодильнике. 10. Метади 1 н. NaOH или насыщенным раствором натрия нитробензол, раствор 20 г/л в абсолютном эти карбоната, затем опять промывают водой и осу- ловом спирте: 400 мг метадинитробензола шают безводным натрия сульфатом или натрия растворяют в 20 мл абсолютного этанола. В карбонатом. После осушения растворитель случае необходимости метадинитробензол перегоняют, используя стеклянный перегонный можно очистить перекристаллизацией, для это аппарат на шлифах, нагреватель обязательно го в колбу вместимостью 3 л помещают 20 г должен быть электрический с водяной баней.
препарата, которые растворяют в 750 мл этило Конкретный режим очистки во многом зави- вого спирта, нагревая до 40 С. Затем прибав сит от качества исходного растворителя;
не- ляют 100 мл 2 н. NaOH, перемешивают, охлаж которые партии этими методами вообще очис- дают и быстро добавляют 2,5 л холодной воды, тить не удается. Об эффективности очистки при этом должны выпасть мелкие кристаллы, лучше всего судить, поставив холостой или которые собирают, фильтруя раствор в воронке калибровочный опыт. Бюхнера. 11. Калибровочный раствор. Навеску Очистка эфира. Для удаления перекисей в несколько миллиграммов дегидроэпиандро эфир взбалтывают с 10 % раствором железа стерона или андростерона растворяют в таком сульфида (сернистого железа Ч FeS) в 1 н. количестве этилового спирта, чтобы концентра серной кислоте, затем промывают водой. Для ция составила 100 мкг/мл.
проверки наличия перекисей 200 мл эфира вы- Ход о п р е д е л е н и я. Суточную мочу паривают, остаток растворяют в 2 мл абсо- собирают в чистую посуду;
если выпадает оса лютного этанола. Из этого количества отби- док, его тщательно перемешивают и из всего рают 0,2 мл, к которым добавляют 0,2 мл 2 % количества отбирают 5Ч20 мл в зависимости спиртового раствора метадинитробензола и от содержания кетостероидов. Объем доводят 0,2 мл 5 н. раствора едкого кали в метаноле;
изотоническим раствором натрия хлорида до окраска не должна превышать той, которая 20 мл, добавляют 3 мл HCI, 1 мл уксусной развивается при добавлении к тем же реакти- кислоты и 0,2 мл раствора формальдегида.
вам Г) мкг кристаллического кетостероида. Колбу закрывают стеклянной затычкой груше видной формы (можно использовать воронки Р е а к т и в ы. 1. НС1 примерно 30%.
или неплотноприлегающие стеклянные пробки) К 80 мл концентрированной HCI добавляют и ставят на 15 мин на кипящую водяную баню;
20 мл воды. 2. Дихлорметан (метиленхлорид).
этот этап надо проводить под тягой или в хо- 3. Этиловый эфир, лучше использовать марки рошо проветриваемом помещении. для наркоза. 4. Этиловый спирт 30 %. К 35 мл После охлаждения содержимого колбы его 96 % этилового спирта добавляют воды до дважды экстрагируют порциями по 10 мл эфи- объема 100 мл. 5. Едкое кали, спиртовой рас ра, экстракты сливают вместе, сначала промы- твор 200 г/л. Растворяют 2 г КОН в 10 мл эти вают 10 мл 10 % раствора едкого натра, затем лового спирта, нерастворившиеся примеси отде водой. Экстракцию и промывание можно про- ляют центрифугированием. Раствор нестоек.
водить в делительных воронках, но лучше в 6. Метадинитробензол, спиртовой раствор 5 г/л.
колбочках, используя для перемешивания маг- Растворяют 250 мг метадинитробензола в 50 мл нитную мешалку, или в пробирках с притерты- этилового спирта. 7. Едкое кали или едкий натр ми стеклянными пробками. Вместо промывания гранулированный. 8. Калибровочный раствор.
10 % раствором NaOH можно добавлять гра- Навеску в несколько миллиграммов дегидро нулы едкого натра в эфирный экстракт, кото- эпиандростерона или андростерона растворяют рый затем сливают в чистую посуду. Промытый в таком количестве этилового спирта, чтобы эфирный экстракт небольшими порциями пере- концентрация составила 500 мкг/мл.
