Книги, научные публикации
Pages: | 1 | ... | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | ... | 13 | СПРАВОЧНИК Лабораторные методы исследования в клинике Под редакцией профессора В.В.Меньшикова МОСКВА ДМЕДИЦИНА" 1987 ББК 53.4 М51 УДК 61б-074/-078:061.6 В. В. МЕНЬШИКОВ, Л. Н. ДЕЛЕКТОРСКАЯ, Р. П. ...
-- [ Страница 7 ] --Т а б л и ц а 38. Нормальные величины белковых Подготовка бумаги: полосы фильтровальной фракций (в процентах) бумаги смачивают раствором свежего буфера.
Избыток буфера удаляют, отжимая полосы ме жду лентами фильтровальной бумаги, и помеща ют их в электрофоретическую камеру. Бумажная лента может быть расположена горизонтально (горизонтальный электрофорез) или под углом (вертикальный электрофорез). При горизон тальном электрофорезе бумажная лента должна быть хорошо натянута.
Нанесение сыворотки: на край ленты наносят по 5Ч10 мкл негемолизированной сыворотки в виде поперечной полосы, отступя на 0,5 см от краев.
Проведение электрофореза: камеру закрыва ют крышкой и проводят электрофорез сыворотки в течение 6Ч24 ч при напряжении от 3 до 8 В В о с п р о и з в о д и м о с т ь п о к а жд о й на 1 см пути тока. Продолжительность электро и з ф р а к ц и и. В серии V ~ 1,5Ч5 %, изо дня фореза устанавливают в зависимости от силы в день V~3- 8%.
и напряжения тока, вида буферного раствора, рН, длины, ширины и толщины бумажных Пр и м е ч а н и я. 1. Можно использовать барбиталовый (мединал-вероналовый) бу- полос.
фер такого же состава, как и для электро- Обработка бумажных полос: выключают ток, фореза на бумаге. 2. После проведения элек- вынимают ленты, сушат в сушильном шкафу трофореза буфер из катодной и анодной в течение 10 мин при 105С и красят, погружая камер смешивают, что дает возможность ис- в раствор красителя на 20 мин. Краситель сли вают и ленты несколько раз промывают 20 г/л пользовать его несколько раз.
раствором уксусной кислоты до устранения Ли т е р а т у р а. Сентебова Н. А., Медве фона (окрашенные участки бумаги, свободные дева Л. А., Александровская Т. Н. В кн.: Унифи от белка). Ленты вновь просушивают на воз кация лабораторных методов исследования/Под духе.
ред. В. В. Меньшикова. М., 1978, вып. VIII, Расчет: измерение проводят на денситометре с. 39Ч49;
Kohn J. In: Laboratory medicine.
или на фотометре после элюирования. Резуль V. 1Ч Hagerstown e. a., 1975, Chap. 12B.
таты выражают в процентах.
Электрофоретическое разделение на бумаге. Элюирование: кусочки ленты, содержащие П р и н ц и п тот же, что при электрофорезе отдельные фракции, вырезают и помещают в на пленках из ацетата целлюлозы. пробирки для элюирования. Для этого в каждую Р е а к т и в ы. 1. Буфер. Можно использо- пробирку с глобулиновой фракцией приливают вать различные виды буферов Ч мединал-веро- по 10 мл 0,02 моль/л раствора NaOH, к альбу наловьш. боратный, трис-буфер. а) Мединал- миновой фракции Ч 20 мл и оставляют в тече вероналовый буфер рН 8,6:10,3 г мединала и ние 1Ч2 ч. Измерение проводят в кювете с тол 1,84 г веронала растворяют и доводят до 1 л щиной слоя 1 см против 0,02 моль/л раствора NaOH при 500Ч560 нм (зеленый светофильтр). представляет собой насыщенный водный рас Величину экстинкции альбуминов умножают твор тимола в буфере. Химическая сущность на 2. Определяют сумму экстинкции всех фрак- тимоловой пробы окончательно не выяснена.
ций, принимая ее за 100 %, и вычисляют долю Считают, что проба является положительной каждой фракции. при уменьшении альбуминов и увеличении (3- и Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы у вз рос - у-глобулинов.
л ы х: альбумины 50Ч70 %;
глобулины: он 3Ч Способ приготовления тимолового реактива 6 %;
а2 9Ч15;
в 8Ч18 %;
у 15Ч25 %.
и вид буфера могут влиять на результаты. Тимо Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Диагно- ловый реактив в вероналовом буфере, предло стическое значение определения альбумина женный Маклаганом, неустойчив. Повысить ус представлено выше. Увеличение содержания <х- тойчивость реактива можно различными спосо глобулинов в сыворотке крови характерно для бами. Хуэрго и Поппер предложили модифици острых воспалительных процессов, так как в ровать оригинальный реактив Маклагана, изме данную фракцию входят белки острой фазы нив способ его приготовления (тимол добавля (С-реактивный белок, а1-гликопротеид, а1-анти- ется к вероналовому буферу в форме концентри трипсин, а2-макроглобулин, церулоплазмин, рованного спиртового раствора).
гаптоглобулин и др.). Во фракцию а-глобулинов Позднее было предложено заменить верона входит большинство гликопротеидов. Содержа- ловый буфер трис-буфером, который в сочета ние а-глобулинов увеличивается также при нии с НС1 и малеиновой кислотой увеличивает различных хронических заболеваниях, злока- стабильность реактива. Немаловажное значение чественных новообразованиях, метастазирова- имеет оптимизация условий определения. Реак нии опухолей, травмах, ревматизме, инфаркте ция более чувствительна при рН 7,55 и темпе миокарда.
ратуре 23Ч25 С.
Повышение в-глобулинов в сыворотке крови Оценку помутнения, возникшего в ходе реак чаще наступает при гиперлипопротеидемиях ции, можно проводить визуально или турбиди различного происхождения, что связано с нали- метрически. Предложены различные суспензии чием в данной фракции липопротеидов. Фрак- для построения калибровочной кривой. Чаще ция у-глобулинов увеличивается при патологи- других применяют бариево-сульфатный реактив.
ческих состояниях, связанных с интенсифика- Тимоловая и сулемовая пробы и проба Вельт цией иммунологических процессов, так как мана утверждены в качестве унифицированных фракция у-глобулинов состоит главным образом в 1972 г.
из иммуноглобулинов. Увеличение содержания Тимоловая проба (унифицированный метод).
у-глобулинов может наступать за счет образо- Пр и н ц и п. При взаимодействии сыворотки вания патологических белков Ч парапротеинов, с тимолово-вероналовым раствором появляется относящихся к иммуноглобулинам.
помутнение вследствие образования глобулино Гипогаммаглобулинемии могут носить вро- тимоло-липидного комплекса.
жденный характер или могут быть обуслов Р е а к т и в ы. 1. Тимол, 100 г/л спиртовой лены наличием различных заболеваний или па раствор: 10 г очищенного тимола растворяют тологических состояний, сопровождающихся ис в 96 % этиловом спирте в мерной колбе вме тощением иммунной системы. К таким заболева стимостью 100 мл. Очистка тимола: 100 г тимола ниям относятся злокачественные опухоли, хро ч. растворяют в 100 мл 96 % этилового спирта, нические воспалительные процессы, аллергиче фильтруют. К фильтрату прибавляют 1 л холод ские заболевания.
ной воды, сильно встряхивают и оставляют сто ять на 20 мин. Затем фильтруют;
кристаллы, оставшиеся на фильтре, промывают 2 раза хо лодной водой, сушат до постоянной массы вна 5.1.4. Осадочные пробы чале на фильтровальной бумаге, затем в течение 2Ч3 дней в эксикаторе над безводным хлоридом Применение осадочных проб с диагности- кальция. 2. 5,5-Диэтилбарбитуровая кислота ческой целью основано на изменениях устойчи- (веронал), фарм. 3. 5,5-Диэтилбарбитуровой ки вости белков плазмы при некоторых заболева- слоты натриевая соль (мединал), фарм. 4. Бу ниях. В норме белки в плазме крови находятся ферный раствор: 2,76 г веронала и 2,06 г меди в коллоидном состоянии и отличаются высокой нала растворяют и доводят до 1 л водой. Хранят устойчивостью. При постановке осадочных проб, в холодильнике;
при появлении осадка раствор которые сопровождаются химическим или физи- негоден к употреблению. 5. Тимолово-веронало ческим вмешательством, наступает преципита- вый буфер рН 7,55Ч7,6: в мерной колбе вмести ция белков, приводящая к помутнению или об- мостью 100 мл смешивают 80 мл буферного разованию хлопьев. раствора и 1 мл 100 г/л спиртового раствора Основные осадочные пробы. Пробы с приме- тимола, встряхивают и доливают буферным рас нением реакции Таката (проба Таката, проба твором до метки. Проверяют рН. 6. Бария хло Гросса, сулемовая проба);
тимоловая проба;
рид ч. д. а. или х. ч. 7. Калибровочный раствор.
кефалин-холестериновая проба;
цинк-сульфат- а) Раствор хлорида бария: 1,175 г хлорида ная (Кункеля) проба;
реакция Вельтмана;
зо- бария (ВаСl2-2Н2О) растворяют и доводят до лото-коллоидальная проба. Наибольшее диагно- 100 мл водой, б) Серная кислота х. ч.,0,1 моль/л.
стическое значение при заболевании печени име- Суспензия сульфата бария: 3 мл раствора хло ет тимоловая проба. Тимоловая проба предло- рида бария наливают в мерную колбу вмести жена в 1944 г. Маклаганом. Тимоловый реактив мостью 100 мл и доводят объем до метки 0,1 моль/л раствором серной кислоты при тем- личестве миллилитров раствора сулемы, пошед пературе 10 С (при этой температуре размеры ших на титрование.
частиц преципитированного сульфата бария Но р м а л ь н ы е величины: 1, 6Ч2, 2 мл дают относительно стабильный результат). Сус- сулемы.
пензию сульфата бария готовят перед употреб Ли т е р а т у р а. Grinstedt F. Acta med лением.
Scand., 1948, vol. 131, p. 66.
Ма т е р и а л для и с с л е д о в а н и я.
Сыворотка крови, свободная от гемолиза.
Проба Вельтмана (унифицированный ме Ход о п р е д е л е н и я. К 6 мл тимолово- тод). Пр и н ц и п. При добавлении к сыворотке вероналового буферного раствора прибавляют крови раствора хлорида кальция и нагревании 0,1 мл сыворотки, оставляют стоять 30 мин и происходит нарушение коллоидальной устойчи затем измеряют оптическую плотность при дли- вости сыворотки.
не волны 630Ч690 нм (красный светофильтр) Р е а к т и в ы. 1. Кальция хлорид 0,5%.
против тимолово-вероналового буфера в кюве- Готовят из 10 % раствора хлорида кальция тах с толщиной слоя 1 см. Реакцию проводят (СаСl Х 6Н О), что соответствует 5 % раствору 2 при комнатной температуре.
безводного хлорида кальция. Точно определить Ра с ч е т ведут по калибровочному гра- массу хлорида кальция невозможно из-за его фику.
гигроскопичности, поэтому концентрацию раст По с т р о е н и е к а л и б р о в о ч н о г о вора определяют по относительной плотности;
г р а фи к а : из калибровочного раствора суль- 5 % раствор безводного хлорида кальция имеет фата бария (суспензии) готовят разведения, относительную плотность 1,040. Для приготовле соответствующие единицам помутнения по ния 10 % раствора хлорида кальция 99,14 г Шенк Ч Хогланд. Калибровочные растворы хо- СаСl Х 6Н О доводят до 1 л бидистиллированной 2 рошо встряхивают и тотчас при длине волны водой и растворяют, затем измеряют относитель 630Ч690 нм в кюветах с толщиной слоя 1 см ную плотность и путем дальнейшего разведения против воды измеряют.
доводят относительную плотность до 1,040.
Из полученного раствора, разведя его в 10 раз, готовят 0,5 % раствор хлорида кальция. Для приготовления 0,5 % раствора можно использо Суспензия 0,1 моль/л раст- Единицы BaSO, мл вор НаSО, мл помутнения вать ампулированный раствор хлорида каль 4 ция. Если относительная плотность ампулиро ванного раствора 1,040, то 0,5 % раствор гото 1,35 4,65 вят разведением ампулированного раствора 2,7 3,3 в 10 раз.
5,4 0,6 Ма т е р и а л д л я и с с л е д о в а н и я.
Сыворотка крови, свободная от гемолиза.
Ход о п р е д е л е н и я. К 0,1 мл сыворотки прибавляют 4,9 мл воды, перемешивают, опро Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы : 0Ч4 ед.
кидывая пробирку, и прибавляют 0,1 мл 0,5 % Пр и м е ч а н и е. Можно использовать го раствора хлорида кальция, встряхивают и на товый набор реактивов Био-Ла-Тест Тимоло- гревают пробирку над пламенем до однократ вая проба (Лахема, ЧССР), в состав которо ного закипания смеси. Охлаждают пробирку и го входят трис-буфер и малеиновая кислота.
смотрят на свету. Если хлопьев нет, то в эту же пробирку добавляют еще 0,1 мл хлорида каль Ли т е р а т у р а. Huerga J., Popper H.
ция и вновь кипятят. Процедуру повторяют, J. Lab. clin. Med., 1949, vol. 34, p. 877;
Shank R., пока не выпадут хлопья.
Hoagland C. J. biol. Chem., 1946, vol. 162, p. 33.
Результаты оценивают, подсчитывая общее Сулемовая проба (унифицированный метод).
количество пошедшего на реакцию хлорида Пр и н ц и п. Сулема в присутствии мелкодис- кальция.
персных коллоидов (белков) образует коллои Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы. В норме дальный раствор солей ртути. Нарушение дис коагуляция наступает при прибавлении 0,4Ч персности белковых фракций сыворотки крови 0,5 мл раствора хлорида кальция.
вызывает осаждение грубодисперсных частиц.
Кл и н и ч е с к о е з на ч е ние. Результа Р е а к т и в ы. 1. Сулема, 1 г/л раствор:
ты осадочных проб могут быть патологическими 0,1 г двухлористой ртути растворяют в воде при заболеваниях печени, а также при других в мерной колбе вместимостью 100 мл. 2. Натрия заболеваниях, сопровождающихся диспротеине хлорид, 154 ммоль/л.
миями. Поэтому их следует расценивать в соче Ма т е р и а л для и с с л е д о в а н и я.
тании с другими лабораторными тестами и кли Сыворотка крови, свободная от гемолиза.
ническими симптомами. Наиболее специфичной Ход о п р е д е л е н и я. К 0,5 мл сыворотки для поражения печени является тимоловая про добавляют 1 мл 154 ммоль/л раствора NaCl ба, она бывает положительной раньше появле и титруют 1 г/л раствором сулемы. После появ ния желтухи. Сулемовая проба чаще бывает ления первоначально обратимого помутнения положительной при циррозе печени, токсических титруют медленно с интервалом 20Ч30 с до поражениях печени, силикозе. В пробе Вельт стойкого помутнения (через вертикальный слой мана коагуляция наступает при прибавлении жидкости нельзя прочитать газетный текст).
меньшего количества раствора хлорида кальция Результаты сулемовой реакции выражают в ко при паренхиматозном поражении печени, маля рии. Коагуляция мри прибавлении большего Л и т е р а т у р а. Weltmann О, Med. Klin., количества раствора хлорида кальция наблюда- 1930, vol. 26, p. 240;
Weitmann O. Wicn. kl i n.
ется при ревматизме, туберкулезе легких. Wschr., 1930, vol. 11, p. 1301.
5.2. ФЕРМЕНТЫ 5.2.1. Общая часть 1 для ЛДГ и 10000:1 для АсАТ и ААТ);
размер и форма молекул ферментов и величина В основе многих болезней лежат нарушения молекулярной массы;
внутриклеточная локали нормального функционирования ферментатив- зация ферментов. Важно также время полу ных процессов. Изменения в специфических фер- распада фермента в плазме;
оно может коле ментативных реакциях можно идентифициро- баться от нескольких часов до нескольких дней.
вать как причину или следствие различных пато- Ферменты, поступающие в плазму, могут быть логических состояний. Эта взаимосвязь наибо- специфичными для плазмы и выполнять в ней лее отчетливо выявляется при некоторых врож- определенные физиологические функции. Их ак денных нарушениях метаболизма. Большинство тивность в плазме больше, чем в клетках или ферментов, катализирующих химические реак- тканях. К ним относятся: церулоплазмин, псев ции, протекающие в живом организме, нахо- дохоли нэстераза, липопротеиновая липаза. Эти дятся в клеточной среде, тем не менее на основа- ферменты синтезируются в печени и постоянно нии результатов анализов внеклеточных жид- высвобождаются в плазму. С диагностической костей (особенно плазмы или сыворотки крови) точки зрения они представляют интерес, когда можно сделать заключение об изменениях, их активность в плазме ниже нормы за счет происходящих внутри клеток разных органов нарушения функции печени.
и тканей. Вторая группа ферментов, неспецифичных Определяемая в норме активность ферментов для плазмы, не выполняет определенных физио в сыворотке крови есть результат сбалансиро- логических функций в плазме. Их активность ванности скорости, с которой ферменты синте- в плазме гораздо ниже, чем в клетках и тканях.
