Книги, научные публикации
Pages: | 1 | ... | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | ... | 13 | СПРАВОЧНИК Лабораторные методы исследования в клинике Под редакцией профессора В.В.Меньшикова МОСКВА ДМЕДИЦИНА" 1987 ББК 53.4 М51 УДК 61б-074/-078:061.6 В. В. МЕНЬШИКОВ, Л. Н. ДЕЛЕКТОРСКАЯ, Р. П. ...
-- [ Страница 8 ] --Оптическую плотность проб измеряют против холостой пробы тем же способом, что и при 5.2.11. Щелочная фосфатаза, определении активности фермента в сыворотке.
изоферменты щелочной фосфатазы Пе р е с ч е т активности уроканиназы на микромоли разложившейся уроканиновой кис лоты на 1 л сыворотки за 1 мин производят Фосфатазы Ч ферменты, гидролизующие по формуле: эфиры фосфорной кислоты. В зависимости от значения рН, при котором действует фермент, активность уроканиназы, нмоль/(с-л) = различают щелочную и кислую фосфатазу.
Щелочная фосфатаза Ч-,ЩФ (фосфогидро лаза моноэфиров ортофосфорной кислоты;
К. Ф.
3.1.3.1) содержится практически во всех живот ных тканях;
наиболее богаты ферментом печень, имело применение так называемых трансформи костная ткань, кишечник, плацента. Щелочная рующих буферов.
фосфатаза Ч негомогенный фермент;
разли- Наиболее приемлемыми являются два тран чают 5 тканево-специфических изоферментов сформирующих буфера: 2-амино-2-метил-1-про щелочной фосфатазы: плацентарный, костный, паноловый и диэтаноламиновый. В пропаноло печеночный, кишечный, почечный. Множествен- вом буфере различия по отношению к изофер ные формы щелочной фосфатазы обусловлены ментам менее выражены и степень чистоты его как генетическими факторами, так и посттран- более приемлемая, чем для диэтанол-аминового сляционной модификацией. Для плацентарной буфера. В пропаноловом буфере п-нитрофенил формы существуют отдельный генетический ло- фосфат более стабилен. Диэтаноламиновый кус и аллельные варианты, которые не обнару- буфер требует высокой степени очистки, так как живаются для других изоформ. Фракции щелоч- содержит ингибиторы ЩФ. В наборах реакти ной фосфатазы различаются по своим каталити- вов Лахема (ЧССР) предложен новый буфер ческим свойствам, электрофоретической под- D-N-метилглюкамин. К трансформирующим бу вижности, устойчивости к тепловой инактива- ферам относится М-(2-оксиэтил)-этилендиамин ции. Исследованием термоустойчивости (56 С тетрауксусная кислота (НЭДТА). Этот буфер 10 мин или 65 С 5 мин) изоферментов ЩФ из содержит ионы цинка и магния, которые необхо различных тканей установлено, что при указан- димы для работы фермента. Данный буфер ных условиях плацентарная ЩФ устойчива к на- и субстрат п-нитрофенилфосфат используются греванию, костная фракция очень чувствитель- в оптимизированном референтном методе опре на к теплу (85Ч90% инактивации);
менее деления активности ЩФ, разработанном Меж чувствительна к теплу кишечная фракция (50Ч дународной Федерацией клинической химии. За 65 % инактивации) и печеночная (50Ч75 % последние годы за счет оптимизации условий инактивации). измерения достигнуты значительные улучшения Однако только по методу тепловой инакти- аналитических качеств методов определения ак вации судить об органной принадлежности ЩФ тивности ЩФ. В СССР в качестве унифициро невозможно. В норме при электрофорезе выяв- ванных в 1972 г. утверждены два метода с суб ляется 1Ч2 фракции ЩФ в зоне а2-глобулинов. стратом Ч (3-глицерофосфатом и п-нитрофенил При патологии количество изоферментов и их фосфатом.
расположение при электрофорезе могут менять- Унифицированный метод по гидролизу п-нит ся. ЩФ образует комплексы с белками и липи- рофенилфосфата. Пр и н ц и п. Субстрат п-нит дами. рофенилфосфат натрия гидролизуется с образо Методы определения фосфатаз различаются ванием п-нитрофенола, дающего в щелочной по используемому субстрату: р-глицерофосфат среде желтое окрашивание.
натрия Ч метод Боданского;
фенилфосфат нат- Ре а к т и в ы. 1. п-Нитрофениловый эфир рия Ч метод Кинга Ч Армстронга;
п-нитрофе- фосфорной кислоты динатриевая соль ч. д. а.
нилфосфат натрия Ч метод Бессея Ч Лоури Ч 2. НС1, 0,001 моль/л. 3. п-Нитрофенилфосфат Брока;
кроме того, применяются субстраты Ч натрия, 4 г/л раствор в 0,001 моль/л раствора нафтилсульфат, фенолфталеиндифосфат, фе- НС1: 0,4 г п-нитрофенилфосфата помещают в нолфталеин монофосфат, тимол фталеинмоно- мерную колбу вместимостью 100 мл и доливают фосфат. Ниболее специфичным и простым явля- до метки 0,001 моль/л раствором НС1. В связи ется метод Бессея Ч Лоури Ч Брока, основан- с тем, что в продаже чаще имеется бариевая ный на ферментативном гидролизе п-нитро- соль п-нитрофенилфосфата, то перевод ее в нат фенилфосфата, однако для получения правиль- риевую соль осуществляется следующим спосо ных результатов важным в данном методе явля- бом: к навеске п-нитрофенилфосфата бария, ется оптимизация условий определения. Во всех соответствующей получению 9 г/л раствора и по методах субстратами служат однозамещенные мещенной в фарфоровую ступку, добавляют не ортофосфата, дву- и трехзамещенные производ- большими количествами 0,001 моль/л раствор ные гидролизу щелочной фосфатазой не подвер- НС1 в процессе растирания соли в ступке в тече гаются. Определение ЩФ с субстратом п-нитро- ние 10 мин. Добавлением насыщенного раствора фенилфосфатом проводится на биохимических сульфата натрия (1 мл на 100 мл раствора) автоанализаторах различного принципа дей- бариевую соль переводят в натриевую. Через ствия. 5 мин полученный раствор п-нитрофенилфос Оптимизация условий определения и унифи- фата натрия фильтруют в делительную воронку, кации методов. Во всех странах, где занимаются где затем взбалтывают с равным объемом водо стандартизацией методов, стандартизован метод насыщенного бутилового спирта. После разделе с субстратом п-нитрофенилфосфатом, однако ния слоев жидкости в делительной воронке условия измерения предложены различные. (вверху Ч бутанол, внизу Ч постепенно обес п-Нитрофенилфосфат легко гидролизуется, дает цвечивающийся субстратный раствор) бутанол минимальные различия для изоферментов ЩФ выливают, а субстратной раствор подвергают в оптимизированной концентрации и с образова- описанной выше процедуре очистки еще 2Ч3 ра нием хромогена при гидролизе субстрата, что за, пока он не станет совершенно бесцветным.
дает возможность осуществлять кинетическое После бутанола производят экстракцию водона измерение. Высокое значение молярного погло- сыщенным эфиром 1Ч2 раза. Реактив не дол щения п-нитрофенилфосфата делает этот метод жен содержать свободного п-нитрофенола, от достаточно чувствительным. Для оптимизации сутствие которого в субстратном растворе про методов определения ЩФ большое значение веряется следующей пробой: к 1 мл субстратного раствора прибавляют 10 мл-0,02 моль/л рас твора едкого натра и измеряют на ФЭКе при длине волны 400Ч420 нм (фиолетовый свею фильтр). Экстинкция должна быть меньше 0,08;
если экстинкция больше 0,08, необходимо уда лить свободный п-нитрофенол. Для этого реак тив экстрагируют 2 или 3 раза равными объема ми бутилового спирта и один раз Ч эфиром.
Затем удаляют следы эфира выдерживанием на воздухе. Бутиловый спирт и эфир должны иметь нейтральную реакцию. Если реактив не выдерживает указанный выше тест, то экстра гирование повторяют. Хранят раствор в холо дильнике в замороженном состоянии R течение 2Ч3 нед. 4. Аминоуксусная кислота (гликокол, глицин) ч. д. а. или х. ч. 5. Магния хлорида 6-водный ч. д. а. или х. ч. 6. Натр едкий ч. д. а.
или х. ч.;
растворы 0,1 моль/л, 0,02 моль/л, не содержащие углекислого газа. 7. Буферный рас твор Ч 0,05 моль/л глициновый буфер с добав- Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы: 278Ч лением катализатора хлорида магния Ч 95 мг/л: нмоль/(с-л), или 1Ч3 мкмоль п-нитрофенола, 375 мг глицина и 10 мг MgCI Х 6Н О растворяют освобожденного 1 мл сыворотки за 1 ч инкуба 2 в 42 мл 0,1 моль/л раствора едкого натра и дово- ции Ч единицы Бессея Ч Лоури Ч Брока. Нор дят объем водой до 100 мл. 8. Субстратно-буфер- мальные величины ЩФ в значительной степени ный раствор готовят смешиванием равных ча- зависят от возраста.
стей растворов 3 и 7, рН раствора 10,5. При В о с п р о и з в о д и м о с т ь. Коэффициен смешивании 2 мл раствора с 10 мл 0,02 моль/л ты вариации равны в среднем 5Ч9 %.
раствора едкого натра реактив не должен давать Ли т е р а т у р а. Bessey О. A., Lowry О. Н., экстинкцию на ФЭКе более 0,1 (толщина слоя Brоck M.~ J. Biol. Chem., 1940, vol. 164, p. 321.
1 см, длина волны 400Ч420 нм). В противном случае раствор негоден или подлежит реэкстра- Оптимизированный метод по гидролизу п-ни гированию бутанолом или эфиром. После эк- трофенилфосфата. Пр и н ц и п. Измерение пог стракции необходимо снова установить рН. Хра- лощения при 405 нм при образовании п-нитрофе нят в холодильнике в течение 2Ч3 дней. 9. н-Ни- нола из п-нитрофенилфосфата. Реакция проте трофенол Ч калибровочный раствор 5-10~ кает по следующему уравнению:
моль/л: 696 мг п-нитрофенола х. ч. растворяют в 0,02 моль/л растворе едкого натра и доводят этим же раствором объем до 1 л;
1 мл раствора рН 10, содержит 5 мкмолей п-нитрофенола.
= п-нитрофенол + фосфат Ма т е р и а л д л я и с с л е д о в а н и я.
Свежая, свободная от гемолиза сыворотка или плазма крови. Цитрат, оксалат, ЭДТА, гепарин Ре а к т и в ы. 1. 2-Амино-2-метил-1-пропа вызывают интерференцию. При хранении актив нол (2А2М1П). 2. HCI, 1 моль/л. 3. 2-Амино ность фермента возрастает.
2-метил-1-пропаноловый буфер, 0,393 моль/л, Ход о п р е д е л е н и я. Опытная проба: в рН 10,4: 2А2М1П нагревают при температуре пробирки вносят по 1 мл субстратно-буферного 30Ч35 С до получения жидкости. 17,52 г раствора, прогревают при 37 С в течение 5 мин, 2А2М1П растворяют в 400 мл воды, доводят затем добавляют по 0,1 мл сыворотки. Содержи- рН до 10,4 раствором HCI 1 моль/л и доводят мое пробирок перемешивают и инкубируют в те- объем водой в мерной колбе до 500 мл. Раствор чение 30 мин при 37 "С. После инкубации про- необходимо предохранять от СО воздуха;
ста бирки переносят в водяную баню со льдом, а за- билен при комнатной температуре в течение тем добавляют по 10 мл 0,02 моль/л раствора месяца. 4. Магния хлорид 6-водный (MgClj X едкого натра и тщательно перемешивают. Через Х6Н О), 6,38 ммоль/л: растворяют 0,131 г хло 5 мин пробы измеряют на ФЭКе при длине рида магния в 60Ч70 мл воды в мерной колбе волны 400Ч420 нм (фиолетовый светофильтр) вместимостью 100 мл и доводят водой до метки.
в кювете с толщиной слоя 1 см против холостой Раствор стабилен. 5. п-Нитрофениловый эфир пробы. Холостую пробу ставят так же, как фосфорной кислоты динатриевая соль, имп.
опытную, но сыворотку добавляют после (п-НФФ), 204 ммоль/л: растворяют 0,757 г инкубации. п-НФФ в 10 мл 6,38 ммоль/л раствора хлорида Ра с ч е т производят по калибровочному магния. При хранении в посуде из темного стек графику. ла раствор стабилен в течение 5Ч6 ч, поэтому По с т р о е н и е к а л и б р о в о ч н о г о раствор готовят в необходимом количестве перед г р а фи к а. Из рабочего калибровочного рас- употреблением.
твора готовят ряд разведений, как указано ни- С п е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а н и е.
же, и измеряют оптическую плотность растворов Спектрофотометр с термостатированной кюве при условиях, аналогичных опытным, против той или биохимический анализатор, позволя 0,02 моль/л раствора едкого натра. ющий проводить кинетическое измерение.
Ход о п р е д е л е н и я. Перед определе- Электрофоретическое разделение изофермен нием температура растворов и исследуемой сы- тов на пленках из ацетата целлюлозы. Пр ин воротки должна быть доведена до температуры цип. Фракции ЩФ разделяются путем электро измерения. Определение проводят по следующей фореза на пленках из ацетата целлюлозы при схеме. рН 8,6. Затем пленки инкубируются на геле, содержащем субстратную смесь.
Ре а к т ив ы. 1. Буфер барбиталовый для В термостатиро- Конечная Опытная ванную кювету концентрация электрофореза, 0,075 моль/л, рН 9,2: 5,5-диэтил проба приливают веществ барбитуровая кислота (веронал) Ч 2,01 г, 5,5 (мкл) (30 С) в пробе диэтилбарбитуровой кислоты натриевая соль (мединал) Ч 15,4 г. Навески реактивов поме щают в мерную колбу вместимостью 1 л, рас 2А2М1П-буфер 920,0 2А2М1П творяют и доводят до метки водой. 2. Буфер 0,345 моль/л боратный для приготовления субстрата, рН 10,5:
Сыворотка крови 20, борная кислота Ч 0,309 г, калия хлорид Ч Перемешивают, оставляют на 5 мин 0,373 г, натрия гидроокись Ч 0,176 г, магния хлорид 6-водный Ч 0,0005 г. Навески реактивов Раствор п-НФФ 80,0 п-НФФ помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, 16 ммоль/л растворяют и доводят до метки водой. 3. Суб MgCl2 Ч 0, стратно-буферная смесь для инкубации пленок:
ммоль/л а-нафтилфосфат натрия Ч 0,04 г, фиолетовый быстрый Б (Fast violet В. salt) Ч 0,04 г. Навес ки реактивов растворяют в 20 мл боратного Осторожно перемешивают и точно через 1, 2, буфера. 4. Агароза: 0,32 г на 40 мл субстратного 3 мин (или через другие, но равные промежутки буфера. Заливают сначала половинным коли времени) измеряют экстинкцию при длине вол чеством буфера, доводят до кипения, после чего ны 405 нм в кювете с толщиной слоя 1 см против прибавляют остаток буфера. Смесь второй раз воды.
доводят до кипения. Охлаждают до 60 С и сме Расчет активности фермента проводят по шивают с буферно-субстратной смесью 1: 1.
формуле:
5. Раствор для промывания Ч 50 г/л раствор активность, моль/(с Х м3) =нмоль/(с Х л) Х 106 = уксусной кислоты.
Сп е ц и а л ь н о е обору дова ние.
1. Аппарат для электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы. Можно использовать ЭПАУ где Vp,c, Ч объем реакционной смеси, мл;
20-50 отечественного производства. 2. Ацетат Усыв Ч объем сыворотки, мл;
/ Ч время реак- целлюлозная пленка ТУ 6-05-1696-74.
Ход о п р е д е л е н и я. Нанесение сыво Ч изменение экстинкции за 1 с;
ротки: способ нанесения (аппликация) сыво ротки имеет немаловажное значение при элект е Ч коэффициент молярной экстинкции п-НФ рофорезе на ацетатцеллюлозных пленках. Же 2 - в растворе 2А2М1П при 30 С, м -моль лательно, чтобы аппликатор был фиксирован (18,8- 102). Коэффициент молярной экстинкции и позволял наносить микроколичества сыворот п-НФ может меняться в зависимости от качества ки. Для определения изоферментов ЩФ тре реактива и условий определения;
/ Ч толщина буется 1Ч5 мкл сыворотки (двойная апплика слоя жидкости в кювете, м (1 Х 10- 2). 1 МЕ = ция). Для облегчения трактовки результатов = 1 мкмоль/(мин Х л) = 16,67 нмоль/(с-л).
электрофореграммы на ацетатцеллюлозную Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы;
500Ч пленку можно наносить равные количества нмоль/(с-л), или 30Ч85 ME.
обычной и предварительно инактивированной Оце нк а а н а л и т и ч е с к о й на де ж- теплом сыворотки.
нос т и. Коэффициенты вариации составляют Пр о в е д е н и е э л е к т р о фо р е з а.