носят в пробирку, в которой выпаривают на Ход о п р е д е л е н и я. Из тщательно водяной бане при температуре не выше 50 С перемешанной суточной мочи отбирают 10 мл при встряхивании, под струей воздуха или луч- в большую пробирку или колбочку, желательно ше азота. Сухой экстракт можно оставить на с притертой пробкой, добавляют 10 мл 30 % несколько дней в ожидании окончания анализа.
HCI и кипятят на водяной бане 10 мин. Этот В пробирку с сухим экстрактом добавляют этап надо проводить под тягой. После охлажде 0,2 мл 5 н. раствора едкого кали в метаноле, ния добавляют 10 мл дихлорметана или эфира 0,2 мл абсолютного этанола и 0,2 мл 2 % спир- и тщательно встряхивают;
когда слои разде тового раствора метадинитробензола, переме- ляются, водный слой удаляют. Если для эк шивают и оставляют в темноте при комнатной стракции используют дихлорметан, который тя температуре на 1 ч. После этого добавляют желее воды, то водный слой оказывается свер 4 мл 50 % этанола и 2 мл хлороформа, энер- ху, поэтому его легче удалить, чем при гично встряхивают и дают образоваться двум экстракции эфиром, который оказывает слоям. Верхний, водно-спиртовой, слой корич- ся в верхнем слое. После удаления водной невого цвета, содержащий загрязнения, отса- фазы к органической добавляют 10Ч20 гранул сывают, нижний слой фиолетового цвета фото- КОН или NaOH для осушения. Они должны метрируют в кюветах с длиной оптического быть добавлены в таком количестве, чтобы п-ути 0,5 см против холостого опыта при длине образовался конгломерат, впитавший всю волны 520 нм;
кюветы закрывают крышками. оставшуюся водную фазу, а дихлорметановый Одновременно ставят холостой опыт, в который слой был подвижным, прозрачным и однород вместо пробирки с высушенными экстрактами ным. Отбирают 5 мл экстракта, которые пере берут чистую пробирку, в которую помещают носят в чистую сухую пробирку, где выпари по 0,2 мл этанола, 5 н. раствора едкого кали вают в токе воздуха или азота при температу в метаноле и 2 % раствора метадинитробензола, ре не выше 50 С.
дальнейшую обработку проводят так же, как К сухому остатку добавляют 0,4 мл раство и опытных проб.
ра метадинитробензола и 0,2 мл раствора ед Для калибровки к 20 мл изотонического кого кали и выдерживают 40 мин в темноте при раствора натрия хлорида добавляют 0,5 мл 35 С для развития реакции. После этого до калибровочного раствора, т. е. 50 мкг кетосте- бавляют 2 мл этилового спирта и 5 мл эфира, роида;
в дальнейшем калибровочную пробу встряхивают и дают разделиться слоям. Верх обрабатывают так же, как и опытную пробу ний (эфирный) слой переносят в кювету дли мочи. ной оптического пути 1 см, закрывают крышкой При налаживании методики или смене ре- и фотометрируют при трех длинах волн Ч 440;
активов рекомендуется построить калибровоч- 520 и 600 нм против кюветы, заполненной во ный график, для приготовления которого берут дой. Следует иметь в виду, что в результате (1,5;
1;
1,5 и 2 мл калибровочного раствора. испарения эфира температура проб понижает Ра с ч е т проводят по правилу пропорций. ся, они мутнеют, что мешает фотометрии, Получается содержание кетостероидов в 20 мл поэтому кюветы с пробами обязательно надо мочи. Чтобы узнать выведение за сутки, полу- закрывать крышками.
ченную величину делят на 20 и умножают на Для построения калибровочного графика в неличину суточного диуреза. сухие чистые пробирки вносят 0,05Ч0,15 мл Упрощенный метод по реакции с метади- калибровочного раствора, т. е. 25Ч75 мкг кето нитробензолом. Пр и н ц и п. Принцип и ход стероида, и выпаривают досуха в токе воздуха определения такой же, как и в унифицирован- или лучше азота. В темном месте такие под ном методе, но некоторые детали упрощены, готовленные пробы могут храниться несколько что практически не сказывается на точности месяцев. В каждую пробирку вносят 0,4 мл метода. Чтобы уменьшить ошибки, вызванные раствора динитробензола и 0,2 мл спиртового посторонними веществами, экстинкцию изме- раствора едкого кали, дальнейшая обработка ряют трехволновым методом. такая же, как и для опытных проб.