зируются внутри клеток и выходят из них, со К ним относятся: а) секретируемые ферменты;
скоростью удаления ферментов из внеклеточной б) ферменты, связанные с клеточным метабо жидкости путем инактивации и разрушения и их лизмом. К секретируемым ферментам принадле экскреции. Изменения активности ферментов в жат липаза, а-амилаза, ЩФ. Эти ферменты биологических жидкостях при заболеваниях мо- секретируются определенными органами (под гут быть обусловлены рядом причин. желудочная железа, печень) и выводятся с мо Повышение активности может быть резуль- чой, желчью. В норме их активность в плазме татом ускорения процессов синтеза (например, относительно низка и постоянна. Однако при ЩФ при рахите, гепатите), некроза клеток патологии, если блокирован любой из обычных (например, КК, АсАТ при инфаркте миокарда), путей экскреции, активность этих ферментов понижения выведения (например, ЩФ, ЛАП в плазме значительно увеличивается (напри при закупорке желчных путей), повышения про- мер, повышение активности ЩФ в сыворотке ницаемости клеточных мембран (например, крови при закупорке желчевыводящих путей).
Ал AT, АсАТ при вирусном гепатите). Основная группа ферментов Ч это ферменты клеточного обмена, локализованные внутри кле Понижение активности вызывается уменьше ток в цитоплазме и клеточных структурах;
в сы нием числа клеток, секретирующих фермент воротке крови их активность низка или они (например, ХЭ при циррозе печени), недоста вообще отсутствуют.
точностью синтеза (например, церулоплазмин при болезни Вильсона), увеличением выведения Основным принципом ферментной диагно фермента (например, церулоплазмин при неф- стики является выбор оптимального спектра розе), торможением активности (например, ак- ферментов, изменение активности которых тивности трипсина антитрипсином). характерно для патологии определенных орга Наиболее важны с диагностической точки нов или тканей. Спектр ферментов для диагно зрения те изменения, которые обусловлены на- стики заболеваний некоторых органов: сердце Ч рушением скорости образования ферментов или КК, ЛДГ, АсАТ;
скелетные мышцы Ч КК, АЛД;
высвобождением ферментов из поврежденных кости Ч ЩФ;
кровь Ч ЛДГ2, ЛДГ3;
поджелу или омертвевших клеток. Многие факторы спо- дочная железа Ч а-амилаза, липаза;
предста собны повышать проницаемость мембран для тельная железа Ч КФ;
печень (желчные пу белков и таким образом вызывать лутечку ти) Ч ААТ, ГДГ, ХЭ, ЩФ, 7-ГПТ. Очень внутриклеточных ферментов: уменьшение до- высокая активность ферментов в крови может ставки кислорода в клетку, истощение запаса указывать на поражение определенного органа, глюкозы в крови, лекарственные и химические например, очень высокая активность ААТ ука вещества. Если началось выделение ферментов зывает на поражение печени. Имеет значение из клетки, то на скорость появления ферментов и знание внутриклеточной локализации фермен в сыворотке крови воздействуют следующие тов, особенно для контроля за течением болезни.
факторы: концентрационный градиент внутри Для ферментной диагностики важны также и клетки и в сыворотке крови (например, для гепа- сведения о соотношении активности ферментов, тоцита соотношение концентраций равно 3000: например, АсАТ к ААТ или КК к АсАТ. Опре деление активности органоспецифйческих фер- трацией субстрата согласно уравнению Михаэ ментов, т. е. ферментов, содержащихся только лиса Ч Ментен. Константа Михаэлиса (Км) в одном органе, например сорбитолдегидроге- характеризует степень сродства фермента с суб наза (печень), уроканиназа (печень), орнитил- стратом и представляет собой концентрацию карбамилтрансфераза (печень), не имеет боль- субстрата, при которой скорость ферментатив шого диагностического значения. Количество та- ной реакции равна половине максимальной.
ких ферментов ограничено, а активность их Ос н о в н ые т р е б о в а ния, предъ в сыворотке крови очень низкая или они вообще я в л я е м ые к фе р м е н т а т и в н о й ре отсутствуют и не всегда определяются сущест- а к ц и и. Активность фермента необходимо оп вующими методами. Более важно для диагно- ределять в условиях насыщения фермента суб стики определение изоферментов. стратом;
до конца измерения должна быть из Фермент в целом, как правило, содержится расходована только небольшая часть субстрата;
в ряде органов, а отдельные изоферменты орга- субстрат не должен содержать примесей, влия носпецифичны. Особое значение в ферментной ющих на определение.
диагностике имеет знание пределов нормальных Фа к т о р ы, в л и я ющи е на а к т ив величин активности фермента, которые в значи- но с т ь фе р ме нт о в. Температура, вид суб тельной степени зависят от метода и условий страта и его концентрация;
вид буфера и его определения. В энзиммологии, как ни в какой концентрация;
рН;
наличие активаторов и ин другой области, существует большое количество гибиторов.
единиц активности ферментов, несравнимых ме- Ферментативная реакция чувствительна к жду собой, поэтому стандартизация единиц изменениям температуры. При повышении тем в клинической энзимологии Ч необходимое ус- пературы энергия теплового движения молекул ловие для получения диагностически значимых увеличивается, в результате чего число молекул, и сравнимых результатов лабораторных иссле- способных достичь переходного состояния, т. е.
дований. подвергнуться действию фермента, возрастает, Методические вопросы определения актив- при дальнейшем повышении температуры может ности ферментов. Из-за низкой активности фер- наступать инактивация ферментов. Температур ментов в биологических жидкостях, а также из- ный коэффициент скорости реакции равен при за трудности дифференциации различных фер- близительно 10 % на 1 С. Это значит, что при ментов химическим способом на практике, как повышении температуры на 1 С активность правило, не применяется прямое химическое фермента увеличивается на 10 %. Однако при определение активности ферментов, а измеря- значительном повышении температуры скорость ется каталитический эффект ферментов путем реакции снижается из-за денатурации белка.
измерения скорости реакции, при которой суб В 1961 г. Международный биохимический страт под действием фермента превращается союз рекомендовал измерять активность фер в продукт реакции. Эта величина известна как мента при температуре 25 С, в 1964 г. эти реко скорость реакции и при определенных усло мендации были изменены на 30 С. Междуна виях прямо пропорциональна количеству при родная согласованность температуры измерения сутствующего фермента.
активности ферментов является предпосылкой Чтобы понять механизм ферментативной ре- для международной стандартизации методов, акции, необходимо иметь представление о ее так как при разной температуре оптимальные кинетике, т. е. о тех законах, которым подчиня- значения рН, концентрации буфера, субстрата ется реакция, протекающая под действием и других параметров реакции различны.
фермента. Строгое математическое описание ки- Главное свойство ферментов, отличающее их нетики ферментативных реакций очень сложно. от других катализаторов,Ч высокая специфич Классические кинетические реакции могут иметь ность;
фермент вступает в реакцию только с оп различный порядок. Скорость реакции нулево- ределенным химическим веществом Ч субстра го порядка зависит только от катализатора, том. Некоторые ферменты обладают почти абсо а не от концентрации реагирующих веществ. лютной специфичностью по отношению к дан Скорость реакции первого порядка зависит ному субстрату. Так, ЛДГ специфична к L-лак от концентрации одного из реагирующих ве- тату, глутаматдегидрогеназа Ч к L-глутамату.
ществ. Реже встречаются реакции второго и Специфичность других ферментов выражена не третьего порядка, скорость которых зависит от столь сильно Ч их действие простирается обыч двух или трех компонентов реакции соответ- но на определенную группу веществ. К таким ственно. При высокой концентрации субстрата ферментам относятся фосфатазы, пептидазы.
скорость ферментативной реакции практически Для определения активности ферментов в ря не зависит от изменения концентрации субстра де случаев применяют синтетические субстраты, та. При этом в отношении субстрата реакция так как иногда бывает трудно определить физи приобретает нулевой порядок, происходит насы ологический субстрат или продукты распада щение фермента субстратом. При этих условиях синтетического субстрата определить легче, чем скорость реакции зависит только от активности физиологического. Как указано ранее, при оп фермента.
ределенной концентрации субстрата достигается Исследование эффекта насыщения привело максимальная скорость реакции. Рассчитать L. Michaelis, M. Menten в 1913 г. к созданию концентрацию субстрата, при которой достига общей теории кинетики ферментативных реак ется максимальная скорость реакции, можно ций, которой установлена зависимость между теоретически, исходя из уравнения Михаэли скоростью ферментативной реакции и концен са Ч Ментен.
Для достижения максимальной скорости нее проводить в оптимизированных условиях ферментативной реакции концентрация субстра- относительно концентрации субстрата, буфера, та должна во много раз (50 и более) превышать активаторов и величины рН.
константу Михаэлиса. На практике не исполь- Методы определения активности ферментов.
зуют слишком высокую концентрацию субстра- Существует большое количество методических та, так как субстрат или его продукт может принципов определения активности ферментов, тормозить активность фермента. Если для реак- различающихся по технике исполнения, анали ции взять концентрацию субстрата, в 10 раз тическим качествам, способу измерения актив превышающую константу Михаэлиса, то ско- ности ферментов. По способу измерения разли рость реакции составит 90 % от максималь- чают: непрерывное кинетическое измерение, ной, что достаточно для практических целей. двухточечное измерение, измерение по конечной Эмпирически также можно определить необхо- точке. Преимущество кинетического измерения димую субстратную концентрацию по кривой состоит в возможности прямого непрерывного изменения скорости реакции при увеличении измерения скорости ферментативной реакции концентрации субстрата. Вид буфера может ока- в начальной линейной части кривой при оптими зывать значительное влияние на активность зированной концентрации реактивов. С этой ферментов, особенно ЩФ. Все ферменты имеют точки зрения наиболее точными и приемлемыми оптимальную область рН действия. В качестве являются методы, основанные на оптическом активаторов для многих ферментов могут слу- тесте. Оптический тест был разработан Вар жить органические и неорганические соедине- бургом в 30-х годах. Принцип теста Варбурга ния. Например, активатором для КК являются основан на разнице поглощения при определен сульфгидрильные соединения, для ЩФ Ч ионы ной длине волны (340 нм) восстановленной магния. При определении активности ферментов (NADH) и окисленной (NAD) форм никотина чаще приходится иметь дело с ингибиторами. мидадениндинуклеотида. При длине волны Ингибиторы ферментов могут находиться в ис- 340 нм NADH имеет максимальную абсорбцию, следуемом материале и в реактивах. В моче, тогда как NAD не имеет поглощения при данной например, много ингибиторов ЛДГ. Ионы тяже- длине волны. Качество реактива имеет большое лых металлов органических и неорганических значение для получения правильных результа реактивов являются ингибиторами для боль- тов. Поэтому коэффициент молярной абсорбции шинства ферментов. рекомендуется проверять в лаборатории, он не 2 - 1 На практике для каждого фермента экспери- должен быть ниже5-10 моль -м. Различают ментально должна подбираться концентрация прямой и непрямой оптические тесты. Прямой субстрата, оптимум рН, вид буфера и его кон- оптический тест применяется для определения центрация. Оптимизация условий определения активности дегидрогеназ. Непрямой оптический активности ферментов повышает аналитическую тест включает, помимо измерительной, индика надежность результатов исследования и их торную и вспомогательную реакции. Например, диагностическую информативность, поэтому оп- прямой оптический тест для определения актив ределение активности ферментов предпочтитель- ности ЛДГ:
При непрямом оптическом тесте требуется торам, снижающим специфичность данных ме введение в реакцию ферментов. Активность фер- тодов, относится влияние метаболитов эндоген ментов измеряют на спектрофотометре предпоч- ного происхождения. В редоксиндикаторных ме тительно с термостатированной кюветой, а так- тодах NADH восстанавливает синий тетразолий же на биохимических анализаторах, позволя- или другие вещества с образованием окрашен ющих измерять кинетику ферментативной реак- ных соединений. Промежуточным продуктом ции. К преимуществам методов, основанных на служит феназинметасульфат.
оптическом тесте, относятся возможность опре- Флуориметрические методы определения ак деления активности ферментов при оптимизиро- тивности ферментов более чувствительны, чем ванных условиях, в начальной линейной части спектрофотометрические. Сравнительно новыми кривой, при кинетике нулевого порядка. К фак- и еще более чувствительными являются хемилю Т а б л и ц а 39. Уменьшение активности фермен- как, например, КФ, АЛД, ЛДГ, так как при тов в сыворотке крови при хранении [Berg- свертывании крови указанные ферменты будут освобождаться из тромбоцитов, поэтому актив meyer Н. U., 1983| ность ЛДГ, АЛД в сыворотке крови будет выше, чем в плазме. Важно также знать содержание ферментов в эритроцитах. Те ферменты, которые содержатся в эритроцитах, при гемолизе попа дают в сыворотку и активность их в сыворотке будет значительно выше. В табл. 39 представ лены данные о стабильности ряда ферментов.
Практически важен также вопрос о разведении сыворотки при высокой активности фермента.
Для ряда ферментов (АсАТ, КК) известен эф фект разведения, т. е. при разведении сыворотки 154 ммоль/л раствором NaCI активность фер мента не снижается пропорционально разведе нию. Это объясняется различными причинами:
концентрация белка в сыворотке может влиять на активность фермента во время инкубации;
при разведении нарушается соотношение инги биторов и активаторов, что также не дает ожи даемого результата от разведения, поэтому при определении активности ферментов предпочти тельнее не разводить сыворотку, а уменьшать время инкубации.
Множественные формы ферментов. Множе ственность молекулярных форм ферментоп мо жет быть обусловлена различными причинами.
Она может быть закодирована генетически, тогда такие множественные формы называют изоферментами, и может быть обусловлена ге терогенностью полипептидных цепей (например, ЛДГ), различием в аминокислотном составе фермента (например, для АсАТ). Множествен ность молекулярных форм Ч более широкое по нятие, чем изоферменты, она может быть обу словлена различным строением небелковой части молекулы (например, ЩФ), конформа ционной изомерией (например, МДГ) и другими факторами. Изоферментами обозначают группу ферментов из организма одного и того же биоло * д Ч день.
гического вида, обладающих одним типом суб минесцентные методы с применением люцифе- стратной специфичности, но отличающихся по рин-люциферазной системы. Из перечисленных физико-химическим и иммунологическим свой методов наиболее широкое клиническое приме- ствам. Изоферменты отличаются друг от друга по кинетическим свойствам (отношение к инги нение находят спектрофотометрические методы.
Оптический тест Варбурга лежит в основе мето- биторам, активаторам, сродство с субстратом).
дических принципов, заложенных в большинство Для большинства ферментов установлено су выпускаемых коммерческих наборов реактивов. ществование множественных форм. Важность Для определения активности ферментов при- изучения изоферментов для диагностики была меняют фотометрические методы, основанные на впервые установлена в 1957 г. для ЛДГ. Изо образовании окрашенных соединений с продук- ферменты способны образовывать комплексы с иммуноглобулинами, липидами, липопротеина тами ферментативной реакции. Как правило, измерение проводят по конечной точке, что явля- ми и другими компонентами сыворотки, что ется недостатком методов этой группы, и точ- может менять их электрофоретическую подвиж ность их ниже, чем методов, основанных на опти- ность.
ческом тесте Варбурга. Исключение составляют Методы определения изоферментов. К ним методы, в которых в ходе реакции непосред- относятся электрофоретические методы на раз ственно из субстрата образуется окрашенное личных носителях, хроматографические, им соединение. мунологические;
методы, основанные на опреде Материал исследования. Наиболее часто ак- лении субстратного оптимума изоферментов;
тивность ферментов определяют в сыворотке, термическое инактивирование;
ингибирование различными веществами;
методы, основанные на плазме, моче, клетках крови. Для большинства различном сродстве изоферментов к субстратам.
ферментов не имеет принципиального значения, Наиболее распространены электрофоретические определяется ли активность фермента в плазме или сыворотке крови. Это имеет значение для тех методы определения изоферментов на различ ферментов, которые содержатся в тромбоцитах, ных носителях: бумаге, крахмальном геле, плен Рис. 8. Схема расположения некоторых изоферментов сыворотки крови при электрофорезе на бумаге или ацетатцеллюлозе.
1,2,3,4,5 Ч соответствующие изоферменты ЛДГ Ч ЛДГ1. ЛДГ2, ЛДГ3, ЛДГ4, ЛДГ5;
П Ч печеночный изо фермент ЩФ;
ММ Ч мышечный изофермент К.К;
ВВ Ч мозговой изофермент К.К;
Мнт Ч митохондриальный изофермент АсАТ;
- Ч цитоплазматический изофермент АсАТ;
Пж Ч поджелудочный изофермент а-ами лазы;
Сл Ч слюнной изофермент а-амилазы.
ках из ацетата целлюлозы, полиакриламидном методы для ряда ферментов, а также требова геле (рис. 8). Хроматографические методы осно- ния к референтным материалам для измерения ваны на разной степени адсорбции изофермен- активности ферментов '. В рамках рабочей тов. группы экспертов стран Ч членов СЭВ также Иммунологическая дифференциация изо- разработаны правила определения активности ферментов предусматривает применение специ- ферментов.
фических антисывороток. Электрофореграммы Согласно разработанным рекомендациям различных ферментов представлены на рис. 8. номенклатура ферментов должна употребляться Стандартизация и унификация методов опре- в соответствии с рекомендациями (1972) Комис деления активности ферментов предусматривает сии Международного биохимического союза по выбор и оценку унифицированных методов для номенклатуре и классификации ферментов (с до практической работы в клинико-диагностиче- полнениями по 1975 г.);
определение активности ских лабораториях, разработку наиболее точ- ферментов рекомендуется проводить в оптимизи ных, референтных (эталонных) методов. Рефе- рованных условиях с кинетическим измерением;
рентные методы предназначаются для оценки предпочтительная температура измерения 30 С, аналитической надежности унифицированных колебания ее не должны превышать 0,05 С.