3,2Ч4,8 %. При сравнении данного метода с ре- Ацетатцеллюлозную пленку замачивают в ферентным методом МФКХ r = 0,99. По анали- электрофоретическом буфере в течение 20Ч тическим качествам его можно использовать 30 мин. Высушивают фильтровальной бумагой, в качестве временного референтного метода. наносят 1Ч5 мкл сыворотки и подключают ка меру к источнику напряжения. Электрофорети Ли т е р а т у р а. IFCC. Expert Panel on En- ческое разделение проводят в течение 50 мин symes. Part 5 IFCC method for alkaline phosp- при напряжении 270 В и силе тока 15Ч25 мА.
hatase (ortho-phosphoric-monoester phospho- После электрофореза пленки кладут рабочей hydrolase, al kal i ne optimum EC 3.1.3.1).Ч Clin. стороной на поверхность геля, содержащего суб chim. Acta, 1983, vol. 135, p. 339F Ч 367F Bo- стратно-буферную смесь ( 1: 1), и выдерживают wers G. N., McComb R. B. Cl i n. Chem., 1975, в термостате при 37 С до развития окраски.
vol. 21, № 13, p. 1988Ч1995;
Bowers G. N., Оц е н к а р е з у л ь т а т о в. Непросветлен McComb R. В., Upretti A. Clin. Chem., 1981, ные высушенные пленки оценивают с помощью vol. 27, № 1, p. 135Ч143;
A reference method денситометра.
for measurement of al kal i ne phosphatase activity Но р м а л ь н ые з н а ч е н и я. В норме вы in human serum.Ч Clin. Chem., 1983, vol. 29, являются 1Ч2 фракции ЩФ в зоне а2-глобу № 5, p. 751Ч761. линов.
Кл и н и ч е с к о е з на ч е ни е. Значи- вый оптимум рН, но различаются по действию тельное увеличение активности ЩФ в сыворотке на них ряда веществ (ингибиторов), в частности крови наблюдается при костных заболеваниях, тартрата (солей винной кислоты). Активность связанных с увеличением количества остеоблас- простатической фракции фермента ингибируют тов, или с более интенсивным синтезом ЩФ тартрат, ионы фтора и железа. При использо в остеобластах. Наиболее высокая активность вании 0,02 моль/л раствора тартрата и п-нитро (выше нормы в 20 раз и более) наблюдается фенилфосфата в качестве субстрата ингибиро при болезни Педжета (деформирующий остит), вание составляет 95 %, т. е. простатическая КФ менее высокая Ч определяется при рахите. Зло- является тартратлабильной. Специфичностью к качественные новообразования, поражающие КФ предстательной железы обладают субстраты кости, также вызывают повышение активности п-нафтилфосфат и тимолфталеинфосфат.
ЩФ в сыворотке крови. При гиперпаратирео- Методы определения КФ те же, что и для идизме уровень ЩФ повышается незначитель- ЩФ, но различаются по используемым буфер но. Изменения активности ЩФ в сыворотке ным системам и значению рН.
крови, помимо костной патологии, характерны Оптимизация условий определения и унифи при заболеваниях печени и желчных путей. кация методов. В методах определения актив Резкое увеличение активности фермента на- ности общей простатической КФ чаще всего блюдается при заболеваниях, сопровождающих, применяется цитратный буфер, обладающий ся механической желтухой. В меньшей степени способностью активировать кислую фосфатазу активность ЩФ увеличивается при гепатите и предстательной железы. В большинстве стан циррозе печени. Повышение активности фермен- дартных методов, рекомендуемых в различных та в сыворотке крови при заболевании печени странах, и в наборах реактивов в качестве и желчных путей связано с высвобождением субстрата используется п-нитрофенилфосфат.
ЩФ из поврежденных печеночных клеток или Лахема (ЧССР) выпускает набор реактивов задержкой экскреции ЩФ из желчи, в резуль- для определения общей и простатической КФ.
тате чего фермент вновь поступает в кровоток, Метод по гидролизу п-нитрофенилфосфата а также с индуктивным ее синтезом в желчных для определения активности общей и простати канальцах. При заболеваниях костей ЩФ в сы- ческой фракций. Пр и н ц и п. КФ гидролизует воротке по своим свойствам аналогична кост- п-нитрофенилфосфат в кислой среде с образова ному ферменту, при болезнях печени Ч фермен- нием п-нитрофенола, дающего в щелочной среде ту, который выделяется из печени. Если при желтое окрашивание. Активность КФ предста электрофорезе в норме выявляется 1Ч2 фрак- тельной железы ингибируется L-тартратом.
ции ЩФ, то при патологии количество фракций Ре а к т и в ы. 1. п-Нитрофенилфосфат ди и их расположение при электрофорезе могут натриевая соль (п-нитрофенилфосфат не дол меняться. Наиболее быстро мигрирующей фрак- жен содержать примеси п-нитрофенола);
п-нит цией (от катода к аноду) является печеночный рофенилфосфат отечественного производства изофермент. При заболеваниях печени возмож- требует перекристаллизации (см. 5.2.11). 2. Нат но появление второй печеночной полосы ЩФ.
рия хлорид ч. д. а. или х. ч. 3. Натрия цитрат Несколько более медленно по сравнению с пече- трехзамещенный, 1 моль/л, рН 5,5. 4. Калий ночной фракцией движется костная фракция натрий виннокислый ч. д. а. или х. ч. (раствор ЩФ. Еще более медленно движется плацент- ингибитора), 0,12 моль/л раствор в 1 моль/л ная термостабильная фракция ЩФ. Фракция растворе цитрата. 5. Раствор А: 80 мл концент ЩФ с очень высокой термостабильностью наз- рированного буферного раствора разбавляют вана изоферментом Реган по имени больного 32 мл воды и в 37 мл этого раствора растворяют раком легкого, у которого он был обнаружен 0,09 г п-нитрофенилфосфата и 0,31 г хлорида впервые. Ее появление может быть связано с на- натрия. Определение можно проводить по набо личием злокачественного новообразования. На- ру реактивов Лахема (ЧССР). 6. Раствор Б:
иболее медленно мигрирующей фракцией явля- 40 мл концентрированного раствора ингибитора ется кишечная ЩФ.
разбавляют 16 мл воды и в 18,5 мл этой смеси растворяют 0,045 г п-нитрофенилфосфата и 0,155 г хлорида натрия. Растворы А и Б стабиль 5.2.12. Кислая фосфатаза, ны при хранении в холодильнике в посуде из фракция кислой фосфатазы темного стекла в течение нескольких недель.
7, п-Нитрофенол ч. д. а. 8. Основной калибро Кислая фосфатаза Ч КФ (фосфогидролаза вочный раствор п-нитрофенола: 16,68 мг п-нит моноэфиров ортофосфорной кислоты, кислый рофенола помещают в мерную колбу вмести оптимум рН;
К. Ф. 3.1.3.2) Ч содержится почти мостью 100 мл и доливают до метки водой. 9.
во всех органах и тканях человека, особенно Натр едкий ч. д. а. или х. ч., 0,1 моль/л.
богаты КФ клетки крови, предстательная желе- Ма т е р и а л д л я и с с л е д о в а н и я.
за, печень, почки, кости. Активность КФ в пред- Свежая сыворотка или плазма крови, свобод стательной железе в 100 раз выше, чем в других ные от гемолиза.
тканях. КФ не является гомогенным ферментом. Ход о п р е д е л е н и я. Опытная проба: в Большинство тканей содержат два или более одну пробирку вносят 0,5 мл раствора А (общая изоферментов, отличающихся по своим свой- активность), в другую пробирку Ч 0,5 мл рас ствам. твора Б (тартратстабильная фракция) и нагре Ткань предстательной железы содержит два вают до 37 С в течение 5 мин. Добавляют основных изофермента, которые имеют одинако- в обе пробирки по 0,1 мл сыворотки или плазмы и инкубируют 30 мин при 37 С. Затем в обе к набору реактивов для определения активности пробирки добавляют по 2 мл О, I моль/л раствора кислой фосфатазы в сыворотке крови. Био-Ла гидроокиси натрия. Холостая проба: в пробирку Тест, Лахема (ЧССР).
вносят 0,5 мл раствора А, далее обрабатывают Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Определе так же, как опытную, но сыворотку или плазму ние активности КФ обычно проводится для диаг добавляют после инкубации. Измеряют экстинк ноза карциномы предстательной железы. При цию опытной и холостой пробы при длине волны этом простатическая фракция КФ имеет боль 405 нм в кювете с толщиной слоя 1 см против шее диагностическое значение, чем общая КФ.
воды.
Определение активности КФ может быть исполь По с т р о е н и е к а л и б р о в о ч н о г о зовано для дифференциальной диагностики ме г р а фи к а. Из основного калибровочного тастазов рака предстательной железы в кости раствора готовят рабочие растворы, как указано и заболеваний костной ткани, в частности остео ниже.
дистрофий, при которых обычно повышен уро вень только щелочной фосфатазы, в то время Активность КФ как при костных метастазах рака предстатель Основной ной железы повышается, как правило, актив калибро- Вода ди № ность в крови как ЩФ, так и КФ. Массаж пред вочный ра- стилли про стательной железы, катетеризация, цистоско створ п- рован- мкмоль/ нмоль/ бирки нитрофе- ная, мл (мин-л) (с- л) пия, ректальные исследования приводят к повы нола, мл шению активности КФ, поэтому кровь для опре деления активности КФ рекомендуется брать не раньше чем через 48 ч после указанных про 1 1,9 2,5 41,7 цедур.
0, 2 0,2 1,6 5 83, 3 0,5 2,0 10 166, 4 1,0 1,0 25 416, 5 1,0 Ч 50 833,5 5.2.13. Фруктозо-1,6-дифосфат-альдолаза Альдолаза Ч АЛД (В-фруктозо-1,6-бисфос фат D-глицеральдегид-З-фосфат-лиаза;
К. Ф.
В каждую из 5 пробирок наливают по 0,1 мл 4.1.2.13) относится к классу лиаз. АЛД явля соответствующего рабочего калибровочного ется ферментом гликолиза. О. Warburg, раствора, прибавляют по 2,5 мл раствора NaOH, W. Christian выделили впервые фермент в 1943 г.
перемешивают и измеряют экстинкцию против из скелетных мышц крыс. АЛД состоит из трех воды при тех же условиях, что и экстинкцию изоформ: мышечной, печеночной, мозговой, опытной пробы. По полученным значениям различающихся по субстратной специфич экстинкции строят калибровочный график зави- ности.
симости экстинкции от активности фермента. Мышечный фермент (фруктозе-1,6-дифосфа Ра с ч е т активности производят по калиб- тальдолаза) катализирует гидролиз фруктозо ровочному графику. Из экстинкции опытной про- 1,6-дифосфата значительно быстрее, чем фрук бы (раствор А) вычитают экстинкцию холостой тозо-1-монофосфата;
он отличается малой ор пробы;
разность экстинкции соответствует эк- ганной специфичностью, наибольшая актив стинкции общей КФ. Из экстинкции опытной ность его обнаруживается в скелетной муску пробы (раствор Б) вычитают экстинкцию хо- латуре, в сердечной мышце и печени. Печеноч лостой пробы;
разность экстинкции соответству- ный тип (фруктозо-1-фосфатальдолаза) катали ет экстинкции тартратстабильной фракции. Для зирует реакцию расщепления фруктозе-1-моно обеих разностей находят соответствующую ак- фосфата на глицериновый альдегид и диокси тивность по калибровочному графику. Из вели- ацетонфосфат, содержится исключительно в пе чени.
чины активности общей КФ вычитают величину активности тартратстабильной фракции, полу- В норме в сыворотке крови активность фруктозо-1-фосфат-альдолазы не определяется.
чают активность тартратлабильной фракции КФ (КФ предстательной железы). Для целей диагностики чаще определяют фрук Но р м а л ь н ые в е л и ч и н ы. Общая ак- тозо-1,6-дифосфат-альдол азу.
тивность 67Ч167 нмоль/(с-л), или 4Ч10 ME;
Методы определения. Для определения ак тартратлабильная фракция 0Ч16,7 нмоль/ тивности АЛД в сыворотке крови применяют /(с-л), или 0Ч1 ME. спектрофотометрические методы по непрямому В о с п р о и з в о д и м о с т ь. Коэффициен- оптическому тесту Варбурга;
фотометрические ты вариации колеблются от 6 до 10 %. Если методы, основанные на определении фосфора полученная величина активности общей КФ пре- фосфотриоз по реакции с параоксидифенилом;
вышает 830 нмоль/(с-л), то исследование пов- динитрофенилгидразиновые методы (Сибли-Ле торяют при инкубации 10 мин и полученный нинжер, 1949). Шапиро (1960) был предложен результат умножают на 3. динитрофенилгидразиновый метод для опреде ления активности фруктозе-1-фосфатальдолазы Ли т е р а т у р а. Bessey О. A., Lowry О. Н., в сыворотке крови. Определение АЛД по не Brock М. 1. J. biol. Chem., 1946, vol. 164, прямому оптическому тесту протекает по сле p. 321Ч329;
Кислая фосфатаза. Инструкция дующим реакциям.
Метод, основанный на указанных реакциях, (от 30 до 40 мл), доводят рН до 7,4Ч7,6 и доли трудно выполнять в практических лабораториях вают водой до 100 мл. 6. Монойодуксусная без наличия готовых наборов реактивов, к тому кислота, 0,4 г/л водный раствор: 40 мг монойод же глицерол-3-фосфат-дегидрогеназа отличает- уксусной кислоты растворяют в 80 мл воды, ся низкой стабильностью. Из-за трудоемкости доводят рН раствором едкого натра до 7,4 и до методы, основанные на определении фосфотри- ливают водой до 100 мл. 7. Трихлоруксусная оз также не нашли широкого применения. кислота, 100 г/л. 8. Едкий натр, 30 г/л. 9. Бром Наиболее простыми и распространенными тимоловый синий (индикатор), 0,4 г/л: раство являются динитрофенилгидразиновые методы, ряют 10 мг индикатора в 3,2 мл 2 г/л раствора основанные на гидролизе фруктозодифосфата едкого натра. Объем раствора доводят водой до с образованием триоз, которые дают с 2,4-ди- 25 мл. Этим раствором пользуются для установ нитрофенилгидразином окрашенные гидразоны. ления рН. При рН 7,4Ч7,7 индикатор приобре Первый динитрофенилгидразиновый метод для тает синий цвет. 10. Калибровочный раствор определения активности альдолазы в сыворотке диоксиацетона.
крови был описан J. Sibley, A. Lehninger в 1949 г. Ма т е р и а л д л я и с с л е д о в а н и я !
В дальнейшем были предложены различные мо- Сыворотка, свободная от гемолиза.
дификации метода. В методах определения АЛД Ход о пр е д е л е ни я. Опытная проба: в сложным является вопрос относительно выбора пробирку вносят: 0,5 мл исследуемой сыворотки:
калибровочного материала. В качестве калибро- 0,5 мл 5 г/л раствора NaHCOa, 0,12 мл раствора вочного материала можно использовать фрукто- гидразина сульфата, 0,12 мл раствора монойод зодифосфат и триозы: глицеральдегид или диок- уксусной кислоты, 0,12 мл воды, 0,12 мл фрукто сиацетон. Возможность использования глицер- зодифосфата. Перемешивают, инкубируют 1 ч альдегида и диоксиацетона обусловлена тем, при 37 С. После инкубации в пробу добавляют что в ходе ферментативной реакции образуется 1,5 мл 100 г/л раствора трихлоруксусной кисло равное количество триоз. Диоксиацетон Ч более ты, содержимое пробирок перемешивают и цен стойкое вещество, чем глицеральдегид, поэтому трифугируют.
его предпочтительнее использовать в качестве В другую пробирку вносят 0,5 мл центри калибровочного материала.
фугата, 0,5 мл 30 г/л раствора NaOH и оставля Колориметрический динитрофенилгидрази- ют на 10 мин при комнатной температуре. Затем новый метод (Товарницкого Ч Волуйской).
добавляют 0,5 мл раствора 2,4-динитрофенил Пр и н ц и п. Альдолаза расщепляет фруктозо- гидразина, перемешивают, смесь нагревают 1,6-дифосфат на фосфоглицериновый альдегид 10 мин при 37 С, добавляют по 3 мл 30 г/л и фосфодиоксиацетон. При отщеплении лабиль- раствора NaOH и через 10Ч20 мин определяют ного фосфора альдегидные и кетоновые группы оптическую плотность раствора на ФЭКе в кюве триоз фиксируются гидразином по мере их обра- те с толщиной слоя 0,5 см с зеленым светофильт зования. Для предупреждения вовлечения фос- ром (540 нм) против холостой пробы. При стоя фотриоз в дальнейшие реакции к раствору нии проб больше 20 мин окраска бледнеет.
фруктозодифосфата прибавляется монойодук- Во с п р о и з в о д и мо с т ь. Коэффициент сусная кислота, которая блокирует ферменты, вариации около 10 %.
разрушающие фосфотриозы. Свободные триозы Ра с че т проводят по калибровочной с 2,4-динитрофенилгидразином образуют гидра- кривой.
зоны, окрашенные в щелочной среде.
По с т р о е н и е к а л и б р о в о ч н о й Ре а к т и в ы. 1. 0-фруктозо-1,6-дифосфата к р ив о й. 22,5 мг диоксиацетона при нагрева натриевая соль, 0,06 моль/л;
2 мл 10 % раствора нии растворяют в 25 мл воды;
1 мл такого рас натриевой соли 0-фруктозо-1,6-дифосфата (рас- твора содержит 10 мкмолей диоксиацетона.
фасованного в ампулах) разводят в колбе вме- В ряд пробирок (см. ниже) разливают калибро стимостью 25 мл водой и доводят объем раствора вочный раствор диоксиацетона, доливают водой до метки. Разведенный раствор фруктозе-1,6- и далее проводят реакцию так же, как и при дифосфата стабилен при хранении в холодиль- определении активности фермента.
нике. 2. HCI, 2 моль/л. Готовят разведением Ли т е р а т у р а. Sibfey J. A., Lehninger A. L.
17 мл концентрированной кислоты (отн. плот- J. biol. diem., 1949, vol. 177, p. 859.
ность 1,19) в 100 мл воды. 3. 2,4-Динитрофенил- Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Повыше гидразин, 1 г/л раствор: 100 мг сухого вещества ние активности АЛД наблюдается при многих растворяют в 100 мл 2 моль/л раствора HCI.