Для проведения расчета сначала вычисляют тать с одной и той же партией. 310 мл концент исправленную величину экстинкции (Е ) по рированной серной кислоты осторожно выли исп формуле: вают в 190 мл воды, охлаждая колбу водой со льдом, чтобы избежать нагревания, кото рое может сказаться на качестве реактива, 100 мл разведенной таким образом кислоты Строят калибровочный график, откладывая на осторожно смешивают с 50 мл этилового спир одной оси Е а на другой Ч содержание кето- т а. 9. Фенилгидразиновый реактив: 21,7 мг исп стероида в калибровочной пробе. В связи с тем гидрохлорида фенилгидразина растворяют в что в конечном итоге в исследуемой пробе 50 мл серно-спиртового реактива. В случае оказываются все кетостероиды, содержавшиеся необходимости гидрохлорид фенилгидразина в 5 мл мочи, чтобы узнать концентрацию, вы- можно приготовить из фенилгидразина осно раженную в мг/л, полученную величину делят вания, нейтрализуя его НС1 из расчета 10 мл на 5;
чтобы узнать выведение за сутки, кон- 10 н. HCI на 9,4 г фенилгидразина основания.
центрацию умножают на суточный диурез. Препарат очищают перекристаллизацией из Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы. Экскреция этилового спирта, для этого 5Ч10 г вещества 17-КС у мужчин 23Ч80 мкмоль/сут (8Ч29 растворяют в 30Ч40 мл этанола, затем охлаж мг/сут), у женщин 22Ч60 мкмоль/сут (8Ч дают в холодильнике, кристаллы отделяют на 22 мг/сут). фильтре и высушивают. 10. Ацетатный буфер Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Повыше- рН 4,5. Растворяют в воде 5,79 г ацетата нат ние 17-КС свидетельствует о гиперсекреции рия, добавляют туда 3,25 мл ледяной уксусной глюкокортикоидов (синдром Кушинга), чаще кислоты, доводят рН до требуемой величины всего вследствие опухоли надпочечника, гипо- уксусной кислотой или NaOH и доливают водой физа или АКТГ продуцирующей опухоли лег- до 1 л. 11. в-Глюкуронидаза, активность ких, уменьшение Ч признак пониженной выра- 100 000 ЕД в 1 г препарата. Растворяют в воде ботки глюкокортикоидов и мужских половых в таком количестве, чтобы активность была гормонов. 500 ЕД в 1 мл, раствор хранят 1Ч2 дня. Пре парат плохо растворим в воде, поэтому при приготовлении раствора его надо перемеши 5.7.3. 17-Оксикортикостероиды вать не менее 30 мин, лучше на магнитной ме шалке, после чего осадок удаляют центрифуги Определение в моче по реакции с фенил- рованием или фильтрацией. Можно готовить гидразиновым реактивом после ферментатив- раствор и на ацетатном буфере, но в этом слу ного гидролиза. Пр и н ц и п. 17-Оксикортико- чае надо убедиться, что препарат действитель стероиды (17-ОКС), т.е. глюкокортикоидные но растворяется (см. примечание 3). 12. Ка гормоны и их метаболиты, содержащие гидро- либровочный раствор, содержащий 20 мкг гор ксильные группы в положениях 17 и 10 и кето- мона в 1 мл. Для его приготовления 1 мг гидро группу в положении 20, при нагревании с фе- кортизона или кортизона растворяют в 50 мл нилгидразином в смеси серной кислоты и спир- этилового спирта.
та дают окрашенные в желтый цвет соедине- Ход о п р е д е л е н и я. Из хорошо пере ния. Одновременно с основным опытом ставят мешанного объема суточной мочи отбирают не холостой, в котором учитывают неспецифи- большое количество и доводят рН до 6,5, до ческую окраску, которая в этих условиях разви- бавляя по каплям 2 н. NaOH или НС1, кислот вается без фенилгидразина. В связи с тем что ность контролируют рН-метром или универсаль большая часть 17-ОКС мочи присутствует в ной индикаторной бумагой. Отбирают 2 пробы виде парных соединений с глюкуроновой и сер- (опытную и холостую) по 5 мл и нагревают их ной кислотами, предварительно проводят гид- на кипящей водяной бане 3Ч5 мин для разру ролиз с помощью фермента глюкуронидазы, шения ингибитора фермента. Если по какой затем 17-ОКС экстрагируют хлороформом или либо причине моча сразу не может быть про дихлорметаном и переводят в смесь серной анализирована, желательно хранить ее после кислоты и спирта. кипячения, которое одновременно убивает и Ре а к т и в ы. 1. Хлороформ или дихлорме- микробную флору. После охлаждения и к опыт тан, лучше всего марки для наркоза1. 2. Эти- ной, и к холостой пробе добавляют по 5 мл ловый спирт 2. 3. 2. н. раствор едкого натра. ацетатного буфера, по 5 мл раствора фермента 4. 2 н. раствор НС1. 5. Универсальная индика- и ставят в термостат на 18Ч20 ч при 37 С.