методов, для оценки качества рефе- Активность ферментов выражается в моль/ рентных и контрольных материалов, они /(с Х л);
мкмоль/(с Х л);
нмоль/(с Х л). Между также могут быть использованы для прак- народная единица (ME) Чмкмоль/(мин Х л) тической работы в клинико-диагностических соответствует 16,67 нмоль/(с-л) ;
единица, лабораториях. Референтные методы для фер- используемая в унифицированных методах Ч ментов разрабатываются на основе: оптимиза- мкмоль/(ч Х мл) соответствует 278 нмоль/(с Х л).
ции параметров реакции, стандартизации усло вий измерения;
установления необходимой степени чистоты реактивов и калибровочных материалов, требований к точности приборов;
оценки аналитической надежности методов.
IFCC. Committee on Standarts. Expert Международной федерацией клинической химии Panel on Enzymes, 1975, 1976, 1977, 1979.
(МФКХ) разработаны общие требования к из IFCC. Scientific Committee. Expert Panel on мерению активности ферментов и референтные Enzymes, 1980, 1981.
межлабораторных экспериментов и проверки ка Комиссия по величинам и единицам МФКХ и Международного союза теоретической и при- чества методов.
кладной химии предложила именовать величину Ли т е р а т у р а. Номенклатура ферментов.
нмоль/(с Х л) каталом. Поскольку присвоение Рекомендации (1972) Международного биохи производным единицам собственных наименова мического союза по номенклатуре и классифи ний может производиться только в соответствии кации ферментов, а также по единицам фермен с решением Генеральной конференции по мерам тов и символам кинетики ферментативных ре и весам, то до такого решения наименование акций.ЧМ.: ВИНИТИ, 1979.Ч320;
Вилкинсон катал Ч неприемлемо.
Д. (Wilkinson J. Н.). Принципы и методы ди Вопросами выбора методов определения агностической энзимологии/Пер. с англ.Ч активности ферментов успешно занимаются, по М.: Медицина, 1981.Ч624 с.
мимо международных организаций, многие на циональные комитеты. Созданы Комиссии по 5.2.2. Аминотрансферазы ферментам Американской ассоциации Клиниче ской химии (США), Немецкого общества клини Аспартатаминотрансфераза Ч АсАТ (L-ac ческой химии (ФРГ), Скандинавский комитет партат: 2-оксоглутарат аминотрансфераза;
по ферментам, Английская рабочая группа по К. Ф. 2.6.1.1) катализирует обратимый перенос ферментам. Комиссии по ферментам работают аминогрупп с L-аспарагиновой кислоты на а-ке в Австрии, Канаде, Франции, Италии, Японии.
тоглутаровую.
Помимо выбора метода, важным направле Аланинаминотрансфераза Ч ААТ (L-ала нием в деятельности вышеуказанных организа нин: 2-оксоглутарат аминотрансфераза;
К. Ф.
ций является разработка референтных материа 2.6.1.2) катализирует обратимый перенос амино лов для методов определения активности фер групп с L-аланина на а-кетоглутаровую кислоту.
ментов, определение их стабильности, чистоты и возможность их применения для проведения Реакция, катализируемая АсАТ:
Ферменты открыты советскими учеными А. Е. с соавт. Наиболее распространенным динитро Браунштейном и М. Г. Крицман. АсАТ и ААТ фенилгидразиновым методом является метод обнаружены во всех исследованных к настояще- Райтмана Ч Френкеля (1956), в котором опре му времени тканях человека и животных. АсАТ деляют окрашенные динитрофенилгидразоны состоит из изоферментов: цитоплазматического щавелевоуксусной и пировиноградной кислот без и митохондриального, каталитические свойства экстракции их толуолом в отличие от метода которых различны. Митохондриальная форма Тонгази. Метод Бабсона, принцип которого фермента имеет более высокие величины К, для основан на образовании щавелевоуксусной кис а-кетоглутарата и более низкие для L-acnap- лотой с солями диазония окрашенного продукта тата. реакции, прост по исполнению, дает надежные Методы определения аминотрансфераз осно- результаты, но пригоден только для определения ваны главным образом на определении скорости АсАТ. Методы определения глутаминовой кисло образования пировиноградной и щавелево- ты с помощью бумажной хроматографии трудо уксусной кислот, так как нет простых способов емки и применяются главным образом в научных определения L-аспарагиновой, а-кетоглутаро- исследованиях. Манометрические методы трудо вой кислот и L-аланина. Для определения актив- емки и не применяются в клинических лабора ности АсАТ и ААТ наиболее распространен- ториях. Флуориметрические методы высокочув ными являются спектрофотометрические и коло- ствительны и точны, но требуют специального риметрические методы. оборудования. Методы с в-гидроксибензальде Первые спектрофотометрические методы, гидом и ванилином не нашли применения из-за основанные на оптическом тесте, были предло- низкой специфичности.
жены для АсАТ А. Кагтеп в 1955 г., для Оптимизация условий определения и унифи ААТ Ч F. Wroblewski, J. La Due в 1956 г. кации методов. В большинстве стран в качестве В последующем эти методы были модифициро- стандартного предлагаются методы, основанные ваны и оптимизированы. на оптическом тесте. Различия в национальных Первый динитрофенилгидразиновый метод рекомендациях по стандартизации методов ка определения АсАТ и ААТ описан N. Н. Tongasi саются не принципа метода, а оптимизирован ных условий измерения. За исключением метода Советском Союзе в 1972 г. утвержден МФКХ, ни в одном стандартном методе не в качестве унифицированного модифицирован добавляется в инкубационную среду пиридо- ный метод Райтмана Ч Френкеля. В качестве ксаль-5-фосфат, являющийся коферментом для наиболее точных рекомендованы оптимизи АсАТ и ААТ. Добавление его в инкубацион- рованные методы, основанные на оптическом ную среду позволяет увеличить чувствитель- тесте Варбурга.
ность метода. Степень активации зависит от АсАТ. Унифицированный метод по оптими многих факторов: вида буфера, концентрации зированному оптическому тесту. П р и и ц и и.
субстрата, концентрации апофермента, содер- Различие спектров поглощения окисленной и жания витамина B6 в организме. восстановленной форм NAD при 340 им.
1. Основная реакция:
фическая каталитическая активность выше Равновесие реакции сдвинуто вправо.
Ре а к т и в ы. 1. Калия фосфат однозаме- 17 ммоль/(с-л). Примеси: АсАТ<0,01%, ГДГ < 0,003 %, ЛДГ < 0,01 %. Для приго щенный (КН2РО4) х. ч., ч. д. а. 2. Калия товления рабочего раствора к 20 мкл суспензии фосфат двузамещенный (К2НРО4 Х ЗН2О) ч.д.а.
3. L-Аспарагиновая кислота или L-аспараги- добавляют 5 мл воды. 9. Лактатдегидрогеназа из скелетной мышцы кролика или свиньи. Сус новой кислоты натриевая соль. 4. Фосфатный буфер 0,1 моль/л, рН 7,4: 0,16 г однозамещен- пензия в 50 % растворе глицерина. Специфи ческая каталитическая активность выше 8 ммоль/ ного фосфата калия и 2,07 г двузамещенного /(с фосфата калия трехводного растворяют в 40Ч - л). Примеси: АсАТ < 0,01 %, ГДГ < 60 мл воды, проверяют рН и доводят водой в < 0,003 %, ААТ < 0,01 %. Для приготовле ния рабочего раствора к 40 мкл суспензии добав мерной колбе до 100 мл. Стабилен при хранении в холодильнике. 5. Субстратно-буферный раст- ляют 5 мл воды. Стабилен в течение 3 мес при вор 0,25 моль/л L-аспарагиновой кислоты в хранении в холодильнике в хорошо укупоренной посуде. 10. Натр едкий, 5 моль/л;
1 моль/л.
0,1 моль/л фосфатном буфере рН 7,4: 3,30 г L-аспарагиновой кислоты (или 3,9 г натриевой 11. Натрия хлорид, 154 ммоль/л (физиологи ческий раствор).
соли L-аспарагиновой кислоты) растворяют в 40Ч50 мл 0,1 моль/л фосфатного буфера, про веряют рН и доводят фосфатным буфером в Пр и м е ч а н и е. Для определения актив мерной колбе до 100 мл. Если применяют L-acna ности АсАТ и ААТ по оптическому тесту рагиновую кислоту, то к навеске перед растворе используют отечественные реактивы квали нием в фосфатном буфере для установления фикации х.ч. или ч.д.а. или импортные, рН 7,4 добавляют л20Ч26 мл 1 моль/л раство например, можно использовать реактивы ра едкого натра и затем проверяют рН. Стабилен фирмы Reanal (ВНР). Реактивы квалифи при хранении в холодильнике в течение месяца.
кации ч. непригодны. Все реактивы готовят 6. в-Никотинамидадениндинуклеотид восста на бидистиллированной воде, хранят при новленный, динатриевая соль, 15 ммоль/л: 16 мг температуре от 0 до +4 С. Уменьшение NADH-Na -4H O растворяют в 1,5 мл воды.
2 стабильности может наступить за счет роста Раствор стабилен в течение 2 нед при хранении микроорганизмов. Поэтому в растворы ре в темной посуде в холодильнике. Коэффициент комендуется добавлять несколько капель молярного поглощения не ниже 5,6 Х 10 2 м 2 X хлороформа.
X моль-1 при 340 нм. 7. а-Кетоглутаровая кислота, 0,45 моль/л: 0,2 г а-кетоглутаровой Сп е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а н и е.
кислоты растворяют в 2,5 мл воды и добавляют Спектрофотометр с термостатированной кюве 0,5 мл 5 моль/л раствора едкого натра. Если той. Измерение проводят при 340 нм.
используют динатриевую соль а-кетоглутаровой Ма т е р и а л д л я и с с л е д о в а н и я.
кислоты, то 0,26 г соли растворяют в 3 мл воды. Сыворотка крови или плазма, свободные от Раствор стабилен в течение 2 нед при хранении гемолиза.
в холодильнике. а-Кетоглутаровая кислота не Ход о п р е д е л е н и я. Перед определени должна содержать примесей пирувата и мала- ем температура растворов и сыворотки должна та. 8. Малатдегидрогеназа из сердца свиньи быть доведена до температуры измерения. Пе (L-малат: NAD+ оксидоредуктаза;
К. Ф. 1.1.1.37). ред работой можно готовить смесь реактивов, Суспензия в 50 % растворе глицерина. Специ- состоящую из субстратно-буферного расмтра.
раствора NADH, МДГ и ЛДГ в соотношении Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы : от 30 до 60: 1 : 1 : 1. Определение проводят по следую- 420 нмоль/ (с -л) ((от 2 до 25 ME)] при 30 С.
щей схеме.
Пр и м е ч а н и е. Определение активности фермента можно проводить по микрометоду.
В термостати- Опыт- Холо Для этого перед работой готовят смесь ре Конечная кон рованную ная стая центрация ве- активов, состоящую из субстратно-буферно кювету проба, проба, ществ в пробе го раствора, растворов NADH, ЛДГ, МДГ приливают мл мл в соотношении 60: 1 : 1 : 1. Опытная проба включает смесь реактивов Ч 0,630 мл, сыво Субстратно- 3,0 3,0 Фосфатный бу- ротку Ч 0,10 мл, а-кетоглутаровую кисло буферный фер - ту Ч 0,02 мл. Холостую пробу ставят так раствор м моль/л же, как опытную, но вместо сыворотки до L-Аспарагино- бавляют 154 ммоль/л раствор хлорида натрия.
вая кислота Ч Определение проводят по той же схеме, что и 200 ммоль/л в макрометоде.
NADH-раст- 0,05 0,05 0,18 ммоль/л вор ААТ. Унифицированный метод по оптими МДГ-суспен- 0,05 0,05 10000 нмоль/ зированному оптическому тесту. П р и н ц и и зия /(с-л) тот же, что для АсАТ.
ЛДГ-суспен- 0,05 0,05 10000 нмоль/ 1. Основная реакция:
зия /(с-л) Сыворотка Ч 0, крови 154 м моль/л раствор хло рида натрия 0, Ч Перемешивают и оставляют стоять на 10 мин при 30 или 37 С Раствор а-ке- 0,1 0,1 12 ммоль/л Р е а к т и в ы. 1. Калия фосфат однозаме тоглутаровой щенный (KH PO ) ч.д.а., х.ч. 2. Калия фосфат кислоты 2 двузамещенный (К2НРО4 Х ЗН2О) ч.д.а. 3. Фос фатный буфер, 0,1 моль/л, рН 7,4: 0,16 г одно замещенного фосфата калия и 2,07 г двузаме щенного фосфата калия трехводного растворя Перемешивают и через 60 с (лаг-фаза) изме ют в 40Ч60 мл воды, проверяют рН и доводят ряют экстинкцию и одновременно включают водой в мерной колбе до 100 мл. Стабилен при секундомер. Точно через 1, 2, 3 мин (или через хранении в холодильнике. 4. 1.-а-Аланин. 5.
более короткие, но равные промежутки времени) Субстратно-буферный раствор, 0,63 моль/л L измеряют экстинкцию.
аланина в 0,1 моль/л фосфатном буфере, рН 7,4:
Поправку на холостой опыт проводят по 5,62 г L-аланина растворяют в 80 мл 0,1 моль/л формуле:
фосфатного буфера, проверяют рН и доводят фосфатным буфером в мерной колбе до 100 мл.
Стабилен в течение 2 мес при хранении в холо дильнике. 6. р-Никотинамидадениндинуклеотид восстановленный, динатриевая соль, 15 ммоль/л (коэффициент молярной экстинкции не ниже 5.6 Х 102 м2 Х моль-1 при 340 нм) : 16 мг Скорректированную величину опытной про- NADH-Na -4H O растворяют в 1,5 мл воды.
2 бы используют в дальнейших расчетах. Раствор стабилен в течение 2 нед при хранении Ра с ч е т производят по формуле:
в темной посуде в холодильнике. 7. Натр едкий, активность, моль/(с Х м3) = нмоль/(с-л) Х 106 = 5 моль/л. 8. а-Кетоглутаровая кислота, 0,56 моль/л:
0,245 г а-кетоглутаровой кислоты растворяют в 2,5 мл воды и добавляют 0,5 мл 5 моль/л раствора едкого натра. Если используют ди натриевую соль а-кетоглутаровой кислоты, то 0,318 г соли растворяют в 3 мл воды. Раствор стабилен в течение 2 нед при хранении в холо где Vf с.Ч объем реакционной смеси, мл;
дильнике. 9. Лактатдегидрогеназа из скелетной VennЧ объем сыворотки, мл;
/ Ч время реак мышцы кролика или свиньи, суспензия в 50 % растворе глицерина. Специфическая каталити изменение экстинкции за 1 с;
ческая активность выше 8 ммоль/(с Х л). При F Ч коэффициент молярной экстинкции \Л1)Н меси: АсАТ < 0,01 %, ГДГ < 0,003 %, ААТ < 0,01 %. Для приготовления рабочей) раствора к 45 мкл суспензии добавляют 5 мл кювете в метрах воды. Стабилен в течение 3 мес при хранении Условные обозначения те же, что для опре в холодильнике. 10. Натрия хлорид, 154 ммоль/л деления АсАТ.
(физиологический раствор). Все реактивы Но р ма л ь н ые в е л и ч и н ы: от 30 до лучше готовить на бидистиллированной воде. 420 нмоль/(с Х л) [(от 2 до 25 ME)] при 30 С.
Сп е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а н и е т о Пр и м е ч а н и е. Определение активности ж е, что для АсАТ.
фермента можно проводить по микрометоду.
Ма т е р и а л и с с л е д о в а н и я. Свежая Для этого перед работой готовят смесь ре сыворотка или плазма крови, свободные от гемо активов, состоящую из субстратно-буферно лиза. Фермент стабилен при 4 С в течение го раствора, растворов NADH и ЛДГ суток.
в соотношении 60 : 1 : 2. Опытная проба Ход о п р е д е л е н и я. Перед определени включает: смесь реактивов Ч 0,630 мл;
сы ем температура растворов и сыворотки должна воротку - 0,10 мл;
а-кетоглутаровую кисло быть доведена до температуры измерения. Перед ту Ч 0,02 мл. Определение проводят по той работой можно готовить смесь реактивов, сос же схеме, что и в макрометоде.
тоящую из субстратно-буферного раствора, Оц е н к а а н а л и т и ч е с к о й на д е ж раствора NADH и ЛДГ в соотношении 60 : 1 : 1.
н о с т и ме т о д ов. Коэффициенты вариации Определение проводят по следующей схеме.
2Ч6 %. При использовании реактивов, сво бодных от ингибиторов, и точного спектрофото В термостати- Опыт- Холо- Конечная метра метод дает правильные результаты.
рованную ная стая концентрация Реакции для АсАТ и ААТ линейны до величины кювету про- про- веществ приливают ба, мл ба, мл в пробе активности 4000 нмоль/(с -л).
Ли т е р а т у р а. Делекторская Л. Н. В. кн.:
Субстратно-бу- 3,0 3,0 Фосфатный бу- Унификация лабораторных методов исследова ферный раствор фер Ч 80 ммоль/л ния / Под ред. В. В. Меньшикова.Ч М., 1978, L-Аланин Ч вып. VIII, с. 83Ч89;
Bergmeycr //. U. (Hrsg.) 500 ммоль/л Methoden der enzymatischen Anal yse. Wein NADH-раствор 0,05 0,05 0,18 ммоль/л hei m/Ver l ag Chemie, 1974, Bd 1, S. 769Ч775, ЛДГ 0,1 0,1 20 000 нмоль/ 785Ч792;
Karmen A..}. Cl i n. Invest., 1955, (с-л) vol. 34, p. 131;
Wrobtewski F., La Due J. S.
Сыворотка кро- 0,5 Ч Proc. Soc. exp. biol. Med., 1956, vol. 91, p. 569Ч 571.