патологических состояниях: остром гепатите, ин 4. Натрия карбонат кислый, 5 г/л: 500 мг фаркте миокарда, прогрессивной мышечной ди МаНСОз растворяют в 100 мл воды. 5. Гидрази- строфии, дерматомиозите, гемолитических со на сульфат, 0,56 моль/л: растворяют 7,3 г гидра- стояниях, активном ревматизме, раке различной зина сульфата в небольшом количестве воды локализации.
5.2.14. Псевдохолинэстераза Калибре-- Фрукто Различают два типа холинэстераз Ч ацетил вочный Дистил- Диокси- 30-1,6 № про- раствор лирован- ацетон в дифос- холинэстеразу, или истинную холинэстеразу Ч бирки диокси- ная вода, пробе, фат в АХЭ (ацетилхолин-ацетилгидролаза;
К. Ф.
ацетона, мл мкмоль пробе, 3.1.1.7) и псевдохолинэстеразу Ч ХЭ (ацил мл мкмоль холин-ацилгидролаза;
К.Ф. 3.1.1.8). Истинная холинэстераза содержится преимущественно в эритроцитах, нервной и мышечной тка 1 0,05 0,45 0,5 0, нях;
Псевдохолинэстераза Ч в сыво 2 0,4 1 0, 0,1 ротке крови, печени, поджелудочной железе.
3 0,2 0,3 2 АХЭ и ХЭ различаются по ряду свойств и прежде 4 0,3 0,2 3 1, всего по субстратной специфичности. Наиболее 5 0,4 4 0,1 специфичным субстратом для истинной холин эстеразы является ацетилхолин, для псевдохо линэстеразы Ч бутирилхолин. Псевдохолинэс тераза не отличается строгой субстратной спе Повышение активности фруктозомонофо- цифичностью и гидролизует такие субстраты, сфат-альдолазы наблюдается при острых гепа- как ацетилхолин, бензоилхолин, сукцинилхолин титах. При хронических гепатитах и циррозах и другие эфиры холина.
печени активность фермента повышается у боль- При гидролизе ацетилхолина реакция проте шинства больных, но это повышение менее выра- кает следующим образом:
жено, чем при остром гепатите.
Методы определения. Манометрические ме- ров под действием фермента образуется тиохо тоды основаны на измерении в аппарате Вар- лин, который посредством своей SH-группы реа бурга количества СО2, образовавшегося из кар- гирует с 5,5'-дитио-бис-2-нитробензойной ки бонатного буфера под влиянием уксусной ки- слотой с образованием 2-нитро-5-меркапто-бен слоты, освободившейся во время ферментной зоата, имеющего желтую окраску с максимумом реакции;
титрометрические методы Ч на изме- абсорбции 410 нм. Эти методы могут быть ис рении количества щелочи, пошедшей на титро- пользованы для кинетического измерения актив вание уксусной кислоты;
фотометрические мето- ности фермента. При использовании в качестве ды Ч на изменении цвета раствора под влия- субстрата бензоилхолина применяют спектрофо нием уксусной кислоты в присутствии индика- тометрический метод, принцип которого основан тора. К этой группе относится метод Молан- на различии абсорбции бензоилхолина и обра дера Ч Фридмана (1954), гидроксиламиновый зующейся в процессе реакции бензойной ки метод Хестрина (1949). Электрометрические ме- слоты.
тоды основаны на измерении рН реакционной В 1974 г. в качестве унифицированного ут смеси до и после опыта. Принцип кондуктомет- вержден фотометрический метод с субстратом рических методов состоит в изменении электро- ацетилхолинхлоридом. Все параметры реакции проводности инкубационной среды в результате в методе оптимизированы.
ферментативной реакции. Унифицированный метод по гидролизу аце Применение кондуктометрических и мано- тилхолинхлорида. Пр и н ц и п. Под действием метрических методов на практике ограничено, холинэстеразы происходит гидролиз ацетилхо так как требуется дорогостоящая аппаратура. линхлорида с образованием уксусной кислоты Наиболее простыми являются фотометрические и холина. Уксусная кислота сдвигает рН раст методы, основанные на гидролизе ацетилхолина вора, что устанавливается с помощью индика с образованием уксусной кислоты и изменением тора.
'цвета реакционной смеси в присутствии индика- Ре а к т и в ы. 1. Ацетилхолина хлорид, тора. Эти методы различаются по концентрации 0,9 моль/л: 1,63 г ацетилхолина хлорида рас субстрата, виду буфера и индикатора. Широко творяют в 10 мл воды. При использовании фар применяются также методы с использованием макопейного ампулированного препарата содер в качестве субстрата ацетилтиохолина или бути- жимое одной ампулы (0,2 г) растворяют в 1,2 мл илтиохолина. В результате гидролиза этих эфи- воды. 2. 5,5'-Диэтилбарбитуровой кислоты нат риевая соль (натриевая соль веронала), фарм. Из каждого разведенного раствора берут по 3. НС1, 0,1 моль/л. 4. Натр едкий х. ч., 0,05 0,2 мл, смешивают с 5 мл вероналового буфера, моль/л. 5. Феноловый красный, индикатор, рас- 0,1 мл сыворотки, прогревают 5 мин при 37 С, твор 0,1 г/л, область действия рН 6,8Ч8,4. затем добавляют 0,2 мл прозерина, 0,2 мл аце Изменение окраски от желтой к красной. В фар- тилхолинхлорида, инкубируют 30 мин при 37 "С форовой ступке с 5,7 мл 0,05 моль/л раствора и охлаждают. Измерение проводят при тех же едкого натра растворяют 0,1 г сухого индика- условиях, что и опытные пробы. Холостую пробу ставят так же, как калибровочную, но вместо тора, переносят в мерный цилиндр и доводят до 25 мл водой. Из полученного 4 г/л раствора растворов уксусной кислоты добавляют воду.
перед употреблением готовят 0,1 г/л раствор Из экстинкции холостой пробы вычитают эк разведением водой в 40 раз. 6. Вероналовый стинкцию калибровочной пробы. Линейная зави буфер, 0,0075 моль/л, рН 8,4: 1,5450 г натриевой симость калибровочного графика сохраняется соли веронала растворяют в 500 мл воды, добав- в пределах от 0 до ПО мкмоль/(с Х л).
ляют 9 мл 0,1 моль/л раствора HCI и 150 мл Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы: 45Ч 0,1 г/л раствора индикатора, измеряют рН. мкмоль/(с Х л), или 160Ч340 мкмоль/(ч Х мл).
Доливают водой до 1 л. При хранении в холо- В о с п р о и з в о д и м о с т ь. Коэффициен дильнике в посуде из темного стекла реактив ты вариации 5Ч9 %.
стабилен в течение 1 мес. 7. Прозерин, фарм., Ли т е р а т у р а. Делекторская Л. Н., Доб 7 г/л: 0,7 г прозерина помещают в мерную колбу рянская Л. Д. В кн.: Унифицированные методы вместимостью 100 мл и доводят до метки водой.
клинических лабораторных исследований/Под Хранят в посуде из темного стекла. 8. Калибро ред. В. В. Меньшикова.Ч М., 1974, вып. VI, вочный раствор уксусной кислоты, 0,1 моль/л:
с. 5Ч18;
Molander D., Friedman M., La Due J.
0,57 мл ледяной уксусной кислоты (х. ч.) поме Ann. Int. Med., 1954, vol. 41, № 6, p. 1139Ч1151;
щают в мерную колбу вместимостью 100 мл Schafer C. W., Dopke K. H., Gall, Gothe W.
и доводят до метки водой.
Arzn. standard, 1967, Bd 3, S. 84.
Ма т е р и а л д л я и с с л е д о в а н и я.
Сыворотка, свободная от гемолиза. Цитратную Метод с субстратом бутирилтиохолина йоди и оксалатную плазму употреблять нельзя, так дом. Пр и н ц и п. Холинэстераза гидролизует как соли лимонной и щавелевоуксусной кислот субстрат бутирилтиохолина йодид с образова ингибируют активность фермента. нием кислоты и тиохолина. Тиохолин взаимодей ствует с 5,5'-дитио-бис-(2-нитро-бензойной ки Ход о п р е д е л е н и я. Опытная проба:
слотой) с образованием 2-нитро-5-меркаптобен смешивают 5 мл вероналового буфера, 0,2 мл зоата, окрашенного в желтый цвет.
воды и 0,1 мл сыворотки. Смесь прогревают Основная реакция:
при 37 С в течение 5 мин. Затем добавляют 0,2 мл раствора ацетилхолинхлорида и инкуби руют в течение 30 мин при 37 С. После инкуба ции добавляют 0,2 мл раствора прозерина. Ох лаждают и измеряют на ФЭКе в кювете с толщи Индикаторная реакция:
ной слоя 0,5 см при длине волны 500-560 нм тиохолин+ 5,5'-дитио-бис-(2-нитробензойная (зеленый светофильтр) против воды. Окраска кислота) Ч Ч>-2-нитро-5-меркаптобензоат.
устойчива в течение 1 ч. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но раствор прозерина Активность холинэстеразы сыворотки крови добавляют до инкубации. Из экстинкции хо- пропорциональна скорости изменения поглоще ния 2-нитро-5-меркаптобензоатом в индикатор лостой пробы вычитают экстинкцию опытной пробы. ной реакции.
Ра с ч е т ведут по калибровочному гра- Р е а к т и в ы. 1. Калия фосфат однозаме щенный ч. д. а. или х. ч. 2. Натр едкий х. ч. или фику.
По с т р о е н и е к а л и б р о в о ч н о г о ч. д. а. 3. Фосфатный буфер, 52 ммоль/л, рН 7,7:
г р а фи к а. Из 0,1 моль/л раствора уксус- в мерной колбе вместимостью 1000 мл последо вательно растворяют приблизительно в 900 мл ной кислоты готовят разведения, как указано воды 7,075 г однозамещенного фосфата калия ниже.
и 1,496 г едкого натра. Проверяют рН и доводят объем до метки водой. 4. 5,5'-Дитио-бис-(2-нит робензойная кислота) кристаллическая, 0, ммоль/л раствор в фосфатном буфере, рН 7,7:
0,103 г 5,5'-дитио-бис-(2-нитробензойной кисло ты) растворяют в 500 мл фосфатного буфера рН 7,7 в мерной колбе вместимостью 1 л. Объем доводят буфером до метки. Раствор стабилен в течение 6 нед при хранении в холодильнике в посуде из темного стекла. 5. S-Бутирилтио холина йодид кристаллический, 218 ммоль/л:
0,0792 г бутирилтиохолина йодида растворяют в мерной колбе, вместимостью 10 мл в воде.
Объем доводят до метки. Раствор стабилен в те чение 6 нед при хранении в холодильнике в посу де из темного стекла. 6. L-Цистеина гидрохло рид, мол. м. 175,6, х. ч. Пригоден L-цистеина С п е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а н и е. 1.
гидрохлорид производства ВНР. Хранят в холо- Спектрофотометр или колориметр с термостати дильнике. 7. Основной калибровочный раствор рованной кюветой (25;
30;
37 С) для микро L-цистеина гидрохлорид, 5 ммоль/л. Готовят в измерений. Колебания температуры не должны ледяной бане: 0,0878 г цистеина гидрохлорида превышать 0,1 С. 2. Полуавтоматические растворяют в 50 мл воды в колбе вместимостью микропипетки.
100 мл, объем доводят до метки водой. Раствор Ма т е р и а л д л я и с с л е д о в а н и я.
стабилен в течение 2 ч при хранении в холодиль- Сыворотка или плазма крови. Холинэстераза нике. 8. Рабочий калибровочный раствор ци- сыворотки крови стабильна в течение 5 дней при стеина гидрохлорида 2 ммоль/л соответствует хранении при комнатной температуре или в хо активности холинэстеразы 4000 МЕ/л, или лодильнике.
66,68 мкмоль/(с Х л). Готовят путем разведения Ход о п р е д е л е н и я. Перед определени основного калибровочного раствора водой в ем температура рабочих растворов и сыворотки 2,5 раза. Стабилен в течение 2 ч при хране- должна быть доведена до температуры измере нии в холодильнике. ния. Определяют по следующей схеме.
Смешивают и тотчас измеряют оптическую изменение экстинкции в 1 с;
/ Ч толщина слоя плотность против воды при длине волны 400 жидкости в кювете, м ( 1- 10- );
? Ч коэф 440 (405) нм в кювете с толщиной слоя 1 см и од- фициент. молярной экстинкции 2-нитро-5-мер новременно включают секундомер. Далее еще каптобензоата в условиях проведения определе 3 раза измеряют экстинкцию точно через 30;
ния (м Х моль- ' ).
60;
90 с. Величина коэффициента молярной экстинк Ра с че т. Для расчета ^Е/30 с-из каждого ции зависит от условий проведения определе последующего результата измерения (при 25 ния: рН, температуры, длины волны измерения или 30 С для опытной пробы и при 37 С Ч- и др. Коэффициент молярной экстинкции при для опытной и холостой проб) вычитают пре- температуре 25 С, длине волны 405 нм, толщине 2 дыдущий. Из полученных величин Е/30 с рас- слоя кюветы I см равен 13,3- 10 м /моль, при измерении на фотоколориметре со светофильт ром с длиной волны 405 нм при 30 С Ч 14, 2 м /моль, при 37 С Ч 14,66 м /моль.
рую используют в последующих расчетах. В ел у По с т р о е н и е к а л и б р о в о ч н о й чае измерения при 37 G делают поправку на к р и в о й. Из основного раствора L-цистеина холостую пробу (за счет спонтанного гидролиза приготавливают серию рабочих калибровочных субстрата). растворов как указано ниже.
Активность холинэстеразы в сыворотке крови может быть рассчитана по формуле с примене нием коэффициента молярной экстинкции 2 нитро-5-меркаптобензоата, по калибровочной Активность кривой и с использованием величины экстинкции Основной холинэстеразы Вода ди рабочего калибровочного раствора L-цистеина.
№ про- раствор стиллиро Ра с ч е т с применением коэффициента мо- бирки L-цистеи ванная, мл мкмоль/ на, мл лярной экстинкции производят по следующей ME (с-л) формуле:
каталитическая активность, моль/(с-м ) = 1 1 9 1 000 16, 2 2 8 2000 33, 3 4 6 4000 66, 4 6 4 6000 100, 5 8 2 8000 133, где Vр. с.Ч объем реакционной смеси;
V Ч 6 10 Ч 10000 166, сыв объем сыворотки;
t Ч время реакции, с;
^E Ч К 5 мкл каждого рабочего калибровочного Во с п р о и з в о д и мо с т ь 7Ч10%.
Во с п р о и з в о д и мо с т ь 7Ч10%.
раствора добавляют 750 мкл 5,5'-дитио-бис Пр и ме ч а н и е. Определение и расчет ко Пр и ме ч а н и е. Определение и расчет ко (2-нитробензойной кислоты) в фосфатном бу эффициента молярной абсорбции для 2-нит эффициента молярной абсорбции для 2-нит фере и 25 мкл воды. Экстинкцию измеряют при ро-меркаптобензоата проводят по формуле:
ро-меркаптобензоата проводят по формуле:
405 нм в кювете с толщиной слоя 1 см против Е холостой пробы.
2, Е = М /МОЛЬ, Холостая проба включает 750 мкл раствора 5,5'-дитио-бис-(2-нитробензойной кислоты) в где с Ч концентрация L-цистеина в реакци фосфатном буфере и 30 мкл воды.
онной смеси, моль/м3;
/ Ч толщина слоя Линейность калибровочной кривой сохраня кюветы, м;
Ч экстинкция 2-нитро-5-мер ется до 166,7 мкмоль/(с-л) или 10000 ME.
каптобензоата для данной концентрации Ра с че т. При расчете по рабочему калиб L-цистеина в условиях опыта.
ровочному раствору L-цистеина используют Ли т е р а т у р а. Knedel M., Bottger R.
формулу:
Klin. Wschr., 1967, Bd 45, S. 325;
Szasz G.
Clin. chim. Acta, 1968, vol. 19, p. 191;
Test Combination Cholinesterase. Cat. № 124133, Boehringer Mannheim GmbH. Diagnostica.
Кл и н и ч е с к о е з на ч е ни е. При пораже ния абсорбции опытной пробы за 30 с;
Екал Ч эк- нии печени активность фермента в сыворотке стинкция рабочего калибровочного раствора крови понижается, так как нарушается синтез L-цистеина;
66,68 Ч активность холинэстеразы фермента клетками печени. Определение актив для рабочего калибровочного раствора L-цисте- ности холинэстеразы не имеет большого значе ина, мкмоль/(с Х л), за 30 с. ния при остром гепатите, но очень ценно для Но р м а л ь н ые в е л и ч и н ы: при наблюдения за течением болезни и для определе 25 С Ч 50Ч155 мкмоль/(с-л), или 3000Ч ния прогноза при хронических заболеваниях 9300 ME;
при 30 С Ч 62Ч191 мкмоль/(с Х л), печени. Активность фермента уменьшается при или 3714Ч11513 ME;
при 37 С Ч 88Ч240 отравлении фосфорорганическими соедине мкмоль/(с-л), или 4659Ч14443 ME. ниями.
5.3. НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ АЗОТИСТЫЕ ВЕЩЕСТВА Низкомолекулярные азотистые вещества или ществами с образованием окрашенных соедине небелковые азотистые компоненты крови состоят ний;
ферментативными методами с последу главным образом из конечных продуктов обмена ющим определением аммиака или углекислоты белков и нуклеиновых кислот. Эти вещества ос- как продуктов действия уреазы на мочевину.
таются в сыворотке крови после осаждения Принцип газометрических методов основан на белка. окислении мочевины гипобромитом натрия в ще В состав фракций небелкового азота крови лочной среде. Мочевина подвергается окисле или сыворотки крови входит азот мочевины нию соответственно следующему уравнению:
~50 %, аминокислот ~25 %, мочевой кислоты ~4 %, креатина и креатинина ~7,5 %, аммиа CO(NH2)2 + 3NaBrOЧ> ка и индикана ~0,5 %, полипептидов, нуклео тидов и других азотистых соединений ~5 %.