торная бумага;
вместо нее можно пользоваться После ферментации каждую пробу экстра рН-метром. 6. 0,1 н. раствор едкого натра. гируют 75 мл хлороформа (пятикратный объем), 7. Натрия сульфат или натрия карбонат после расслаивания удаляют верхний слой (мо безводный. 8. Серно-спиртовой реактив. Для чу), хлороформенный экстракт промывают 7,5 мл его приготовления используют наиболее чистую 0,1 н. NaOH и затем еще 3 мл воды, после серную кислоту марки выдерживает пробу чего осушают безводным натрия сульфатом Саваля, стараясь как можно дольше рабо- или натрия карбонатом. Из опытной пробы от меривают точно 50 мл хлороформенного экс тракта и экстрагируют его 4 мл фенилгидра зинового реактива, из холостой пробы также Очистку см. с. 251.
Очистку см. с. 250. Очистку см. с. 250.
точно отмеривают 50 мл хлороформенного чи и 4 мл фермент-буферного раствора, а экстракта и экстрагируют их 4 мл серно-спир- экстрагировать их 50 мл хлороформа или тового реактива. Каждая из этих экстракций дихлорметана, в этом случае из суммар должна занимать около 2 мин. После этого ного экстракта отбирают по две порции по осторожно удаляют нижние, хлороформенные, 20 мл Ч одну для экстракции фенилгидра слои, а верхние, т. е. соответственно фенил- зиновым реактивом (опыт), другую для гидразиновый и серно-спиртовой реактивы, пе- экстракции серно-спиртовым реактивом (хо реносят в отдельные пробирки и нагревают на лостой опыт). Экстракцию в этом случае водяной бане при 60 С в течение 20 мин. проводят порциями по 2 мл серно-спирто Одновременно ставят калибровочный опыт, вого и фенилгидразинового реактива;
этого для чего 1 мл калибровочного раствора, содер- количества оказывается достаточно, чтобы жащий 20 мкг/мл, выпаривают досуха в про- измерить светопоглощение на спектрофото бирке, растворяют в 50 мл хлороформа и экстра- метре типа СФ даже без специальных мик гируют 4 мл фенилгидразинового реактива, хо- рокювет, а просто приподнимая стандарт лостой опыт при калибровке не ставят. Все ные кюветы с помощью вкладышей. Это три раствора Ч опытный с фенилгидразино- сокращает расход растворителя почти в вым реактивом, холостой с серно-спиртовым раза Ч с 150 до 50 мл. 4. В качестве экстра реактивом и калибровочный Ч фотометрируют тента могут быть использованы и хлоро в кюветах с длиной оптического пути 1 см при форм, и дихлорметан, но последний труднее длине волны 410 нм против прогретого серно- получить достаточно высокого качества.
спиртового реактива.
Экстрагирование дихлорметаном удобнее, Ра с че т проводят по правилу пропорции, так как он легче серно-спиртового и фенил учитывая, что из 5 мл мочи, взятых для иссле- гидразинового реактивов, в то время как дования, на стадии хлороформенного экстракта хлороформ тяжелее их. По этой причине отбрасывается 1/3 часть, поэтому фактически дихлорметановый слой оказывается сверху в фенилгидразиновый реактив переходят 17- и его проще полностью удалить, оставив на оксикортикостероиды из 3,33 мл мочи. Вводит- дне пробирки тот слой, который в дальней ся также поправка на неспецифические хромо- шем используют для анализа. 5. Если нет гены, о которых судят по экстинкции холостой достаточно чистых реактивов, иногда можно пробы. Окончательный расчет проводят по вводить поправку на их небольшие загряз формуле: нения, используя измерение экстинкции при трех длинах волн Ч 370;
410 и 450 нм, как это делается при анализе крови. 6. Иногда после ферментативного гидролиза моча рез ко темнеет;
это признак того, что обследуе мый получил с пищей или принял в виде фармацевтических препаратов какие-то Умножая полученную величину на суточный вещества, которые образовали парные соеди диурез, получают выведение 17-ОКС с мочой нения с глюкуроновой кислотой. Как прави за сутки.