ви 154 ммоль/л раствор хлори Унифицированный динитрофенилгидразино да натрия Ч 0, вый метод Райтмана Ч Френкеля. Пр и н ц и п.
В результате переаминирования, происходящего Перемешивают и оставляют стоять на 10 мин под действием АсАТ и ААТ, образуются щаве при 30 или 37 С левоуксусная и пировинОградная кислоты. При добавлении 2,4-динитрофенилгидразина в ще Раствор а-кето лочной среде образуются окрашенные гидразо глутаровой кис ны пировиноградной и щавелевоуксусной кислот.
лоты 0,1 0,1 15 ммоль/л Ре а к т и в ы. 1. Натрия фосфат двузаме щенный (Na2HPO4), 0,1 моль/л: 14,2 г Na2HPO, доводят до 1 л водой. 2. Калия фосфат одно Перемешивают, через 60 с (лаг-фаза) изме замещенный, 0,1 моль/л: 13,60 г КН2РО4 до ряют экстинкцию и одновременно включают се водят до 1 л водой. 3. 0,1 моль/л фосфатный кундомер. Точно через 1, 2, 3 мин (или через буфер рН 7,4: смешивают 840 мл 0.1 моль/л более короткие, но равные промежутки времени) раствора Na2HPO4 и 160 мл 0,1 моль/л раствора измеряют экстинкцию. Измерение опытной и КН2РО4. Полученный раствор с индикатором холостой проб проводят против воды при 340 нм бромтимоловым синим должен давать голубую в кювете с толщиной слоя 1 см.
окраску. Величину рН буфера доводят под контро Поправку на холостой опыт проводят по лем рН-метра. К приготовленному раствору в формуле:
качестве консерванта можно добавить 5Ч10 мл хлороформа. 4. Натр едкий, 0,05 моль/л;
1 моль/л.
5. Бромтимоловый синий, 0,04 % раствор: мг индикатора растирают в ступке с 3,2 мл 0,05 моль/л раствора едкого натра. После раст ворения смывают водой в мерную колбу вмести Скорректированную величину опытной про- мостью 250 мл и доводят водой до метки. 6. DL бы используют в дальнейших расчетах. Аспарагиновая кислота или I.-аспарагиновая кислота *. 7. DL-Аланин или L-аланин *. 8. а Ра с ч е т производят по формуле:
* Если берется вместо DL-аспарагиновой кислоты L-аспарагиновая, а вместо DL-аланина L-аланин, то навеска уменьшается вдвое.
Кетоглутаровая кислота. 9. Субстратный раст- Ра с ч е т активности ферментов в сыворотке вор для определения АсАТ: 29,2 мг а-кетоглута- крови производят по калибровочному графику.
ровой кислоты и 2,66 г DL-аспарагиновой Построение калибровочного графика: из кали кислоты растворяют в 1 моль/л растворе едкого бровочного раствора готовят ряд разведений, натра. Едкий натр следует прибавлять осторож- как указано ниже.
но, небольшими порциями, до полного растворе ния составных частей и до получения рН 7,4.
Активность Раствор переливают количественно в мерную Ди Пировино Калибро фермента, стил колбу вместимостью 100 мл, ополаскивая 0,1 моль/л градная № вочный нмоль/ лиро фосфатным буфером рН 7,4. Доливают буфер кислота про- раствор (с-л) ван в колбу до метки, тщательно перемешивают, бир- пирувата ная ки натрия, прибавляют 1 каплю хлороформа и сохраняют мл АсАт, ААТ мкг МКМПЬ в холодильнике в замороженном виде. Перед мл употреблением замороженный раствор должен полностью оттаять (повторное оттаивание не 1 0,05 0,55 4,4 0,05 рекомендуется). 10. Субстратный раствор для 2 0,1 0,5 8,8 0,1 определения ААТ: 29,2 мг а-кетоглутаровой 13, 3 0,15 0,45 0,15 кислоты и 1,78 г DL-аланина отвешивают на 4 0,2 0,4 17,6 0,2 аналитических весах. Дальнейшая работа про 5 0,25 0,35 22,0 0,25 водится так же, как для субстратного раствора АсАТ. 11. HCI 1 моль/л. 12. Раствор 2,4-динитро фенилгидразина: 19,8 мг 2,4-динитрофенилги дразина растворяют в небольшом количестве Калибровочные пробы ставят так же, как 1 моль/л раствора HCI при нагревании на водя опытные, но вместо сыворотки добавляют разве ной бане. После охлаждения доводят объем денные калибровочные растворы. Измеряют НС1 до 100 мл. На следующий день реактив против холостой пробы, в которую вместо ка фильтруют. Раствор стабилен при хранении в либровочных растворов добавляют воду. Кали холодильнике в посуде из темного стекла. 13. Натр бровочная кривая линейна до величины экстинк едкий, 0,4 моль/л, свободный от карбонатов.
ции 0,3.
Бутыли с реактивом и водой закрывают пробка Но р ма л ь н ые в е л ич ины: для АсАТ, ми с поглотительными трубками, наполненными ААТ 28Ч190 нмоль/(с-л) [0,1Ч0,68 мкмоль/ натронной известью. 14. Пировинограднокислый (ч-мл)] при 37 С.
натрий. Для приготовления калибровочного Оц е н к а а н а л и т и ч е с к о й на д е ж раствора 11 мг кристаллического пирувата н о с т и ме т ода. Воспроизводимость: коэф натрия (белого цвета) растворяют в небольшом фициенты вариации составляют 2Ч6 % в зави количестве воды, переносят в мерную колбу симости от условий определения. Правильность вместимостью 100 мл и доводят объем раствора метода зависит в значительной степени от пра до метки водой;
1 мл раствора содержит 110 мкг вильного построения калибровочной кривой и пирувата натрия, что соответствует 88 мкг (или правильной постановки холостой пробы. Специ 1 мкмолю) пировиноградной кислоты.
фичность: абсорбционная способность гидразо Ма т е р и а л д л я и с с л е д о в а н и я.
на щавелевоуксусной и пировиноградной кислот Сыворотка крови, свободная от гемолиза.
выше, чем гидразона а-кетоглутаровой кислоты Ход о п р е д е л е н и я Ас АТ. Опытная при 500 нм. Интерференция: ацетилсалициловая проба: в пробирку вносят 0,5 мл субстратного кислота (аспирин), барбитураты, пенициллин, раствора для определения АсАТ, нагревают при опиаты завышают результаты во всех методах.
37 С в течение 5 мин, добавляют 0,1 мл сы Ли т е р а т у р а. Reltman S., Frankel S.
воротки и инкубируют при 37 С 30 мин.
Amer. J. Cl i n. Pathol., 1957, vol. 28, p. 56.
Затем добавляют 0,5 мл раствора Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Несмотря 2,4-динитрофенилгидразина и выдерживают в на отсутствие органной специфичности, опреде течение 20 мин при комнатной температуре.
ление АсАТ и ААТ при заболеваниях печени Добавляют 5 мл 0,4 моль/л раствора едкого и сердца имеет большую диагностическую цен натра, тщательно перемешивают и оставляют ность. При инфаркте миокарда активность АсАТ для развития окраски на 10 мин при комнатной в сыворотке крови повышена: активность воз температуре. Измеряют на ФЭКе при длине растает через 4Ч6 ч после инфаркта миокарда волны 500Ч560 нм (зеленый светофильтр) в и снижается до нормы на 3Ч7-й день.
кювете с толщиной слоя 1 см против холостой Особенно важное значение имеет определе пробы.
ние аминотрансфераз для раннего выявления Холостую пробу ставят так же, как опытную, гепатита. Острый гепатит сопровождается рез но сыворотку добавляют после инкубации.
ким повышением ААТ;
АсАТ при этом также Ход о п р е д е л е н и я Ал АТ. В пробир- повышена, но обычно ниже активности ААТ.
ку вносят 0,5 мл субстратного раствора ААТ Активность ААТ начинает увеличиваться уже и нагревают при 37 С в течение 5 мин. Затем в продромальной стадии, когда другие признаки вносят 0,1 мл сыворотки и инкубируют при болезни еще не появились. Коэффициент Де 37 С 30 мин. Дальнейший ход анализа осу- Ритиса АсАТ/ААТ < 1. При тяжелом пораже ществляют так же, как и при определении нии печени соотношение активности ферментов АсАТ, меняется.
5.2.3. а-Амилаза литические и иммунологические свойства, незна чительно отличаются по электрофоретической а-Амилаза (1,4-а-D-глкжан глюканогидро- подвижности, но разделяются при гель-фильтра лаза, К. Ф. 3.2.1.1) Ч один из первых открытых ции на ДЭАЭ-сефадексе.
ферментов;
катализирует эндогидролиз а-1,4- Методы определения а-амилазы в биологи глюкозидных связей крахмала, гликогена и род- ческих жидкостях.основаны на различных прин ственных им полисахаридов до мальтозы, ципах: сахарифицирующие или редуктометри декстринов и других полимеров. У человека ческие методы Ч на определении образующихся а-амилаза секретируется поджелудочной и слюн- из крахмала Сахаров (метод Энгельгардта Ч ными железами, небольшая ее активность об- Герчука, 1925);
амилокластические Ч на опре наруживается в тканях печени и скелетной делении остатка нерасщепленного крахмала по мускулатуры. Молекулярная масса а-амилазы степени интенсивности его окраски с йодом (ме относительно низкая (~ 48000);
в отличие от тоды Самоги, Смита Ч РОЭ, Каравея). Амило большинства ферментов она фильтруется в кластические методы более чувствительны и клубочках почек и содержится в моче. а-Амила- специфичны, чем редуктометрические, но также за состоит из двух изоферментов: панкреати- не лишены недостатков: точность их во многом зависит от качества крахмала и оптимизации ческого (Р-тип) и слюнного (S-тип), каждый условий определения.
из которых делится на несколько фракций.
Изоферменты происходят соответственно из под- Вискозиметрические методы основаны на желудочной и слюнной желез. Существует измерении вязкости суспензии крахмала. Они также макроамилаза, которая не выделяется не отличаются высокой точностью и редко при почками из-за большой величины молекулы, но меняются. Методы с применением хромогенных может встречаться в сыворотке крови в норме субстратов основаны на использовании. ком и при патологии. У здоровых людей в сыворотке плексов субстрат-краситель, которые под дей крови около 70 % амилолитической активности ствием а-амилазы распадаются с образованием приходится на слюнной изофермент, в моче водорастворимого красителя. К новым методам приблизительно такой же процент приходится определения активности а-амилазы относятся на панкреатическую изоамилазу. Два изофер- методы, основанные на сопряженных фермент мента а-амилазы имеют почти идентичные ката- ных реакциях.
Наиболее перспективными являются фото- быть использованы также амилоза, мальто метрические методы с применением субстра- триоза. Оптимум рН действия фермента на тов Ч п-нитрофенилмальтозида или п-нитрофе- ходится в пределах значений от 6,5 до 7,5.
нилмальтогептозида. Активность фермента значительно возрастает в Зарубежными фирмами выпускаются наборы присутствии ионов хлора. В молекулу а-амилазы реактивов с применением хромогенных субст- входит атом кальция. Ионы кальция не только ратов;
реже наборы реактивов, основанные на активизируют а-амилазу, но и предохраняют сопряженных ферментных реакциях. Для опре- ее от потери активности и распада под влиянием деления изоферментов а-амилазы наиболее протеолитических ферментов.
точными являются электрофоретические Ингибирование активности а-амилазы фто методы. ридами, цитратом, оксалатом и ЭДТА объясня Оптимизация условий определения и унифи- ется связыванием ионов кальция. Вид буфера кация методов. В качестве субстрата в методах не влияет на активность фермента. В большинст определения а-амилазы чаще всего применяют ве стран применяются в качестве стандартных крахмал. Крахмал-полисахарид, состоящий на амилокластические методы. В СССР в 1972 и 10Ч20% из амилозы, имеющей 1,4-глюкозид- 1974 гг. утверждены в качестве унифицирован ные связи и растворимой в воде, и амилопек- ных два амилокластических метода: Смита Ч тина, нерастворимого в воде, имеющего, кроме Роя и Каравея.
того, 1,6-глюкозидные связи. Содержание Унифицированный амилокластический метод амилозы в различных препаратах крахмала со стойким крахмальным субстратом (Каравея).
варьирует, поэтому качество крахмала имеет П р и н ц и п. а-Амилаза гидролизует расщепле большое значение. Предпочтительнее использо- ние крахмала с образованием конечных про вать крахмал, обладающий лучшей раствори- дуктов, не дающих цветной реакции с йодом.
мостью и дающий наивысшую интенсивность Об активности а-амилазы судят по уменьше окраски с иодом. В качестве субстрата мшгут нию интенсивности окраски.
Р е а к т и в ы. 1. Бензойная кислота ч.д.а. где Е Ч экстинкция холостой пробы;
Е Ч 1 или х.ч. 2. Натрия фосфат двузамещенный без- экстинкция опытной пробы;
С Ч количество водный (Na HPO ) ч.д.а. 3. Крахмал раствори- крахмала, введенного в опытную и холостую 2 мый для нефелометрии или крахмал по Lintner. пробы (0,2 мг в микроварианте);
/ Ч коэффи Крахмал по Lintner выпускается зарубежными циент пересчета на 1 с инкубации;
К Ч коэф фирмами специально для использования его фициент пересчета на 1 л биологической жид в качестве субстрата при определении а-амила- кости с учетом разведения.
зы. 4. Натрия хлорид, 0,154 моль/л. 5. Субстрат- Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы. Сыворотка но-буферный раствор рН 7,0: 13,3 г Na HPО крови: 3,3Ч8,9 мг/(с Х л), или 12Ч32 мг/(ч Х мл).
2 и 2 г бензойной кислоты растворяют в 250 мл Моча: до 44 мг/(с Х л), или до 120 мг/(ч Х мл).
0,154 моль/л хлорида натрия и доводят до Дуоденальное содержимое: 1,7 -4,4 г/(с Х л), кипения. Суспендируют 0,2 г растворимого крах- или 6Ч16 г/(ч Х мл). Коэффициент пересчета мала в небольшом количестве холодной воды в единицы СИ Ч мг/(с Х л) Ч равен 0,278.
и вводят в кипящий буферный раствор. Кипятят В о с п р о и з в о д и м о с т ь. Коэффициент 1 мин, охлаждают и доводят водой до 500 мл. вариации 5Ч10 %. Линейность реакции сохра Стабилен при хранении при комнатной темпера- няется в течение 10 мин.
туре в течение 10Ч12 дней. Субстратно-буфер Ли т е р а т у р а. Caraway W. Т. Атег. J.
ный раствор должен быть прозрачным. 6. Калия din. Pathol., 1959, vol. 32, p.'97.
йодид ч.д.а., х.ч. 7. Калий йодноватокислый ч.д.а., х.ч. 8. Калия фторид ч.д.а. 9. HCI кон- К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Гиперами центрированная, х.ч. 10. 0,01 н. раствор йода: лаземия и гиперамилазурия наблюдаются при 0,036 г йодноватокислого калия и 0,45 г йодида многих заболеваниях, но наиболее выражены калия растворяют в 40 мл воды и медленно при при остром панкреатите, при котором активность помешивании добавляют 0,09 мл концентри- увеличивается в основном (до 90 % и более) рованной НС1. 5 г фторида калия растворяют за счет панкреатического изофермента. При дан в 50 мл воды, фильтруют в мерную колбу, ном заболевании наибольший подъем содержа приливают 40 мл раствора йода и доливают ния амилазы в крови и моче отмечен в первые водой до 100 мл. Хранят в посуде из темного 1Ч3 сут. Гиперамилазурию панкреатического стекла. Годен в течение месяца. Если в рабочий происхождения вызывают также такие заболе раствор йода не добавляют фторид калия, то вания, как вирусный гепатит, рак поджелудоч его следует готовить ежедневно. ной железы. К гиперамилаземии непанкреати ческого происхождения относят поражение Ма т е р и а л дл я и с с л е д о в а н и я.
слюнных желез, почечную недостаточность.
Свежая сыворотка или плазма крови, моча или дуоденальное содержимое, предварительно раз- Причинами повышения а-амилазы в крови веденное 154 ммоль/л раствором хлорида натрия являются нарушение секреции желез, содержа в 100 раз. щих а-амилазу, недостаточность выделения Ход о пр е д е л е ния. Ми к р о в а р и а н т. почками амилазы из организма. Имеется ряд Опытная проба: 0,5 мл субстратно-буферного заболеваний, при которых трудно объяснить раствора помещают в пробирку, нагревают наличие гиперамилаземии: холецистит, перито 5 мин при 37 С, добавляют 0,01 мл биологи- нит, ожог, острый аппендицит.
ческой жидкости. Инкубируют 7,5 мин при Гиперамилаземию вызывают многие фарма 37 С. Время инкубации следует строго отсчиты- кологические вещества Ч кортикостероидные вать по секундомеру с момента добавления био- препараты, силицилаты, тетрациклин, фуросе логической жидкости в крахмальный субстрат. мид, гистамин. Для а-амилазы крови характер Тотчас же после инкубации добавляют 0,5 мл ны широкие внутри- и межиндивидуальныс 0,1 н. раствора йода и доводят объем водой вариации. Наиболее информативным с диагно до 5 мл. Измеряют на ФЭКе в кювете с толщи- стической точки зрения является определение ной слоя 1 см при длине волны 630Ч690 нм панкреатической изоамилазы.
(красный светофильтр) против воды.
Холостую пробу ставят так же, как опытную, биологическую жидкость добавляют поело 5.2.4. у-Глутамилтрансфераза инкубации вместе с 0,1 н. раствором йода. Изме ряют при тех же условиях, что и опытную у-Глутамилтрансфераза [ (5-глутамил) пробу, против воды.
пептид: аминокислота 5-глутамилтрансфераза, Ма к р о в а р и а н т. Ход определения у-глутамилтранспептидаза;
К.Ф. 2.3.2.2] откры опытной и холостой проб тот же, что и при та в 1950 г.;
выделена и очищена в 1963 г.
микроварианте, но объем всех реактивов и ис- Фермент катализирует реакцию переноса у-глу следуемой жидкости увеличивают в 5Ч10 раз.
тамилового остатка глутамиловой кислоты на Ра с че т. Активность а-амилазы выражают акцепторный пептид или на L-аминокислоту.
в миллиграммах или граммах крахмала, гидро- у-ГТФ содержится почти во всех органах чело лизованного 1 л биологической жидкости за века, наибольшая удельная активность опре 1 с инкубации при 37 С. Расчет производят деляется в ткани почек. Фермент не является по формуле:
гомогенным, в зависимости от вида патологии активность а-а.милазы, мг/(с Х л) = количество фракций может меняться.
Методы определения активности у-ГТФ различаются по используемому субстрату. В пер вых методах применялись физиологические суб страты, например глутатион. Методы этой груп- в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят пы трудоемки, малочувствительны и имеют до метки водой и растворяют. Для определе лишь историческое значение. Позднее стали ния активности у-ГТФ можно пользоваться применяться методы, в которых использовались набором реактивов Лахема (ЧССР).
следующие субстраты: L-y-глутамилнафтила- Ма т е р иа л для и с с л е д о в а ни я. Сы мид;
L-v-глутамил-п-нитроанилид (методы воротка или плазма крови. Гемолиз не влияет Орловского и др.);
L-y-глутамиланилид (метод на активность фермента.
Гольдберга и др.). Наиболее распространены Ход о п р е д е л е н и я. Опытная проба: в методы с применением в качестве субстрата пробирку вносят 0,5 мл раствора субстрата и Ь-у-глутамил-п-нитроанилида. Позднее был помещают в водяную баню при температуре описан более быстрорастворимый субстрат Ч 37 С, приливают 0,05 мл сыворотки крови;
со производное Ь-у-глутамил-п-нитроанилида Ч держимое перемешивают и инкубируют точно Ь-у-глутамил-3-карбокси-4-нитроанилид. Дан- 15 мин при 37 С. Затем прибавляют 3 мл ный субстрат используется в наборах реактивов раствора уксусной кислоты и перемешивают.
фирмы Boehringer Mannheim (ФРГ). В ка- Холостую пробу ставят так же, как опытную, но сыворотку добавляют после инкубации. Изме честве буферов могут применяться трис-буфер, глицил глициновый, 2-амино-2-метил-1,3-про- ряют на спектрофотометре при длине волны 410 нм или на ФЭКе при длине волны 400Ч пандиоловый. Вид буфера почти не оказывает влияния на активность фермента. Преимуще- 500 нм (фиолетовый или синий светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см против холостой ство глицилглицинового буфера состоит в том, пробы. Окраска стабильна в течение нескольких что он одновременно является и буфером, и часов.
акцептором у-глутамилового остатка.
В СССР в 1979 г. в качестве унифицирован- Ра с ч е т активности производят по кали ного утвержден метод с субстратом L-y-глута- бровочной кривой. Построение калибровочной мил-п-нитроанилидом и глицилглициновым бу- кривой: из основного калибровочного раствора готовят рабочие растворы, как указано ниже.
фером.
Унифицированный метод с субстратом L-y глутамил-п-нитроанилидом. Пр и н ц и п. у-ГТФ Калибровоч- Активность катализирует реакцию переноса L-y-глутами- № калиб- Дистилли ный раствор у-ГТФ, ровочного рованная лового остатка с L-y-глутамил-п-нитроанилида п-нитроани- нмоль/ раствора вода, мл на глицилглицин. Количество освобожденного лина, мл (с-л) в ходе реакции n-нитроанилина измеряется и служит мерой активности у-глутамилтрансфе 1 0,25 3,75 разы:
2 0,50 3,50 3 1,00 3,00 1 4 1,00 1,00 5 1,50 0,50 6 2,00 Ч Р е а к т и в ы. 1. L-y-Глутамил-п-нитроани лид. 2. Натрия хлорид ч.д.а., х.ч. 3. Глицил- В каждую из 6 пробирок наливают по 0,05 мл глицин, 0,55 моль/л, рН 8,3 : 3,63 г глицилгли- рабочих калибровочных растворов № 1Ч6, прибавляют по 3,5 мл раствора уксусной кис цина помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доливают до метки водой и растворяют лоты,перемешивают и измеряют экстинкцию (буферный раствор). 4. Субстратно-буферный против раствора уксусной кислоты при тех же раствор: в пробирку наливают 10 мл воды и условиях, что и опытную пробу. По полученным добавляют 0,028 г L-y-глутамил-п-нитроанили- значениям экстинкции строят калибровочную да и 0,082 г хлорида натрия и, не переставая кривую. Линейность калибровочного графика сохраняется до активности 5000 нмоль/(с Х л).
мешать, растворяют содержимое пробирки на кипящей водяной бане в течение 60 с. Затем Но р ма л ь ные в е л ич ины. Мужчины:
раствор охлаждают до 37 С и добавляют 2,5 мл 250Ч1767 нмоль/(с-л), или 15Ч106 ME;
жен буферного раствора. Приготовленный раствор щины: 167ЧПО нмоль/(с-л), или 10Ч66 ME субстрата во время работы хранят в водяной при 37 С.
бане при 37 "С. Неиспользованный раствор суб- Во с п р о и з в о д и мо с т ь. Коэффициен страта можно хранить в холодильнике в течение ты вариации 1Ч4 %.
недели. Субстрат плохо растворим и при комнат- С п е ц и ф и ч н о с т ь. Расщепление у-глу ной температуре выпадает в осадок. Поэтому тамиловых пептидов другими пептидами не перед употреблением выкристаллизовавшийся известно.
субстрат растворяют нагреванием в кипящей Ли т е р а т у р а. Инструкция к набору водяной бане. Нагревание и растворение суб реактивов Био-Ла-Тест для определения актив страта можно повторить не более 2 раз. 5. Уксус ности у-глутамилтранспептидазы в сыворотке ная кислота ледяная ч.д.а., х.ч., раствор 100 г/л:
крови, Лахема ЧССР.
10 мл кислоты доводят водой до 100 мл.
6. Основной калибровочный раствор п-нитро- Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Несмотря на высокую активность у-ГТФ в почках, опре анилина: 0,0829 г n-нитроанилина помещают 7 п/р В. В. Меньшикова деление активности фермента в сыворотке крови зуют для определения активности фермента.
проводят преимущественно для диагностики за- Хранят в холодильнике. 3. Феназина метасуль болевания печени и желчных путей. Повыше- фат, 0,02 г/л. Раствор нестабилен, готовят перед ние активности у-ГТФ наблюдается при забо- употреблением. 4. НС1, 1 моль/л. 5. Трис-буфер, леваниях желчных путей с явлениями обтура- 0,74 моль/л, рН 8,0: 44,8 г трис-(оксиметил) ции, при гепатитах, опухолях и метастазах аминометана растворяют в 200 мл воды, при в печень. Активность у-ГТФ в сыворотке крови бавляют 1 моль/л раствор HCI до получения увеличивается, как правило, параллельно увели- рН 8,0 и доводят водой до 500 мл. Хранят чению активности щелочной фосфатазы, но в холодильнике. 6. Раствор 2,6-дихлорфенолин активность у-ГТФ увеличивается раньше, дер- дофенолята натрия в трис-буфере. К 5,8 мг жится на повышенных цифрах более длительное 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия прибав время и относительное увеличение активности ляют 40 мл 0,7 моль/л трис-буфера рН 8,0.
фермента в несколько раз выше, чем щелочной Хранят в холодильнике. 7. Смесь реактивов, фосфатазы. состоящая из 1 части раствора NADP, 1 части Наркотики, седативные средства, этанол раствора глюкозо-6-фосфата, 2 частей раствора индуцируют активность у-ГТФ печени. Поэтому феназина метасульфата, 16 частей раствора у-ГТФ является чувствительным тестом для 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия. Смесь диагностики алкогольно-токсических заболера- реактивов нестабильна, готовят перед упот ний печени. Исследование изоферментов у-ГТФ реблением.
не имеет большого диагностического значения. Ход о п р е д е л е ни я. Опытная проба: в При острых панкреатитах активность фермента пробирку наливают 1 мл воды, добавляют повышена незначительно. 0,02 мл крови и после наступления полного гемолиза (через 6Ч10 мин) прибавляют 0,5 мл 5.2.5. Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа смеси реактивов. При проведении массовых ис следований прибавление смеси может быть Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (d-глюко- проведено одновременно в 35Ч40 пробах. Время зо-6-фосфат: NADP 1-оксидоредуктаза;
К.Ф. от момента взятия крови до прибавления реакти 1.1.1.49) впервые была изолирована Варбургом вов не должно превышать 45 мин. Через 30 мин из эритроцитов. Наибольшая активность фер- производят оценку результатов.
мента определяется в эритроцитах, менее богаты Контрольную пробу ставят так же, как опыт Г-6-ФДГ печень, поджелудочная железа, почки, ную, для исследования берут кровь практически легкие. здорового человека.
Методы определения. Применяют оптический Оце нк а р е з у л ь т а т о в. При отрица тест, а также качественные методы, основан- тельной реакции (в норме) происходит полное ные на восстановлении NADP и 2,6-дихлорфено- обесцвечивание краски;
при сомнительной Ч линдофенола в присутствии феназина метасуль- явное обесцвечивание, но по сравнению с конт фата;
оптимум рН фермента между рН 7,4 и рольной пробой остается зеленоватый оттенок;
8,6. Определение активности фермента можно при положительной реакции обесцвечивания проводить в фосфатном, триэтаноламиновом, краски не происходит или происходит очень глицилглициновом буферах и трис-буфере. незначительно.
I Ионы магния активируют фермент. Описанный Пр и м е ч а н и я. 1. При работе в экспе ниже метод утвержден в качестве унифициро диционных условиях заранее приготовляют ванного в 1974 г. Активность фермента опре навески реактивов в зависимости от количе деляют в эритроцитах.
ства исследований, запланированных на Проба Бернштейна (унифицированный ме один раз. 2. Сомнительные реакции не должны тод). Пр и н ц и п. Глюкозо-6-фосфат в при приниматься в расчет при массовом обследо сутствии Г-6-ФДГ эритроцитов и NADP окис вании населения;
плохо вымытая пробирка ляется с образованием NADPH. NADPH вос может симулировать сомнительную реак станавливает феназин метасульфат, который в цию. При массовых обследованиях имеют свою очередь восстанавливает 2,6-дихлорфенол значение резко положительные и положи индофенол. Феназина метасульфат действует в тельные реакции. 3. Сомнительные реакции этой реакции как активный переносчик электро следует принимать во внимание и проверять нов от NADP к краске.
активность фермента количественным мето Ре а к т ив ы. 1. Никотинамидадениндинук дом у женщин с подозрением на гемолити леотидфосфат (NADP). 5,75 мг NADP раство ческую анемию, обусловленную дефицитом ряют в 2,5 мл воды. Раствор стабилен в те активности фермента, особенно после приема чение 4 нед при хранении в холодильнике.
лекарств, вызывающих гемолитические кри 2. D-Глкжозо-б-фосфорной кислоты динатрие зы у этих больных.
вая соль: 38 мг глюкозо-6-фосфата растворяют Лит е р а т у р а. Идельсон Л. И., Кото в 2,5 мл воды. В продаже чаще имеется бариевая ян Э. Р. Лаб. дело, 1970, № 7, с. 428;
Bern соль глюкозо-6-фосфата;
перевод ее в динатрие stein R. Е. Nature, 1962, vol. 194, p. 192.
вую соль осуществляется следующим образом:
60 мг бариевой соли глюкозо-6-фосфата раство- Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Дефицит ряют в I мл воды, добавляют 0,2 мл насыщен- активности Г-6-ФД эритроцитов относится к ного раствора сульфата натрия, центрифуги- наиболее распространенным наследственным руют. Отбирают весь надосадочный слой и аномалиям;
наследуется дефицит Г-6-ФД доми прибавляют к нему 1,3 мл воды. Раствор исполь- нантно, клинически проявляется как гемолити ческая анемия. При массовых обследованиях обратимую реакцию фосфорилирования креа населения на выявление дефицита Г-6-ФД тина.
учитываются резко положительные и положи- КК человека состоит из двух субъединиц Ч тельные результаты анализов. М, В, которые образуют три формы изофермен тов. ММ-фракция Ч мышечный тип;
МВ-фрак ция Ч сердечный тип и ВВ-фракция Ч мозго 5.2.6. Креатинкиназа вой тип.
Методы определения активности КК исполь Креатинкиназа (КК) (АТФ: креатин М-фос- зуют оба направления катализируемой реакции фотрансфераза;
К.Ф. 2.7.3.2) катализирует с определением образующихся соединений.
Образующийся в данной реакции креатин Унифицированный метод с использованием может быть определен фотометрически по реак- креатина в качестве субстрата. Пр и н ц и п.
ции с а-нафтолом, флуорометрически Ч по Активность фермента пропорциональна количе реакции с нингидрином, а также может быть ству неорганического фосфора, образующегося использован как субстрат в непрямом опти- в результате кислотного гидролиза синтезиро ческом тесте. ванного ферментом креатинфосфата. Неоргани Реакция с субстратом креатинфосфатом ческий фосфор определяется по цветной реакции более чувствительна, чем с креатином, и ее с молибдатом аммония.
используют чаще для определения активнос- Р е а к т и в ы. 1. Аденозин-5 -трифосфорной ти КК. кислоты динатриевая соль. 2. L-Цистеин, Методы, основанные на оптическом тесте, 0,024 моль/л: 2,9 мг растворяют в 1 мл воды.
точные, однако без готовых наборов реактивов Готовят раствор перед употреблением. На одну постановка их трудоемка и требует наличия пробу требуется 0,1 мл. 3. Креатин. 4. Магния чистых кристаллических ферментов. Более сульфат 7-водный, ч.д.а. 5. Аммоний молибде простыми являются фотометрические методы, новокислый 4-водный х.ч., 0,02 моль/л: 2,5 г основанные на определении неорганического молибденовокислого аммония растворяют в фосфора, освобожденного в результате гидроли- мерной колбе в 70Ч80 мл воды и доводят за креатинфосфата. Большинство коммерческих объем до 100 мл водой. 6. Натрия сульфат наборов реактивов основано на оптическом безводный ч.д.а. 7. Натрий сернистокислый тесте. Результаты, получаемые с помощью набо- пиро (метабисульфит натрия) ч.д.а. 8. 1-Амино ров реактивов, выпускаемых различными фир- 2-нафтол-4-сульфокислота (эйконоген) ч.д.а.
мами, как правило, не дают сопоставимых 9. Серная кислота, 2,5 моль/л. 10. НС1, 0,1 моль/л.
результатов исследования, что связано с раз- 11. Трис-(оксиметил)-аминометан (трис), ч.д.а.
личными условиями определения.
12. Трис-буфер, 0,133 моль/л, рН 9,0: 1,61 г Оптимизация условий определения и унифи- трис растворяют в мерной колбе вместимостью кация методов. В большинстве стран в каче- 100 мл в 50Ч60 мл воды, устанавливают рН стве стандартного предложен метод, основан- буфера 0,1 моль/л раствором HCI и доводят ный на оптическом тесте по обратной реакции. водой до метки. 13. Раствор эйконогена: 15,36 г Однако национальные различия касаются вида пиросернистокислого натрия, 0,512 г сернисто буфера, активатора, концентрации реактивов, кислого натрия и 0,128 г эйконогена растворяют температуры определения. На активность фер- в 70Ч80 мл воды, взбалтывают, доводят объем мента в значительной степени влияют исполь- водой в мерной колбе до 100 мл и дважды зуемые в качестве активаторов различные тиоло- фильтруют (через 2 ч и через сутки после вые соединения. В качестве унифицированного приготовления). Раствор следует беречь от в нашей стране принят метод по определению яркого света;
в случае выпадения осадка вновь фосфора. фильтруют. Стабилен в течение 1 мес при хра нении в холодильнике. 14. Основная смесь реактивов, содержащая 0,02 моль/л сульфата Коли Кали магния, 0,033 моль/л креатина и 0,0067 моль/л чество Актив бровоч- Дистилли АТФ: 0,4920 г сульфата магния, 0,4326 г № про- фосфо- ность КК, ный ра- рованная креатина и 0,3692 г АТФ растворяют в 70Ч80 мл бирки ра в нмоль/ створ, вода, мл пробе, (с-л) трис-буфера (для полного растворения креатина мкг смесь нагревают в течение 5Ч10 мин на водяной бане при 40Ч45 С). Затем объем основной смеси реактивов доводят трис-буфером в мерной 1 1,0 14,4 1 колбе до 100 мл. 15. Трихлоруксусная кислота 2 1,0 7,7 2 ч.д.а., 4,9 моль/л: 80 г ТХУ растворяют в 50Ч 3 1,0 5,13 3 60 мл воды и объем раствора доводят в мерной 4 1,0 2,85 4 колбе до 100 мл. 16. Смесь растворов для 5 1,0 2,08 5 проведения кислотного гидролиза креатинфос фата. Смесь готовят перед употреблением, учитывая, что на одну пробу расходуют 2 мл.
Смесь состоит из 0,25 мл раствора молибдено вокислого аммония, 0,25 мл раствора серной ных пределах, и точных данных установить не кислоты и 1,5 мл воды (соотношение 1 : 1 : 6 ). удалось. Активность ММ-фракции составляет 17. Калия фосфат однозамещенный безводный более 90 %, а КК MB Ч менее 2 % от общей х.ч. (для приготовления калибровочного раство- активности КК.
ра): 0,0169 г КН2РО4 растворяют в воде и объем Пр и м е ч а н и е. Если активность КК раствора доводят в мерной колбе до 100 мл.
превышает 500 нмоль/( с-л), то время Сп е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а ние. Фо инкубации сокращают до 15 или 10 мин;
тоэлектроколориметр.
полученные величины активности умножают Ма т е риа л для ис с ле дова ния. Све соответственно на 2 или 3. Разбавлять сы жая сыворотка или плазма крови. При хране воротку не рекомендуется, так как актив нии в холодильнике и при комнатной температу ность фермента при разведении сыворотки ре активность фермента падает.
изменяется непропорционально.
Ход о п р е д е л е н и я. Предварительно все растворы реактивов прогревают в течение Воспроиз водимост ь. Коэффициент 5 мин при 37 С. Опытная проба: в пробирку вариации составляет в среднем 10 %.
вносят 1,5 мл основной смеси реактивов, 0,1 мл Л и т е р а т у р а. Ертанов И. Д., Борисен раствора цистеина и 0,4 мл сыворотки крови.
коЛ. М., Делекторская Л. Н. В кн.: Унификация Содержимое пробирки осторожно перемеши лабораторных методов исследования / Под ред.
вают и ставят в термостат при 37 С на 30 мин.
В. В. Меньшикова.Ч М., 1980, с. 16---28;
Левин Затем прибавляют 0,2 мл раствора трихлор Ф. Б., Березов Т. Т., Кушниренко Е. А. Лаб.
уксусной кислоты, перемешивают стеклянной дело, 1973, № 4, с. 229Ч231;
Kuby S., Noda L., палочкой и центрифугируют при 3000 об/мин Lardy H. A. J. hiol. Chern., 1954, vol. 209, p. 191.
в течение К) мин. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но сыворотку добавляют после Метод с использованием креатинфосфата в прибавления раствора трихлоруксусной кисло- качестве субстрата. Пр и н ц и п. Активность ты. Из опытной и холостой проб забирают по фермента пропорциональна количеству креати 1 мл надосадочной жидкости и переносят в хими- на, образующегося в результате ферментатив ческие пробирки (маркированные соответствую- ной реакции. Креатин определяется но цветной щим образом), в которых содержится по 2 мл реакции с а-нафтолом.
смеси растворов для проведения специфического Р е а к т и в ы. 1. Трис-(оксиметил)-аминоме гидролиза креатинфосфата. Полученную смесь тан (трис) х.ч. 2. Магния сульфат ч.д.а., х.ч.
растворов перемешивают и оставляют при ком- 3. Трис-буфер, 0,1 моль/л, рН 7,4, содержа натной температуре на 30 мин (время гидролиза щий 0,015 моль/л Mg+2 (в виде MgSO4):
креатинфосфата). После этого в пробы добавля- 1,21 г триса и 0,180 г MgSO4 помещают в ют с интервалом 1 мин по 0,25 мл раствора мерную колбу вместимостью 100 мл и доливают эйконогена и точно через 15 мин опытную пробу водой до метки. Раствор стабилен в течение измеряют против холостой пробы при длине месяца при хранении в холодильнике. 4. Креа волны 600Ч700 нм (красный светофильтр) в тинфосфат, динатриевая соль, 0,012 моль/л, кювете с толщиной слоя 0,5 см. рН 7,4: растворяют 0,044 г креатинфосфата в Ра с ч е т производят по калибровочному 10 мл воды. Раствор стабилен в течение недели графику. Построение калибровочного графика;
при хранении в холодильнике. 5. Аденозин готовят калибровочные пробы, как указано ниже. 5-дифосфорной кислоты натриевая соль, 0, Из каждого калибровочного раствора берут моль/л, рН 7,4: 0,017 г аденозиндифосфата по 0,4 мл и обрабатывают, как опытные пробы. натрия (мол. м. 449) растворяют в 10 мл воды.
В холостую пробу вместо калибровочных раство- Раствор стабилен в течение недели при хранении ров берут по 0,4 мл воды. в холодильнике. 6. Бария гидроокись 8-водная Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы: до 100 ч.д.а. или х.ч., 50 г/л: 5 г безводной гидро нмоль/л(с Х л), или до 6 ME. окиси бария или 8 г 8-водной гидроокиси бария Активность изоферментов КК в сыворотке помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл крови у здоровых лиц колеблется в значитель- и доливают до метки водой, не содержащей СО. 7. Цинка сульфат ч. д. а., х.ч., раствор скелетной мускулатуры. К поражениям сердеч 50 г/л: 5 г сульфата цинка помещают в мерную ной мышцы, которые могут вызвать повышение колбу вместимостью 100 мл и доводят до метки активности фермента, помимо инфаркта, отно водой, не содержащей СО2. 8. а-Нафтол (1 -наф- сятся миокардиты, сердечная недостаточность, тол) ч.Д.а. 9. Натрия карбонат ч.д.а. 10. Натрия сердечные аритмии. При этом активность КК гидроокись ч.д.а. 11. Раствор а-нифтола 10 г/л: может увеличиться в 20Ч30 раз по сравнению 1 г а-нафтола, 16 г карбоната натрия и 6 г гидро- с нормой. При поражении скелетной мускулату окиси натрия помещают в мерную колбу вмести- ры уровень активности фермента достигает зна мостью 100 мл и доводят до метки водой. Раст- чительно более высоких цифр. При инфаркте вор готовят не ранее чем за 2 ч до использова- миокарда, как правило, подъем активности КК ния. 12. Основной раствор диацетила в этиловом наступает через 4Ч8 ч, максимальная актив спирте: 0,2 мл диацетила растворяют в 20 мл ность наблюдается через 16Ч36 ч и нормаль этилового спирта. 13. Рабочий раствор диацети- ный уровень устанавливается к 3Ч6-му дню. По ла 0,5 г/л: к 1 мл основного раствора прили- вышение активности КК может быть вызвано и вают 20 мл воды. Раствор хранят в холодильни- рядом других причин Ч употреблением алкого ке. 14. Основной калибровочный раствор креати- ля, отравлением снотворными средствами, на: 0,131 г креатина помещают в мерную колбу внутривенным введением ряда лекарственных вместимостью 100 мл и доливают водой до веществ. МВ-фракция КК является высокоспе метки. 15. Рабочий калибровочный раствор цифичной для сердечной мышцы, активность креатина, 150 мкмоль/л: 1,5 мл основного раст- ее повышается, как правило, при инфаркте вора креатина помещают в мерную колбу миокарда.
вместимостью 100 мл и доводят водой до метки.
Раствор хранят в холодильнике.
Сп е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а н и е.
5.2.7. Лактатдегидрогеназа, Спектрофотометр или фотоэлектроколориметр.
Ход о пр е д е л е ния. Опытная проба: изоферменты лактатдегидрогеназы 0,3 мл буфера, 0,3 мл раствора креатинфосфата, 0,1 мл сыворотки нагревают 5 мин при 37 С. Лактатдегидрогеназа Ч ЛДГ (L-лактат:
Добавляют 0,3 мл раствора аденозиндифосфа- NAD-оксидоредуктаза: К.Ф. 1.1.1.27) Чглико та натрия и инкубируют 30 мин при 37 С. литический фермент, открытый Мейергофом в После инкубации добавляют по 0,5 мл растворов 1918 г., катализирует обратимую реакцию вос гидроокиси бария и сульфата цинка, центрифу- становления пировиноградной кислоты в молоч гируют 15 мин при 3000 Ч 4000 об/мин. К 1 мл ную.
центрифугата добавляют 1 мл воды, 1 мл раство ра а-нафтола, 0,5 мл раствора диацетила. Для развития окраски пробу помещают в термостат на 30 мин. Измеряют при 520 нм (зеленый светофильтр). Холостую пробу ставят так же, как опытную, но вместо раствора аденозинди- В кристаллическом виде впервые получена фосфата натрия добавляют воду.
в 1943 г. ЛДГ состоит из 5 изоферментов, Ка л и б р о в о ч н а я проба. 0,3 мл буфе- представляющих собой различные комбинации ра, 0,3 мл раствора аденозиндифосфата, 0,4 мл двух типов (М и Н) полипептидных цепей.
рабочего раствора креатина обрабатывают так Изофермент, преобладающий в мышечной тка же, как опытную пробу. Измеряют против ни, состоит из 4 идентичных М-цепей и его холостой пробы. Холостую пробу ставят, как обозначают М (ЛДГ );
преобладающий в ткани 4 опытную, но вместо креатина берут воду.
сердца, содержит 4 идентичные Н-цепи, и его Ра с ч е т производят по формуле:
обозначают как Н,((ЛДГ|). Остальные три изо фермента представляют собой различные соче тания М- и Н-цепей, а именно М Н, М Н, МНз.
3 2 ЛДГ: наиболее быстро продвигается к аноду, термостабилен, адсорбируется на ДЕАЕ-сефа X 333 нмоль/(с Х л), дексе, тормозится высокой концентрацией пиру вата, незначительно инактивируется при дей где Eoп Ч экстинкция опытной пробы;
Ехол Ч ствии мочевины и щавелевоуксусной кислоты экстинкция холостой пробы;
Е Ч экстинкция и обладает одинаковой активностью при при к калибровочной пробы;
333 Ч коэффициент пере- менении а-кетобутирата и пирувата в качестве счета на наномоли креатинфосфата, преформи- субстрата.
рованного 1 л сыворотки за 1 с. ЛДГб при электрофорезе продвигается Но р м а л ь н ые в е л и ч и н ы: от 0 до медленнее других фракций, термолабилен, почти 220 нмоль/(с - л), или от 0 до 13 ME. полностью инактивируется при действии мочеви ны и щавелевоуксусной кислоты и обладает Ли т е р а т у р а. Токарская 3. Б. Лаб. дело, незначительной активностью при применении 1971, № 1, с. 24Ч27;
Ennor A. H., Rosenberg H.
а-кетобутирата в качестве субстрата. ЛДГ.
Biochem. J., 1954, vol. 57, p. 203.
ЛДГ, ЛДГ обладают промежуточными свой 3 Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. В сыворот- ствами. При использовании в качестве субстрата ке крови повышенная активность КК может а-кетобутирата определяется а-гидрооксибу быть следствием повреждения сердечной или тиратдегидрогеназа, являющаяся не самостоя тельным ферментом, а фракцией ЛДГ, ориенти- щенный (КН2РО4) ч.д.а., х.ч. 2. Калия фосфат ровочно соответствующая ЛДГ|. двузамещенный 3-водный (К2НРО4 Х ЗНзО) Методы определения. Наиболее аналитиче- ч.д.а. 3. Натрия пируват;
содержание основ ски надежными для определения общей ЛДГ ного вещества не менее 99 %. 4. b-Никотинами являются спектрофотометрические методы, осно- дадениндинуклеотид восстановленный, дина ванные на прямом оптическом тесте Варбурга триевая соль. Коэффициент молярного поглоще - с использованием в качестве субстрата как ния не ниже 5,6 Х 10 2 моль Х м 2 при 340 нм.
L-лактата, так и пирувата. Колориметрические 5. Фосфатный буфер 0,1 моль/л, рН 7,4, с раство динитрофенилгидразиновые методы более до- ром NADH 0,165 ммоль/л и раствором пирувата ступные, но менее точные. Редоксиндикаторные натрия 0,00103 моль/л: 0,16 г однозамещен методы основаны на превращении бесцветной ного фосфата калия, 2,07 г двузамещенного окисленной формы тетразолиевых солей в окра- фосфата калия, 0,0117 г NADH и 0,0114 г шенную восстановленную форму за счет окисле- пирувата натрия растворяют в 40Ч60 мл ния NADH. 0,1 моль/л фосфатном буфере, доводят рН и Для определения изоферментов ЛДГ наибо- доливают водой в мерной колбе до 100 мл.
лее распространенными являются электрофоре- Стабилен в течение суток при хранении в холо тические методы. Хроматографические методы дильнике и 8 ч при хранении при комнатной основаны на разной степени адсорбции изо- температуре. 6. Натрия хлорид, 154 ммоль/л.
ферментов ЛДГ на сефадексе. Возможно опре- Сп е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а ние. 1.
деление изоферментов ЛДГ по выбору опти- Спектрофотометр с термостатированной кю мальной концентрации субстрата для каждого ветой для микроизмерений. 2. Полуавтомати изофермента. Наиболее простыми и быстро ческие пипетки.
выполнимыми методами определения изофер- Ма т е риа л для ис с л е д ов а ния. Све ментов являются методы, основанные на раз- жая сыворотка, свободная от гемолиза.
личном отношении ЛД | и ЛДГ5 к температуре Ход о п р е д е л е н и я. Перед определени и действию мочевины.
ем температура растворов и сыворотки должна В методе, основанном на термической инакти- быть доведена до температуры измерения. Опре вации изоферментов ЛДГ, сыворотку, смешан- деление проводят по следующей схеме.
ную с буфером, инкубируют при 56;
60;
65 С 30 мин. Затем определяют активность ЛДГ В термостатиро- Конечные Опытная в неинкубированной и инкубированной сыворот ванную кювету концентрации проба, мкл ках и рассчитывают процент падения актив- (30 С) приливают веществ в пробе ности при инкубации при различной темпера туре. Сыворотка крови здоровых людей за 30 мин Буфер с NADH и 1. Фосфатный при 56 С теряет около 30 % своей активности, пируватом 650 буфер, 0, при 65 С Ч около 80%. При заболеваниях моль/л печени при 56 С сыворотка теряет активность 2. NADH, 0, до 50 % и при 65 С Ч до 90 %. При сердечных ммоль/л поражениях инактивация при 56 С дает потерю Сыворотка 20 3. Пируват, активности до 10 % и при 65 С Ч около 60 %.
1 ммоль/л Определение изоферментов ЛДГ по инги бированию мочевиной основано на свойстве мочевины как ингибитора. Мочевина тормозит ЛДГ5 почти на 100 %. В большинстве случаев Перемешивают, тотчас измеряют экстинкцию определяется процент стабильной к мочевине и одновременно включают секундомер. Точно фракции от общей ЛДГ, который при заболе- через 1 и 2 мин (или через более короткие ваниях печени обычно составляет около 20 %. промежутки времени) измеряют экстинкцию.
В норме мочевиностабильная фракция состав- Измерение опытной пробы проводят против воды ляет около 30% (20Ч36%). Однако указан- при 340 нм в кювете с толщиной слоя жидкости ные методы недостаточно аналитически надежны. 1 см. Расчет производят по формуле:
Оптимизация условий измерения и унифи кация методов. Вид буфера почти не оказывает активность, моль/(с Х м 3) = нмоль/(с -л) Х 106 = влияния на активность фермента при определе нии общей ЛДГ. Оптимум рН равен 7,2Ч7,5.
Точные оптимальные концентрации реактивов и оптимума рН зависят от состава изофер ментов ЛДГ. В большинстве стран в качестве стандартных предложены методы, основанные где Vp,c Ч объем реакционной смеси;
КСыВ Ч на оптическом тесте, различия касаются условий А определения. В нашей стране в 1974 г. утвержден объем сыворотки;
t Ч время реакции;
ЧЧ в качестве унифицированного колориметриче ский динитрофенилгидразиновый метод.
изменение экстинкции за секунду;
е. Ч коэффи Унифицированный метод по оптимизирован- циент молярной экстинкции NADH, моль -1 Х м2;
ному оптическому тесту. П р и н ц и п. Различно l Ч толщина слоя жидкости в кювете, м (1х10-2).
спектров поглощения окисленной и восстанов- Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы: до ленной форм NAD при 340 нм. нмоль/(с Х л), или до 195 ME, при 25 С. До Ре а к т и в ы. 1. Калия фосфат однозаме- 5330 нмоль/(с Х л), или до 320 ME при 30 С.
Во с п р о и з в о д и мо с т ь. Коэффициен- Ра с че т активности производят по кали ты вариации составляют 5Ч6 %. бровочному графику.
Пост роение ка л иб р о в о ч но г о г ра Ли т е р а т у р а. Bergmeyer H. U. (Hrsg.) фика : из рабочего калибровочного раствора Methoden der enzyrnalischen Analyse. Bd. 1.Ч пирувата натрия готовят ряд разведений, как Weinheim: Verlag Chemie, 1974, S. 607Ч612.
указано в таблице. Затем в пробирки прили Унифицированный метод по реакции с 2,4-ди- вают по 0,5 мл раствора 2,4-динитрофенилгидра нитрофенилгидразином (Севела Ч Товарека). зина. Далее калибровочные пробы обрабаты Пр и н ц и п. L-Лактат под действием фермента вают и измеряют, как опытные. Холостую пробу сыворотки в присутствии NAD окисляется в ставят так же, как калибровочную, но вместо пируват, который определяется по цветной калибровочного раствора добавляют воду.
реакции с 2,4-динитрофенилгидразином.
Ре а к т ив ы. 1. Молочная кислота 80% ч.д.а., х.ч. 2. Натрия гидроокись ч.д.а., х.ч., растворы 2 моль/л;
0,4 моль/л. 3. 0,45 моль/л раствор лактата натрия. В мерную колбу вмести мостью 100 мл вносят 5 мл 80 % молочной кислоты, добавляют 2 моль/л раствора едкого натра до получения рН 7,5 и доводят объем водой до метки. Хранят в посуде из темного стекла в холодильнике. 4. Натрия фосфат пиро (Na4P2O7-10 Н2О) ч.д.а. 5. НС1 1 моль/л.
6. Натрия пирофосфат 0,03 моль/л, рН 8,8:
6,69 г натрия пирофосфата растворяют в неболь шом количестве воды, добавляют 1 моль/л раствор НСl до получения рН 8,8 и доводят объем водой до 500 мл. Стабилен в течение месяца при хранении в холодильнике. 7. NAD окисленная форма. Готовят из расчета 3 мг NAD на 1 мл воды. Раствор стабилен в течение 4 нед при хранении в холодильнике. 8. Раствор Линейная зависимость между концентрацией 2,4-динитрофенилгидразина: 19,8 мг 2,4-ди- пировиноградной кислоты и оптической плот нитрофенилгидразина растворяют в небольшом ностью сохраняется от 0 до 3000 нмоль/(с Х л).
количестве 1 моль/л раствора НС1 при нагре- Но р м а л ь н ые в е л и ч и н ы: 220Ч вании на водяной бане. После охлаждения до- нмоль/(с Х л), или 0,8Ч4,0мкмоль/(ч Х мл) при водят объем 1 моль/л раствором НС1 до 100 мл. 37 С.
На следующий день реактив фильтруют. Раст- Во с п р о и з в о д и мо с т ь. Коэффициент вор хранят в посуде из темного стекла. Стабилен вариации около 10 %.
в течение 1 года. 9. Пируват натрия (для по Лит е ра т у ра. Seuela M., Tovarek J.
строения калибровочной кривой): 11 мг кристал Cas. Lek Cesk., 1959, vol. 98, N 27, p. 844.
лического пирувата натрия растворяют в не большом количестве бидистиллированной воды, Электрофоретическое разделение изофер переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл ментов ЛДГ на пленках из ацетата целлюлозы.
и доводят водой объем раствора до метки;
Пр и н ц и п. Изоферменты ЛДГ разделяются 1 мл раствора содержит 88 мкг пировиноград- путем электрофореза на пленке из ацетата цел ной кислоты. Рабочий раствор готовят разведе- люлозы при рН 8,6. Затем пленка инкубируется нием основного раствора в 10 раз бидистиллиро- на слое геля, содержащего субстратную смесь;
ванной водой;
1 мл рабочего раствора содержит при этом места расположения полос изофермен 8,8 мкг пировиноградной кислоты. тов прокрашиваются в синий цвет формазаном Ход о пр е д е л е ния. Опытная проба: в результате следующей реакции:
0,1 мл сыворотки, разведенной 1 : 2, смешивают с 0,3 мл раствора NAD, прогревают 5 мин при 37 "С. Затем добавляют 0,8 мл 0,03 моль/л раствора пирофосфата натрия и 0,2 мл NADH + НСТЧ 0,45 моль/л раствора лактата натрия, предвари I тельно прогретых при 37 С, и инкубируют смесь (нитросиний тетразолий) при 37 С в течение 15 мин. Тотчас после инкуба ции добавляют 0,5 мл раствора 2,4-динитро фенилгидразина, выдерживают 20 мин при Оптимум рН инкубационной среды лежит комнатной температуре. Затем добавляют 5 мл в области 8,0Ч8,3. Реакция ускоряется в при 0,4 моль/л раствора едкого натра, перемеши- сутствии феназина метасульфата.
вают и через 10 мин измеряют на ФЭКе в Ре а к т и в ы. 1. Буфер для электрофореза:
кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны а) 1,84 г 5,5-диэтилбарбитуровой кислоты (веро 500Ч560 нм (зеленый светофильтр) против нала) и 10,3 г натриевой соли 5,5-диэтилбарби холостой пробы. Холостую пробу ставят, как туровой кислоты (мединала) растворяют в 1 л опытную, но сыворотку добавляют после инку- воды, рН 8,6;
б) 3,025 г трис-(оксиметил) бации. аминометана растворяют в 700 мл воды в мерной колбе, концентрированной HCI, доводят до комнатной температуре. Пленка должна быть в рН 8,6 и доливают водой до метки. Растворы расправленном виде. Денситометрируют при ла и б смешивают в равных пропорциях. длине волны 575Ч600 нм.
2. Буфер для приготовления агара: 24,2 г трис- Но р м а л ь н ые в е л и ч и н ы. Соотноше (оксиметил)-аминометана растворяют в 700 мл ние фракций ЛДГ, по данным различных авто воды, доводят рН до 8,3 прибавлением кон- ров, составляет: ЛДГ Ч 19Ч29 %, ЛДГ Ч 1 центрированной HCI и доливают водой до метки. 23-37 %;
ЛДГз - 17-25 %;
ЛДГ - 8 3. Буфер для растворения субстратной смеси, 17 %;
ЛДГ -8-18%.
рН 8,3: 2,42 г трис-(оксиметил)-аминометана В о с п р о и з в о д и м о с т ь. Коэффициен и 1,41 г однозамещенного фосфата калия ты вариации для различных изоферментов от (КН Ро ) растворяют в 100 мл воды, рН 8,3. 10 до 15%.
2 4. Агар Дифко. 5. Лития лактат ч.д.а., х.ч.
Ли т е р а т у р а. Михайлов Ю. Е., Шишло 6. Тетразолевый п-нитросиний (нитросиний Л. А. Лаб. дело, 1983, № 10, с. 23Ч26;
Маг тетразолий, НСТ) ч.д.а. 7. Метилфеназоний kert С. L., Moller F. Proc. nat. Acad. Sci., метасульфат (феназина метасульфат ФМС) ч.
1959, vol. 45, p. 753Ч763;
Oplier A. л/., Collier 8. Никотинамидадениндинуклеотид окисленный C. S., Miller J. M. Clin. Chem., 1966, vol. 12, (NAD). 9. Уксусная кислота, 5 % раствор.
N 5, p. 308Ч313.
Сп е ц и а л ь но е о б о р у д о в а ни е. 1. Ап парат для электрофореза на пленках из ацетата Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Актив целлюлозы. Может быть использован аппарат ность ЛДГ в сыворотке крови повышается при ЭПАУ-20-50 отечественного производства. 2. Аце- повреждениях миокарда, лейкозах, почечных за татцеллюлозная пленка ТУ-6-05-1696-74 г. болеваниях, тромбоцитопениях, инфекционном 3. Денситометр. мононуклеозе, повреждениях паренхимы печени, Ма т е р и а л для и с с л е д о в а н и я. опухолях, прогрессивной мышечной дистрофии.
Сыворотка крови, свободная от гемолиза. При инфаркте миокарда активность фермента Ход о п р е д е л е н и я. Приготовление в сыворотке крови достигает максимума через агара: 1 г агара Дифко растворяют при нагре- 24Ч36 ч и приходит к норме медленнее (на вании в 50 мл буфера № 2, затем охлаждают 8Ч10-й день), чем активность КК и АсАТ.
до 65Ч70 "С. Субстратную смесь 264 мг лактата Однако из-за отсутствия органной специ лития, 4 мг НСТ, 20 мг NAD и 0,4 мг ФМС (4 мг фичности диагностическая значимость опреде ФМС растворяют в 1 мл субстратного буфера ления общей активности ЛДГ ниже, чем ее и берут 0,4 мл) растворяют при помешивании изоферментов. Изофермент ЛДГ, обладающий в 10 мл субстратного буфера;
беречь от света. наибольшей электрофоретической подвижно 10 мл охлажденного до 65 С раствора агара стью (ЛДГ|), локализуется преимущественно в осторожно смешивают с приготовленной суб- ткани сердца. Увеличение активности этого стратной смесью, избегая образования пузырь- изофермента в сыворотке крови характерно ков. Полученный гель наливают ровным слоем главным образом для поражения сердца. При толщиной около 2 мл на стекло или в какую- инфаркте миокарда в большей степени увеличи либо подходящую емкость. Помещают гель в вается активность ЛДГ| по сравнению с общей темное место при комнатной температуре и ЛДГ. В скелетных мышцах, печени преобладает накрывают крышкой, следя за тем, чтобы капли медленно движущийся изофермент ЛДГ (ЛДГ ), влаги не оседали на его поверхности. При остром гепатите резко возрастает актив Пр о в е д е н и е э л е к т р о ф о р е з а. За- ность ЛДГз и ЛДГ и уменьшается активность ЛДГ и ЛДГ. При циррозе печени сдвиг в ливают в камеру прибора примерно 90 мл 1 охлажденного до 4 С буфера для электрофоре- изоферментном спектре ЛДГ также происходит за. С заранее замоченной в этом буфере ацетат- в сторону ЛДГ. При холецистите активность ЛДГз увеличивается незначительно. При остром целлюлозной пленки удаляют избыток влаги лейкозе в сыворотке крови увеличивается актив фильтровальной бумагой и закрепляют пленку в предназначенной для этого рамке (см. инструк- ность ЛДГ и ЛДГз, причем степень увеличения цию к аппарату ЭПАУ-20-50). Наносят на по- зависит от количества незрелых клеток. В опухо верхность пленки образцы сыворотки в коли- левых тканях преобладают изоферменты ЛДГ и ЛДГ, однако определенной корреляции честве около 1,5 мкл с помощью аппликатора между ростом опухоли и изменением спектра (2 аппликации). Помещают рамку с пленкой в камеру, закрывают камеру крышкой и вклю- ЛДГ в сыворотке крови определить не удалось.
чают ток. Электрофорез проводят в течение 25 мин при напряжении 150 В (сила тока 3Ч5 мА). Выключают ток, снимают пленку 5.2.8. Липаза с рамки и помещают (предварительно обрезав влажные концы пленки) на слой геля. К гелю Панкреатическая липаза (триацилглицерол должна прилегать поверхность пленки, на кото ацилгидролаза;
К.Ф. 3.1.1.3) относится к группе рую нанесены образцы. Следует избегать обра эстераз, гидролизует в жирах внешние, эфирные зования воздушных пузырьков. Помещают гель связи с освобождением жирных кислот.
с пленкой в термостат на 30 мин при темпера туре 37 С. После окрашивания пленку отмы вают в растворе 5 % уксусной кислоты примерно в течение 3 мин и высушивают между листами фильтровальной бумаги в термостате или при Фермент секретируется поджелудочной железой лении жирных кислот в виде медных солей, и в большом количестве содержится в дуоде- которые определяются по реакции с диэтилди нальном содержимом. В сыворотке крови актив- тиокарбаминатом.
ность фермента низкая. Липаза представляет Оптимизация условий определения и уни собой гликопротеид, по данным некоторых фикация методов. Оптимум рН для липазы авторов, может существовать в виде двух 8,8Ч9,0. Липаза поджелудочной железы водо изоформ. Помимо панкреатической липазы, в растворима, и ее липолитическое действие про сыворотке крови содержатся и другие липазы, является на поверхности жировых гранул.
например липопротеиновая липаза. Липаза Поэтому эмульсия масла должна быть тща является термолабильным ферментом и при тельно приготовлена. В качестве эмульгатора 37 С частично инактивируется. чаще применяют дезоксихолат натрия;
опти Методы определения активности липазы от- мальная концентрация 3,5 г/л. Липазу акти личаются по используемому субстрату, буферу, визируют желчные кислоты, ионы кальция, по технике исполнения и основаны главным колипаза. Кроме того, желчные кислоты, так образом на определении количества освободив- иге как и дезоксихолат натрия, уменьшают по шихся под действием фермента жирных кислот. верхностное натяжение, что приводит к образо В качестве субстратов наиболее часто приме- ванию эмульсий и увеличению контакта между няются: оливковое масло, трибутирин, 2-нафтил- жирами и липазой.
меристат, твин-80, триолеин, а-нафтиллаурат, Свободные жирные кислоты, образующиеся фениллаурат и др. За исключением триглице- в результате ферментативной реакции, инги ридов (оливковое масло, триолеин), другие бируют липазу. Связывание жирных кислот субстраты подвергаются гидролизу под действи- ионами кальция с образованием нерастворимых ем неспецифических эстераз, что снижает специ- соединений является причиной активации липа фичность методов, использующих эти субстраты. зы в присутствии ионов кальция.
Оливковое масло способно образовывать тонко- Колипаза, представляющая собой белок, дисперсную стабильную эмульсию. образует с желчными кислотами и липазой Первый метод определения активности липа- комплекс, который обладает большим сродством зы с применением оливкового масла в качестве к субстрату по сравнению со свободной липа субстрата был описан в 1932 г. Впоследствии зой. При применении в качестве субстрата метод подвергался многочисленным модифика- эмульсии оливкового масла реакция нулевого циям. По способу оценки результатов фермента- порядка протекает в течение короткого интерва тивной реакции методы могут быть титро- ла времени (от 4 до 12 мин). В СССР реко метрические, фотометрические, турбидиметриче- мендован в качестве унифицированного тур ские, сталагмометрические, манометрические. бидиметрический метод с оливковым маслом Большинство методов относится к титрометри- в качестве субстрата. В методах определения ческим, основанным на титровании жирных активности липазы сложным является стан кислот, освобождающихся в результате фер- дартизация единиц активности. Изменение ментативного гидролиза. мутности пропорционально освобождению жир ных кислот, но оно варьирует при измерении Методы этой группы недостаточно точны, на разных фотометрах. Поэтому абсорбционные так как очень трудно установить конечную единицы нежелательно употреблять для измере точку титрования в масляной эмульсии. При титровании эмульсия оливкового масла должна ния липазной активности. При разрушении быть гомогенной, в противном случае получен- 1 мкмоля оливкового масла освобождается ные результаты будут неправильными. 2 мкмоля жирных кислот. Поэтому возможны два способа выражения активности: в микро Колориметрические методы более точные, но связаны с введением в реакцию ряда дополни- молях разрушенного под действием липазы сы тельных реактивов. Турбидиметрические методы воротки крови оливкового масла или триолеина или в микромолях освобожденных жирных основаны на измерении величины уменьшения оптической плотности стабильной эмульсии кислот. Однако калибровать турбидиметриче оливкового масла под действием липазы. Ста- ские методы сложно, так как рассеяние света лагмометрические методы используют поверхно- меняется с концентрацией нелинейно.
стные свойства жирных кислот, что позволяет Унифицированный метод с использованием только условно судить об активности фермента. оливкового масла в качестве субстрата. Пр ин Манометрические методы очень сложны и трудо- цип. Спектрофотометрическое измерение изме емки. Принцип их основан на измерении объема нения мутности суспензии оливкового масла угольной кислоты, которая вытесняется из би- под действием липазы. Активность фермента карбонатного буфера жирными кислотами. пропорциональна количеству гидролизованного Оливковое масло или триолеин как субстраты оливкового масла или количеству жирных кис используются в методах, предлагаемых в ка- лот, образующихся при гидролизе.
честве стандартных в США, а также в боль- Ре а к т ив ы. 1. Оливковое масло, мол. мас шинстве наборов реактивов для определения са 880 (сред.). 2. Алюминия окись хромато активности липазы, в частности, в наборах графически чистая (для очистки оливкового реактивов фирмы Harleco (США), Boehrin- масла). Очистка оливкового масла: в колбу ger Mannheim (ФРГ), амилазно-липазном ана- вместимостью 50 мл помещают 25 мл оливко лизаторе модели Perkin-Elmer 91 (США) с вого масла и добавляют 5 г окиси алюминия, прилагаемым набором реактивов. Описаны ставят на 1 ч на аппарат для встряхивания фотометрические методы, основанные на выде- жидкости в сосудах. Затем оливковое масло переливают в центрифужные пробирки и центри- Ра с ч е т а к т и в н о с т и. Для расчета фугируют 30 мин при 5000 об/мин. Оливковое активности липазы можно использовать кон масло сливают с осадка и пропускают через трольную сыворотку с известной активностью плотный бумажный фильтр (с синей полосой) на липазы. Активность липазы в контрольной сы воронке Бюхнера. 3. Меди сульфат 5-водный воротке определяют так же, как в исследуемой.
(CuSO4 Х 5Н2O) для получения абсолютного Расчет производят по формуле:
спирта. 4. Этиловый спирт абсолютный. Для абсолютирования этилового спирта применяют безводный сульфат меди (сульфат меди) белого цвета. Безводный сульфат меди получают про сушиванием CuSO4 Х 5НгО при температуре 120С в сушильном шкафу при периодическом где Еоп Ч изменение величины экстинкции перемешивании. Безводный сульфат меди (охла- опытной пробы за 1 мин;
ДЕоп = Е1аи Ч Е2оп жденный) заливают 96 % этиловым спиртом. за 1 мин;
ДЕ Ч изменение величины экстинк к Тщательно перемешивают и оставляют стоять ции в контрольной сыворотке за минуту, ДЕ = к 3Ч4 дня, ежедневно перемешивая. Кристаллы = Е1 Ч Е2к за 1 мин;
С Ч активность липазы к к сульфата меди приобретают синий цвет. Затем в контрольной сыворотке, ME. Расчет в мкмолях спирт сливают и засыпают в него новую порцию разрушенного оливкового масла ведут по фор сульфата меди. Операцию продолжают до тех муле:
пор, пока цвет кристаллов не будет меняться.
Спирт сливают и фильтруют. 5. Основной раст вор оливкового масла, 0,011 моль/л. В колбу с притертой пробкой наливают 100 мл абсолют ного спирта, пипетку с 1,1 мл очищенного олив кового масла помещают в колбу так, чтобы конец ее находился близко к поверхности спирта, но не касался ее. Держа пипетку в таком поло- где ДЕоп Ч изменение экстинкции опытной про жении, непрерывно вращают колбу круговыми бы за 1 мин;
170 Ч концентрация оливкового движениями до тех пор, пока оливковое масло масла в рабочей эмульсии (мкмоль/л), при не вытечет из пипетки. Затем колбу ставят на которой экстинкция равна приблизительно 1;
1 ч на аппарат для встряхивания жидкости.
Ек Ч экстинкция рабочей эмульсии оливкового Хранят при комнатной температуре. 6. Рабочая эмульсия оливкового масла, 0,00017 моль/л, или 170 мкмоль/л: 1,5 мл основного раствора олив кового масла медленно добавляют к 100 мл буфера рН 8,8. При этом кончик пипетки держат под поверхностью эмульсии. Реактив стабилен коэффициент пересчета на 1 л сыворотки.
при хранении в холодильнике в течение 2 нед.
Линейная зависимость сохраняется до 7. Трис-(оксиметил)-аминометан. 8. Дезоксихо- мкмоль/л оливкового масла. 16,67Чкоэффи левой кислоты натриевая соль. 9. НС1 концен- циент пересчета в нмоль/(с Х л).
трированная. 10. Буфер, содержащий трис, Но р м а л ь н ые в е л и ч и н ы: 0Ч 0,025 моль/л и натриевую соль дезоксихолевой нмоль/(с Х л), или 0Ч28 мкмоль/(мин Х л).
кислоты, 0,014 моль/л, рН 8,8: 0,3 г триса и Пр и ме ч а н и е. Нормальные величины 0,6 г дезоксихолата натрия растворяют в 40Ч следует проверять в каждой лаборатории.
60 мл воды, доводят рН до 8,8 концентрирован Во с п р о и з в о д и мо с т ь. Коэффициен ной НС1 (3Ч8 капель) и доливают водой в ты вариации составляют 10Ч15 %.
мерной колбе до 100' мл. Реактив стабилен при хранении в холодильнике в течение 2 нед.
Лит е р а т у р а. Делекторская Л. П., Бори Сп е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а ние.
сенкоЛ. М., Стародворцева В. Г. В кн.: Унифи Спектрофотометр с термостатированной кюветой. кация лабораторных методов исследова Ма т е риа л для ис с л е д о в а ния. ния/Под ред. В. В. Меньшикова.Ч М., 1980, Сыворотка, свободная от гемолиза, или плазма с. 41Ч49;
Огнев Ю. В., Шабанова Т. К. Лаб. де крови. Активность липазы сохраняется в тече- ло, 1978, № 7, с. 424Ч427;
Shihabi L. К., ние 7 дней при хранении сыворотки в холо- Bishop С. Clin. chem., 1971, vol. 17, p. 1150.
дильнике. Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. В сыворот Ход о п р е д е л е н и я. Перед определени- ке здоровых людей активность липазы очень ем сыворотку и реактивы прогревают до темпе- низкая, при остром панкреатите активность фер ратуры измерения. В кювету приливают 3 мл мента может увеличиться до 200 раз по сравне рабочей эмульсии оливкового масла, добавляют нию с нормой. Активность липазы в крови быст 0,1 мл сыворотки, смешивают (без встряхива- ро увеличивается в течение нескольких часов ния) и ставят в термостат при 30 или 37 С, после приступа панкреатита, достигая максиму через 2 мин измеряют экстинкцию (Ei) против ма через 12Ч24 ч, и остается повышенной в те воды или воздуха при длине волны 340 нм чение 10Ч12 дней, т. е. более продолжительное в кювете с толщиной слоя 1 см, затем кювету время, чем а-амилаза. В моче активность липа снова помещают в термостат при той же темпе- зы не обнаруживается. В дуоденальном содер ратуре и через 5 мин измеряют экстинкцию жимом липазу рекомендуется определять после (Е2), рассчитывают ЛЕ за 1 мин. стимуляции секретином и панкреозимином.
5.2.9. Сорбитолдегидрогеназа В термостатиро- Конечная Опытная ванную кювету концентрация проба, мл + приливают в пробе Сорбитолдегидрогеназа (L-идитол: NAD 5-оксидоредуктаза;
К. Ф. 1.1.1.14) фермент, ка тализирующий следующую обратимую реакцию: Триэтаноламино- Около вый буфер 1,6 ммоль/л СДГ NAD- Na2, раствор 0,1 0,4 ммоль/л Сыворотка крови 1, В человеческом организме фермент содер жится в основном в клетках печени.
Методы определения основаны на прямом оп тическом тесте или на образовании окрашенного соединения фруктозы с резорцином Ч метод Се вела Ч Товарека. В методах определения актив ности СДГ, основанных на оптическом тесте, используют обратную реакцию. Методы, исполь зующие эту реакцию, более чувствительные.
Оптимизация условий определения и унифи где Vр.с. Ч объем реакционной смеси;
Vсыв Ч кации методов. Для определения активности СДГ, основанного на UV-тесте, применяют сле- объем сыворотки;
t Ч время реакции, с;
^Е Ч дующие буферные растворы: фосфатный, триэ- изменение экстинкции за 1 с;
е Ч коэффициент 2 - таноламиновый, трис-буфер. В трис-буфере ре- молярной экстинкции NADH в м -моль ;
/ Ч акция протекает быстрее, чем в триэтанолами- толщина слоя жидкости в кювете, м (1-10~ ).
Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы. Активность новом, однако в трис-буфере для насыщения фермента требуется более высокая концентра- в сыворотке крови здоровых людей низкая Ч до 25 нмоль/(с-л), или до 1,5 ME.
ция фруктозы. Оптимум рН для СДГ 7.4 Ч 7,6.
В качестве унифицированного в 1974 г. утвер- Во с п р о и з в о д и мо с т ь. Коэффициент жден колориметрический метод Севела Ч Това- вариации около 5 %. Если при 365 нм Л> 0,03, то сыворотку следует развести или уменьшить река.
Метод по оптическому тесту. П р и н ц и п интервалы измерения.
Различие спектров поглощения окисленной и Ли т е р а т у р а. Bergmeyer H. U. (Hrsg.) восстановленной форм NAD при 340 им.
Methoden der enzymatischen Analyse. Wein Ре а к т и в ы. 1. Триэтаноламина гидрохло heim: Verlag Chemie, 1974, S. 601Ч606.
рид. 2. Натр едкий, 2 моль/л. 3, Триэтанолами новый буфер, 0,2 моль/л, рН 7,4: 37,2 г гидро- Унифицированный метод по реакции с резор цином (метод/Севела Ч Товарека). Пр ин хлорида триэтаноламина растворяют в воде, до водят рН до 7,4 2 моль/л раствором NaOH и до- цип. Сорбитол под действием фермента сыво ротки в присутствии NAD превращается во ливают водой до 1 л. Стабилен при комнатной фруктозу, при реакции фруктозы с резорцином температуре. 4. Натрия карбонат кислый (NaHCO ), 10 г/л. 5. Никотинамидаденинди- образуется розово-красное окрашивание, интен сивность которого пропорциональна количеству нуклеотид восстановленный, динатриепая соль, образовавшейся фруктозы.
12 моль/л: 15 мг NAD- Na растворяют в 1,5 мл Ре а к т ив ы. 1. Трис- (оксиметил) -аминоме 10 г/л раствора NaHCO. Стабилен при 4 С 1 нед. 6. D-Фруктоза, 4 моль/л: 72,0 г D-фрук- тан. 2. НС1, 0,2 моль/л. 3. Трис-буфер, 0,05 моль/л, рН 8,8: 70,5 мг триса растворяют в 2,5 мл воды, тозы растворяют в воде и доводят водой до прибавляют 0,4 мл 0,2 моль/л раствора HCI.
100 мл. Раствор стабилен при 4 С 4 нед.
Доводят рН, доливают водой до 10 мл. Раствор Сп е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а н и е.
Спектрофотометр с термостатированной кюве- стабилен при хранении при комнатной темпера туре. 4. D-сорбитол, 0,5 моль/л раствор в той.
0,05 моль/л трис-буфере: 0,225 г D-сорбитола Ма т е р и а л д л я и с с л е д о в а н и я.
растворяют в 2,5 мл 0,05 моль/л раствора трис Свежая сыворотка или плазма крови.
буфера. Раствор стабилен в течение 4 нед при Ход о п р е д е л е н и я. Предварительно хранении в холодильнике. 5. NAD, 0,006 моль/л:
все растворы реактивов и сыворотку прогревают 25 мг NAD растворяют в 4,5 мл трис-буфера.
до температуры измерения. Определение прово Раствор стабилен в течение 4 нед при хранении дят по следующей схеме:
в холодильнике. 6. Трихлоруксусная кислота, Смешивают и измеряют экстинкцию при раствор 100 г/л. 7. Резорцин, 1 г/л раствор 340 или 365 нм в кювете с толщиной слоя 1 см в 96 % этаноле. 8. HCI, 30 % раствор. 9. НС1, против воды в течение 5Ч8 мин через каждую 0,2 моль/л раствор. 10. Натрия хлорид, минуту.
ммоль/л. 11. D-фруктоза, калибровочный рас Ра с ч е т производят по формуле:
твор: 27 мг D-фруктозы растворяют в небольшом количестве 154 ммоль/л раствора хлорида нат рия, переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем до метки 154 ммоль/л раствором хлорида натрия.
Ход о п р е д е л е н и я. Опытная проба: перемешивают и помещают в водяную баню при в центрифужную пробирку вносят 0,1 мл 80 С точно на 8 мин, охлаждают. Возникающее 0,5 моль/л раствора D-сорбитола и 0,3 мл сыво- розово-красное окрашивание измеряют на ФЭКе ротки, прогревают 5 мин при 37 С, затем добав- при длине волны 500Ч560 нм (зеленый свето ляют 0,2 мл 0,006 моль/л раствора NAD, предва- фильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см против холостой пробы. Холостую пробу ставят так же, рительно прогретого при 37 С, и инкубируют 30 мин при 37 С. Инкубацию прерывают добав- как опытную, но раствор трихлоруксусной кисло ты добавляют до инкубации.
лением 0,4 мл 100 г/л раствора трихлоруксусной кислоты. Центрифугируют. В чистую пробирку Ра с ч е т активности по калибровочному графику.
вносят 0,5 мл надосадочной жидкости, 0,5 мл раствора резорцина, 1,5 мл 30 % раствора НС1, № 154 Раствор Актив Калибровочный Раствор Трис- Раствор 30% про- ммоль/л трихлор- ность раствор сорби- буфер, резор- раствор бир- раствор уксусной сдг, D-фруктозы, мл тола, мл мл цина, мл HCI, мл ки NaCI, мл кислоты, мл нмоль/ (с-л) 0,2 0,4 1,0 3,0 55, 1 0,2 калибровочно- 0,1 0, го раствора, раз веденного в 10 раз 2 0,05 0,25 0,2 0,4 1,0 3,0 0, 3 0,1 0,2 0,2 0,4 1,0 3,0 0, 4 0,2 0,2 0,1 0,2 0,4 1,0 3,0 5 0,3 0,2 0,4 1,0 3,0 Ч 0, По с т р о е н и е к а л и б р о в о ч н о г о же условиях, что и опытные пробы, против хо г р а фи к а. Из калибровочного раствора лостой пробы. В холостую пробу вместо калибро D-фруктозы готовят ряд разведений с добавле- вочного раствора добавляют 154 ммоль/л рас нием реактивов, как указано ниже. Далее калиб- твор хлорида натрия. Пересчет активности СДГ ровочные пробы помещают в водяную баню при на микромоли фруктозы на 1 л сыворотки за 1 с 80 С на 8 мин, охлаждают и измеряют при тех инкубации при 37 С производят по формуле:
С-1000-3300- активность СДГ, нмоль/(с-л) = 180- где С- 1000 количество D-фруктозы в калиб- ность фермента в сыворотке крови наблюдается ровочной пробе, нг;
3300Ч коэффициент пере- в первые дни острого гепатита и при обострении хронического гепатита.
счета на 1 л сыворотки;
Ч коэффициент пересчета на 1 с инкубации;
180Ч масса 1 мик- 5.2.10. Уроканиназа ромоля D-фруктозы, мкг.
Линейная зависимость сохраняется от 0 до У человека уроканиназа содержится главным 830 нмоль/(с -л). образом в печени. Для определения ее актив Но р м а л ьн ы с в е л и ч и н ы : до ности в сыворотке крови пользуются спектрофо 5,6 нмоль/(с-л), или до 0,02 мкмоль/(ч Х мл). тометрическим методом, основанным на спектро В о с п р о и з в о д и м о с т ь. Коэффициен- фотометрическом определении концентрации ты вариации до 10 %. уроканиновой кислоты. В описанном методе ус ловия определения оптимизированы, метод уни Ли т е р а т у р а. Sevela M., Tovarek J. фицирован.
Vni trni i ek, 1961, vol. 7, p. 1392. Унифицированный спектрофотометрический метод. Принцип. Субстрат уроканиназы Ч К л и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. СДГ со- уроканиновая кислота Ч в щелочной среде име держится главным образом в печени, поэтому ет максимум поглощения при 277Ч280 нм. Ак повышение активности в сыворотке крови специ- тивность фермента определяют по убыли суб фично для ее поражения. Однако из-за низкой страта в процессе ферментативной реакции.
активности СДГ в сыворотке крови и недоста- Ре а кт ив ы. 1. Калия фосфат однозаме точной чувствительности метода определения щенный безводный х. ч., 0,01 моль/л: 1,36 г СДГ нормальное значение активности фермента KHzPO4 растворяют в мерной колбе вместимо в сыворотке крови еще не говорит об отсутствии стью 1 л и доводят до метки водой. 2. Калия поражения печени. Наиболее высокая актив- фосфат двузамещенный, безводный х.ч., 0,01 моль/л: 1,74 г К НРО растворяют в мерной 2 колбе вместимостью 1 л и доводят до метки водой. 3. Фосфатный буфер, 0,01 моль/л, рН 7,2: к 0,01 моль/л раствору К НРО 2 приливают порциями 0,01 моль/л раствор КН РО до получения рН 7,2. 4. Натр ед 2 кий, 0,05 моль/л. 5. Уроканиновая кислота 2-водная, имп. 6. Основной калибровочный рас твор уроканиновой кислоты;
0,001 моль/л:
0,0087 г уроканиновой кислоты растворяют в мерной колбе вместимостью 50 мл в 0,01 моль/л фосфатном буфере. 7. Рабочий калибровочный раствор уроканиновой кислоты. Готовят разве дением основного раствора в 20 раз раствором 0,05 моль/л NaOH;
1 мл рабочего калибровоч ного раствора содержит 0,05 мкмоля уроканино вой кислоты. В буфер и в раствор уроканиновой кислоты в целях консервации добавляют 3Ч 4 капли хлороформа, после чего буферный рас твор можно хранить при комнатной температуре.
Раствор уроканата при хранении в холодиль нике без замораживания стабилен в течение где С Ч количество разложившейся уроканино нескольких месяцев. вой кислоты, нмоль (по калибровочному графи Сп е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а н и е. ку);
5-10 Чкоэффициент пересчета на 1 л Спектрофотометр с длиной волны 280 нм. сыворотки крови;
14 400Ч коэффициент пере Ма т е р и а л для и с с л е д о в а н и я. счета на 1 с инкубации.
Сыворотка крови. Фермент стабилен в течение Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы. У практи 2Ч3 дней при 4 С. чески здоровых людей активность уроканиназы Ход о п р е д е л е н и я. Опытная проба: в крови отсутствует.
0,35 мл фосфатного буфера смешивают с 0,1 мл Во с п р о и з в о д и мо с т ь. Коэффициен основного калибровочного раствора уроканино- ты вариации в среднем составляют 7Ч8 %.
вой кислоты, затем добавляют 0,05 мл сыво- Сп е ц и фи ч н о с т ь ме т ода. Уроканат ротки крови и инкубируют смесь 4 ч при 37 С. является единственным субстратом для урока После инкубации в пробу сразу добавляют ниназы, обладающей абсолютной субстратной 2,5 мл 0,05 моль/л раствора NaOH для останов- специфичностью.
ки реакции. Холостую пробу № 1 ставят так же, Ли т е р а т у р а. Буробин В. А., Лихаче как опытную, но вместо 0,1 мл основного рас ва Н. В. В кн.: Унификация лабораторных мето твора уроканиновой кислоты добавляют 0,1 мл дов исследования/Под ред. В. В. Меньшико фосфатного буфера. Холостую пробу № 2 ставят ва.Ч М., 1980, с. 35Ч40;
Буробин В. А., Лиха так же, как опытную, но 0,1 мл основного рас чева Н. В., Абгафорова Г. Е. Лаб. дело, 1978, твора уроканиновой кислоты добавляют после № 11, с. 650Ч653;
Tabor H., Mehler A. H.
инкубации и сразу останавливают реакцию Acad. Press. Soc., 1955, vol. 11, p. 228Ч233.
0,05 моль/л раствором NaOH. После остановки реакции измеряют оптическую плотность опыт- Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Урокани ной пробы и холостой № 2 против холостой наза является органоспецифическим ферментом пробы № 1 на спектрофотометре при длине печени. В 1963 г. С. Р. Мардашевым и В. А. Бу волны 280 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. робиным впервые было обнаружено, что при Ра с ч е т активности производят по калиб- токсическом гепатите уроканиназа определяется ровочному графику. При этом из величины в крови. В дальнейшем многие исследователи экстинкции холостой пробы № 2 вычитают вели- показали, что активность фермента обнаружи чину молярной экстинкции опытной пробы. вается в крови при циррозе печени, хронических По с т р о е н и е к а л и б р о в о ч н о г о гепатитах. Активность фермента в крови при г р а фи к а. Из рабочего калибровочного раст- токсическом или вирусном гепатите достигает вора уроканиновой кислоты готовят ряд разве- величин 5Ч13 нмоль/(с-л), или 0,3Ч0, дений, как указано ниже. мкмоль/(мин -л).
Pages: | 1 | ... | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | ... | 13 | Книги, научные публикации