Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии

Микробиологические аспекты разработки и применения антисептиков и антисептических средств для профилактики и лечения раневых инфекций

Автореферат докторской диссертации по биологии

СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА

Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |

 

Физико-химические методы

Для количественной оценки белка в матриксе микробной биопленки использовали метод Лоури (Lowry O.H. et al, 1951).

Сорбционную емкость сорбентов оценивали по метиленовому синему (Решетников В.И., 2003).

Цитологические методы

Для работы с культурой клеток формировали монослой фибробластов в 96-луночных планшетах (Sarstedt, Германия) в ростовой питательной среде Игла в течение 48 часов при 37С по методике (Грабовская К.Б., Тотолян А.А., 1977; Грабовская К.Б., Афиногенов Г.Е., Копылова Т.В., Тотолян А.А., 1987). Для оценки острого цитотоксического действия (ЦТД) использовали 5-бальную шкалу FDA, США: 0 баллов - отсутствие цитотоксического действия, 1 балл - слабое токсическое действие (20-25% лизированных клеток), 2 балла - мягкое токсическое действие (50% гибели клеток), 3 балла - умеренное токсическое действие (70-75% клеточного монослоя содержат округлые и/или лизированные клетки), 4 балла - тяжелое токсическое действие (100% деструкция клеточного монослоя). В каждом опыте оценивали не менее 100 клеток. Согласно данной шкале тестируемые препараты отвечают требованиям безопасности, если во всех опытных лунках степень ЦТД не более 1 балла (МУ 1.2.1105-02).

Экспериментальные методы

Модель экспериментального остеомиелита воспроизводили по методу Riegels-Nielsen P. et al., 1995. Острую токсичность и общетоксическое действие вытяжек из костного цемента invivo изучали по методу Дейхмана и Ле Бланка на мышах массой 18,0-20,0 г (Голиков С.Н., Саноцкий Н.В. и др., 1986). Оценку местно-раздражающего действия проводили на морских свинках белой масти обоего пола массой 250,0-300,0 г и на кроликах породы Шиншилла массой 2,5-3,0 кг по МУ 1.2.1105-02.

аа Статистическая обработка результатов.

Математическую обработку полученных данных осуществляли с использованием компьютерных программ STATISTICA for Windows v.5.0 (Stat Soft Inc., 1995) (Ойвин И.А., 1960; Стентон Г., 1999; Юнкерова В.И., Григорьева С.Г., 2002), рассчитывая среднюю арифметическую, стандартную ошибку средней арифметической, доверительный интервал. Достоверность различий между средними величинами оценивали с использованием t-критерия Стьюдента (уровень значимости Р<0,05).

Микробиологические исследования выполнены под руководством и при личном участии автора в отделении профилактики и лечения раневой инфекции ФГУ РНИИТО им. Р.Р. Вредена. Экспериментальные и патоморфологические исследования проведены при содействии сотрудников и руководителя экспериментально-морфологического отделения д.м.н. Г.И. Нетылько. Электронную микроскопию проводили совместно с в.н.с. И.Л. Потокиным (лаборатория электронной микроскопии ГНИИОЧБ ФМБА); гистологические и клинические исследования протеза сетчатого для герниопластики - совместно с проф. Н.А. Постреловым (кафедра хирургических болезней с курсом детской хирургии СПБ ГМА им. И.И. Мечникова); клиническая апробация антисептической композиции АРГАКОЛ в стоматологии - совместно с профессором, Заслуженным деятелем науки В.Н. Трезубовым (кафедра стоматологии и материаловедения с курсом ортодонтии СПб ГМУ им. акад. И.П. Павлова).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка перспективности применения антисептиков в клинических условиях

Чашечно-суспензионный метод бактериологического анализа позволяет получать достоверные результаты оценки антимикробной активности различных препаратов при коротких экспозициях от нескольких секунд до 24 часов в присутствии естественных нейтрализаторов, что, в свою очередь, способствует рациональному использованию клиницистами эффективных и нетоксичных средств. Критерием эффективности антисептика при этом служит коэффициент снижения числа тест-микроорганизмов - Кред (коэффициент редукции). Он выражается в десятичных логарифмах и характеризует порядок уменьшения контаминации в результате воздействия антисептика при заданной экспозиции. Достаточной считают эффективность антисептиков при Кред ? 1. По результатам исследований (табл.1) можно говорить о высокой противомикробной активности антисептиков различных химических групп, антибиотика амикацина и антисептического геля АРГАКОЛ. Коэффициент редукции во всех случаях составил от 3,5 до 9,5 lg.