ло, это не влияет на дальнейший ход Пр и ме ч а н и я. 1. Серно-спиртовой и фе- анализа.
нилгидразиновый реактивы очень агрессив Но р м а л ь н ые в е л и ч и н ы. Суточное ны как в отношении кювет и прибора, так выведение 17-ОКС составляет 4Ч20 мкмоль/сут и в отношении платья и рук лаборанта, (1,4Ч7,2 мг/сут).
поэтому работать с ними надо очень осто Определение 17-ОКС в плазме крови по рожно. 2. Результаты работы по этой мето реакции с фенилгидразином. Пр и н ц и п ме дике во многом зависят от чистоты реакти тода аналогичен определению 17-ОКС в моче вов Ч растворителя, спирта, кислоты и даже с той разницей, что определяются лишь не свя солей, используемых для осушения, поэто занные с глюкуроновой кислотой соединения, му при налаживании методики или смене поэтому ферментативный гидролиз не прово реактивов желательно провести контрольное дится. Для экономии плазмы крови холостой определение, в котором вместо мочи взять опыт не ставят, а поправку на неспецифическое воду. Оптические плотности серно-спиртово поглощение проводят путем вычитания сосед го и фенилгидразинового реактивов в этом них участков спектра.
случае должны быть не более 0,1Ч0,2 при Ре а к т ив ы. 1. Хлороформ'. 2. Фенил измерении против воды, в противном случае гидразина гидрохлорид. 3. Фенилгидразиновый надо искать тот реактив, который вносит реактив 2. Сначала готовят смесь серной кисло загрязнения. 3. Приведенный унифициро ты, спирта и воды, для чего осторожно, избе ванный метод требует значительного рас гая нагревания, смешивают 62 мл концентри хода реактивов, поэтому появилось много рованной серной кислоты, 38 мл воды и 50 мл предложений о том, как можно проводить этилового спирта. В день определения раство определение более экономно. С нашей точ ряют 4,3 мг гидрохлорида фенилгидразина ки зрения заслуживают внимания предло жения, направленные на уменьшение рас- Очистку см. с. 251.
хода хлороформа. Это можно сделать, если Требования к чистоте спирта и серной растворять фермент непосредственно в бу- кислоты см. с. 253.
ферном растворе и брать в опыт по 4 мл мо- Очистку см. с. 253.
в 10 мл этой смеси. 4. 0,2 н. раствор натрия 5.7.4. 11-Оксикортикостероиды карбоната. 5. Калибровочный раствор гидро кортизона, содержащий 0,5 мкг в 1 мл. Гото вят, растворяя 1 мг препарата в 5 мл метило- Унифицированный метод по флюоресцен вого или этилового спирта, и доводят объем ции в серно-спиртовом реактиве. Пр и н ц и п.
водой до 2 л. Кортикостероиды, имеющие гидроксилы в по Ход о п р е д е л е н и я. Для анализа же- ложениях 11 и 21 и кетогруппу в положении 3, лательно использовать гепаринизированную после обработки смесью серной кислоты и спир плазму, полученную на холоду, но можно про- та флюоресцируют зеленым светом. Их опре водить определение и в сыворотке, полученной делению мешают холестерин и другие липиды, обычным методом. Экстрагируют 5 мл плазмы которые в этих условиях также образуют 25 мл хлороформа, плазму удаляют, экстракт флюоресцирующие соединения, поэтому их уда промывают два раза порциями по 2,5 мл 0,2 н. ляют предварительной экстракцией гексаном, в натрия карбоната, затем таким же количеством который кортикостероиды не переходят.
воды. Отмытый экстракт упаривают при темпе- Ре а кт ив ы. 1. Гексан. 2. Дихлорметан.
ратуре не свыше 40 С до объема 1 Ч1,5 мл, 3. 0,2 н. раствор натрия карбоната. 4. Серно который переносят в центрифужную пробир- спиртовой реактив: смешивают 3 объема кон ку. Стенки посуды, где проводилось выпари- центрированной серной кислоты и 1 объем эти вание, смывают еще 1 Ч 1,5 мл хлороформа, кото- лового спирта, смесь охлаждают до комнатной рый переносят в ту же центрифужную пробир- температуры, реактив годен только в день при ку. К суммарному экстракту добавляют 0,2 мл готовления. Требования к качеству серной ки фенилгидразинового реактива, экстрагируют слоты и спирта те же '. 5. Калибровочные взбалтыванием и дают отстояться не менее растворы. Желательно, чтобы калибровочные 20Ч30 мин. После этого хлороформенный слой растворы содержали гидрокортизон и кортико (нижний) осторожно отсасывают, опасаясь стерон в тех же соотношениях, в которых они захватить фенилгидразиновый экстракт. Про- присутствуют в крови человека, т.е. 4:1, но бирку с кислотным экстрактом прогревают 30 можно обойтись и одним гидрокортизоном.