+ 3NaBr+2H2O.
Содержание небелковых компонентов сыворотки крови может меняться в зависимости от способа осаждения белков. Основной фракцией остаточ Углекислота поглощается раствором, объем ного азота является мочевина, определение ко газообразного азота измеряется с помощью спе торой может применяться в диагностических циального аппарата. Наиболее удобно для прак целях вместо остаточного азота.
тических целей проводить определение мочевины в аппарате Бородина. Недостатком этой реакции являются ее низкие специфичность и точность, так как гипобромит натрия реагирует не только 5.3.1. Мочевина с мочевиной, но и с другими соединениями, содержащими аминогруппы. Методы этой груп Синтез мочевины происходит в печени глав- пы неточны, плохо воспроизводимы и неудобны ным образом из аммиака, который образуется при серийной работе, чувствительность их низ при дезаминировании аминокислот, распада пу- кая. Бром характеризуется высокой токсично риновых и пиримидиновых нуклеотидов. стью.
Методы определения мочевины. Мочевину Среди фотометрических методов наиболее в биологических жидкостях можно определить распространенными являются методы, основан газометрическими, гипобромитными методами;
ные на реакции мочевины с диацетилмоноокси прямыми фотометрическими методами, основан- мом Ч реакции Ферона, протекающей в два ными на реакции мочевины с различными ве- этапа.
Для окисления гидроксиламина могут приме- достаточно чувствительна, но определению няться следующие вещества: персульфат калия, аммиака мешает наличие в пробах мышьяковая кислота, хлорная кислота, катионы, бел ка.
феназон. Для интенсификации окраски и повы- Ферментные методы определения аммиака по шения ее стабильности применяются: тиосеми- оптическому тесту Варбурга с применением глу карбазид, фенилантраниловая кислота, глюку- таматдегидрогеназы позволяют определить наи ронолактон, катионы, триптофан и нитриты. Ме- более правильно содержание аммиака и прием тоды этой группы отличаются хорошей воспро- лемы для ручного и автоматического определе изводимостью, высокой чувствительностью, ния мочевины.
большей специфичностью, чем гипобромитные. Ксантгидроловые методы в клинических ла В некоторых методах используется 20Ч50 мкл бораториях применяются редко, так как трудо сыворотки, что позволяет применять их без де- емки и неспецифичны, многие амины и амиды протеинизации сыворотки. дают с ксантгидролом такую же реакцию, как Ферментативные методы основаны на гидро- и мочевина. Кроме перечисленных выше ве лизе мочевины уреазой. Для уреазы мочевина ществ, мочевина образует окрашенные соедине является единственным физиологическим суб- ния с п-диметиламинобензальдегидом (реакция стратом, поэтому уреазные методы высокоспе- Эрлиха), изо-нитрозопропиофеноном, N-бром цифичны. Оптимум действия уреазы рН 6,0Ч сукцинидом. Однако перечисленные реакции не 8,0 зависит от вида буфера. Наиболее употре- являются специфичными на мочевину. Уреазный бительные буферные растворы в уреазных ме- и диацетилмонооксимный методы применяются тодах: ЭДТА-буфер, оптимум рН 6,0Ч6,5, и на автоанализаторах различного принципа дей фосфатный буфер, оптимум рН 6,9Ч7,0. Ком- ствия.
мерческие препараты уреазы характеризуются Унификация методов. В качестве унифици различной активностью и степенью чистоты. Об- рованных утверждены диацетилмонооксимный разовавшийся в ходе ферментативной реакции метод в 1972 г. и уреазный метод, фенолгипо аммиак можно определить с помощью различ- хлоритная реакция в 1974 г. Лахема (ЧССР) ных реакций. Фенолгипохлоритная реакция вы- выпускает наборы реактивов для определения сокочувствительна и специфична на аммиак.
мочевины диацетилмонооксимным и уреазным В реакции используются катализаторы, наибо- методами. На уреазном принципе основано лее эффективным из применяемых катализато- определение мочевины во многих коммер ров является нитропруссид натрия. Интенсив- ческих наборах реактивов, например фирмы ность окраски образующегося соединения не за- Boehringer Mannheim (ФРГ), Reanal висит строго от концентрации реактивов. Изме- (ВНР).
нение концентрации фенола и нитропруссида Унифицированный метод по цветной реакции натрия на 20 % и гипохлорита натрия на 25Ч с диацетилмонооксимом. Пр и н ц и п. Мочеви 50 % не влияет на интенсивность окраски. Соот- на образует с диацетилмонооксимом в присут ношение концентраций фенола, едкого натра ствии тиосемикарбазида и солей железа в кис и гипохлорита натрия в реакции приблизительно лой среде окрашенное соединение.
должно быть равно 1:1:0,1. Салицилатно-гипо- Р е а к т и в ы. 1. Трихлоруксусная кислота, хлоритная реакция, описанная R. Richterich, 100 г/л. 2. Диацетилмонооксим, 25 г/л водный является чувствительной и специфичной на ам- раствор. Реактив стабилен. 3. Тиосемикарбазид, миак. Реакция Несслера не является специфич- 2,5 г/л водный раствор. Для приготовления ной, приблизительно в 10 раз менее чувствитель- реактива можно пользоваться также тиосеми на на аммиак, чем фенолгипохлоритная. Недо- карбазида гидрохлоридом;
последний применя статком реакции является частое образование ется в виде 3,2 г/л водного раствора. Оба реак помутнения. Дихлоризоциануратная реакция тива стабильны при хранении в темной посуде при комнатной температуре. 4. Серная кислота тывают калибровочную пробу, как описано для концентрированная. 5. Ортофосфорная кислота определения мочевины в сыворотке крови.
85 %. 6. Хлорное железо. Основной раствор Ра с ч е т мочевины на суточное количество хлорного железа: 5 г хлорного железа доводят мочи производят по следующей формуле:
до 100 мл водой и подкисляют добавлением 1 мл концентрированной серной кислоты. Из основно го раствора готовят рабочий раствор хлорного железа: 1 мл основного раствора хлорного желе за доводят до 100 мл водой, затем добавляют где Мсут Ч количество мочевины в суточной мо 8 мл концентрированной серной кислоты и 1 мл че, ммоль;
Еоп Ч экстинкция опытной пробы;
85 % ортофосфорной кислоты. Хранят в темной Е Ч экстинкция калибровочной пробы;
С Ч к к посуде. Годен в течение 2 нед. 7. Бензойная содержание мочевины в калибровочном рас кислота, 2 г/л;
0,2 г кристаллической бензойной творе, ммоль;
а Ч суточное количество мочи, кислоты растворяют в 100 мл воды при интенсив- мл, б Ч количество мочи, взятое на анализ, ном перемешивании на водяной бане. 8. Моче- мл;
КЧкоэффициент разведения мочи.
вина для приготовления калибровочного рас- Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы. Для сыво твора. Готовят 7 ммоль/л раствор мочевины: ротки крови Ч 2,5Ч8,3 ммоль/л, или 15Ч50 мг/ 42 мг мочевины растворяют в воде в мерной кол- 100 мл;
для мочи Ч 330Ч580 ммоль мочевины бе вместимостью 100 мл. В качестве раствори- в суточной моче, т. е. 20Ч35 г/сут.
теля можно использовать 2 г/л раствор бензой Пр и м е ч а н и я. 1. Измерение проводят не ной кислоты. Калибровочный раствор, приго позже чем через 15 мин после охлаждения товленный на растворе бензойной кислоты, ста проб ввиду неустойчивости окраски. 2. Из-за бильнее, чем водный;
1 мл калибровочного рас неустойчивости окрашенного комплекса мо твора содержит 0,007 ммоль мочевины. 9. Цвет чевины с диацетилмонооксимом и зависимо ной реактив: к 30 мл рабочего раствора хлорного сти окраски от условий нагревания калибро железа добавляют 20 мл воды, 1 мл 25 г/л рас вочную пробу определяют параллельно каж твора диацетилмонооксима и 0,25 мл 2,5 г/л дой серии опыта. 3. При содержании моче раствора тиосемикарбазида. Цветной реактив вины в сыворотке крови выше 17 ммоль/л готовят каждый раз перед употреблением.
сыворотку разводят изотоническим раство Ма т е р и а л для и с с л е д о в а н и я.
ром хлорида натрия, а результаты умножают Сыворотка крови, моча. Перед определением на коэффициент разведения. 4. Для пере профильтрованную мочу (из суточного коли счета на азот мочевины результаты следует чества) разводят изотоническим раствором нат разделить на 2,14.
рия хлорида в соотношении 1:25 или 1:50.
Ход о п р е д е л е н и я мочевины в сыво- Оц е н к а а н а л и т и ч е с к о й на д е ж ротке крови. Опытная проба: в центрифужную н о с т и ме т од а. Воспроизводимость: коэф пробирку наливают 0,8 мл воды, 0,2 мл сыво- фициенты вариации составляют 3Ч6 %. Пра ротки и 1 мл 100 г/л раствора трихлоруксусной вильность: результаты исследования, получен кислоты, смешивают. Через 15 Ч 20 мин центри- ные диацетилмонооксимным методом, хорошо фугируют. В чистую пробирку вносят 0,5 мл коррелируют с уреазным методом;
г = 0,93Ч надосадочной жидкости и 5 мл цветного реакти- 0,97.
ва. Пробирку выдерживают на кипящей водяной бане в течение 20 мин, затем охлаждают в тече- Ли т е р а т у р а. Marsh W., Fingerhut В., ние 2 Ч 3 мин под проточной водой. Измерение Miller H. Clin. Chern., 1965, vol. 11, p. 624.
проводят на фотометре при длине волны 530 Ч 560 нм (зеленый светофильтр) против холостой Уреазный метод по реакции с фенол-гипо пробы в кювете с толщиной слоя 1 см. Холо- хлоритом. Пр и н ц и п. Мочевина под действи стую пробу ставят так же, как опытную, но ем уреазы разлагается с образованием аммиака вместо надосадочной жидкости берут 0,5 мл и углекислого газа. Выделившийся аммиак об воды. разует с гипохлоритом натрия и фенолом окра Ра с ч е т проводят по формуле путем срав- шенный продуктЧиндофенол (синего цвета).
нения с калибровочной пробой. Калибровочную Реакция катализируется нитропруссидом нат пробу ставят аналогично опытной, но вместо рия. Интенсивность окраски пропорциональна сыворотки берут 0,2 мл калибровочного рас- содержанию мочевины. Стадии реакции:
твора.
где Еоп Ч экстинкция опытной пробы;
Е Ч эк к стинкция калибровочной пробы;
С Ч концен к трация мочевины в калибровочном растворе, 7 ммоль/л.
Оп р е д е л е ни е м о ч е в и н ы в мо ч е проводят аналогично определению мочевины в сыворотке крови, но вместо сыворотки берут 0,2 мл разведенной мочи. Параллельно обраба Ре а кт ив ы. 1. Уреаза. Для определения содержит 0,011 моль/л гипохлорита и 0,13 моль/л пригодна уреаза с активностью > 5 МЕ/мг. едкого натра. Раствор хранят в холодильнике 2. Этилендиамин-N, N, N', N'-тетрауксусной в посуде из темного стекла. 12. Мочевина ч. д. а.
кислоты динатриевая соль (трилон Б), ч. д. а. 13. Бензойная кислота, 2 г/л (кислоту раство 3. ЭДТА Ч буфер, 0,0269 моль/л, рН 6,5:0,50 г ряют при нагревании). 14. Калибровочный рас трилона Б растворяют в 30Ч40 мл воды, доводят твор мочевины, 0,5 ммоль/л: 15 мг мочевины рН до 6,5 1 моль/л раствором едкого натра и до- растворяют в мерной колбе вместимостью 500 мл ливают водой в мерной колбе до 50 мл. 4. Основ- в 2 г/л растворе бензойной кислоты. Раствор ной раствор уреазы в буфере, 10 МЕ/мл: 20 мг стабилен при хранении в холодильнике. 15. Нат уреазы (активность 5 МЕ/мг) растворяют в рия хлорид, 0,154 моль/л.
10 мл буфера. Навеску уреазы берут в зависи- С п е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а ние.
мости от активности фермента. Раствор Спектрофотометр или колориметр с кюветой стабилен в течение месяца при хранении для микроизмерений. 2. Полуавтоматические в холодильнике. 5. Рабочий раствор уреазы.
микропипетки.
Перед началом определения берут Ма т е р иа л для и с с л е д о в а н и я.
необходимое количество основного рас- Сыворотка крови или плазма.
твора уреазы и разводят бидистиллированной Ход о п р е д е л е н и я. Перед определе водой в отношении 1:4. 6. Фенол ч. д. а. 7. Нат- нием сыворотку разводят 0,154 моль/л раство рия нитропруссид 2-водный ч. д. а. 8. Цветной ром хлорида натрия в отношении 1:9.
реактив: фенол Ч 0,11 моль/л, нитропруссид Опытная проба: 100 мкл рабочего раствора натрия Ч 0,18 моль/л: 0,0263 г нитропруссида уреазы вносят в пробирку, добавляют 20 мкл натрия помещают в мерную колбу вместимостью разведенной сыворотки. Закрывают пробкой, пе 500 мл, приливают примерно 300 мл воды, рас- ремешивают и инкубируют в течение 15 мин творяют при перемешивании. Затем добавляют при 37 С. После инкубации добавляют 300 мкл 5,18 г фенола и доливают водой до метки. Реак- цветного реактива и 300 мкл рабочего раствора тив стабилен в течение месяца при хранении гипохлорита натрия. Перемешивают и инкуби в холодильнике в посуде из темного стекла. руют в течение 20Ч30 мин при 37 С. Измеряют 9. Натр едкий ч. д. а., х. ч., 1 моль/л;
0,26 моль/л. экстинкцию в кювете с толщиной слоя 1 см 10. Гипохлорит натрия. Приготовление основ- при длине волны 500Ч560 нм (зеленый свето ного раствора гипохлорита: 100 г хлорной из- фильтр) против холостой пробы. Окраска ста вести размешивают в течение 15 мин с 170 мл бильна в течение нескольких часов.
воды, после чего прибавляют при непрерывном Холостую пробу обрабатывают так же, как помешивании раствор, состоящий из 170 мл во- опытную, но вместо сыворотки берут 0,154 моль/л ды и 70 г карбоната натрия. Масса сначала раствор NaCl.
густеет, затем разжижается. Оставляют стоять Калибровочную пробу обрабатывают так же, до следующего дня. Надосадочную жидкость как опытную, но вместо сыворотки берут калиб (гипохлорит натрия) сливают и фильтруют че- ровочный раствор мочевины. Измеряют при тех рез промытый водой фильтр. Хранят в холо- же условиях против холостой пробы.
дильнике в посуде из темного стекла. Определе- Расчет ведут по формуле:
ние активности хлора: 1 мл основного раствора гипохлорита натрия смешивают с 100 мл воды.
К 50 мл этого раствора добавляют 5 мл свеже приготовленного 50 г/л раствора йодида калия где Еоп Ч экстинкция опытной пробы;
Ек Ч эк и 10 мл 6 моль/л раствора НС1. Титруют 0,1 н. стинкция калибровочной пробы;
0,5Ч концент раствором тиосульфата натрия (готовят из фик- рация мочевины в калибровочном растворе, санала). Как только раствор приобретает слабо- ммоль/л;
10Ч коэффициент разведения.
желтую окраску, добавляют 10 капель 1 % рас- Линейная зависимость между оптической твора крахмала и титруют до обесцвечивания. плотностью и концентрацией мочевины сохра Концентрацию гипохлорита натрия рассчитыва- няется до 33 ммоль/л.
ют по хлору: Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы. Сыворотка крови Ч2,5Ч8,3 ммоль/л, или 20Ч50 мг/100 мл.
К = а- 0,709, Оц е н к а а н а л и т и ч е с к о й на де ж но с т и ме т ода. Коэффициенты вариации где К Ч концентрация активного хлора, находятся в пределах 3Ч8 %. Уреазная реак г/100 мл гипохлорита натрия;
а Ч количество ция высокоспецифична. Фенолгипохлоритная тиосульфата, пошедшего на титрование, мл;
реакция в условиях проведения метода при 0,709 Ч коэффициент пересчета 1 мл тиосуль- рН> 7,0 также специфична.
фата натрия в концентрацию хлора, г/100 мл.
Пр и м е ч а н и е. Объемы сыворотки и реак 11. Рабочий раствор гипохлорита натрия. После тивов можно пропорционально увеличивать.
установления концентрации активного хлора ос новной раствор гипохлорита натрия разводят Ли т е р а т у р а. Chaney A. L., Mar водой так, чтобы концентрация хлора состав- bach Е. P. Clin. Chem., 1962, vol. 8, p. 131;
ляла 0,78 г/л. Раствор гипохлорита с содержа- Gutmann 1., Bergmeyer H. U. In: Methods of нием хлора 0,78 г/л смешивают с равным объе- enzymatic analysis/Ed. H. U. Bergmeyer 2 ed.
мом 0,26 моль/л раствором едкого натра New Jork Ч London, 1974, vol. 4, p. 1791 Ч (100 мл + 100 мл). Активность хлора проверяют 1794;
Kaplan A. In: Standard methods in clinical не реже одного раза в 2 нед. Рабочий раствор chemistry.Ч New York, 1965, vol. 5, p. 245.
Уреазный метод по салицилатно-гипохлорит- Ра с ч е т производят по следующей фор ной реакции. Пр и н ц и п. Тот же. Вместо фе- муле:
нола применяют салицилат натрия.
концентрация мочевины, ммоль/л = Ре а к т ив ы. 1. Этилендиаминтетрауксус ная кислота, динатриевая соль ЭДТА. 2. Азид натрия. 3. Натр едкий, 5 моль/л;
1 моль/л.
4. Гипохлорит натрия. 5. Йодид калия, 50 г/л.