Впервые методом двойных дисков с ЭДТА выявлена перспективность комплексонов в качестве эффективных ингибиторов МБЛ. Наибольшим ингибирующим действием в отношении металло-бета-лактамазы P. aeruginosa, сходным с ЭДТА, обладают комплексоны бисфосфонаты (например, дифосфоновая, метиленфосфоновая кислоты) иа Унитиол.

Использование метода серийных разведений позволило одновременно определять собственную противомикробную активность препаратов и их различных сочетаний, а также их способность ингибировать МБЛ клинических штаммов резистентных грамотрицательных бактерий. Полученные данные свидетельствуют о высоком уровне устойчивости штамма P. aeruginosa 804 МБЛ+ к меропенему, а также о наличии бактериостатического и бактерицидного действия комплексонов Унитиол, Ксидифон, Бонефос, антисептика ПРОНТОСАНо в отношении штаммов P. aeruginosa 804 МБЛ+ и A. baumannii4257. В наших исследованиях показано, что сочетанное применение мерапенема или цефтазидима с суббактерицидными концентрациями антисептика ПРОНТОСАНо и комплексонов усиливает действие антибиотика (табл.2-3).

Показано, что в отношении штамма P. aeruginosa 804 МБЛ+ действие антибиотика меропенема в присутствии суббактерицидной концентрации препарата ПРОНТОСАНо усиливается в 8 раз, при добавлении к смеси в суббактерицидной концентрации Унитиола - в 16 раз, Бонефоса - в 512 раз, Ксидифона - в 1024 раза. Наилучшие результаты в усилении действия цефтазидима наблюдали при его сочетании с суббактерицидными концентрациями препарата ПРОНТОСАНо и Ксидифона - в 85 раз, препарата ПРОНТОСАНо и Бонефоса - в 43 раза. Сочетанное применение цефтазидима и препарата ПРОНТОСАНо усиливало действие антибиотика в 11 раз (различия достоверны, Р<0,05). В случае использования препарата ПРОНТОСАНо с Унитиолом не наблюдали усиления действия цефтазидима (различия не достоверны, Р>0,05).

В отношении штамма A. baumannii 4257 действие антибиотиков меропенема и цефтазидима (табл.3) достоверно усиливалось в сочетаниях с антисептиком ПРОНТОСАНо, Ксидифоном и Бонефосом в 85-170 раз (P<0,05). Сочетанное применение меропенема или цефтазидима с антисептиком и Унитиолом достоверно не усиливало действие соответствующего антибиотика (Р>0,05).

Таким образом, в исследованиях показано, что сочетанное применение мерапенема или цефтазидима с суббактерицидными концентрациями антисептика ПРОНТОСАНо и комплексонов значительно усиливает действие антибиотика (до уровня чувствительного штамма). Полученные результаты позволят клиницистам эффективно использовать сочетанное применение антибиотиков общего действия, антисептиков и комплексонов для терапии инфекций, вызванных антибиотикорезистентными неферментирующими грамотрицательными бактериями.

Таблица 1 - Определение антимикробной активности антисептиков, амикацина, антисептических средств (чашечно-суспензионный метод, 37?С, экспозиция 60 мин)