мин при 60 С, при этом остатки хлороформа Основной калибровочный раствор содержит выпариваются. Прогретый реактив, приобрет- 200 мкг гидрокортизона и 50 мкг кортикосте ший желтоватую окраску, пастеровской пипет- рона в 1 мл;
его готовят, растворяя кортикоиды кой переносят в микрокювету и измеряют свето- в 1 мл спирта и добавляют воду до нужного поглощение при длинах волн 370;
410 и 450 нм объема. Ампулированные фармацевтические против фенилгидразинового реактива, который препараты обычно содержат гемисукцинат и прогревают так же, как и опытную пробу. для калибровки не годятся.
Для калибровки аналогичным образом экс- Ход о п р е д е л е н и я. Исследуемую трагируют 25 мл хлороформа 1 мл калибровоч- плазму или сыворотку в количестве 1 мл экстра ного раствора (0,5 мкг гидрокортизона), экс- гируют 3 мл гексана, верхний (гексановый) тракт упаривают и реэкстрагируют фенилгидра- слой удаляют, остаток гексана упаривают под зиновым реактивом так же, как и опытную вакуумом на водяной бане при 40 С. Плазму пробу. экстрагируют 10 мл дихлорметана, дают хоро Для проведения расчета сначала вычисляют шо отстояться (по крайней мере 20 мин), дожи исправленную величину экстинкции (Дгп) по даясь полного просветления раствора, промы формуле: вают его 0,5 мл 0,2 н. раствора натрия карбо ната, затем 0,5 мл воды и 8 мл переносят в чистую пробирку, куда добавляют 2,5 мл сер ЕДса = 410 Ч 0,5 Х (з?о + 450) но-спиртового реактива, встряхивают и через несколько минут удаляют дихлорметановый слой (верхний). Через час измеряют флюорес как для опытной, так и для калибровочной проб. Содержание 17-ОКС в 5 мл плазмы кро- ценцию серно-спиртового экстракта в диапазо ви рассчитывают по правилу пропорций, не 540Ч550 нм при возбуждении светом с дли сопоставляя Е опытной и калибровочной ной волны 475 нм.
исп проб. В 1 л содержится в 200 раз больше Одновременно с опытными пробами обраба 17-ОКС. тывают и калибровочные с той разницей, что Но р м а л ь н ые в е л и ч и н ы: 140Ч550 экстракцию гексаном пропускают, а 1 мл кали нмоль/л (5Ч20 мкг в 100 мл). бровочного раствора непосредственно экстра Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Нестойкое гируют 10 мл дихлорметана;
дальнейшая обра увеличение 17-ОКС бывает при нервно-эмо- ботка такая же, как и в опытных пробах.
циональных напряжениях, тяжелой физической Ра с ч е т проводят по формуле:
работе у нетренированных людей, травмах, хирургических операциях и т. д. Стойкое уве -=сД, личение свидетельствует о развитии гиперкор тицизма (синдром Кушинга) чаще всего в результате опухоли надпочечника, гипофиза и где Ф и Ф Ч соответственно величины флюо эктопической АКТГ продуцирующей опухоли. оп к ресценции опытной и калибровочной проб, Снижение свидетельствует о гипокортицизме вследствие поражения надпочечников (болезнь См. с. 253.
Аддисона) или длительной стероидной терапии.
а С Ч содержание 11-ОКС в калибровочном и высушенной. Остатки окиси алюминия пере к растворе. Результаты выражают в мкг/л. носят в колонку еще 2Ч3 порциями воды. 15 мл Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы: 140Ч230 мочи наносят на колонку и дают стечь под нмоль/л (5Ч8 мкг в 100 мл). действием силы тяжести, затем промывают Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е такое же, 10 мл воды, к которым добавлена 1 капля 0,5 н.
как и определения 17-ОКС. NH4OH;
Pages: | 1 | ... | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | ... | 13 | Книги, научные публикации