6. НС1, 6 моль/л. 7. Нитропруссид натрия, где Еоп -- экстинкция опытной пробы, измерен 2,69 ммоль/л. 8. Буферный раствор: ЭДТА Ч ная против холостой пробы на реактивы;
26,9 ммоль/л;
HCI Ч 20 ммоль/л;
азид нат- Е, Ч экстинкция холостой пробы на сыво х ол сыв рия Ч 15,4 ммоль/л, рН 6,5. 10 г ЭДТА, 1 г ротку, измеренная против холостой пробы на азида натрия растворяют в 800 мл воды с 20 мл реактивы;
С Ч концентрация мочевины в ка к 1 моль/л раствора едкого натра. Доводят рН до либровочном растворе, ммоль/л.
6,5 и доливают водой до 1 л. Раствор стабилен, Линейность калибровочной кривой до хранят в закрытом виде. 9. Салицилат натрия, 75 ммоль/л.
1060 ммоль/л: 170 г салицилата натрия рас- Но р м а л ь н ые в е л и ч и н ы те же, что творяют в воде и доводят объем до 1 л. Рас- и в предыдущем методе.
твор стабилен, хранят в закрытом виде. 10. Ги Ли т е р а т у р а. Richterich R. KHnische похлорит натрия, раствор: 70 ммоль/л гипохло Chomie. Thcorie und Praxis. 3 AuFl.Ч Basel etc.:
рита натрия и 2500 ммоль/л натра едкого. При S. Karger, 1971, S. 286Ч289.
готовление раствора гипохлорита и определение Автоматический селективный анализатор активности хлора см. предыдущую методику.
GSA-II фирмы Greiner (Швейцария). Методы 11. Уреазный реактив: 200 мг препарата уреазы исследования с. 1Ч5.
с активностью 5000 Сигма ед.* растворяют в 1 л буферного раствора. Хорошо перемешивают, Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Отклоне профильтровывают. Раствор стабилен в течение ния от нормального содержания мочевины в сы недели при хранении в холодильнике. 12. Сали воротке крови зависят от скорости процессов цилатный реактив Ч 1060 ммоль/л салицилата синтеза мочевины и ее выделения. Увеличение натрия и 2,69 ммоль/л нитропруссида натрия:
содержания мочевины в сыворотке крови явля 800 мг нитропруссида натрия растворяют в 1 л ется одним из главных признаков нарушения раствора салицилата натрия, фильтруют. Стаби функции почек. Из фракций остаточного азота лен в течение недели.
раньше всего повышается уровень мочевины, Ма т е р и а л для и с с л е д о в а н и я.
причем уровень мочевины достигает более высо Плазма, сыворотка крови.
ких цифр по сравнению с другими фракциями Ход о п р е д е л е н и я. Реакцию проводят остаточного азота. При почечной недостаточ при 37 "С. Опытная проба: к 10 мкл сыворотки ности азот мочевины может составлять до 90 % добавляют 0,1 мл воды или 154 ммоль/л рас фракций остаточного азота. Повышение уровня твора хлорида натрия, 0,5 мл уреазного реакти мочевины сыворотки крови может носить и вне ва. Смесь инкубируют в течение 3Ч3'/2 мин почечный характер: при потере жидкости (обез (время инкубации должно быть постоянным!) воживание, рвота, понос), при усиленном рас при температуре 37 С, затем добавляют 2 мл паде белков (острая желтая атрофия печени, салицилатного реактива, перемешивают. Через тяжелые заболевания). Уменьшение содержа 48 с инкубации при 37 С добавляют 2 мл гипо ния мочевины в сыворотке крови может наблю хлоритного реактива. Через 5Ч6 мин инкубации даться при заболеваниях печени (паренхима при 37 С измеряют оптическую плотность рас тозная желтуха, цирроз печени) из-за наруше твора на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 10 мм ния синтеза мочевины в печени.
при длине волны 500Ч560 нм (зеленый свето фильтр) против холостой пробы на реактивы.
Окраска стабильна в течение нескольких часов. 5.3.2. Креатинин Холостую пробу на реактивы ставят так же, как опытную, но вместо сыворотки берут воду. В синтезе эндогенного креатина принимают Холостую пробу на сыворотку ставят так же, участие аминокислоты Ч аргинин, глицин, мети как опытную, но уреазный реактив добавляют онин. Креатин при фосфорилировании превра после салицилатного реактива перед гипохло- щается в креатинфосфат, из которого образу ритом. Измеряют против холостой пробы на ется креатинин (ангидрид креатина). Этот про реактивы.
цесс в живом организме необратимый.
Калибровочную пробу обрабатывают так же, как опытную, но вместо сыворотки берут калиб ровочный раствор мочевины. Измеряют в тех же условиях, что и опытную, против холостой пробы на реактивы.
* Сигма ед. соответствует активности уреа- Креатин и креатинфосфат являются важны зы, катализирующей образование 1 мг азота ми азотистыми веществами мышц, участву аммиака в течение 5 мин при 20 С. ющими в химических процессах, связанных с мышечными сокращениями. В сыворотке крови ем о-нитробензальдегида и реакции Сакагучи содержится в основном креатинин. Суточное трудоемки. Ферментативные методы определе выделение креатинина'для каждого человека Ч ния креатинина с применением ферментов Ч величина относительно постоянная, которая за- аминогидролазы, креатинкиназы, пируваткина висит главным образом от массы мышечной зы, лактатдегидрогеназы Ч дорогостоящие и ткани и мало зависит в отличие от мочевины неабсолютно специфичные.
от питания. Содержание креатинина в сыворот Наиболее правильные результаты дает метод ке крови уменьшается с возрастом. масс-фрагментографии, сочетающий газовую Методы определения. Большинство методов хроматографию и масс-спектрометрию;
данный определения креатинина основаны на реакции принцип может быть положен в основу рефе Яффе, описанной в 1886 г., в основе которой рентного метода.
лежит реакция ароматических нитровеществ (на- Унификация методов. В качестве унифици пример, пикриновая кислота) с веществами, со- рованного в 1972 г. утвержден метод, основан держащими активную метиленовую (=СН2) ный на реакции Яффе (метод Поппера).
или метиновую (=СН) группы. В крови многие В основу набора Био-Ла-Тест Креатинин хромогены, производные креатинина Ч глюко- (народное предприятие Лахема, ЧССР) поло циамид, 5-метилглюкоциамид, 5-метилкреати- жена реакция Яффе с осаждением белков сыво нин, а также аскорбиновая кислота, пировино- ротки трихлоруксусной кислотой. Концентрация градная кислота, ацетон, глюкоза и другие ве- реактивов дана в таком соотношении, которое щества Ч реагируют с пикриновой кислотой дает возможность получить величину рН реак аналогично креатинину, что обусловливает низ- ционной смеси 12,4.
кую специфичность методов, основанных на ре- Унифицированный метод по цветной реакции акции Яффе. По скорости образования окра- Яффе (метод Поппера). Пр и н ц и п. Креати шенных соединений в реакции Яффе различают нин реагирует с пикриновой кислотой в щелоч три группы веществ: группу очень быстро реа- ной среде с образованием окрашенных соеди гирующих хромогенов (30Ч40 с), креатинин нений.
и группу медленно реагирующих веществ (после Р е а к т и в ы. 1. Пикриновая кислота, насы 15Ч20 мин). щенный раствор. Товарная пикриновая кислота содержит 15Ч20 % влажности;
кислоту не су Совершенствование методов, основанных на реакции Яффе, направлено главным образом на шить! Взрывоопасно! В 100 мл воды растворяют повышение их специфичности. Для повышения 2 г пикриновой кислоты при нагревании в горя специфичности рекомендуется применять устра- чей бане. После этого раствор оставляют стоять нение мешающих хромогенов;
отделение креати- на 24 ч, периодически перемешивая. Затем рас нина от остальных хромогенов с помощью бу- твор фильтруют. Реактив стабилен. Хранят в мажной хроматографии, электрофореза;
экс- темной посуде. 2. НС1, 0,1 моль/л. 3. Основной тракцию креатинина тетрафенилборатом нат- калибровочный раствор креатинина, 10ммоль/л:
рия;
сорбенты Ч бентонит, сефадекс, реактив 113,1 мг креатинина доводят до 100мО,1 моль/л Ллойда. раствором HCI. Хранят в холодильнике в посуде В автоанализаторах различного типа дей- с притертой пробкой. Для определения креати ствия возможно кинетическое измерение креа- нина в сыворотке крови рабочий калибровочный раствор получают разведением основного раст тинина в сыворотке крови без предварительного осаждения белков с разделением на три пере- вора водой в 100 раз;
1 мл раствора содержит численные выше группы веществ, дающих поло- 0,1 ммоль креатинина. 4. Натр едкий, 2,5 моль/л.
жительную реакцию Яффе. Депротеинизации Ма т е р и а л д л я и с с л е д о в а н и я.
в таких методах можно избежать путем добавле- Сыворотка крови, моча. В качестве консервантов нии детергентов Ч тритона Х-100 или доде- для мочи можно использовать тимол и толуол.
цилсульфата натрия. Ход о п р е д е л е н и я. Оп р е д е л е н и е На аналитические качества реакции Яффе, к р е а т и н и н а в с ыв о р о т к е к р о в и :
повышение ее специфичности, чувствительности 2 мл сыворотки смешивают с 6 мл насыщен влияет ряд факторов: температура реакции ре- ного раствора пикриновой кислоты. Через 5 мин комендуется не ниже 30 "С, разница температур пробирку помещают на 15Ч20 с в кипящую в опытной и калибровочных пробах не должна водяную баню, затем центрифугируют. К 4 мл превышать 3Ч5 "С. Оптимальное время реакции центрифугата добавляют 0,2 мл 2,5 моль/л рас 15Ч20 мин, тем самым удается избежать влия- твора едкого натра и тщательно смешивают.
ния медленно реагирующих хромогенов. Опти- Иногда после подщелачивания раствор мутнеет мальной является величина рН в интервале вследствие выпадения фосфатов. В этом слу 12,3Ч12,5, что в значительной степени повышает чае раствор еще раз центрифугируют. Затем рас специфичность реакции и правильность метода. твор доводят до объема 10 мл водой. Через К проблеме, окончательно еще не решенной, 10 мин (не позже 20 мин) измеряют в кювете относится выбор способа депротеинизации и его с толщиной слоя 2 см при длине волны 500Ч влияние на правильность метода. Способами 560 нм (зеленый светофильтр) против холостой выбора являются осаждение белков трихлор- пробы.
уксусной и пикриновой кислотами.
Холостая проба: 3 мл насыщенного раствора Для определения креатинина значительно пикриновой кислоты и 0,2 мл 2,5 моль/л раство реже применяется реакция с 3,5-динитробензой- ра едкого натра доводят до объема 10 мл водой.
ной кислотой. Образующаяся в ходе реакции Ра с ч е т производят по калибровочному окраска мало стабильна. Методы с применени- графику.
По с т р о е ни е к а л и б р о в о ч н о г о Кл и н и ч е с к о е з на ч е ние. Определе г р а фи к а : из рабочего калибровочного рас- ние креатинина проводят для исследования твора креатинина готовят разведения, как ука- функции почек. Содержание его в сыворотке кро зано ниже. ви увеличивается при значительном ухудшении функции почек. Концентрация креатинина в сы воротке крови здоровых людей относительно постоянна, мало зависит от пола, возраста, диеты, и связано это с тем, что образование креатинина как конечного продукта метабо лизма креатина в мышцах относительно по стоянно. Это является важным условием для исследования клиренса эндогенного креатинина как меры клубочковой фильтрации.
5.3.3. Мочевая кислота Мочевая кислота является конечным про дуктом распада пуриновых оснований. Обра зовавшаяся мочевая кислота выделяется поч ками.
Методы определения. Первый метод опреде Через 10 мин производят измерения при тех ления мочевой кислоты был предложен О. Folin, же условиях, что и опытные пробы. Калибровоч- W. Denis в 1912 г. Он основан на способности ная кривая линейна до 260 мкмоль/л креати- мочевой кислоты восстанавливать фосфорно нина. вольфрамовую кислоту с образованием окра Оп р е д е л е н и е к р е а т и н и н а в мо- шенных соединений. Впоследствии метод под че. В мерной колбе или цилиндре вместимостью вергался многочисленным модификациям и до 100 мл смешивают 0,5 мл мочи (из суточного настоящего времени остается одним из наиболее количества) с 3 мл раствора пикриновой кис- распространенных. К другим веществам, кото лоты. Смесь тщательно встряхивают и добав- рые восстанавливаются мочевой кислотой и при ляют 0,2 мл 2,5 моль/л раствора едкого натра.
меняются для ее определения, относятся мышья Выдерживают при комнатной температуре в те- ковомолибденовая кислота, железосинероди чение 10 мин. Доводят объем до 100 мл водой. стый калий. Однако эти методы не являются Измеряют на фотометре в кювете с толщиной специфичными. Ряд веществ (цистеин, трипто слоя 1 см при длине волны 500Ч600 нм (зеле- фан, тирозин) вызывают интерференцию в дан ный светофильтр) против холостой пробы. ном методе. Повысить специфичность методов Холостая проба: 3 мл раствора пикриновой можно предварительным применением ионооб кислоты и 0,2 мл 2,5 моль/л раствора едкого менной хроматографии.
натра доводят водой до объема 100 мл. Наиболее специфичными являются фермен Ра с ч е т производят по формуле при срав- тативные, уриказные методы. Они основаны на нении с калибровочной пробой. расщеплении мочевой кислоты уриказой до ал Ка л и б р о в о ч н а я пр о б а. К 0,5 мл лантоина, СО2 и Н О с последующей индика 2 основного калибровочного раствора прибавляют торной реакцией. Результаты реакции можно 3 мл раствора пикриновой кислоты и 0,2 мл измерить следующими способами: измерением 2,5 моль/л раствора едкого натра. Далее пробы потребления кислорода, что требует специаль обрабатывают так же, как опытные. ной аппаратуры;
измерением абсорбции мочевой кислоты при 293 нм (образовавшийся в резуль тате реакции аллантоин не поглощает света при 293 нм);
измерением образовавшейся перекиси водорода. На ферментативном принципе осно где К Ч количество креатинина в суточной моче, ван флуорометрический метод определения мо мкмоль, С Ч количество креатинина в калибро к чевой кислоты, а также потенциометрический вочной пробе, 50 мкмоль;
Е Ч экстинкция оп метод с иммобилизованной уриказой.
опытной пробы;
Е Ч экстинкция калибровоч к Прямое спектрофотометрическое определе ной пробы;
а Ч суточное количество мочи;
б Ч ние мочевой кислоты в сыворотке крови основано количество мочи, взятой для анализа.
на измерении поглощения, обусловленного моче Но р ма л ь н ые в е л и ч и н ы. В сыво вой кислотой при 282Ч295 нм. Максимум погло ротке крови: у женщин 0,044Ч0,088 ммоль/л, щения зависит от рН среды. Наиболее рас или 44Ч88 мкмоль/л (0,5Ч1 мг/100 мл);
у пространенным методом определения мочевой мужчин 0,044Ч0,1 ммоль/л, или 44Ч кислоты в практических лабораториях явля 100 мкмоль/л. Содержание креатинина в суточ ется фосфорновольфрамовый метод, который ной моче 4,4Ч17,7 ммоль/сут, или 0,5Ч2 г/сут.
утвержден в 1979 г. в качестве унифицирован Во с п р о и з в о д и мо с т ь. Коэффициен ного.
ты вариации составляют 5Ч6 %.
Унифицированный метод по реакции с фос Ли т е р а т у р а. Popper H., Mandel F., форновольфрамовым реактивом. Пр и н ц и п.
Mayer H.Ч Biochem. Z., 1937, vol., 291, p. 354. Мочевая кислота восстанавливает фосфорно вольфрамовый реактив с образованием соеди- Калибровочную пробу ставят и измеряют нения голубого цвета. так же, как опытную, но вместо фильтрата берут Ре а к т и в ы. 1. Серная кислота, 0,35 моль/л: 3 мл рабочего калибровочного раствора.
к 200 мл воды добавляют 10 мл концентрирован ной серной кислоты отн. плотности 1,84 и дово- Концентрация мочевой кислоты, ммоль/л = дят объем водой до 500 мл. 2. Натрий вольфра мовокислый двухводный (Na2WO4-2H2O) ч.д.а., 100 г/л: растворяют 50 г вольфрамовокислого натрия в небольшом количестве воды и доводят где ЕОП Ч экстинкция опытной пробы;
ЕК Ч объем до 500 мл. 3. Натрия карбонат ч.д.а., экстинкция калибровочной пробы;
С Ч кон к 103 г/л: растворяют 51,5 г натрия карбоната в центрация рабочего калибровочного раствора, небольшом количестве воды и доводят объем 0,03 ммоль/л;
10 Ч пересчет на объем сыворотки до 500 мл. 4. Ортофосфорная кислота, 85 %, (в опытную пробу берут 0,3 мл, т.е. в 10 раз ч.д.а. 5. Лития сульфат (Li2SO4-Н2O) ч.д.а.
меньше, чем в калибровочную пробу).
6. Лития карбонат (Li2СОз) ч.д.а. 7. Фосфор Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы. Мужчины:
новольфрамовый реактив;
в круглодонную колбу 0,24Ч0,50 ммоль/л, или 4,0Ч8,5 мг/100 мл;
вместимостью 1,5 л вносят 40 г вольфрамово женщины: 0,16Ч0,4 ммоль/л, или 2,8Ч кислого натрия и 300 мл воды. Добавляют 32 мл 7,5 мг/100 мл.
85 % ортофосфорной кислоты и несколько стек Во с п р о и з в о д и мо с т ь. Коэффициен лянных бусинок. Осторожно кипятят в течение ты вариации находятся в пределах 3Ч5 %.
2 ч на песочной или глицериновой бане с обрат ным холодильником. Охлаждают до комнатной Ли т е р а т у р а. Henry R. J., Sobel С., тепературы и доливают водой до 1 л. Добавляют Kim J. Amer. J. din. Pathol., 1957, vol. 28, p. 152.
32 г сульфата лития. Раствор стабилен при хра Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Повыше нении в холодильнике. 8. Мочевая кислота, имп.
ние содержания мочевой кислоты в крови наблю 9. Формалин, не менее 37,5 %, фарм. 10. Основ дается при нарушении ее выделения из орга ной калибровочный раствор мочевой кислоты, низма (заболевания почек, ацидоз, токсикоз 6 ммоль/л: растворяют 0,6 г карбоната лития беременности);
повышенном образовании пури в 150 мл воды, фильтруют и нагревают до 60 С.
нов (некоторые гематологические заболевания, Взвешивают 1,017 г мочевой кислоты, вносят в прием пищи, богатой пуринами).
предварительно нагретую колбу вместимостью 1 л, вливают теплый раствор карбоната лития и быстро встряхивают. После растворения мо чевой кислоты колбу охлаждают до комнатной 5.3.4. Аминокислоты и пептиды температуры, добавляют 20 мл раствора фор малина, наливают 300Ч350 мл воды. Добав- В крови содержатся свободные аминокис ляют несколько капель раствора метилового лоты экзогенного и эндогенного происхождения.
оранжевого, затем встряхивают, медленно до- Концентрация их в сыворотке крови невелика.
бавляют 20Ч22 мл 0,35 моль/л серной кислоты С диагностической целью определяют как от до изменения цвета в розовый. Доливают колбу дельные аминокислоты, так и общий аминный до метки водой. Раствор стабилен при хранении азот. Наибольшее клиническое значение имеет в холодильнике в посуде из темного стекла;
определение таких аминокислот, как фенилала 1 мл раствора содержит 0,006 ммоль мочевой нин, оксипролин, цитруллин. Для определения кислоты. 11. Рабочий калибровочный раствор свободных аминокислот применяют: хромато мочевой кислоты, 0,03 ммоль/л: 1 мл основного графию на бумаге, ионообменную хроматогра калибровочного раствора доводят до 200 мл фию и фотометрические методы. Чаще всего оп водой. Стабилен в течение 2 нед при хранении ределение аминокислот проводят на аминокис в холодильнике. лотных анализаторах в соответствии с прилагае Ма т е р и а л д л я и с с л е д о в а н и я. мой к прибору инструкцией.
Сыворотка, свободная от гемолиза. Кровь содержит также в небольшом коли Ход о п р е д е л е н и я. Опытная проба: честве полипептиды, которые поступают из ки к 8 мл воды добавляют 1 мл сыворотки, 0,5 мл шечника при переваривании белков и образуют 0,35 моль/л серной кислоты и перемешивают. ся эндогенно как продукты распада белков тка Затем добавляют 0,5 мл раствора вольфрамо- ней.
вокислого натрия и тщательно перемешивают. Многие из полипептидов, циркулирующие в Через 5Ч10 мин фильтруют. К 3 мл фильтрата биологических жидкостях, относятся к биологи добавляют 1,5 мл раствора натрия карбоната, чески активным веществам, и их определение перемешивают. Затем добавляют 1 мл фосфор- имеет большое клиническое значение. Методы новольфрамового реактива, перемешивают, пе- их определения будут описаны соответственно реворачивая пробирку. Через 30 мин измеряют в других главах.
в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны Хроматографическое разделение на бумаге 590Ч700 нм (красный светофильтр) против хо- по БодеЧГири. Пр и н ц и п. В основе разде лостой пробы. Холостую пробу ставят так же, ления лежат различия в степени адсорбции как опытную, но вместо фильтрата берут 3 мл аминокислот и растворимости их в соответст воды. вующем растворителе. После разделения амино Ра с ч е т ведут по формуле при сравнении кислоты с нингидрином в слабокислой среде с калибровочной пробой. дают синее окрашивание с последующим прев ращением полученного синего производного в рифужную пробирку с притертой пробкой и стабильное медное производное оранжево-крас- экстрагируют 3 раза (каждый раз в течение ного цвета, имеющее максимум пoглощения при 1 ч) 8 мл солянокислого ацетона. Нераствори 530 нм. Метод позволяет определить все амино- мый осадок отделяют центрифугированием.
кислоты, за исключением пролина и оксипро- Надосадочную жидкость (всего 24 мл) выпари лина. вают досуха в фарфоровой чашке на водяной Ре а к т и в ы. 1. н-Бутиловый спирт. 2. Ук- бане при 40 С. Сухой остаток растворяют в 1 мл сусная кислота ледяная. 3. Смесь бутилового воды и и обрабатывают 2 мл эфира для удаления спирта, уксусной кислоты и воды (в объемных липидов. После отделения эфира водный рас соотношениях 4 : 1 : 5): смешивают в мерном ци- твор помещают в фарфоровую чашку и сгущают линдре 40 мл бутилового спирта, 10 мл ледяной досуха. Сухой остаток растворяют в 0,2 мл уксусной кислоты и 50 мл воды. Смесь переносят воды. На хроматограмму наносят 40 мкл эк в делительную воронку. После расслаивания стракта порциями по 5 мкл.
берут верхний слой и используют его в качестве По л у ч е н и е о д н о ме р н ых х рома подвижного растворителя. Нижний слой исполь- т о г р а м м с ыв о р о т к и к р о в и. На лист зуют для насыщения хроматографической ка- бумаги, промытой раствором 8-оксихинолина, меры. 4. Смесь бутилового спирта, уксусной кис- наносят в 2 точках по 40 мкл полученного лоты и воды (в объемных отношениях 40: 15:5). экстракта сыворотки крови. В третью точку на Смесь используют в качестве подвижного раст- носят 5 мкл 0,01 моль/л раствора аминокислот ворителя. 5. Ацетон. 6. Нингидрин, раствор свидетелей. В качестве растворителя исполь 5 г/л в ацетоне. Хранят в темной склянке. Пе- зуются смеси: н-бутанол, уксусная кислота, вода ред определением смешивают 95 частей 5 г/л (в соотношении 4: 1: 5) и н-бутанол, уксусная раствора нингидрина в ацетоне с 1 частью ледя- кислота, вода (40: 15:5). Наиболее четкое и ной уксусной кислоты и 4 частями воды. 7. Эти- полное разделение аминокислот сыворотки кро ловый спирт 96 %. 8. Меди сульфат 5-водный, ви достигается при трехкратном пропускании насыщенный раствор в 75 % этиловом спирте. обеих смесей (в этом случае после каждого про Перед употреблением раствор фильтруют. пускания растворителя бумагу высушивают на 9. Набор аминокислот, растворы 0,01 моль/л. воздухе и снова помещают в хроматографи 10. НС1 концентрированная. 11. Солянокислый ческую камеру). После последнего пропускания ацетон: 1 мл концентрированной НС1 сме- растворителя хроматограмму высушивают при шивают с 99 мл ацетона. 12. Диэтиловый комнатной температуре в течение 2 ч. Следует эфир. придерживаться одного и того же времени Сп е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а ни е. 1. сушки хроматограмм, что обеспечивает луч Хроматографические камеры. В качестве хрома- шее совпадение результатов отдельных опре тографической камеры могут быть использованы делений.
высокие стеклянные банки с пришлифованной Ход и с с л е д о в а н и я. Хроматограмму, стеклянной крышкой диаметром 25 см и больше, освобожденную путем высушивания от избытка высотой 50Ч60 см. 2. Хроматографические кю- растворителя, погружают на несколько секунд веты. Для получения нисходящих хроматограмм в 5 г/л раствор нингидрина в ацетоне, просуши растворитель наливают в хроматографическую вают в течение нескольких минут на воздухе и кювету, представляющую собой трубку диамет- прогревают в течение 10 мин при 50 С в сушиль ром 2Ч4 см и имеющую по длине щель шириной ном шкафу для развития окраски. Далее хро 3Ч6 мм. Трубка имеет оправу из стеклянных матограммы высушивают в течение суток на воз палочек, через которые перекидывается бумага. духе. Затем вырезают участки хроматограмм с 3. Бумага. Для разделения аминокислот исполь- фиолетовыми пятнами аминокислот, разрезают зуют хроматографическую фильтровальную бу- их на мелкие кусочки и помещают в пробирки магу марки быстрая (Б). Для количествен- с притертыми пробками. В пробирку добавляют ного определения аминокислот может быть ис- 2,5 мл насыщенного раствора сульфата меди пользована только бумага, освобожденная от в этиловом спирте. При этом фиолетовая окрас катионов металлов, мешающих точному коли- ка аминокислот переходит в оранжево-красную чественному определению аминокислот на хро- в результате образования комплексного соеди матограммах. Для удаления катионов металлов нения с медью, которое растворяется в 75 % из бумаги последнюю обрабатывают раствором этаноле и экстрагируется из бумаги. Пробирки 8-оксихинолина или трилона Б (динатриевая закрывают пробками и содержимое их тща соль этилендиаминтетрауксусной кислоты). тельно перемешивают для полноты экстракции Ма т е р и а л д л я и с с л е д о в а н и я. окрашенного продукта. Экстракцию продол Получение концентрированного безбелкового жают в течение часа в темноте при комнатной экстракта сыворотки крови: предварительная температуре. Одновременно с пятнами амино подготовка сыворотки крови для количествен- кислот вырезают из бумаги контрольные участ ного определения аминокислот сводится к полу- ки, равные по площади опытным, и обрабаты чению экстракта сыворотки крови, свободного вают их точно таким же образом. Интенсивность от белков и солей, мешающих хроматографи- окраски измеряют на фотоколориметре при ческому разделению аминокислот, и сгущению 500Ч530 нм (зеленый светофильтр) в кюветах безбелкового экстракта. Для этого порошок, с толщиной слоя 5 мм против контрольной полученный из 2 мл сыворотки, высушенной пробы.
лиофилизацией или в вакуумном эксикаторе над Ра с ч е т аминокислот проводят по калиб безводным хлоридом кальция, помещают в цент- ровочным графикам, которые строят по калибро вечным растворам аминокислот. Дальнейший Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Содержа расчет проводят по формуле: ние аминокислот в крови увеличивается при экссудативном диатезе, заболеваниях печени, фенилкетонурии, опухолях.
где А Ч количество аминокислоты, мгк/л сыво- 5.3.5. Индикан ротки;
а Ч количество аминокислоты в пробе, найденное по калибровочному графику, мкг;
Индикан представляет собой калиевую соль в Ч количество экстракта, взятое для хромато- индоксилсерной кислоты.
графирования, мкл;
с Ч общее количество экст- Методы определения. В практических лабо ракта, мкл;
d Ч количество сыворотки (мл), раториях чаще применяют качественное иссле соответствующее общему количеству экстракта. дование (обнаружение) индикана в моче. Наи По с т р о е н и е к а л и б р о в о ч н ы х более распространенной является проба Обер г р а фи к о в. Для построения калибровочных мейера, основанная на образовании синего и графиков готовят растворы аминокислот красного индиго. Среди других исследований 0,01 моль/л, содержащие в 1 мкл 0,01 мкмоль применяют пробы с тимолом, а-нафтолом.
каждой аминокислоты. На бумагу наносят 5;
10;
Проба Обермейера. Пр и н ц и п. Индикан 15 и 20 мкл калибровочного раствора амино- превращают в индоксил, в результате окисления кислот порциями по 5 мкл. Каждая точка гра- которого образуется синее индиго (индиготин) фика будет соответствовать 0,05;
0,10;
0,15;
0,20 и красное индиго (индигорубин).
мкмоль аминокислоты. Линейная зависимость Ре а к т и в ы. 1. Свинца ацетат, 100 г/л.
между концентрацией вещества и интенсив- 2. Железо хлорное. 3. НС1 концентрированная, ностью окраски сохраняется при концентрациях отн. плотность 1,19. 4. Реактив Обермейера:
от 0,025 до 0,2 мкмоль для каждой аминокис- 0,2Ч0,4 г хлорного железа и 100 мл НС1 кон лоты. центрированной. 5. Хлороформ.
Разделение смеси калибровочных растворов Ход о б н а р у ж е н и я. Несколько милли аминокислот проводят при строгом соблюдении литров мочи смешивают с раствором ацетата всех условий хроматографирования и определе- свинца в соотношении по объему 1 : 10, фильтру ния описанных выше. На основании найденной ют. Смешивают 1Ч2 мл фильтрата с реактивом величины оптической плотности и взятых кон- Обермейера в соотношении 1 : 1, прибавляют центраций аминокислот строят калибровочные 0,5Ч1 мл хлороформа.
графики. Оц е н к а р е з у л ь т а т о в. Если слой Большинство аминокислот, за исключением хлороформа окрашивается в синий или красный фенилаланина, аспарагиновой кислоты, тиро- цвет, проба положительная.
зина, имеют очень близкие величины молярной Но р ма. Индикан содержится в моче в не оптической плотности, поэтому для их количест- значительном количестве и не обнаруживается венного определения можно пользоваться об- качественными пробами.
щим графиком.
Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы в сыворот Пр и м е ч а н и е. При наличии солей йода ке крови по данным различных авторов (даны в моче образуется красно-фиолетовая окрас пределы колебаний в мг/л): лейцинЧ 12Ч19;
ка хлороформа, которая исчезает после при фенил-аланин Ч 10Ч28;
валин Ч 13Ч29;
тиро бавления раствора тиосульфата натрия.
зин Ч 4Ч20;
аланин Ч 18Ч50;
глутаминовая кислота Ч 7Ч49;
глицин Ч 10Ч39;
серии Ч 4Ч18;
аспарагиновая кислота Ч 0,3Ч9,8;
цис- Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Увеличе тин -+- цистеин Ч 15Ч38;
метионин Ч 3,8;
трип- ние содержания индикана в моче происходит тофанЧ 11, 1;
гистидин Ч 11Ч30;
орнитин Ч при заболеваниях, связанных с усилением рас 7,2;
лизин Ч 8Ч30;
аргинин Ч 8Ч15;
цитрул- пада белка, или при интенсивном гниении бел лин Ч 5. ковых веществ в кишечнике.
5.4. ПИГМЕНТЫ Пигменты, или окрашенные соединения не- незначительное их количество. Основное содер белкового характера, могут находиться в орга- жание порфиринов приходится на долю гемо низме человека в свободном и связанном состоя- протеидов. Гем представляет собой протопорфи нии. рин, связанный с двухвалентным железом.
Основными структурными компонентами Желчными пигментами называют продукты пигментов являются пиррольные кольца, связан- распада гемоглобина и других хромопротеидов.
ные между собой метиновыми группами К желчным пигментам относятся билирубины (= СН ). С диагностической целью в био- и уробилиноиды. При распаде гемоглобина логических жидкостях определяют пигменты разрывается порфириновое кольцо тема, связь красного цвета Ч порфирины и желчные пиг- между ним, железом и белковой частью молеку менты. Биосинтез иорфиринов происходит прак- лы гемоглобина нарушается, образуется били тически в каждой клетке живого организма, вердин, который восстанавливается до основ однако в свободном состоянии находится очень ного желчного пигмента Ч билирубина.
5.4.1. Билирубин ференция желтых небилирубиновых пигментов.
Определение билирубина после окисления осно Билирубин Ч желто-красный пигмент;
пред- вано на образовании пигментов, имеющих раз ставляет собой линейный тетрапиррол. Большая личную окраску. Методы этой группы отли часть его в организме образуется в ретикулоэн- чаются низкой чувствительностью, низкой точ дотелиальной системе печени и селезенки при ностью и позволяют определить лишь общий распаде гемоглобина, миоглобина, цитохромов. билирубин.
Образовавшийся в клетках ретикулоэндотелия Диазометоды основаны на взаимодействии билирубин плохо растворим в воде, является билирубина с диазотированной сульфаниловой токсическим веществом, медленно реагирует с кислотой с образованием азопигментов, этими диазореактивом, что требует добавления аксе- методами определяются количественно две ос лератора, поэтому он называется непрямореаги- новные фракции билирубина. Связанный били рующим. При поступлении его с током крови в рубин дает быструю (прямую) реакцию азо печень в гепатоцитах происходит его обезврежи- сочетания. Реакция несвязанного билирубина вание путем присоединения глюкуроновой кис- значительно медленнее. Ее ускоряют вещества лоты. Диглюкуронид билирубина в отличие от акселераторы: гидроокись натрия, желчные кис свободного билирубина Ч вещество индиф- лоты и их соли, некоторые органические кислоты ферентное, растворим в воде и быстро реагирует и их соли, мочевина, кофеин, ацетамид, смесь с диазореактивом, т. е. является прямореаги- НС1 и диметилсульфоксида, смесь антипирина, рующим. Конъюгирование билирубина в гепа- мочевины и ацетата натрия, этиленгликоль и тоците с образованием диглюкуронида и неболь- другие вещества. Акселераторы освобождают шого количества моноглюкуронида протекает билирубин из белковых комплексов и тем самым с помощью фермента уридиндифосфоглюкуро- ускоряют реакцию азосочетания. Связанный би нилтрансферазы (УДФГА). Гепатоциты обла- лирубин соединен с альбумином значительно дают также способностью удалять связанный менее прочно, чем несвязанный, что обусловли с глюкуроновой кислотой билирубин. Это обус- вает характер реакции.
ловлено главным образом свойствами мембраны Азокраситель, образовавшийся при азосоче гепатоцита и наличием в цитоплазме гепатоцита тании билирубина с диазотированной сульфани специального белка (лигандина). Выделение би- ловой кислотой, ведет себя как кислотно-основ лирубина происходит с желчью, вместе с ной индикатор с несколькими цветными пере желчью билирубин попадает в пищеваритель- ходами. В сильно кислой среде раствор азокра ный тракт, где происходит его дальнейшее прев- сителя окрашен в фиолетовый цвет, в слабо ращение. В сыворотке крови содержится били- кислой и слабощелочной среде Ч в розовый, рубин, связанный с глюкуроновой кислотой, или в сильно щелочной среде Ч в синий. Опреде прямореагирующий (диглюкуронид и моноглю- ление билирубина в сильно щелочной среде куронид);
и билирубин, не связанный с глюку- значительно повышает чувствительность метода.
роновой кислотой, или непрямореагирующий. Азобилирубин обладает свойствами комплексо Обе фракции билирубина в сыворотке крови образования, что повышает интенсивность могут находиться в свободной форме или в виде окраски. На практике для определения билиру комплексов, соединенных с фосфолипидами или бина можно пользоваться азокомплексами альбумином (связывающая способность альбу- с медью и цинком.
мина сыворотки составляет 2 моля билирубина Первый азобилирубиновый метод предложен на 1 моль альбумина). Van den Berg в 1916 г. В оригинальном методе Комплексы связанного билирубина с фосфо- Ван ден Берга не применяются акселераторы;
липидами могут встречаться в сыворотке крови содержание фракций билирубина количественно при длительной закупорке желчных путей. Их этим методом не определяется. Наиболее рас можно экстрагировать из сыворотки эфиром пространенными и приемлемыми являются диа (эфирорастворимый билирубин). Свойства свя- зометоды с применением в качестве акселера занного билирубина обусловливают появление торных веществ смеси кофеина с бензоатом желтухи при значительно более низких цифрах натрия и ацетатом натрия, а также метанола.
его в крови по сравнению с концентрацией несвя- Принцип первого способа положен в основу ме занного билирубина. У новорожденного актив- тода ЕндрассикаЧГрофа, принцип второго Ч ность фермента УДФГА во много раз ниже, чем в основу метода МаллояЧЕвелина. В настоящее у взрослых, ниже и уровень белка лигандина, время в автоанализаторах применяется кинети что является причиной физиологической жел- ческое определение билирубина, основанное на тухи новорожденных. различных кинетических свойствах связанного Методы определения билирубина. Для ис- и несвязанного билирубина.
следования общего билирубина и его фракций Оптимизация условий определения и унифи кация методов. Метод ЕндрассикаЧГрофа ут применяются прямые спектрофотометрические методы, фотометрические методы после окисле- вержден приказом Министерства здравоохране ния, диазометоды, электрохимические методы с ния СССР в 1972 г. в качестве унифицирован использованием платинового и ртутного элект- ного. Данный принцип положен в основу боль родов, хроматографическое разделение отдель- шинства коммерческих наборов реактивов, в ных фракций билирубина. Прямые спектрофото- частности набора реактивов, выпускаемого Ла метрические методы основаны на измерении хема (ЧССР). Концентрация сульфаниловой абсорбции билирубина при 440Ч460 нм. Глав- кислоты не оказывает заметного влияния на ным источником ошибок в них является интер- скорость реакции диазосочетания и на чувстви 8 п/р В. В. Меньшикова тельность метода. Однако молярное соотноше- Сыворотка крови, свободная от гемолиза. Сы ние сульфаниловой кислоты к нитриту в реак- воротку хранят в холодном темном месте не бо ционной смеси не должно быть менее 3 : 1. В на- лее 12 ч.
боре реактивов Био-Ла-Тест (Лахема, ЧССР) Ход о п р е д е л е н и я. В 3 пробирки такое соотношение равно 5 : 1;
в унифицирован- (2 опытные пробы и холостая) вводят реактивы, ном методе 14 : 1. Избыток сульфаниловой кис- как указано в схеме.
лоты не влияет на азокраситель. Наибольшая чувствительность достигается при рН 5,4. Сни Опытная проба, мл Холо жение концентрации кофеина в 10 раз не ока стая зывает существенного влияния на результаты. общий связан Ингредиенты проба, били- ный били Унифицированный метод по диазореакции мл рубин рубин в присутствии акселератора (метод Ендрас сикаЧКлеггорнаЧГрофа). Пр и н ц и п. Под Сыворотка 0,5 0,5 0, воздействием НС1 разрывается тетрапирроловая Кофеиновый реактив 1,75 Ч 1, связь билирубина и образуются два дипиррола, Раствор хлорида которые диазотируются диазобензосульфоновой натрия Ч 1,75 0, кислотой с образованием розово-фиолетового азобилирубина. Связанный билирубин реаги- Диазосмесь 0,25 0, " рует быстро, несвязанный билирубин реагирует после добавления кофеинового реактива.
Р е а к т и в ы. 1. Кофеин, фарм. 2. Натрия бензоат ч. 3. Натрия ацетат 3-водный ч.д.а. или Для определения связанного билирубина из х.ч. 4. Кофеиновый реактив: 5 г кофеина, 7,5 г мерение проводят спустя 5Ч10 мин после добав бензоата натрия, 12,5 г ацетата натрия раство- ления диазосмеси, так как при длительном стоя ряют в 90 мл воды, нагревают до 50Ч60 С, нии в реакцию вступает несвязанный билиру хорошо перемешивают. После охлаждения до- бин. Для определения общего билирубина пробу водят водой до 100 мл. Раствор стабилен в тече- для развития окраски оставляют стоять 20 мин, ние 2 нед. 5. Натрия хлорид ч.д.а. или х.ч., после чего измеряют на фотометре. При даль 154 ммоль/л (изотонический раствор): 0,9 г хло- нейшем стоянии окраска не изменяется.
рида натрия помещают в мерную колбу вмести- Измерение проводят при длине волны 500Ч мостью 100 мл и доводят до метки водой. 6. НС1 560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщи концентрированная ч.д.а. или х.ч. 7. Сульфани- ной слоя 0,5 см против воды. Из показателей, ловая кислота ч.д.а. 8. Диазосмесь. Диазоре- полученных при измерении общего и связанного актив I: 5 г сульфаниловой кислоты растворяют билирубина, вычитают показатель холостой при нагревании в 300Ч400 мл воды, прибавляют пробы.
15 мл концентрированной НС1. Если сульфани- Ра с ч е т производят по калибровочному ловая кислота полностью не растворяется, колбу графику. Находят содержание общего и связан помещают в теплую воду и помешивают. Только ного билирубина.
после растворения и охлаждения раствор доли- По с т р о е н и е к а л и б р о в о ч н о г о вают водой до I л. Реактив стабилен при хране- г р а фи к а. Способ 1 Ч ШелонгаЧВенде с ис нии в посуде из темного стекла. Диазореактив пользованием стабилизирующего свойства бел II: натрия нитрит ч.д.а. или х.ч., 5 г/л (0,07 ка сыворотки крови. Основной раствор билиру моль/л): 0,5 г нитрита натрия помещают в мер- бина: в колбе вместимостью 50 мл растворяют ную колбу вместимостью 100 мл и доводят водой 40 мг билирубина в 30Ч35 мл 0,1 моль/л рас до метки. Реактив стабилен в течение 2Ч3 нед твора карбоната натрия Na2CO3. Хорошо взбал при хранении в посуде из темного стекла. Перед тывают, не допуская образования пузырьков.
работой смешивают 10 мл диазореактива I и Доводят до 50 мл 0,1 моль/л раствором 0,3 мл диазореактива П. 9. Билирубин для по- Na2CO3 и несколько раз перемешивают. Раствор строения калибровочного графика, 800 мг/л, стоек только в течение 10 мин от начала приго или 1368 мкмоль/л. Коммерческие препараты товления. В дальнейшем происходит окисление кристаллического билирубина содержат разные билирубина.
примеси, которые могут мешать реакции азосо- Рабочий раствор билирубина: к 13,9 мл све четания. Рекомендуется использовать набор жей негемолизированной сыворотки здорового Био-Ла-Тест Билирубин-эталон (ЧССР), со- человека добавляют 2 мл свежеприготовленного держащий билирубин высокой степени чистоты основного раствора билирубина и 0,1 мл 4 моль/л с коэффициентом молярной экстинкции не менее раствора уксусной кислоты. Хорошо перемеши - 6,05-104 л-моль Хсм при 453 нм и растворе- вают. При этом выделяются пузырьки углекис нии в хлороформе. Растворы билирубина не- лого газа. Рабочий раствор стоек в течение не стойкие, поэтому их готовят с добавлением белка скольких дней. Этот раствор содержит точно на в качестве стабилизатора. Коммерческие препа- 100 мг/л, или 171 мкмоль/л, билирубина больше, раты билирубина не связаны с глюкуроновой чем сыворотка, взятая для приготовления рас кислотой. 10. Натрия карбонат, 0,1 моль/л: твора. Чтобы исключить при расчетах количество 10,6 г безводного Nа2СОз растворяют и доводят билирубина, содержащегося в этой сыворотке, до 1 л водой. 11. Уксусная кислота, 4 моль/л: при измерении на фотометре из величин эксти 25 мл ледяной уксусной кислоты доводят до нкции калибровочных проб вычитают величины 100 мл водой. экстинкции соответствующих разведений ком Ма т е р и а л для и с с л е д о в а н и я. пенсационной жидкости.
Для приготовления компенсационной жид- Ре а кт ив ы. 1. Однозамещенный фосфат кости смешивают 13,9 мл той же сыворотки, ко- натрия (NaH PO ), 0,2 моль/л. 2. Натр едкий, 2 торая использовалась для приготовления калиб- 5 моль/л. 3. Фосфатный буфер рН 5,0;
0,2 моль/л ровочного раствора билирубина, 2 мл 0,1 моль/л раствор NaH PO доводят до необходимого рН 2 раствора карбоната натрия и 0,1 мл 4 моль/л раствором едкого натра 5 моль/л. 4. Этилацетат.
раствора уксусной кислоты. Для построения 5. п-Бутиловый спирт. 6. Билирубин-эталон лио калибровочного графика готовят ряд разведе- филизированный.
ний с различным содержанием билирубина.
Ма т е р и а л для и с с л е д о в а н и я.
К полученным разведениям прибавляют по Сыворотка крови, свободная от гемолиза.
1,75 мл кофеинового реактива и по 0,25 мл диазо- Ход о п р е д е л е н и я. В2 центрифужные смеси. При появлении помутнения можно до- пробирки вносят по 0,2 мл сыворотки. В первую бавить по 3 капли 30 % раствора едкого натра. приливают 1,8 мл фосфатного буфера и 3 мл Измерение проводят при тех же условиях, что и этилацетата, во вторую Ч 2,2 мл фосфатного в опытных пробах, через 20 мин.
буфера и 3 мл бутанола. Пробирки закрывают, Из компенсационной жидкости готовят раз- энергично встряхивают и центрифугируют 5Ч ведения, аналогичные калибровочным (как ука- 10 мин, после чего все три образовавшихся слоя зано ниже) и далее обрабатывают их так же, переносят осторожно в кюветы спектрофото как калибровочные пробы. метра для измерения. Этилацетатный экстракт содержит свободный билирубин, бутаноловый экстракт Ч свободный билирубин и моноглюку ронид, буферный водный слой Ч диглюкуронид.
Каждую пробу измеряют при 450 и 575 нм (из мерение при 575 нм проводят для исключения поглощения за счет гемоглобина).
Из значения экстинкции при 450 нм вычи тают значение экстинкции при 575 нм. Даль нейший расчет производят по калибровочной кривой. Для построения калибровочной кривой можно использовать Билирубин-эталон лиофи лизированный (Лахема, ЧССР), из которого готовят рабочие калибровочные растворы раз ной концентрации согласно инструкции. Из каж дого раствора берут по 0,2 мл и добавляют соот ветствующий растворитель (этилацетат, п-бута нол, фосфатный буфер). Калибровочные пробы обрабатывают и измеряют при тех же условиях, Спо с о б II. Калибровочный график стро- что опытные пробы.
ится по готовому набору реактивов Билирубин- Оц е н к а р е з у л ь т а т о в. Непрямореа эталон (Лахема, ЧССР).
гирующий билирубин и моноглюкуронид били Набор Био-Ла-Тест Билирубин-эталон рубина определяют в бутаноловом экстракте;
включает: 1) билирубин лиофилизированный в этилацетатном экстракте определяют непрямо (точная концентрация билирубина приведена на реагирующий билирубин;
в фосфорно-буферном этикетке флакона);
2) альбумин лиофилизиро- слое Ч диглюкуронид билирубина;
моноглюку ванный. Способ приготовления растворов били- ронид билирубина определяют по разнице содер рубина указан в инструкции к набору.
жания билирубина в бутаноловом и этилацетат Калибровочная кривая линейка до 170 ном экстрактах.
мкмоль/л.
Но р ма л ь н ые в е л и ч и н ы те же, что в Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы. В сыво- унифицированном методе.
ротке крови содержится 8,5Ч20,5 мкмоль/л об- Ли т е р а т у р а. Eberlein W. R. Pediatrics, щего билирубина (0,5Ч1,2 мг/100 мл), из ко- 1960, vol. 25, p. 878.
торого 75 % приходится на долю свободного Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Причины, (непрямореагирующего) билирубина. На пра-.вызывающие гипербилирубинемию, различны.
вильность метода влияет способ построения ка- Желтуха появляется, когда уровень билирубина либровочной кривой. Ряд веществ Ч гидрокор- в крови превышает 43 мкмоль/л (2,5 мг/100 мл).
тизон, андрогены, эритромицин, глюкокорти- Предложены различные классификации патоло коиды, фенобарбитал, аскорбиновая кислота Ч гических желтух, при которых в зависимости от вызывают интерференцию. механизма их возникновения повышаются раз личные фракции билирубина.
Ли т е р а т у р а. Jendrassik L., Cleghorn R.
Заболевания, вызывающие повышение свя Biochem'J., 1936, vol. 289, p. 1.
занного прямореагирующего билирубина: ви Спектрофотометрический метод определения русный гепатит, цирроз печени, опухоль печени общего билирубина и его фракций (метод Эбер- и метастазы, жировая дистрофия, синдром Ду лейна). Пр и н ц и п. Измерение характерного бинаЧДжонсона.
для билирубина максимума абсорбции при Заболевания, вызывающие повышение не 450 нм после фракционирования билирубина в связанного непрямореагирующего билирубина:
фосфатном буфере, этилацетате и бутиловом гемолитическая анемия, пернициозная анемия;
спирте. несвязанный билирубин бывает также повышен при желтухе новорожденных, болезни Жиль- флюоресценции в ультрафиолетовом свете ха бера, синдроме КриглераЧНайяра, синдроме рактерны для наличия порфиринов. В норме Ротора. с мочой выделяется их немного Ч до 30 мкг/сут.
При механической желтухе связанный с глю куроновой кислотой билирубин увеличивается в основном за счет билирубиндиглюкуронида, 5.4.3. Порфобилиноген при паренхиматозной желтухе Ч билирубин моноглюкуронида. Прямореагирующий билиру- Методы определения порфобилиногена (ПБГ) бин при гемолитической желтухе новорожден- и дельта-аминолевулиновой кислоты в моче ос ных состоит главным образом из билирубинмо- нованы на их разделении с помощью адсорбции ноглюкуронида. на колонках с ионообменной смолой, окисью алюминия, каменным углем и др. После разде 5.4.2. Порфирины ления для определения дельта-аминолевулино вой кислоты применяют метод, основанный на Порфирины представляют собой азотистые реакции с реактивом Эрлиха Ч п-диметил пигменты пиррольного ряда, обладающие общей аминобензальдегидом или на модифицирован основной структурой Ч порфином, который со- ной реакции Яффе с щелочным пикратом.
стоит из 4 пиррольных колец. В зависимости от Для определения порфобилиногена в моче того, какими радикалами замещены атомы водо- применяют прямой метод с реактивом Эрлиха рода в порфине, образуются различные типы и непрямой метод после выделения порфобили порфиринов Ч уропорфирины, копропорфири- ногена при помощи адсорбции на колонке с ны, протопорфирины. Названия луропорфи- окисью алюминия. В качественной пробе Ват рины и копропорфирины были даны по источ- сонаЧШварца с реактивом Эрлиха вызывают нику их первоначального выделения. Все соеди- интерференцию Ч уробилиноген, производные нения, имеющие в основе молекулы кольцо пор- индола, скатола и других веществ. Для повы фирина, флюоресцируют и характеризуются ин- шения специфичности пробы добавляют ацетат тенсивным поглощением на границе видимой натрия и проводят экстракцию хлороформом и ультрафиолетовой областей спектра. Восста- и бутанолом. При добавлении ацетата натрия новленные формы порфиринов называют пор- образуется слабая уксусная кислота, в то время фириногенами. Они являются бесцветными как для реакции индола и скатола с реактивом предшественниками порфиринов. Дельта-амино- Эрлиха необходимо присутствие сильных мине левулиновая кислота является предшествен- ральных кислот. После экстракции хлороформом ником порфобилиногена, который в свою очередь в водной фазе, помимо порфобилиногена, могут является предшественником уропорфириногена остаться и другие вещества (меланоген, оксо и копропорфириногена. Для порфиринов харак- пирролдикарбоксильная кислота и др.). Для их терно наличие изомерии, что обусловлено удаления применяют экстракцию бутанолом, в р а з л и ч н ы м р а с п о л о же н и е м ра- котором растворяются вещества, интерферирую д ика л ов. щие реакцию. Порфобилиноген-альдегид - сое Порфирины входят в состав ряда сложных динение, образующееся при взаимодействии белков: гемоглобина, миоглобина, цитохромов, порфобилиногена и реактива Эрлиха, не раство каталазы. ряется ни в хлороформе, ни в бутаноле. Пред Определение порфиринов в биологическом ложены и другие способы экстракции, например материале имеет диагностическое значение при смесью амилбензила. Метод обнаружения пор ряде патологических состояний Ч анемиях, ге- фобилиногена в моче реакцией с п-диметил патите, отравлении свинцом и особенно при пор- аминобензальдегидом утвержден в качестве уни фириях. Повышение содержания порфиринов фицированного в 1979 г.
может быть связано с увеличением их синтеза Унифицированный метод по реакции с п-ди в различных клетках организма или недоста- метиламинобензальдегидом. Пр и н ц и п.
точностью ферментов, участвующих в их обмене.
Порфобилиноген (ПБГ) реагирует с п-диметил Порфирии представляют собой заболевания, аминобензальдегидом с образованием окрашен чаще всего обусловленные генетическим нару- ного в красный цвет соединения.
шением функций различных ферментных систем.
Ре а к т ив ы. 1. п-Диметиламинобензаль Существуют различные формы порфирии Ч пе- дегид. 2. НС1 концентрированная х.ч. 3. Реактив ченочная, эритропоэтическая и др.
Эрлиха: 0,7 г п-диметиламинобензальдегида Методы определения порфиринов. Исследо- растворяют в 150 мл концентрированной НС1, вание порфиринов в биологическом материале приливают к 100 мл воды и смешивают. Раствор представляет определенные трудности, так как должен быть бесцветным или слегка желтым.
содержание их невелико, существуют разные Хранят в посуде из темного стекла. Реактив типы порфиринов, их изомеры, определение стабилен. 4. Натрия ацетат 3-водный х.ч., ч.д.а., которых требует применения специфических и насыщенный раствор: 375 г ацетата натрия высокочувствительных методов. Количественные 3-водного (или 226 г безводной соли) раство методы определения порфиринов сложны и тре- ряют в 250 мл теплой воды, охлаждают до ком буют наличия дорогостоящей аппаратуры Ч натной температуры. Хранят при комнатной тем спектрометров, флуорометров. Качественные пературе. Раствор должен быть бесцветным и пробы существуют лишь для немногих видов прозрачным. 5. Хлороформ. 6. Бутиловый спирт.
порфиринов. Пурпурно-красная окраска мочи, 7. Бумага индикаторная для измерения рН а также обнаружение оранжевой или красной (в интервале 4,0Ч5,0).
Ма т е р и а л д л я и с с л е д о в а н и я. ацетон ч.д.а. 7. п-Диметиламинобензальдегид Моча в первые 2Ч3 ч после мочеиспускания. ч. 8. Раствор А: 11,55 мл ледяной уксусной кис Ход о б н а р у ж е н и я и о ц е н к а ре- лоты разводят водой в мерной колбе вмести з у л ь т а т о в. Смешивают в пробирке 2,5 мл мостью 1 л. 9. Раствор Б: 27,2 г ацетата натрия реактива Эрлиха и 2,5 мл мочи. Добавляют растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 5 мл насыщенного раствора ацетата натрия 1 л. 10. Ацетатный буфер рН 3,6: готовят, сме и перемешивают. Измеряют рН индикаторной шивая 463 мл раствора А и 37 мл раствора Б;
бумагой;
значение рН должно быть в интервале доводят до метки водой в мерной колбе вмести 4,5Ч5,0;
если рН меньше 4,0 добавляют раствор мостью 1 л. 11. Калибровочный основной раст ацетата натрия для установления нужного рН. вор АЛК, 0,75 ммоль/л (100мкг/мл) в пересчете Если окраски не образуется Ч результат отри- на основание: 0,00635 г АЛК гидрохлорида цательный. При образовании розовой или крас- растворяют в ацетатном буфере рН 3,6 в мерной ной окраски добавляют 5 мл хлороформа и колбе вместимостью 50 мл. Хранят в холодиль встряхивают. Если окраска переходит в слой нике не более месяца. 12. Рабочий калибровоч хлороформа, а верхний водный слой становится ный раствор АЛК, 1 мкг/мл. Готовят перед бесцветным или желтым Ч результат отрица- употреблением разведением основного калибро тельный. При сохранении окрашивания водной вочного раствора ацетатным буфером в 100 раз.
фазы переносят 6Ч8 мл водного слоя в другую 13. Взвесь угля: 0,25 г активированного угля пробирку, добавляют бутиловый спирт в соот- помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл ношении 2 : 1 и встряхивают. Обычно фазы раз- и разбавляют ацетатным буфером рН 3,6. Перед деляются быстро;
в противном случае смесь цент- употреблением тщательно встряхивать. 14. Реак рифугируют. При переходе окраски в бутиловый тив Эрлиха: 1 г п-диметиламинобензальдегида слой Ч результат отрицательный. Если водная растворяют в мерной колбе вместимостью 50 мл часть остается окрашенной Ч результат поло- в 35 мл ледяной уксусной кислоты, добавляют жительный для ПБГ. 8 мл 57 % хлорной кислоты и доводят до метки Но р ма л ь но е з на ч е ние. В норме ледяной уксусной кислотой. Хранят в посуде из ПБГ в моче не обнаруживается (0Ч2 мг/л). темного стекла в холодильнике не более недели.
Данным методом ПБГ обнаруживается при кон- 15. Беззольные фильтры (синяя лента).
центрации, превышающей 6 мг/л. Ма т е р и а л для и с с л е д о в а н и я.
Отбирают не менее 2 мл мочи. Допускается Пр и м е ч а н и е. При хранении мочи свы хранение мочи в холодильнике, рН мочи должен ше 3 ч при комнатной температуре реакция быть равен 6, для чего добавляют на 10 мл мочи может стать ложноотрицательной, что, по 0,1 мл ледяной уксусной кислоты.
видимому, связано с превращением ПБГ в С п е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а н и е.
порфирины и образованием ингибиторов Спектрофотометр.
реакции. Если нет возможности исследовать Ход о п р е д е л е н и я. К1 мл мочи в про мочу в первые 2Ч3 ч, ее хранят в холодиль бирке с притертой пробкой добавляют 9 мл взве нике при 4 С или в замороженном состоя си угля в ацетатном буфере рН 3,6. Суспензию нии. При хранении в холодильнике и дове взбалтывают 1 мин и фильтруют через бумаж дении рН мочи до 6,0Ч7,0 ПБГ стабилен ный фильтр (синяя лента). В две пробирки от длительное время.
бирают по 2 мл фильтрата. Первая пробирка Ли т е р а т у р а. Clinical chemistry. Prin- для холостой пробы. Во вторую пробирку (опыт ciples and technics. 2ed/Eds. R.J. Henry, ную) добавляют 0,05 мл ацетилацетона и тща D. C. Cannon, J. W. Winkel man. Ч Hagerstown тельно перемешивают. Затем обе пробирки по etc.: Harper and Row, 1974, p. 1251 Ч 1263. мещают на 20 мин в кипящую водяную баню.
После охлаждения проб и доведения объема Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Увеличе жидкости ацетатным буфером до 2 мл в каждую ние выделения ПБГ с мочой наблюдается при пробирку добавляют по 2 мл реактива Эрлиха острой перемежающейся порфирии, при ане и перемешивают. Через 15 мин опытную пробу миях, связанных с нарушением порфиринового измеряют против холостой пробы при длине обмена, при свинцовой интоксикации.
волны 553 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.
Окраска раствора стабильна в течение 1 ч.
5.4.4. Дельта-аминолевулиновая Ра с ч е т ведут по калибровочному графи кислота ку (готовят разведения, как указано ниже).
Рабочий АЛК в пробе Унифицированный метод по реакции с п-ди Ацетат (2 мл) № про- калибро метиламинобензальдегидом. Пр и н ц и п. ный буфер вочный бирки рН 3,6, мл Дельта-аминолевулиновая кислота (АЛК) опре раствор, мл мкг мкмоль деляется по реакции с реактивом Эрлиха после удаления ПБГ и других мешающих определению 1 0,1 До 5 мл 0,04 0, веществ сорбированием их на активированном 2 0,3 То же 0,12 0, угле.
3 0,5 0,2 0, Р е а к т и в ы. 1. Уксусная кислота ледяная 4 0,7 0,28 0, х.ч. 2. Хлорная кислота, 57 %, х.ч. 3. Натрия ацетат 5 1,0 0,4 0, 3-водный х.ч. 4. Дельта-аминолевулиновой 6 2,0 0,8 0, кислоты гидрохлорид ч. 5. Уголь активирован ный с дисперсностью 0,25Ч1 мм. 6. Ацетил Из каждой пробы отбирают по 2 мл раствора Ре а к т и в ы. 1. Уксусная кислота ледяная в 2 пробирки (холостую и опытную), которые х.ч. 2. Эфир медицинский. 3. HCI х.ч. 1,4 моль/л.
обрабатывают, как указано выше. По получен- 4. Йод ч.д.а., спиртовой раствор, 0,039 моль/л.
ным данным строят калибровочный график. 5. Раствор йода в НС1. Готовят ежедневно, сме шивая реактивы № 3 (200 объемов) и № Пр и ме ч а н и е. Поскольку диурез за сут (1 объем).
ки может быть различным, более достовер Сп е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а ние.
ным показателем считается содержание АЛК Спектрофотометр.
в пересчете на 1 г креатинина.
Ма т е р и а л для и с с л е д о в а н и я.
Ра с че т. Содержание АЛК в моче Свежевыделенная моча. Срок хранения мочи не (мкмоль/г креатина) рассчитывают с использо- более 3 ч.
ванием калибровочного графика по формуле: Ход о п р е д е л е ни я. В делительную во ронку вносят 2 мл мочи, 0,2 мл ледяной уксусной кислоты, 5 мл эфира и встряхивают в течение 1 мин. После разделения фаз нижний водный где С Ч количество АЛК в пробе (мкмоль), слой отбрасывают. К эфирному слою добавляют найденное по калибровочному графику;
А Ч 5 мл раствора йода в НС1 и встряхивают в тече содержание креатинина в пробе (г) ;
10 Ч коэф- ние 1 мин. После разделения фаз нижний слой фициент разведения мочи, 2 Ч объем фильтра- переносят в пробирку, термостатируют при 37С та (мл). в течение 5 мин. Затем содержимое пробирки Коэффициент пересчета микрограмм АЛК в встряхивают и измеряют оптическую плотность раствора в кюветах с толщиной слоя 1 см при микромоли Ч 0,0076.
Но р м а л ь н ые в е л и ч и н ы содержа- трех длинах волн: 380;
402;
430 нм против ния АЛК в моче 3,9 Ч 19 мкмоль/г креатинина 1,41 моль/л раствора НС1.
(0,52Ч2,5 мг/г креатинина). Ра с че т. Учитывая, что диурез за сутки Оц е н к а а н а л и т и ч е с к о й на де ж- может быть разным, более достоверным показа ности. Нижняя граница чувствительности телем считают содержание КП в пересчете на 0,15 мкмоль/л. Воспроизводимость: коэффи- креатинин. Содержание КП в моче (нмоль/г циент вариации около 5 %. креатинина) рассчитывают по формуле:
Ли т е р а т у р а. Mauzerall D. S., Gra nick S. J. biol. Chem., 1956, vol. 219, № 1, p. 435Ч446.
Кл и н и ч е с к о е з на ч е ние. Выделе- где Е, Е, Е Ч оптическая плотность рас 402 430 ние дельта-аминолевулиновой кислоты с мочой твора при соответствующих длинах волн;
А Ч увеличивается при патологических процессах, содержание креатинина в пробе (г);
1,52 Ч связанных с нарушением порфиринового об- коэффициент пересчета микрограммов КП в на мена, а также при интоксикации свинцом, бен- номоли;
2,093 Ч коэффициент для расчета золом и другими токсическими веществами. содержания КП, предложенный Римингтон.
Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы КП в моче:
30,5Ч122 нмоль/г креатинина (20Ч80 мкг/г 5.4.5. Копропорфирин, уропорфирин креатинина).
Кл и н и ч е с к о е з на ч е ние. Содержа Для копропорфирина (КП) наиболее прием- ние КП в моче повышается при гепатитах, цир лемыми по аналитическим качествам являются розах печени, свинцовой интоксикации и неко спектрофотометрические методы. Спектрофото- торых формах порфирии, наследственной копро метрический метод Соулсби в модификации порфирии, перемежающейся порфирии, эритро Римингтона рекомендован в качестве унифици- поэтической уропорфирии. Повышенное выделе рованного. ние с мочой УП наблюдается при перемежаю щейся порфирии, эритропоэтической уропор Унифицированный метод Соулсби в модифи- фирии.
кации Римингтона. Пр и н ц и п. Экстракция КП и копропорфириногена (КПГ) из мочи в Ли т е р а т у р а. Павловская Н. А., кислой среде с последующим переводом КПГ Кахн X. А., Семенова Л. С., Мере А. Т. Ч Лаб.
в КП йодом, реэкстракция КП кислотой и дело, 1981, № 2, с. 86Ч89;
Rimington С. Ass.
спектрофотометрическое определение его по раз- clin. Pathol., 1971, vol. 70, p. 39Ч42;
Soulsby 1., Smith R. L. Brit. J. industr. Med., 1974, vol. 31, нице оптической плотности при трех длинах № 1, p. 72Ч74.
волн.
5.5. УГЛЕВОДЫ И РОДСТВЕННЫЕ СОЕДИНЕНИЯ 5.5.1. Глюкоза сутствовать фруктоза и пентозы, а при патоло гии и галактоза. После еды увеличивается со Более 90 % всех растворимых низкомолеку- держание фосфорных эфиров гексоз, определя лярных углеводов крови приходится на глюкозу;
емых некоторыми методами вместе с глюкозой.
кроме того, в небольших количествах могут при- Глюкоза распределена почти равномерно между плазмой и эритроцитами, поэтому с равным деления глюкозы, и в обоих идет глюкозоокси успехом может определяться в цельной крови, дазная реакция, но в первом варианте датчик плазме или сыворотке, но надо иметь в виду, что улавливает перекись водорода, а во втором в уже взятой пробе крови, особенно если сгусток уменьшение содержания кислорода, израсходо для получения сыворотки формируется в термо- ванного на окисление глюкозы.
стате или если материал взят нестерильно, идет Редуктометрический феррицианидный метод, интенсивный гликолиз и содержание глюкозы предложенный в 1926 г. Н. С. Hagedorn, быстро падает. Часто принимают, что в венозной В. N. Jensen, малоспецифичен, но не нуждается крови содержится на 0,5 ммоль/л (10 мг в ни в дефицитных реактивах, ни в дорогой аппа 100 мл) меньше глюкозы, чем в капиллярной, ратуре, поэтому принят в качестве унифициро но эта величина, разумеется, условная. ванного и используется и в настоящее время, Широко распространенный термин сахар особенно в небольших лабораториях. Значи крови надо считать неудачным, так же как и тельно точнее методы, основанные на способ термин сахарная кривая, и использовать более ности глюкозы восстанавливать соли меди;
так точные выражения: глюкоза крови и глюкозо-то как образующаяся одновалентная медь легко лерантный тест (ГТТ). окисляется кислородом воздуха, она обычно вы Методы определения глюкозы разделяют на ступает в качестве промежуточного вещества, три группы: ферментативные, редуктометриче- окончательным хромогеном служит мышьяково ские и методы с использованием цветных реак- молибденовая или фосфорно-вольфрамовая кис ций, в которых участвуют продукты, образую- лота. Однако, если в растворе присутствуют щиеся при нагревании углеводов с концентри- комплексообразователи, например неокупреин, рованными кислотами. восстановленная (одновалентная) медь не окис Фе р м е н т а т и в н ы е ме т о д ы иссле- ляется кислородом воздуха, поэтому может быть дования сочетают в себе высокую точность и непосредственно измерена. Методы, основанные техническую простоту анализа, они основыва- на восстановлении глюкозой нитробензолов, в ются на одной из двух реакций Ч гексокиназ- частности пикриновой кислоты, в некоторых ной либо глюкозооксидазной. В первом случае странах широко распространены, эффективность глюкоза сначала фосфорилируется за счет АТФ их, видимо, во многом зависит от степени благодаря действию гексокиназы;
образовав- чистоты реактивов. Ошибки редуктометрических шийся глюкозо-6-фосфорный эфир в присутст- методов в значительной степени вызваны при вии глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы восста- сутствием восстанавливающих веществ неугле навливает NADP, количество которого опреде- водной природы Ч глютатиона и аскорбиновой ляется по увеличению светопоглощения в ульт- кислоты. В связи с тем что глютатион находится рафиолетовой области. Эти методы считаются в эритроцитах, при анализе плазмы или исполь наиболее точными, но для выполнения нужда- зовании такого метода исследования цельной ются в нескольких ферментах и кофакторах, крови, при котором эритроциты удаляются не поэтому определение оказывается дорогостоя- разрушенными, погрешности значительно сокра щаются.
щим для клинико-диагностических лабораторий.
Легче выполнимы глюкозооксидазные методы, Из многочисленных методов, которые осно в которых глюкозооксидаза окисляет глюкозу ваны на ц в е т н ых р е а к ц и я х с продук кислородом воздуха с образованием перекиси тами, образующимися при нагревании углеводов водорода, количество которой определяется либо с кислотами, наибольшее значение имеет орто химическим путем, либо по ее способности в при- толуидиновый метод. Он специфичен, прост в сутствии пероксидазы окислять диамины с обра- выполнении, но по ходу реакции надо кипятить зованием окрашенных продуктов. Практически пробу на водяной бане с концентрированной очень удобен унифицированный в 1974 г. глюко- уксусной кислотой, поэтому работать надо под зооксидазный метод определения глюкозы по тягой или в специальном помещении. Антроно окислению ортотолидина. Он не требует ни на- вый метод значительно менее специфичен, но гревания до высоких температур, ни работы с примерно в 5 раз чувствительнее;
благодаря концентрированными кислотами, но имеет тот малой специфичности он годится для определе недостаток, что орто-толидин токсичен (канце- ния любых углеводов в крови, в частности поли роген), кроме того, трудно получить препарат глюкина. Другие методы этой группы, основан глюкозооксидазы, полностью свободной от ка- ные на цветных реакциях с карбазолом, орци талазы, которая, хотя бы в небольшой степени, ном или резорцином, применяются лишь для оп разрушает образующуюся перекись водорода, ределения углеводов, входящих в состав глико поэтому всегда существует угроза получения протеидов и протеогликанов.
Pages: | 1 | ... | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | ... | 13 | Книги, научные публикации