Препарат	Коэффициент редукции (Кред) в отношении соответствующего тест-штамма
S. aureus АТСС 6538 (микробная нагрузка 109 КОЕ/мл)	E. coli АТСС 25922 (микробная нагрузка 109 КОЕ/мл)	P. aeruginosa АТСС 15442 (микробная нагрузка 109 КОЕ/мл)	C. albicans АТСС 10231 (микробная нагрузка 107 КОЕ/мл)
Контроль lg Nо 9,52	Контроль lg Nо 9,18	Контроль lg Nо 9,24	Контроль lg Nо 7,5
К ред	К ред	К ред	К ред
Клей хирургический АРГАКОЛ	4,81	4,5	4,42	3,9
Диоксидин 1%	5,83	9,18	9,24	3,9
Катапол 0,5%	5,77	6,62	6,61	7,5
Амикацин 1%	9,52	9,18	9,24	3,88
Повиаргол 5%	4,98	4,88	4,89	7,5
ТефлексА 0,4% ПГМГ	5,81	4,86	6,49	7,5
авасепто 0,4% ПГМГ	9,52	9,18	9,24	7,5
Пронтосано 0,1% ПГМГ	5,81	4,86	6,49	7,5
Хлоргексидина биглюконат 0,05%	5,11	5,17	5,25	7,5
Препарат	Контроль lg Nо 9,3	Контроль lg Nо 9,32	не изучали	Контроль lg Nо 7,6
К ред	К ред	не изучали	К ред
ПВП 10% + Диоксидин 1% + Амикацин 1%	9,3	9,32	не изучали	4,95

Таблица 2 - Значения МБцК антибиотиков в сочетаниях с другими лекарственными средствами в отношении штамма Pseudomonas aeruginosa 804 МБЛ+

Антибиотики в сочетании с другими лекарственными средствами в суббактерицидных концентрациях	МБцК антибиотика, мкг/мл (n = 5)	Усиление действия антибиотика
Меропенем	1843,2 197,1	-
Меропенем + ПРОНТОСАНо	230,4 24,6	в 8 раз
Меропенем + ПРОНТОСАНо + Унитиол	115,2 12,3	в 16 раз
Меропенем + ПРОНТОСАНо + Ксидифон	1,8 0,2	в 1024 раза
Меропенем + ПРОНТОСАНо + Бонефос	3,6 0,4	в 512 раз
Цефтазидим	153,6 24,6	-
Цефтазидим + ПРОНТОСАНо	14,4 1,5	в 11 раз
Цефтазидим + ПРОНТОСАНо + Унитиол	115,2 12,3	в 1,3 раза
Цефтазидим + ПРОНТОСАНо + Ксидифон	1,8 0,2	в 85 раз
Цефтазидим + ПРОНТОСАНо + Бонефос	3,6 0,4	в 43 раза

Таблица 3 - Значения МБцК антибиотиков в сочетаниях с другими лекарственными средствами в отношении штамма Acinetobacter baumannii 4257

Антибиотики в сочетании с другими лекарственными средствами в суббактерицидных концентрациях	МБцК антибиотика, мкг/мл (n = 5)	Усиление действия антибиотика
Меропенем	307,2 49,3	-
Меропенем + ПРОНТОСАНо	28,8 3,1	в 11 раз
Меропенем + ПРОНТОСАНо + Унитиол	115,2 12,3	в 2,3 раза
Меропенем + ПРОНТОСАНо + Ксидифон	1,8 0,2	в 170 раз
Меропенем + ПРОНТОСАНо + Бонефос	3,6 0,4	в 85 раз
Цефтазидим	307,2 49,3	-
Цефтазидим + ПРОНТОСАНо	14,4 1,5	в 21 раз
Цефтазидим + ПРОНТОСАНо + Унитиол	115,2 12,3	в 3 раза
Цефтазидим + ПРОНТОСАНо + Ксидифон	3,6 0,4	в 85 раз
Цефтазидим + ПРОНТОСАНо + Бонефос	1,8 0,2	в 170 раз

При оценке количества частиц фага методом агаровых слоев по Грациа пренпараты на основе бисгуанидинов (ТефлексА и хлоргексидина биглюконат 0,05%) снижали титр бактерионфагов на 4 lg в концентрации 0,1%; в концентрации 0,01% оба тестируемых препарата снижали титр на 2 lg; в концентрации 0,001% только препарат ТефлексА проявнлял слабое антифаговое действие, снижая титр на 1 lg. Йодофоры (Йодонат, Монклавит) снижали титр бактенриофагов на 4-6 lg в концентрациях 0,1-0,001%.

В исследованиях по подавлению трансдукции плазмиды ero использовали суббактерицидную концентрацию Монклавита 0,0125%, поскольку именно в этой дозе он оказывал антифаговое действие. Аналогичный эффект бисгуанидинов наблюдали только в бактерицидных концентрациях. Частоту передачи вычисляли по отношеннию числа клеток трансдуктантов к числу клеток реципиентов в 1 мл. Из результатов исследований следует, что новый отечественный антисептик Монклавит (йод на основе высокомолекулярного ПВП) в суббактерицидной концентрации в 1000 раз снижал частоту передачи внехромосомного фактора устойчивости к эритромицину у стафилококков. Таким образом, можно предположить, что снижение интенсивности передачи плазмиды ero йодофорами в значительной мере связано с антифаговым действием суббактерицидных доз этих препаратов. Есть вероятность, что антисептики, обладающие антифаговой активностью в дозах 0,1%-0,001% (по препарату), в клинических дозах будут снижать частоту переданчи плазмид устойчивости в стафилококковых популяцинях на коже и слизистых оболочках. А также они смогут препятствовать формированию лостровов патогенности у микроорганизмов.

Перспективность применения полимерных антисептиков бисгуанидинов

Модель культуры клеток фибробластов кожи эмбриона человека (Грабовская К.Б., Тотолян А.А., 1977; Грабовская К.Б., Афиногенов Г.Е., Копылова Т.В., Тотолян А.А., 1987) адекватна для изучения адгезивных свойств микроорганизмов и формирования ими микробной биопленки, а также для оценки антитоксического и антиадгезивного эффекта антисептиков и антисептических средств. Такая модель позволяет оценить специфическую активность антисептиков одновременно в отношении большого числа патогенов, которые могут участвовать в формировании микробных биопленок на поверхности ран и изделиях медицинского назначения, в условиях, максимально приближенных к условиям макроорганизма.

Было показано, что в присутствии суббактерицидных доз антисептика ПРОНТОСАНо и всех тестируемых микроорганизмов (S. aureus, P. aeruginosa, P. vulgaris, S. agalactiae генотипа SspB1+) монослой фибробластов полностью сохранялся. Из результатов исследований следует, что полимерные антисептики влияют на фенотипические маркеры вирулентности условно-патогенных микроорганизмов: адгезины и факторы колонизации. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности применения антисептиков из класса полигексаметиленбигуанидинов для профилактики и лечения раневых инфекций.

Заслуживает внимания эффект препарата ПРОНТОСАНо в отношении формирования биопленки клиническим штаммом Streptococcus agalactiae - клиническим изолятом серотипа IV, характеризующимся высокой адгезивной активностью и продуцирующим белок SspB1+. В контрольных опытах без антисептика через 2 часа инкубации монослой был разрушен ферментами агрессии стрептококка (рис.1-2). В это же время, в присутствии антисептика монослой полностью сохранялся (рис.3-4). Необходимо отметить, что антиадгезивный и антитоксический эффект у препарата ПРОНТОСАНо проявлялся в суббактерицидной дозе 0,25 мкг/мл, что в 4000 раз меньше клинической (0,1% бисгуанидина соответствует дозе 1000 мкг/мл препарата), что свидетельствует о пролонгированном действии средства.

2 а 1 а	2 а 1 а
Рис. 1 - Состояние монослоя клеток фибробластов кожи эмбриона человека (1) после воздействия S. agalactiae SspB1+ (2) в течение 30 минут. Окраска по Романовскому-Гимза, х630.	Рис. 2 - Состояние монослоя клеток фибробластов кожи эмбриона человека (1) после воздействия S. agalactiae SspB1+ (2) в течение 2 часов. Окраска по Романовскому-Гимза, х1000, имерсия.
2 а 1 а	2 а 1 а
Рис. 3 - Состояние монослоя клеток фибробластов кожи эмбриона человека (1) после воздействия S. agalactiae SspB1+ (2) в течение 30 минут в присутствии дозы 0,25 мкг/мл ПРОНТОСАНо. Окраска по Романовскому-Гимза, х1000, имерсия.	Рис. 4 - Состояние монослоя клеток фибробластов кожи эмбриона человека (1) после воздействия S. agalactiae SspB1+ (2) в течение 2 часов в присутствии дозы 0,25 мкг/мл ПРОНТОСАНо. Окраска по Романовскому-Гимза, х1000, имерсия.

СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА

Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |

     Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии