Книги, научные публикации
Pages: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | ... | 13 | -- [ Страница 1 ] --
СПРАВОЧНИК Лабораторные методы исследования в клинике Под редакцией профессора В.В.Меньшикова МОСКВА ДМЕДИЦИНА" 1987 ББК 53.4 М51 УДК 61б-074/-078:061.6 В. В. МЕНЬШИКОВ, Л. Н. ДЕЛЕКТОРСКАЯ, Р. П.
ЗОЛОТНИЦКАЯ, 3. М. АНДРЕЕВА, А. С. АНКИРСКАЯ, И. С. БАЛАХОВСКИЙ, Д. В. БЕЛОКРИНИЦКИЙ, С. Д. ВОРОПАЕВА, Е. Н. ГАРАНИНА, Т. И. ЛУКИЧЕВА, Н. Г. ПЛЕТНЕВА, А. Я. СМОЛЯНИЦКИЙ Со с т а в ит е л и: Л. Н. Делекторская, докт. мед. наук, зав. Всесоюзным научно-методическим и контрольным центром по лабораторному делу МЗ СССР при I ММИ им. И. М. Сеченова;
Я. П. Золотницкая, канд. мед. наук, сотрудник того же института.
Ре це нз е нт ы: В. А. Макаров, докт. мед. наук, зав. лабораторией патологии гемостаза ЦНИИГиПК;
Ю. И. Ткач, доцент, зав. кафедрой клинической лабора торной диагностики Украинского института усовершенствования врачей.
Лабораторные методы исследования в клинике:
М51 Справочник/Меньшиков В. В., Делекторская Л. Н., Золотницкая Р. П. и др.;
Под ред. В. В. Меньшикова.Ч М.: Медицина, 1987,Ч368 с.: ил.
В справочнике представлены основы лабораторной аналитики: правила проведения и оценка лабораторных анализов, контроль качества исследова ний. Описаны унифицированные методы исследования биологических мате риалов: мочи, мокроты, кала, экссудатов и транссудатов, спинномозговой жидкости, а также желудочной секреции;
исследования крови, в том числе и системы гемостаза. Подробно изложены методы клинической биохимии, иммунологии и микробиологии. Исследования описаны по единой схеме:
принцип метода, реактивы, оборудование, ход исследования, показатели у здоровых людей, оценка надежности метода. Книга предназначена врачам лаборантам и врачам различных специальностей.
4109000000Ч ББК 53. 039(0.)- Издательство Медицина, Москва, ПРЕДИСЛОВИЕ Клинический потенциал лабораторной ди- в различных лабораториях, и затруднить сопо агностики имеет три источника. Патофизиология ставление результатов исследований, проведен и патобиохимия предоставляют сведения об из- ных одному и тому же пациенту в различных менениях химического и клеточного состава лабораториях. Чтобы избежать негативных по биологических жидкостей при патологических следствий стихийного выбора методов, начиная состояниях организма. Физика, химия, биология с 1968 г. в лабораторной службе здравоохране являются источником методических приемов для ния проводится унификация методов исследова выявления и количественного определения ком- ния.
понентов биологических жидкостей, а тесное Одна из задач данного справочника Ч систе взаимодействие с клинической медициной позво- матизированное описание методов исследова ляет проверить на практике реальную диагно- ния, наиболее приемлемых для практических стическую ценность теоретических представле- лабораторий. Значительная часть приводимых ний и аналитические качества лабораторных методов являются унифицированными, и приме методов исследования. Рациональное использо- нение их в лабораториях лечебно-профилактиче вание этих методов позволяет строить стратегию ских учреждений предписано приказами Мини и тактику получения лабораторной информации стерства здравоохранения СССР: № 290 от о состоянии организма и применять ее в интере- 11.04.72 г. Об унификации клинических лабора сах диагностики болезней, а также контроля за торных методов исследования, № 960 от лечением больных. 15.10.74 г. Об унификации клинических лабора Опубликованное в 1982 г. издательством торных методов исследования, № 250 от Медицина Руководство по клинической лабо- 13.03.75 г. Об унификации методов определе раторной диагностике было посвящено преиму- ния чувствительности микроорганизмов к хими щественно теоретическим и клинико-диагности- отерапевтическим препаратам, '№ 558 от ческим аспектам лабораторной медицины. На- 08.06.78 г. Об унификации микробиологических стоящий справочник имеет своей целью осветить методов исследования при туберкулезе, современное состояние клинической лаборатор- № 1175 от 21.11.79 г. Об унификации клиниче ной аналитики. ских лабораторных методов исследования. Год Одним из направлений научно-технического издания приказа об унификации методов указан прогресса в клинической медицине 60Ч80-х го- в тексте в скобках рядом с описанием этого дов стало ускоренное развитие методов и метода.
средств клинической лабораторной диагностики. Описание методов также в различных разде В результате активного восприятия достижений лах по возможности унифицировано. Оно со физики, химии, молекулярной биологии значи- держит наименование исследуемого компонента, тельно повысились исследовательские возмож- принцип метода исследования, перечень необхо ности во всех разделах деятельности клиниче- димых материалов и оборудования, ход опреде ских лабораторий: клинической биохимии, гема- ления, результаты у здоровых людей," клиниче тологии, иммунологии, микробиологии, токсико- ское значение результатов исследования. Описа логии, паразитологии, возник ряд новых разде- ние метода содержит сведения, позволяющие его лов лабораторной аналитики. воспроизвести в условиях лаборатории с доста Применение новых препаративных и измери- точно высокой степенью надежности результа тельных приборов н готовых аналитических тов. Вслед за описанием- метода или группы форм существенно повышает надежность ре- методов приводятся ссылки на работы, содержа зультатов лабораторных исследований, умень- щие существенную дополнительную информа шает трудовые затраты лабораторных работни- цию.
ков. Внедрение микрометодов в клиническую Естественно, что в зависимости от специфики биохимию, иммунологию, паразитологию, методических приемов между разделами спра предусмотренное постановлением ЦК КПСС и вочника существуют понятные различия в опи Совета Министров СССР от 1982 г. О дополни- саниях методов. Так, в разделе Методы клини тельных мерах по улучшению охраны здоровья ческой иммунологии значительное внимание населения, является новым шагом в совершен- уделяется приготовлению материалов для иссле ствовании клинической лабораторной диагно- дования.
стики. Значительное расширение круга методов Настоящая книга адресована не только ра лабораторной диагностики имеет и обратную ботникам лабораторий. Полезный' справочный сторону. В условиях, когда известны десятки материал найдут в ней и клиницисты, по задани методов исследования одного и того же компо- ям которых выполняются лабораторные иссле нента биологической жидкости, лаборатории дования.
нередко бывает трудно выбрать оптимальный Хотя представленные описания методов ис метод. Влияние случайных обстоятельств может следования и не исчерпывают всего методиче привести к разнобою в методах, применяемых ского арсенала, накопленного клинической ла бораторной диагностикой, тем не менее их пере- 4-го раздела Ч кандидат медицинских наук чень отражает сферу возможных действий А. Я. Смоляннцкий, 5-й раздел подготовлен док современной лаборатории крупного лечебно- торами медицинских наук И. С. Балаховским, профилактического учреждения. К сожалению, Л. Н. Делекторской, В. В. Меньшиковым, 6-й рамки данного издания не позволяют привести раздел Ч кандидатом медицинских наук описание методов клинической паразитологии Д. В. Белокриницким, 7-й раздел Ч докторами и токсикологии. медицинских наук С. Д. Воропаевой, 3. М. Ан Авторский коллектив справочника представ- дреевой, кандидатом медицинских наук А. С. Ан лен преимущественно сотрудниками I Москов- кирской.
ского медицинского института им. И. М. Сечено- Авторы справочника Ч опытные специали ва, на базе которого уже 15 лет действует сты в соответствующих отраслях клинической Всесоюзный научно-методический и контроль- лабораторной диагностики, что позволило обес ный центр по лабораторному делу Министерства печить необходимый профессиональный уровень здравоохранения СССР. В подготовке 1-го раз- отбора и описания лабораторных методов иссле дела участвовали доктора медицинских наук дования.
Тем не менее как набор методов исследо И. С. Балаховский, Л. Н. Делекторекая, вания, так и характер их описания открыты В. В. Меньшиков и кандидат биологических наук Е. Н. Гаранина, 2-го раздела Ч кандидат меди- для обсуждения читателями, мнения которых будут с вниманием встречены авторами, соста цинских- наук Н. Г. Плетнева, 3-го раздела Ч вителями и редактором этой книги.
кандидат медицинских наук Р. П, Золотницкая, В. В. МЕНЬШИКОВ, лауреат Государственной премии СССР, заслуженный деятель науки РСФСР, профессор Раздел ОСНОВЫ ЛАБОРАТОРНОЙ АНАЛИТИКИ 1.1. ПРИНЦИПЫ УНИФИКАЦИИ И СТАНДАРТИЗАЦИИ КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ Унификация клинических лабораторных ме- чувствительность. Преимущество должно отда тодов исследования означает научно обосно- ваться методу, имеющему наиболее высокие ванный выбор и внедрение в практику работы аналитические показатели. Однако, учитывая, клинико-диагностических лабораторий единых что унифицированные методы предназначены аналитических процедур, в наибольшей мере для работы в практических лабораториях, выбор удовлетворяющих современному уровню разви- метода не может основываться только на анали тия медицинской науки и потребностям практи- тических критериях.
ки, обеспечивающих надежность и сопостави- Вторую группу критериев, имеющих меди мость результатов диагностических исследова- цинский характер, составляют: диагностическая ний, выполняемых в различных лабораториях. значимость показателей с учетом применения Унификация клинических лабораторных ме- выбранного метода;
длительность процесса ана тодов в нашей стране проводится в соответствии лиза по отношению к допустимым срокам уста с системой унификации, утвержденной приказом новления диагноза;
способ взятия материала Министерства здравоохранения СССР в для исследования, например кровь из вены или 1971 г. Система включает следующие этапы: пальца;
количество биологического материала, анализ литературы по методам исследования необходимого для исследования. Например, при определенного вещества, сравнение методов- диспансеризации населения большим преимуще кандидатов, выбор методов в соответствии с из- ством является возможность получения крови не ложенными ниже критериями, обсуждение пред- из вены, а из пальца. Время, которое требуется лагаемого метода на Комиссии по унификации для выполнения анализа и получения лабора и контролю качества клинических лабораторных торной информации клиницистами, должно быть методов исследования. Унифицированный метод сопоставимо с допустимыми сроками установле отрабатывается экспериментально, проводится ния диагноза, с темпом развертывания патоло оптимизация условий его определения, после гического процесса, вытекающими отсюда сро чего методы публикуются в виде специальных ками принятия диагностического и лечебного выпусков Унификация клинических лаборатор- решения. В этом плане иммуноферментные (го ных методов исследования. Они рассылаются могенные) исследования по медицинским крите в клинико-диагностические лаборатории и на- риям имеют преимущество перед другими мето учно-исследовательские институты с целью ис- дами, так как позволяют получить результат пытания рекомендуемых методов и получения за несколько минут.
отзывов на них. Длительная проверка метода Среди критериев технико-экономического ха и его экспериментальная отработка Ч необхо- рактера выделяют: расход рабочего времени на димые условия точного воспроизведения методов производство одного исследования;
стоимость в клинико-диагностических лабораториях.
реактивов и доступность их широкому кругу Система унификации методов Ч это непре- практических лабораторий;
влияние реактивов рывный, динамичный процесс, позволяющий со- на здоровье исследователя, их токсичность и вершенствовать методические приемы. В работе канцерогениость;
наличие необходимых для ис по унификации методов участвует широкий круг следования аппаратуры и приборов;
достаточ специалистов, ученых, практических работников ная квалификация исполнителя лабораторного лабораторий. исследования;
возможность адаптации метода В основе выбора унифицированного метода к автоанализаторам. Появление этой группы лежат аналитические, медицинские и технико- критериев обусловлено массовым применением экономические критерии, что позволяет учиты- методов клинической лабораторной диагности вать достижения в области лабораторной ди- ки. В масштабе страны предпочтительнее выби агностики, современный уровень развития мето- рать более экономичные методы при прочих дологии, а также практические возможности равных условиях.
клинико-диагностических лабораторий, без чего При выборе унифицированных методов пред невозможно реальное внедрение унифицирован- почтение следует -отдавать микрометодам. По ных методов в практику. становлением ЦК КПСС и Совета Министров К аналитическим критериям относятся: спе- СССР от 19.08.82г. О дополнительных мерах по цифичность, правильность, воспроизводимость, улучшению охраны здоровья населения предус мотрено развитие медицинского микроанализа, межлабораторных экспериментов по контролю в том числе фотометрического, иммунофермен- качества). Кроме того, унификация методов яв тного и радиоиммунологического. ляется этапом для перехода к более высокой Приказами министра здравоохранения ступени Ч стандартизации методов.
СССР Об унификации клинических лаборатор- Принципы стандартизации клинических ла ных методов исследования до 1984 г. утвержде- бораторных методов исследования предусматри ны в качестве унифицированных около 300 мето- вают разработку ряда научных проблем, касаю дов. щихся системы единых требований к методу Унификация методов способствует повыше- и направленных на улучшение аналитических нию качества работы лабораторий, улучшению качеств метода и сравнимости результатов ис сопоставимости результатов исследования, следования. К первоочередным проблемам стан обеспечивает рационализацию лабораторного дартизации методов относятся: стандартизация обследования, повышает эффективность работы аналитических качеств метода или оценка ана лабораторий в диагностическом и экономиче- литической надежности метода, разработка ре ском отношении, способствует более быстрому ферентных методов, требований к сравнению и организованному внедрению научных дости- методов, разработка требований к построению жений в лабораторную практику и улучшению калибровочных кривых, составление требований материально-технического оснащения лаборато- к характеристике метода, унификация термино рий (разработка готовых аналитических форм логии, стандартизация единиц измерения, раз реактивов, составление перечня оборудования работка требований к стандартным и калибро для клинико-диагностических лабораторий, раз- вочным материалам. Решение перечисленных работка контрольных материалов, адаптация проблем создает теоретические основы стандар методой к автоанализаторам, осуществление тизации методов.
1.2. ОСНОВНЫЕ ПРАВИЛА ПРОВЕДЕНИЯ ЛАБОРАТОРНЫХ АНАЛИЗОВ 1.2.1. Подготовка рабочего места щий как нормальные, так и патологические величины.
и реактивов Удобнее и проще всего налаживать методику Для каждой методики должно быть подго- при наличии готового набора реактивов нужного товлено рабочее место, на котором собраны качества заводского изготовления;
в лаборато нужные реактивы и посуда. Пипетки устанавли- рии остается только приготовить растворы со вают в пробирках, которые стоят в штативах;
на гласно заводской инструкции. Однако таких каждой пробирке (или гнезде штатива) делают наборов часто нет или они оказываются слиш надпись, для какого реактива или операции ком дорогими и приходится использовать ре пипетка предназначается: например, Цветной активы, полученные из разных источников, при реактив или Отсасывание надосадочной жид- этом иногда точно неизвестно, соответствуют ли кости. На флаконы с реактивами приклеивают они по качеству требованиям данной методики.
этикетки с названиями реактивов и датами при- Это наиболее сложный этап налаживания мето готовления. Очень удобно на рабочем месте дики, во время которого приходится проявлять иметь пропись методики, написанную так, что определенную гибкость, не опасаясь в случае каждая новая процедура начинается с новой необходимости взяться за проверку качества, строки. После окончания анализа посуду и ре- а если надо, то и за очистку и синтез некоторых активы убирают, чтобы освободить рабочую простейших соединений.
поверхность стола для других работ. Посуду, в которой выполняются анализы,Ч Налаживание методики Ч один из самых пробирки или пенициллиновые флакончики Ч ответственных этапов лабораторной работы, он не надо надписывать карандашом по стеклу, так начинается после того, как выбран метод, адек- как такие надписи потом трудно удалить, кроме ватный задачам лечебного учреждения и воз- того, карандаш по стеклу при нагревании рас можностям лаборатории (см. раздел 1.1). Пре- ползается и надпись теряется. Лучше всего жде всего надо выписать прописи всех реактивов пронумеровать гнезда в штативе и работать так, и переписать методику, пронумеровав рабочие чтобы анализ пробы с определенным номером процедуры по порядку. Когда реактивы готовы, всегда выполнялся в одном и том же гнезде. Для приступают к анализу калибровочных проб, по этого все образцы биологического материала, данным которых строят калибровочный график. поступившие в этот день в клиническую биохи Если он получился линейным и результаты вос- мическую лабораторию для исследования, нуме производимы, можно переходить к исследова- руют подряд и в дальнейшем всю работу выпол нию биологического материала. няют под номерами. Если же возникает на В некоторых методах рекомендуют прово- добность надписывать пробирки или колбы, дить расчет по результатам исследования одной используемые во время анализа, можно это сде калибровочной пробы, используя правило про- лать, обычным мягким карандашом, предвари порций. Однако и в этом случае при налажива- тельно обработав участок посуды наждачной нии методики, а также при смене реактивов бумагой.
На образовавшийся участок матовой по и длительном перерыве в работе желательно построить калибровочный график, захватываю- верхности хорошо ложится обычный графито вый карандаш, надпись не расползается, но многократном промывании посуды водой. Для легко удаляется обычной резинкой. каждого вида анализов надо отработать адек :
Подавляющее большинство анализов можно ватныйЧ не слишком трудоемкий, но доста с равным успехом проводить как в пробирках, точно надежный метод мытья, убедиться, что он так и в пеннциллиновых флакончиках, однако не искажает результаты исследования и всегда флакончики удобнее, так как могут стоять пользоваться одним и тем же моющим сред на столе без штатива и легко закрываются ством. Какие-либо однозначные советы тут дать пробками. трудно, так как поступающие в продажу сти ральные порошки, помимо основного детерген та Ч алкилсульфоновых кислот, содержат раз 1.2.2. Мытье посуды личные добавки, а разные сорта стекла по Чтобы анализ был успешным, посуда должна разному выщелачиваются и адсорбируют мою быть чисто вымыта, причем для разных исследо- щие средства.
ваний требования к чистоте посуды и, следова- Надо постоянно заботиться также о чистоте тельно, способы мытья неодинаковы. Наиболее той посуды, которую не моют перед каждым широко распространена обработка стеклянной анализом (пипетки и флаконы для реактивов).
посуды хромовой смесью, или, как ее сокра- Иногда вновь приготовленную порцию реактива щенно называют, хромпиком. Для ее приго- можно налить во флакон, в котором еще сохра товления в большую фарфоровую ступку насы- нились остатки предыдущей порции этого же пают кристаллы оихромата калия реактива, но, как правило, остатки выливают и растирают с концентрированной серной кисло- и флакон моют с хромпиком. Делают это потому, той, постепенно увеличивая ее количество, так, что существует угроза развития грибов и микро чтобы раствор был насыщенным. Смесь должна бов, для которых многие реактивы оказываются иметь красноватый оттенок и нагреваться, если если не идеальной, то подходящей средой.
ее налить в мокрую посуду. Когда хромпик Мытье флаконов с хромпиком и высушивание приобретает зеленый цвет и перестает нагре- в горячем сушильном шкафу хотя и не обеспечи ваться, это будет означать, что его способность вают полную стерильность, но значительно к окислению органических соединений исчерпа- уменьшают микробную обсемененность и спо на, в связи с чем он не может более применяться собствуют лучшей сохранности реактивов. То же для мытья посуды. Хромовую смесь наливают относится и к пипеткам, которыми реактивы в колбы, цилиндры и т. д. или погружают в нее отмеривают.
более мелкие предметы Ч пипетки, флакончики и т. п. Перед тем как обрабатывать посуду хром 1.2.3. Приготовление реактивов пиком, надо тщательно удалить все видимые на и проверка их чистоты глаз загрязнения, в том числе надписи каранда шом по стеклу. В противном случае хромовая Теоретически совершенно чистых реактивов смесь быстро портится, но, главное, при взаимо- не существует, в каждом препарате есть какое действии с органическим веществом могут обра- то количество примесей. Практически важно зовываться ядовитые пары и выделяться тепло, только, чтобы они не препятствовали данному что таит в себе опасность взрыва. анализу. В связи с тем что разные партии могут Хромовая смесь Ч очень едкий реактив: он содержать различные примеси, не всегда огово прожигает одежду, а попадая на кожу, вызыва- ренные в стандарте на данный реактив, может ет ожоги. Поэтому, если возможно, лучше по- оказаться, что одна партия для конкретного льзоваться менее едкими средствами Ч содой, вида исследования пригодна, а другая непри мылом, стиральным порошком. Если посуду мо- годна, хотя обе имеют одинаковую квалифика ют, погружая ее в моющие-растворы, то сначала цию. По этой причине следует с определенной надо удалить грязь и надписи с внешней по- осторожностью решать, что препарат такой-то верхности и вымыть ее теплой водой с мылом;
квалификации для данного исследования непри если надписи сделаны стеклографом (каранда- годен. Некоторые способы проверки пригодности реактивов и их очистки приведены в соответству шом по стеклу), их удаляют ватой, смоченной ющих разделах справочника.
в органическом растворителе (хлороформ, эфир Приготовление реактива начинается с взве и т. д.). Грязь на внешней поверхности не только портит моющие растворы, но и может попасть шивания. Надо готовить такое его количество, с ними на внутреннюю поверхность посуды. которое может быть израсходовано за месяц Каждый способ мытья посуды имеет свои (самое большое Ч за 2 мес), но в то же время преимущества и недостатки;
он должен йыть навеска не должна быть менее 20Ч30 мг, так как адекватен тому виду анализа, для выполнения иначе точное взвешивание весьма осложняется.
которого посуда предназначается, поэтому же- При приготовлении калибровочных растворов лательно всегда использовать один и тот же в прописях обычно указывают круглые.числа, комплект посуды. Мытье хромпиком обеспечива- например 100 мг или 0,2 ммоля, которые должны ет степень чистоты, достаточную практически быть растворены в 50 или 100 мл растворителя.
для всех видов лабораторных клинических ра- Если реактив дефицитен или навеска мала, бот, но способ этот трудоемок и требует соблю- удобнее точно взвесить то количество реактива, дения мер предосторожности. Стиральные по- которое сразу же попало на весы: допустим, рошки безопаснее и работать с ними проще, но вместо 10 мг взять 9,3 мг и растворить их в мень надо иметь в виду, что они прочно адсорбиру- шем количестве воды (в данном случае не ются на стекле и могут быть удалены только при в 100 мл, а в 93 мл). Растворы обычно отмерива ют с помощью мерной посуды Ч мерных колб тивны автоматические пипетки со сменными и цилиндров, но иногда бывает удобно взвесить наконечниками для фиксированных или изменя растворитель на весах, особенно если нужно емых объемов. В такой пипетке имеется пор отмерить большие и некруглые количества (на- шень, при перемещении которого засасывается пример, 1450 мл). Это часто оказывается точнее, или выдавливается определенный объем возду чем отмеривание нескольких объемов;
не надо ха, в результате чего в сменный наконечник только забывать, что относительная плотность пипетки сначала засасывается, а затем вытесня многих растворов отлична от I. ется оттуда определенный объем жидкости. Су Часто в прописях используют понятие про- ществуют автоматические пипетки с тремя или центный раствор;
оно не совсем точно, поэтому большим числом наконечников, которые по су в настоящем справочнике везде приведены со- ществу представляют собой несколько пипеток, ответствующие разъяснения. Строго говоря, объединенных в один блок, с единой системой процент Ч это одна сотая часть среди каче- управления, так что одновременно заполняются ственно одинаковых частей. Поэтому когда гово- или опорожняются несколько наконечников. Это рят о 3 % растворе, формально следует пони- позволяет ускорить розлив реактивов.
мать такой раствор, в 100 г которого содержится Автоматический дозатор представляет собой 3 г данного вещества и 97 г каких-то других поршень с цилиндром, который через систему составных частей. Однако в химической литера- клапанов соединен с резервуаром реактива и на туре иногда неправильно называют процент- конечником. За один рабочий ход дозатор запо ным такой раствор, в 100 мл которого со- няет рабочий цилиндр реактивом, а за второй держится 3 г данного вещества. Молярные выпускает отмеренную порцию через наконеч растворы действительно готовят так, чтобы ник. Заполнение и опорожнение цилиндра может I л содержал столько-то молей растворенного производиться либо вручную, либо с помощью вещества;
этот принцип неправильно распро- электропривода. Аналогично дозатору устроен страняют и на процентные растворы. и дилютер, который отличается лишь тем, что Иногда используют понятие лобъемные про- сначала через наконечник засасывает опреде центы, которое предполагает, что данный ленный объем разводимой жидкости (обычно раствор получен путем смешивания А объемов сыворотки), а затем через тот же наконечник растворенного вещества и 100-А объемов выпускает больший объем разводящей жидко растворителя. В связи с тем что при, смешивании сти (реактива), при этом происходит разведение жидкостей суммарный объем смеси обычно ме- и перемешивание.
няется, такой способ выражения нельзя считать При отмеривании растворов стеклянной пи удачным. Правильнее обозначать соотношение петкой с делениями нижний мениск жидкости частей знаком двоеточие (:). Так, запись во- должен быть на уровне соответствующего деле да : спирт : ацетон 1: 2: 3 означает, что дан- ния пипетки, которую располагают строго верти ная смесь получена путем смешивания 1 объема кально. Пипетку заполняют и опорожняют с по воды, 2 объемов спирта и 3 объемов ацетона. мощью резиновой груши или шприца, соеди Растворы с точными концентрациями, осо- ненного с пипеткой резиновой трубкой. Недо бенно калибровочные и буферные, надо готовить пустимо засасывать растворы ртом, так как при в мерных колбах;
мерные цилиндры можно ис- этом в рот могут попасть ядовитые жидкости, пользовать только при отсутствии высоких тре- слюна же почти неизбежно попадает в пипетку, бований к точности. Некоторые работники, пы- а из нее в реактивы и опытные пробы.
таясь сэкономить время, при приготовлении После того как пипетка заполнена с по раствора насыпают навеску непосредственно в мощью резиновой груши, ее можно отсоединить, мерную колбу, растворяют ее там и доводят закрыть отверстие пипетки пальцем и осторожно объем до метки. Так можно поступать лишь выпускать раствор, но при соответствующем на в исключительных случаях, так как мерная посу- выке удобнее регулировать вытекающие объемы да значительно дороже немерной, а когда насы- жидкости, надавливая на грушу. Оправдывает пают вещество через узкое горлышко, а затем себя и такая система, когда пипетка вертикально перемешивают и нагревают для растворения, укреплена в штативе Бунзена, а с помощью колбу легко разбить.
другой лапки на том же штативе укреплены Навеску вещества растворяют в широко- шприц или резиновая груша. Перемещая пор горлой колбе или в химическом стакане в коли- шень шприца, можно заполнять пипетку и вы честве растворителя, которое составляет от 30 до пускать нужные порции реактива.
80 % окончательного объема, а затем перелива- Сухие вещества для приготовления реакти ют в мерную колбу, споласкивают посуду, в ко- вов взвешивают на аналитических, аптечных торой готовили раствор, новой порцией раство- или технических весах, работа с которыми опи рителя, добавляют его в мерную колбу, а затем сывается в соответствующих заводских инструк уже доводят объем до метки. циях и специальных руководствах. Заметим только, что аналитические весы должны быть установлены на капитальных стенах по возмож 1.2.4. Отмеривание растворов, ности дальше от нагревательных и отопительных взвешивание, центрифугирование приборов, а также шахт лифтов;
устанавливает и юстирует весы метрологическая служба, кото Для отмеривания растворов применяют пи- рая выдает соответствующий документ (пас петки различных конструкций (в том числе порт). Необходимо систематически проверять автоматические) и дозаторы. Наиболее перспек- разновесы и делать об этом запись в паспорте.
Взвешивание Ч вполне надежная процедура, зонтально, поэтому осадок ложится точно на дно которая, как правило, не служит источником пробирки и его граница строго перпендикулярна ошибок, однако и здесь необходимы тщатель- длинной оси. Это облегчает количественное от ность и определенный навык. деление осадка от надосадочной жидкости, од Лабораторные центрифуги могут иметь два нако если осадок неплотный, то вследствие типа роторов: угловые и с подвесными стаканчи- толчков при остановке центрифуги может обра ками;
часто одна и та же центрифуга снабжа- зоваться муть.
ется несколькими сменными роторами, рассчи- Каждая центрифуга обязательно снабжа танными на разное количество пробирок. В угло- ется прочным защитным кожухом, крышка кото вом роторе гнезда для пробирок неподвижные, рого должна быть закрыта во время работы.
расположены под углом около 45 " как во время Если пробирка длиннее, чем гнездо ротора, она установки пробирок, так и во время вращения, мешает крышке закрываться. У неопытных ра поэтому граница осадка идет косо, что затрудня- ботников возникает искушение включать цен ет отсасывание последних порций надосадочной трифугу с открытой крышкой;
этого делать ни жидкости. в коем случае нельзя, так как под действием В роторе с подвесными стаканчиками до центробежной силы пробирка может сломаться начала вращения пробирки стоят вертикаль- и осколки стекла с большой силой разлететься но, а во время вращения располагаются гори- и поранить окружающих.
1.3. ЕДИНИЦЫ СИ В КЛИНИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ В I960 г. Генеральная конференция по мерам Та б л иц а 2. Примеры производных единиц СИ и весам приняла Международную систему еди ницЧ СИ (Systeme InternationaleЧSI) как единую универсальную систему для всех отрас лей науки, техники и производства. Стандарт СЭВ СТ СЭВ 1052-78 сЕдиницы физических величин предусматривает введение Междуна родной системы единиц в странах Ч членах СЭВ с 1980 г. XXX сессия Всемирной ассамблеи здравоохранения, состоявшаяся в 1974 г., реко мендует применять СИ во всех областях медици ны, включая практическое здравоохранение.
В основу СИ (табл..1) положена метрическая система. Название системы происходит от грече ского слова метрон, что означает Ч мера. СИ состоит из единиц трех типов: основных (7), дополнительных (2), производных (табл. 2).
Та блица 1. Основные единицы СИ Единица обозначение Величина наимено между рус вание народ ское ное Длина метр m м Масса килограмм кг kg Время секунда s с Сила электри ческого тока ампер А А Термодинами ческая темпе ратура кельвин К К Количество ве щества моль mol моль Сила света кандела cd кд основных единиц, путем умножения или деления можно получить производные единицы.
Дополнительные единицы Ч радиан и стера- Сочетание основных единиц для образования диан. производных иллюстрирует одно из основных Производные единицы образуются из основ- преимуществ СИ. Внутри системы нет ни одного ных в соответствии с правилами Международ- коэффициента перевода, кроме 1. Поэтому такая ной системы единиц. Сочетая две или более система называется когерентной (согласован Та б л ица 3. Множители и приставки для ральной конференцией по мерам и весам для образования десятичных кратных и дольных использования на ограниченный период време единиц и их наименований ни: мм рт. ст., калория,и др.
В клинической лабораторной диагностике Международную систему единиц рекомендуется применять в соответствии со следующими прави лами.
1. В качестве единиц объема следует приме нять литр. Не рекомендуется в знаменателе применять дольные или кратные от литра (1 мл, 100 мл).
2. Концентрация измеряемых веществ указы вается как молярная (моль/л) или как массовая концентрация (г/л).
3. Молярная концентрация используется для веществ с известной относительной молекуляр ной массой. Ионная концентрация указывается в виде молярной.
4. Массовую концентрацию используют для веществ, относительная молекулярная масса ко торых неизвестна.
5. Плотность указывается в г/л;
клиренс Ч в мл/с.
6. Активность ферментов на преформиро ванное количество веществ по времени и объему выражается как моль/(с- л);
мкмоль/(с- л);
нмоль/(с-л).
При переводе единиц массы в единицы коли чества вещества (молярные) коэффициент пере ной) системой. Некоторым производным едини цам даны специальные названия Ч паскаль, ньютон, джоуль и др. Единицы СИ, как основ ные, так и производные, могут быть для практи Соответствующая ческих целей неудобными по размерности. Поэ Исходная единица единица количества тому в табл. 3 приводятся 16 приставок, при массы вещества (молярная) помощи которых возможно образование деся тичных кратных и дольных единиц.
грамм (г) моль (моль) Наряду с единицами СИ допускается приме миллиграмм (мг) миллимоль (ммоль) нение ряда единиц без ограничения срока на микрограмм (мкг) микромоль (мкмоль) равне с единицами СИ, в том числе тонна, нанограмм (нг) наномоль (нмоль) минута, час, сутки, литр. Другая группа единиц, не принадлежавших СИ, была принята Гене 1.4. ОЦЕНКА АНАЛИТИЧЕСКОЙ НАДЕЖНОСТИ КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ Качество результата лабораторного исследо- надежности метода проводить не в одной, а в не скольких точно работающих (референтных) ла вания зависит от многих факторов (качества реактивов, оборудования, квалификации лабо- бораториях с соблюдением всех указаний по рантов), важное значение имеет также и каче- применению метода.
ство метода. Для объективной оценки аналити- Количественные аналитические методы кли нических лабораторных исследований разнооб ческих качеств метода рекомендуется оценка его разны и используются для определения различ аналитической надежности.
ных веществ, поэтому описываемые способы В отличие от системы контроля качества оценки надежности метода могут быть пригодны работы лабораторий, которая должна давать ежедневную информацию о качестве получае- не для всех методов. Оценке аналитической на мых.в лаборатории результатов, оценка анали- дежности должны подвергаться методы, реко тической надежности метода Ч продолжитель- мендуемые для официального утверждения, но ный процесс, во время которого постепенно вые и существенно модифицированные методы.
накапливается информация об аналитических Основными критериями, по которым оцени качествах метода. При оценке надежности мето- вается метод, являются следующие: воспроизво да задача состоит в выявлении погрешностей, димость, правильность, специфичность, чувстви зависящих от метода;
поэтому важно оценку тельность.
1.4,1. Воспроизводимость Такой способ оценки воспроизводимости по зволяет объективно оценивать и сравнивать Воспроизводимость результатов Ч соответ- воспроизводимость различных методов.
ствие результатов повторных определений в од ном и том же материале. Воспроизводимость не 1.4.2. Правильность имеет числовой величины, она определяется сте пенью разброса результатов. Воспроизводи мость аналитического метода определяется вос- Правильность результатов Ч соответствие производимостью результатов, полученных этим среднего значения результатов повторных опре делений одного и того же материала должной методом.
Понятие, обратное воспроизводимости,Ч (номинальной) величине. Правильность не име разброс результатов, или аналитическая вариа- ет числовой величины, она определяется непра ция, зависит от наличия случайных погрешно- вильностью.
стей и может быть охарактеризовано количе- Правильность метода определяется правиль ственно. В зависимости от условий определения ностью результатов, полученных этим методом, различают аналитическую вариацию в серии, во и зависит от наличия систематических погреш времени и межлабораторную. Воспроизводи- ностей метода. Систематическая погрешность мость метода зависит от случайных погрешно- метода может быть обусловлена рядом причин:
стей, обусловленных количеством процедур ме- неспецифичностью метода или неправильным тода (осаждение, центрифугирование, пипетиро- способом построения калибровочной кривой, ис пользованием калибровочного материала недо> вание), а также стабильностью окрашенного комплекса и другими причинами. Воспроизводи- статочной степени чистоты, неправильной поста мость рассчитывают либо по двум параллель- новкой холостой пробы и т. д.
ным результатам при исследовании различных Статистическим критерием правильности яв образцов, либо по результатам повторных опре- ляется средняя арифметическая (X) и степень ее делений на одном и том же контрольном матери- отклонения от должного (номинального) значе але в течение не менее 20 дней, следующих друг ния. Способами определения правильности мо за другом. Контрольный материал должен быть гут быть следующие.
стабильным в течение всего периода проверки. Способ д о б а в к и Ч внесение в биоло Можно использовать пригодный слитый биоло- гическую жидкость точно взвешенного количе гический материал. ства анализируемого вещества и определение Статистическим показателем разброса ре- его с помощью исследуемого метода.
зультатов является среднеквадратическое от- Способ с м е ши в а н и я проб Ч био клонение S и относительный показатель разбро- логическая жидкость с низкой и с высокой са результатов Ч коэффициент вариации концентрацией исследуемого вещества смеши V. Сравнивают аналитическую вариацию метода вается в различных соотношениях.
с помощью F-теста. Способы добавки и смешивания проб (по следний может быть применим в методах опреде ления активности ферментов, где невозможно использовать способ добавки) не всегда позво ляют определить систематическую погрешность метода. Например, добавленное количество кре атинина, определенное по реакции Яффе, может дать хороший процент выявления, однако мето ды, основанные на реакции Яффе, дают непра вильные результаты за счет низкой специфично сти метода. Процент выявления вещества, рав ный 90Ч110, считается удовлетворительным для клинических лабораторных методов.
Ис с л е д о в а н и е к о нт р о л ь но г о ма т е р и а л а с известным содержанием ком понентов Ч наиболее простой способ оценки правильности. Однако он может быть использо ван только для быстрой ориентировочной оценки правильности метода. Обязательным условием, кыми определениями;
п Ч число определении;
ограничивающим возможности этого способа, S Ч среднеквадратическое отклонение;
VЧ ко- является использование метода, который ука эффициент вариации;
F Ч тест оценки вариации зан в аннотации к контрольному материалу.
методов. Процедура изготовления контрольного материа Воспроизводимость определяют на разных ла, хранение его, вид используемой сыворотки уровнях концентрации Ч нормальном и патоло- могут в значительной степени изменить истинное гическом. Это позволяет более полно охаракте- содержание компонента. Особенно большим из ризовать воспроизводимость метода на всем менениям могут подвергнуться ферменты.
диапазоне измеряемых концентраций. Чем мень- Ср а в не ни е методов. Наиболее ин ше коэффициент вариации, тем выше воспро- формативным способом является способ сравне изводимость результатов, получаемых тем или ния методов, который позволяет определять иным методом. общую систематическую погрешность метода.
Смысл сравнения методов состоит в сравнении где X, Р Ч средние арифметические результатов результатов, полученных методом-кандидатом сравниваемых методов;
га Ч ошибка средней (т. е. методом, правильность которого исследу- арифметической.
ется) и сравнительным методом, который дол- Наиболее достоверные результаты тест жен давать правильные результаты. Поэтому Стьюдента дает при нормальном распределении крайне важную роль играет правильность мето- результатов. Поэтому в тех случаях, когда рас да, используемого для сравнения. Оптимальным пределение результатов не является нормаль для этих целей является применение референт- ным или вид распределения невозможно опреде ного метода. лить из-за малого числа наблюдений, рекомен Референтный (эталонный) метод Ч это ме- дуется использовать непараметрические крите тод, обладающий максимальной специфично- рии статистики Ч критерий знаков, тест Вилкок стью, правильностью и воспроизводимостью ре- сона (F. Wilcoxon).
зультатов определения без учета экономических Преимуществом непараметрических крите затрат. Он служит главным образом для сравне- риев является их независимость от вида распре ния методов при оценке аналитической надежно- деления результатов и простота расчета. Крите сти унифицированных и других методов. Однако рий знаков эффективен при большом числе референтные методы могут быть недоступны ла- определений. Он учитывает не степень разли бораториям, и для определения ряда компо- чий в каждой паре, а лишь их направленность нентов они еще не разработаны. Поэтому в каче- (знак) и основан на подсчете числа разностей стве сравнительных могут использоваться мето- между результатами X и F со знаком + или Ч.
ды, правильность которых исследована и резуль- Если число наблюдений невелико и критерий таты не дают существенного отклонения от знаков не выявил различий, целесообразно при истинных величин. менить критерий Т Ч парный критерий Вилкок Для более точной оценки правильности мето- сона. Критерий Т более чувствителен, чем крите да-кандидата сравнение методов следует прово- рий знаков. Заключения строят на достигнутом дить в соответствии с правилами сравнения уровне значимости.
методов. Эти правила предусматривают точное Для целей лабораторной диагностики доста соблюдение всех письменных указаний по при- точен уровень значимости р = 0,05. Полученные менению метода, проведение исследований под значения сравнивают с табличными. Если контролем качества с применением единого кон- р<0,05, то различия между методом-кандида трольного материала для гарантии стабильности том и сравнительным методом достоверны, условий исследования. В сравниваемых методах т. е. метод-кандидат имеет систематическую должны быть проверены точность и линейность ошибку. Если р>0,05, то различия на достигну калибровочных кривых, по возможности приме- том уровне значимости недостоверны, т. е. ме няться одни и те же реактивы, приборы, работа тод-кандидат может быть правильным. Даль должна проводиться одними и теми же лабо- нейшая обработка результатов состоит в оценке рантами. Правильность метода оценивается на статистической связи.
всем диапазоне измеряемых концентраций, поэ- Для о це нк и с т а т и с т и ч е с к о й тому рекомендуется исследовать образцы с низ- с в я з и можно использовать корреляционным кими, нормальными и повышенными концен- метод и метод регрессии. Корреляционный метод трациями вещества. Сравнение методов можно менее информативен, чем метод регрессии. Кор проводить на контрольном материале и на био- реляция указывает на степень связи двух рядов логическом материале, полученном от больных чисел, т. е. изучается зависимость между резуль татами X и У двух методов. Для определения и здоровых лиц;
очень важным является выбор метода для сравнения. корреляции рассчитывают линейный коэффици ент корреляции r и коэффициент ранговой кор реляции р, при расчете которого результаты 1.4.3. Статистическая оценка оценивают порядковыми номерами Ч рангами правильности результатов от меньших результатов к большим. Порядко вый номер каждого результата является его Статистическая обработка результатов со- рангом.
Формула расчета коэффициента корреляции:
стоит в оценке степени совпадения результатов, полученных методом-кандидатом и сравнитель ным методом. Ниже приводится статистический способ оценки результатов сравниваемых мето дов, не требующий специальной вычислительной техники и позволяющий судить о правильности метода-кандидата.
Для оценки правильности определяются до стоверность различий результатов и наличие статистической связи.
Опр е д е л е ние д о с т о в е р но с т и р а з л и ч и й ре з у ль т а т ов. Для этого при меняют тест Стьюдента:
Формула расчета коэффициента ранговой репрезентативными представителями тех групп корреляции:
веществ, которые с физиологической точки зре ния имеют практическое значение.
Интерференция в отличие от неспецифично сти обусловлена влиянием веществ на ход ре акции. Способ влияния (повышение, пониже ние) и степень влияния могут быть различными.
Важным аспектом этой проблемы является интерференция лекарств. Лекарственные веще ства в зависимости от вида, дозы, способа знак сумми применения могут воздействовать на результаты лабораторных исследований различными путя ровании.
ми: различают фармакологическую интерферен Коэффициенты корреляции могут колебаться цию в организме и техническую интерференцию от 0 до +1 при положительной корреляции и от в ходе выполнения анализа.
0 до Ч1 Чпри отрицательной корреляции.
Низкая специфичность, интерференция сни При хорошем совпадении результатов срав жают правильность метода. Поэтому предпочте ниваемых методов значение r будет около ние следует отдавать более специфичным мето 1 (0,9Ч0,99). Чем ниже величина коэффициента дам и свободным от интерференции!
корреляции, тем меньше степень совпадения ре :
зультатов сравниваемых методов. При отсут ствии связи между результатами r=0. Если 1.4.5. Чувствительность корреляция отрицательна, при изменении ре зультатов группы X результаты группы Y будут Аналитическая чувствительность метода оп изменяться в противоположном направлении.
ределяется его способностью выявлять наимень Метод рег рессии. Если корреляция шие различия между двумя концентрациями указывает на степень связи, то регрессия позво исследуемого вещества. В процессе калибровки ляет определить, как количественно меняется устанавливается диапазон линейности калибро один результат по мере изменения другого. Для вочной кривой, что является частью аналитиче построения эмпирической линии регрессии на ской характеристики метода. В диапазоне линей диаграмму наносят парные результаты в виде ности аналитическая чувствительность опреде точек: на оси абсцисс Ч сравнительного метода, ляется наклоном калибровочной кривой.
на оси ординат Ч метода-кандидата. Диаграм Нижний предел чувствительности метода Ч ма дает первое представление о типе связи это концентрация исследуемого вещества, кото между двумя методами. При линейной регрессии рая соответствует наименьшему результату точки располагаются вокруг прямой линии. Если определения, статистически достоверно отлича регрессия нелинейна, то требуется дальнейшая ющемуся от показателей холостой пробы. Ни доработка метода-кандидата, т. е. он непригоден жний предел чувствительности метода может для целей лабораторной диагностики.
быть охарактеризован количественно.
Линейную регрессию рассчитывают по фор Практически определить нижний предел чув муле:
ствительности для фотометрических методов можно следующим образом: проводят многок ратное исследование (не менее 20) холостой где х Ч результаты сравнительного метода;
у Ч пробы и проб с низкой концентрацией анализи результаты метода-кандидата;
а Ч значение у руемого вещества и устанавливают с заданным при х, равном 0;
в Ч коэффициент пропорцио- уровнем значимости статистически достоверные нальности илн регрессии. различия между результатами холостой и опыт Если а статистически отличается от 0, то ной проб с низким значением анализируемого метод-кандидат имеет систематическую погреш- вещества, которое и будет количественно со ность по отношению к сравнительному методу. ответствовать нижнему пределу чувствительно Эта ошибка может быть приемлемой и непри- сти метода.
емлемой. Экспериментально установлено, что обычно нижний предел чувствительности в фотометри ческих методах равен среднему значению холо 1.4.4. Специфичность стой пробы плюс 3 средних квадратических отклонения (X+3S).
Аналитическая специфичность метода Ч спoсобность метода измерять лишь тот компо 1.4.6. Принципы определения допустимых нент или те компоненты, для определения кото погрешностей результатов лабораторных рых он предназначен. Низкая специфичность приводит к получению неправильных результа- исследований тов и должна быть указана в описании метода.
Оценка специфичности не имеет завершения, Проблемы, связанные с повышением анали поскольку любое вещество может повлиять на тической надежности результатов лабораторных результаты. Для оценки аналитической специ- исследований, направлены не только на улучше фичности следует использовать примеси, кото- ние их аналитических качеств, но и на повыше рые, исходя из химической структуры, являются ние диагностической информативности лабора торных тестов. В этом основной смысл работы, должны соответствовать наибольшей точности;
которая проводится в области лабораторной Более высокая степень биологической вариации аналитики. Однако будет неправильно и эконо- обнаруживается у веществ, участвующих в про мически не оправдано стремиться к необосно- цессах анаболизма. К этой группе веществ ванной. наибольшей точности результатов лабо- относятся глюкоза, холестерин. Наибольшую раторных исследований. Необходимый уровень биологическую вариацию имеют вещества, явля точности, соответствующий клиническим целям, ющиеся конечными продуктами катаболизма,Ч или допустимый предел погрешности результа- мочевина, мочевая кислота, креатинин и веще тов лабораторных исследований должен быть ства, выделяющиеся из тканей, например лак установлен на научной основе. татдегидрогеназа, аминотрансферазы и Общая погрешность результатов, анализа, др'. К точности определения веществ этой группы получаемая количественными аналитическими предъявляются менее высокие требования, так методами, зависит от наличия систематической как указанные вещества в норме имеют широ погрешности, характеризующей неправиль- кую биологическую вариацию.
ность, и случайной погрешности, характеризую- Таким образом, во всех случаях при расчете щей аналитическую вариацию (разброс). допустимых пределов погрешности метода инди Пр инцип ы определения допустимой ана- видуально для каждого вещества устанавлива литической вариации базируются на следую- ются необходимая точность или допустимые щем. Прежде всего должна быть установлена пределы ошибок. Каждое вещество в конечном аналитическая вариация метода, что позволит счете исследуется для определенных клиниче реально оценить разброс результатов, получае- ских целей Ч установления диагноза, контроля мых тем или иным методом. Далее величину за лечением, обследования здоровых. В зависи полученной аналитической вариации сравнива- мости от поставленной цели будут меняться ют с биологической вариацией. Смысл такого и требования к точности результатов. Поэтому сравнения состоит в определении степени влия- окончательный критерий в оценке допустимой ния аналитической вариации на биологическую, погрешности должен основываться на определе тем самым определяется степень влияния анали- нии влияния аналитической вариации на диагно тической вариации на расширение диапазона стическую информативность результатов анали нормальных или референтных величин. за, т. е. носить медицинский характер. Медицин Соотношение между различными видами ва- ски допустимые пределы погрешностей в различ риации определяется следующим уравнением: ных клинических ситуациях будут различными;
например, при повторном исследовании лабора торного показателя у одного и того же больного медицински допустимые пределы погрешности будут более строгими Ч они включают внутри индивидуальную и аналитическую вариации изо дня в день. При диспансеризации здоровых наи большее значение для разделения нормы и пато логии будет иметь межиндивидуальная вариа Биологическая вариация имеет два источни ция, при этом медицинские требования к точно ка: внутрииндивидуальная и межиндивидуаль сти могут быть снижены.
ная вариации:
Для оценки медицински допустимых преде лов погрешностей может быть использован оп рос мнений врачей-клиницистов и лабораторных работников [Меньшиков В. В., Делекторская меньше 0,4 влияние аналитической вариации на Л. Н., 1980;
Barnett R., 1968, 1977|. С этой целью общую будет незначительным. лечащие врачи для определенного вида патоло Существуют и другие способы определения гии, например сахарного диабета, устанавлива соотношения аналитической и биологической ва- ют концентрацию исследуемого компонента риаций. Например, по D. Tonks (1968), коэффи- (глюкозы) выше верхнего предела нормальных циент вариации метода не должен превышать значений, за пределами которого начинается, по 1/8 области нормальных пределов в процентах их мнению, определенный вид патологии (са от средней величины нормы. При этом нормаль- харный диабет), например для глюкозы в сыво ные величины рассматриваются как совокуп- ротке крови Ч 110 мг/100 мл (18 мг/100 мл Ч ность аналитической и биологической вариаций. 1 ммоль/л) при верхнем пределе нормы Следовательно, для достижения точности, 90 мг/100 мл.
необходимой для клинических целей, важна не Величина, превышающая верхний предел только величина аналитической вариации, но нормальных значений (20 мг/100 мл в нашем и ее соотношение с биологической вариацией. примере) является мерой медицински допусти Степень же биологической вариации определя- мого отклонения. Эту величину можно использо ется физиологической ролью веществ в орга- вать для расчета медицински допустимого ко низме. В связи с этим м'ожно выделить группу эффициента вариации и последующего его срав веществ, имеющих наилучшую гомеостатиче- нения с аналитической вариацией, получаемой скую регуляцию, т. е. имеющих наименьшую при определении тех же компонентов. Если биологическую вариацию. К ним относятся та- 110 мг/100 мл в приведенном примере являются кие вещества, как натрий, хлор, общий белок, средней величиной (X), полученной на основа калий. Результаты определения таких веществ нии ответов лечащих врачей, то 20 мг/100 мл характеризуют медицински допустимый раз- Клиническая биохимия брос, который при 95 % доверительной веро ятности можно принять за 2S, следовательно, Адреналин 7 Креатинин в приведенном примере S равно 10 мг/100 мл. Алаиинаминотранс- Креатинкиназа Отсюда величина медицински допустимой ана- фераза 7 Лактатдегидроге литической вариации, выраженной в V, равна: Альбумин 3 наза а-Амилаза 10 Лейцинаминопеп Аммиак 5 тидаза Х100 9%.
Аспартатамино- Липиды общие трансфераза 7 Магний Белок общий 3 Медь Определение медицински допустимых преде- Белковые фракции 8 Мочевая кислота лов погрешностей позволит в ряде случаев, не Билирубин 10 Мочевина добиваясь большей точности, чем она требуется Глюкоза 5 Натрий в определенных клинических обстоятельствах, Глюкозо-6-фосфат- Норадреналин тем самым избежать увеличения расходов на дегидрогеназа 8 Триглицериды Проведение анализов.
у-Глутамилтранс- Фосфор Количественная характеристика аналитиче- пептидаза 10 Фосфатаза щелоч ских качеств метода и определение допустимых Железо 5 ная - пределов погрешностей метода направлены на Иммуноглобулины 7 Хлор повышение диагностической значимости, эконо- Калий 2 Холинэстераза мической эффективности лабораторных тестов.
Кальций 2 Холестерин Ниже приведены допустимые пределы анали Кортнзол Гематология тической вариации в процентах для ряда ве ществ, принятые рабочей группой экспертов Гемоглобин стран Ч членов СЭВ по научной разработке и Гематокрит унификации методов и средств клинической ла Лейкоциты бораторной диагностики.
Эритроциты 1.5. КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 1.5.1. Внутрилабораторный воротки, необходимое на день работы (от 10 до 30 мл каждой), находится в зависимости от контроль качества объема работы лаборатории.
Контрольные материалы. Прямой контроль Этапы приготовления сыворотки: остающую качества в лаборатории невозможен, так как ся от ежедневных проб сыворотку от больных истинная величина исследуемого компонента в сливают и хранят в пластиковых бутылях при пробе больного неизвестна. Однако точность Ч 20 С. Последующие порции сыворотки слива и правильность техники анализа можно контро- ют на замороженную смесь прямо в бутыль.
лировать, исследуя пробы специального кон- Гемолизированную, желтушную, липемическую трольного материала. Такие образцы биологиче- и загрязненную сыворотку, а также сыворотку ских препаратов, именуемые в зависимости от их больных с подозрением на гепатит отбрасывают.
квалификации стандартными, эталонными, кон- За 2 нед перед розливом сыворотку оттаива трольными и т. п., имеют ряд преимуществ перед ют при комнатной температуре, тщательно пере другими способами контроля. Как правило, их мешивают стеклянной палочкой или при помощи можно изготовить в относительно больших коли- магнитной мешалки. Слив центрифугируют при чествах, что позволяет применять их сразу во 3000 об/мин в течение 10Ч20 мин в нескольких многих лабораториях, обеспечивая в течение удобных бутылях для оседания фибрина, кото длительного времени единство измерения. Кроме рый может присутствовать (ие подвергать дей того, образцы готовят идентичными анализируе- ствию света). Сыворотку фильтруют и разлива мым веществам, что уменьшает погрешности, ют в соответствии с ежедневной потребностью обусловленные несоответствием образцов и ана- (по 3, 5, 10, 15 мл) в пузырьки и плотно укупори лизируемых проб. К настоящему времени разра- вают. Хранят пузырьки в вертикальном положе ботано несколько видов контрольных материа- нии при Ч20 С. Этот слив можно использовать лов: слитая сыворотка (замороженная или лио- как нормальную контрольную сыворотку для филнзированная, приготовленная в лаборато- биохимических исследований.
рии), сыворотка, изготовленная промышленным Контроль воспроизводимости (метод кон путем с неисследованным и с исследованным трольных карт. Установление контрольных содержанием компонентов.
пределов). После приготовления контрольной Пр и г о т о в л е н и е с лит ой сыво- сыворотки устанавливают содержание в ней раз рот ки. Клиническая лаборатория каждый личных компонентов. В связи с тем что невоз день собирает остатки сыворотки от проб боль- можно получить одну и ту же величину для ных с целью контроля качества. Количество каждого компонента из-за изменчивости лабо нормальной и патологической контрольной сы- раторных результатов, определяют допустимую область, или контрольные пределы исследова- вверх и вниз от средней и параллельно ей прово ний. Для этого каждый компонент, исследуемый дят (в соответствии с масштабом) прямые, в лаборатории, определяют в контрольной сыво- которые обозначают +15, +2S, +3S, Ч1S, ротке 20 раз в течение 2Ч3 нед. Ч 2S и Ч3S (см. пример построения контроль Полученные результаты подвергают ста- ной карты для определения хлоридов).
тистическому анализу на каждый компонент Каждый результат, полученный при исследо по следующей схеме: вании контрольного материала той же серии 1) определение средней (А) и среднеквадра- в последующие дни, отмечается на карте в виде тического отклонения (S);
точки и служит для оценки воспроизводимости 2) исключение сомнительных значений с по- лабораторных исследований.
мощью критерия Т или если они попали за Ин т е р п р е т а ц и я ре з у л ь т а т ов к о н т р о л ь н ых ис с л е д о в а ний. 95% пределы X 2S;
аналитических результатов исследования кон 3) перерасчет средней и среднеквадратиче трольной сыворотки должны находиться внутри ского отклонения;
контрольных пределов, т. е. результаты 19 из 4) определение контрольных пределов 20 анализов должны оказаться внутри Х2S, Х 2S.
причем результаты должны распределяться при Пр и г о т о в л е н и е к о н т р о л ь н ых мерно с одинаковой частотой на каждой стороне карт. После установления статистических па от линии средней.
раметров строят карту контроля качества, от Контрольная карта дает возможность в кладывая на оси абсцисс дни исследования, а на очень наглядной форме своевременно выявить оси ординат Ч концентрацию компонента в со и предотвратить ошибки в выполнении методики ответствующих единицах. Через середину орди и тогда, когда результаты анализов контроля не наты параллельно абсциссе проводят прямую выходят за принятые границы.
(она означает среднюю и обозначается Х), а Построение контрольной карты для определения хлоридов п= Ниже приведены характерные примеры ванным содержанием компонентов. Сыворотка предупредительных и контрольных критериев, с исследованным содержанием используется так ориентируясь на которые можно даже без расче- же, как и неисследованная;
различие состоит тов обнаружить изъяны в работе лабораторий, только в том, что в ней среднюю и среднеквадра О недостатках предупреждают следующие при- тическое отклонение определяет производство знаки: и все исследованные значения для каждoго теста а) шесть результатов подряд Ч по одну сто- с указанием метода исследования представлены рону от линии средней;
в паспорте, прилагаемом к сыворотке.
б) три результата подряд Ч за пределами Ежедневный анализ контрольной сыворотки одного среднеквадратического отклонения;
с неисследованным содержанием помогает под в) один результат Ч за пределами двух сред- держивать на должном уровне сходимость и вос неквадратических отклонений;
производимость исследований. Применение кон г) шесть результатов подряд обнаруживают трольной сыворотки с исследованным содержа тенденцию однообразного отклонения по одну нием позволяет гарантировать также и правиль сторону от средней. ность результатов, получаемых в лаборатории.
При наличии этих признаков результаты Исследование правильности целесообразно исследований можно выдавать в клинические проводить в условиях хорошей сходимости ре отделения, однако необходимо тщательно прове- зультатов. Контроль правильности осуществля рить стандартные или калибровочные растворы, ет периодически работник лаборатории в следу работу измерительных приборов. ющих случаях: а) если результаты исследования При наличии контрольных признаков резуль- контрольного материала выходят за пределы таты исследований ставят под сомнение и до 2S;
б) при налаживании нового метода;
исправления недостатков в отделение не выда- в) при использовании новой измерительной ап ют. К числу таких признаков относятся следую- паратуры, новой партии реактивов и т. д. При щие: этом следует сделать не менее 10 параллельных а) восемь результатов подряд Ч по одну исследований методом, указанным в инструк сторону от линии средней;
ции, прилагаемой к контрольной сыворотке. Эти б) пять результатов подряд Ч за линией же данные могут быть использованы для оценки одного среднеквадратического отклонения;
сходимости. Контроль правильности должен в) три результата выходят за пределы двух осуществляться во всем диапазоне прямолиней среднеквадратических отклонений;
ного хода калибровочного графика. Для этого г) один результат выходит за пределы трех используют контрольную сыворотку с нормаль среднеквадратических отклонений.
ным и патологическим содержанием Компонен Когда аналитическая система функциониру- тов.
ет должным образом, результаты контрольной Статистическим критерием правильности ис сыворотки не нарушают вышеуказанные стати- следований является средняя арифметическая стические правила. Когда распределение резуль- (X) и степень ее отклонения от истинного (номи татов нарушает эти правила, то анализ вышел нального) значения ц. Для оценки правильно из-под контроля.
сти можно использовать также следующие Контроль правильности. Кроме слитой сыво- методы:
ротки собственного приготовления, лаборатории 1) метод добавки Ч внесение в биологиче могут использовать контрольные сыворотки про- скую жидкость точно взвешенного количества мышленного изготовления. Эти сыворотки быва- анализируемого вещества и последующее его ют двух видов: с исследрванным и неисследо- определение;
2) метод смешивания проб Ч в разных со- и каждый член пары имеет свою собственную отношениях смешивается биологическая жид- вариабельность. Затем рассчитывают средне кость с низкой и высокой концентрацией компо- квадратическое отклонение различий и строят нентов;
контрольную карту для оценки воспроизводимо 3), метод, использующий биожидкости здоро- сти, аналогичную описанной выше для контроль вых людей: изменение нормальных показателей ных проб. Разницу между двумя анализами, отражает изменение правильности определений. сделанными для одной и той же пробы, отмечают Этот метод особенно ценен для оценки правиль- каждый день на карте. Результаты, попадающие ности всех компонентов, которые отсутствуют за границы контрольных пределов, с 95 % веро или нестабильны в контрольных пробах.
ятностью покажут существование каких-то на Удобным способом оценки правильности ис- рушений в аналитической системе. В этом случае следований является карта кумулятивных сумм выявляют возможную причину большого раз (лcusum). В отличие от обычной контрольной броса результатов, и исследование повторяют карты на карте cusum откладывают алгебраи- более тщательно.
ческую сумму положительных и отрицательных Ис с л е д о в а ни е с л у ч а й н о й про отклонений результатов от их ожидаемой вели- б ы. Метод этот аналогичен предыдущему мето чины. Пока наносимые на карту результаты ду параллельных проб. Разница заключается колеблются около линии постоянного отклоне- в том, что вместо анализа всех проб лаборант ния, правильность исследований под контролем.
выборочно исследует повторные пробы (одну Методы, ие требующие контрольных матери- или две пробы за неделю). Эти пробы могут быть алов. Иссле дование па ра ле ль ных случайно выбраны заведующим лабораторией проб позволяет оценить воспроизводимость ре- без ведома лаборанта. Таким путем заведующий зультатов исследований с помощью образцов лабораторией оценивает воспроизводимость ре крови больных. Для этого отбирают 10 случай- зультатов, получаемых лаборантами.
ных проб и каждую пробу исследуют дважды. Ис с л е д о в а н и е п о в т о р н ы х Результаты таких параллельных анализов ис- проб. Принцип метода состоит в повторном пользуются для характеристики качества иссле- исследовании нескольких случайно выбранных дований. проб. Сравнивая соответствующие пары резуль Приме р. Для оценки воспроизводимости татов, получают объективные данные о качестве результатов подсчета лейкоцитов исследовали проведенных исследований. Повторные исследо в параллельных определениях 10 образцов цель- вания проб должны проводиться после выполне ной крови с антикоагулянтом. Результаты пред- ния анализов текущего дня.
ставлены в табл. 4. Метод повторных определений дает возмож ность оценить качество работы аппаратуры и ла боранта во время исследований. Метод может Таблица 4. Определение воспроизводимости использоваться в любой лаборатории незави с помощью подсчета количества лейкоцитов в симо от количества производимых анализов.
параллельных пробах Недостатком его является невозможность конт роля правильности полученных результатов.
Ис с л е д о в а ние с ме ша нно й про № об- А В АЧ В (А-В) б ы. При оценке воспроизводимости методом разца дублированных проб получают более близкие значения, чем обычно получают при наличии 1 7970 7400 570 случайных ошибок. В методе смешанной пробы 2 9470 9230 240 это исключено. Метод состоит в следующем: из 3 7410 7230 180 группы образцов случайно выбирают два Ч А и 4 14820 15410 590 В;
из каждого образца А и В берут равные объ 5 3610 4690 1080 1 емы и смешивают (образец С);
исследуют все б 4590 6280 1690 три образца (табл. 5).
7 4490 3700 790 * 9980 10870 890 9 14890 14260 630 Таблица 5. Определение воспроизводимости 10 5240 5540 300 по смешанным пробам Сначала находят разницу между значениями каждой пары, опуская знаки;
затем разницу * Различие между величиной, полученной в сме шанной пробе (С), и теоретической величиной возводят в квадрат, все складывают и делят на А + В 2n (n Ч число пар), так как каждая пара пред ставляет собой индивидуальную переменную 2 ' Ис пол ь з ов а ние по с т о я нных ве- среднюю арифметическую нормальных резуль личин (констант). Некоторые гематоло- татов данного компонента и откладывают на гические показатели у здоровых людей колеб- карте. Чем больше результатов входит в расчет лются в незначительных пределах, и эти пределы средней, тем более эффективной становится колебаний используют в целях контроля каче- средняя в определении действительной области.
ства исследований. Метод средней арифметической нормальных Для этого требуется отобрать не менее величин дает возможность обнаруживать ошиб 11 проб крови здоровых взрослых людей. Пробы ки, не выявленные другими методами контроля, считаются нормальными, если отвечают следую- и является достаточно эффективным контролем щим условиям: число эритроцитов Ч 4Х 10 /л на всех этапах исследования проб больных.
и выше, гематокрнт Ч 36 или выше, эритроциты Ме жл а б о р а т о р ные э кс пе ри в мазке Ч норма;
среднее содержание гемогло- ме нт ы по конт рол ю ка че с т ва. Лабо бина в эритроците (ССГЭ) Ч 26Ч32 пг или ратории, систематически участвующие в межла средняя концентрация гемоглобина в эритроци- бораторных экспериментах по контролю каче те (СКГЭ) Ч 32Ч36 %, определяется также об- ства исследований, могут использовать резуль щее содержание гемоглобина. При соблюдении таты контроля для оценки качества свoей этих условий средние величины (константы) вы- работы. Особенно ценными являются долгосроч шеперечисленных параметров в 11 отобранных ные контрольные опыты.
пробах (или для большего количества проб) должны быть следующими: для ССГЭ Ч 29Ч 1.5.2. Межлабораторный 30 пг;
для СКГЭ Ч 32-33%, Кроме того, в область Х2S должны вхо- контроль качества дить приблизительно нормальные величины.
Контрольную карту готовят с использованием Цель межлабораторного контроля качества:
этих пределов. выявление систематических и случайных.ошибок Для каждой серии проб, содержащей доста- при контрольных определениях;
достижение точно данных, рассчитывают среднюю арифме- сравнимых результатов, получаемых участвую тическую и среднеквадратическое отклонение;
щими лабораториями.
если один из двух параметров окажется вне Анализ контрольных проб должен включать контроля, то проводят соответствующие меро- ся в обычный ход работы лабораторий, произво приятия по выявлению причин ошибок. Метод диться тем же персоналом, которцн выполняет очень чувствителен даже к небольшим посто- повседневные исследования, и принципиально янным ошибкам и помогает выявлять слишком теми же методами, которые лаборатория исполь суженные нормальные области. зует в повседневной практике. Х Метод сре дних но р ма л ь ных ве- Статистическая обработка результатов ис л и ч и н (по данным обследования больных) следования участвующих лабораторий. Основ основан на статистическом анализе результатов ная цель статистической обработки Ч определе проб больных. Предполагается, что средняя ве- ние пределов выполнения контрольных исследо личина, полученная по данной методике за один ваний и выявление систематических и случайных день или за определенное время, при большом ошибок. Статистическая обработка результатов объеме работы лаборатории (не менее 30 опре- проводится для выявления погрешностей, допу делений) приблизительно постоянна изо дня щенных в работе лабораторий, и для оценки в день. Если при выполнении анализа будет сравнимости участвующих лабораторий. Для допущена систематическая ошибка, то это выра- этого производят следующее.
зится в сдвиге средней величины результатов.
1. Результаты группируют по методам, ис Для построения контрольной карты необхо- пользуемым для определения того или иного димо в течение 20 дней ежедневно рассчитывать компонента, и по типу системы (ручной или среднюю нормальных величин данного компо- автоматической). Цель Ч снизить до минимума нента (не менее 16 величин), где нормальную влияние различия самих методов и иметь воз область рассматривают в пределах Х2S. Ве- можность сравнения этих методов.
личины, выходящие за эти пределы, отбрасыва- 2. В каждой группе рассчитывают: X Ч ют. Затем следует рассчитать среднюю арифме- среднюю арифметическую величину;
S Ч сред тическую и среднеквадратическое отклонение неквадратическое отклонение. Рассчитывают средних за 20 дней. Стандартную ошибку сред- пределы X 2S.
них для группы нормальных величин рассчиты- 3. Применяют метод исключения: все резуль вают по формуле: таты, попавшие за пределы X2S, исключают из дальнейших расчетов, а остальные служат для повторного вычисления новых средней арифметической и среднеквадратического от клонения (X и S ).
1 4. Если после повторного пересчета найдутся где п Ч число нормальных величин в группе.
результаты вне пределов X 2S, то их также 1 Затем рассчитывают контрольные пределы исключают, как и в первый раз. Исключение X 2m. Выбор пределов 2m, а не Зm делает ме- и пересчет X и S повторяют до тех пор, пока во тод более чувствительным и увеличивает частоту всем массиве не будет ни одного результата, выявления внеконтрольных величин. После по- выходящего за допустимые пределы Х 2SД.
п строения контрольной карты ежедневно находят Вычисленные после окончательного исключения средняя арифметическая и среднеквадратиче ское отклонение множества результатов служат для оценки сравнимости всех лабораторий в це лом, а также для отдельных лабораторий (в слу чае, когда используется материал с неисследо ванным содержанием компонентов).
нения для множества результатов (после исклю Пример расчета и исключения результата! чения).
Принята следующая градация оценки по Содержание величине IS:
Содержание глю глюкозы крови, козы крови, полу результат хороший;
полученное ла № № ченное лаборато результат удовлетворительный;
бораториями в п/п п/п риями в контроль - результат непригоден.
контрольном ном образце образце (мг в Например, если при контрольных определе (мг в 100 мл) 100 мл) ниях глюкозы о-толуидиновым методом получе 1 75 14 89, 2 70 15 72, 3 34 16 76, 4 33 17 76, 5 98 18 83, 6 82 19 82, 7 94 20 102, 8 89 21 99,1 следовательно, результат непригоден.
9 76 22 73,6 Чем ближе величина IS к нулю, тем лучше 10 88 23 63,6 сравнимость лаборатории с другими участника 11 92 24 103,0 ми, тем лучше качество результатов.
12 86 25 103,5 Указывая результаты, выраженные в IS для 13 87 отдельных лабораторий и компонентов, можно классифицировать все участвующие лаборато рии по качеству выполнения контрольных иссле дований.
Метод Юдена. Кроме статистической обра ботки, возможно графическое изображение ре зультатов межлабораторного исследования, ко торое позволяет лаборатории сравнить свои данные с результатами референтных лаборато рий, а также дает некоторое представление о том, что ошибочно в методике, если результаты непригодны. Для понимания графика не требу ется особых статистических расчетов, но для практического его использования каждой лабо ратории необходимо определить компонент в двух контрольных образцах (например, А и В).
Методика построения графика Юдена представ Оценка отдельных лабораторий. Результаты, лена на рис. 1. Строят систему координат, на оси абсцисс откладывают действительное значение полученные из каждой лаборатории, оценивают по отдельным параметрам путем сравнения их компонента и интервалы среднеквадратического отклонения (2S) для пробы А, на оси орди значений с допускаемыми пределами X 2S, рассчитанными для всего множества результа- нат Ч те же показатели для пробы В. Действи тов после окончательного исключения. Крите- тельные значения компонентов и сигмы берут из паспорта к контрольному материалу. Если ис рием оценки могут служить также паспортные пользуется контрольный материал с неисследо данные контрольного материала и результаты ванным содержанием компонентов, в качестве референтной лаборатории. По результатам контроля можно определить частоту использова- действительных величин используют X и S мно жества после исключений. Из двух точек X и Y, ния разных методов исследования и сравнить их представляющих действительные значения ком воспроизводимость.
В настоящее время разработана количе- понента для пробы А и В соответственно, прово ственная оценка качества результатов отдель- дят две взаимно перпендикулярные прямые. Из ных лабораторий. Для этого результат каждой точки пересечения прямых проводят окружность лаборатории выражают в единицах среднеквад- с радиусом, равным 2S. Прямую линию W прово дят под углом 45 через пересечение средних ратического отклонения по формуле:
прямых, деля нижний левый и верхний правый квадраты. Две дополнительные линии (S' и t) проводят вдоль периферии круга параллельно прямой W.
Пары значений для А и В, полученные от лов и их использования для контроля каче Каждого участника, наносят в виде точек на ства отдельных видов лабораторных исследо график. Если точки попали внутрь окружности, ваний.
результаты пригодны. Если точки располагают- Контроль качества исследований мочи. Для ся вне окружности, но между параллельными контроля правильности и воспроизводимости ре прямыми, это значит, что лаборатории получили зультатов исследования химического состава завышенные или заниженные величины для обе- мочи используют контрольные материалы, близ кие по возможности к образцам мочи пациентов, их проб и что имеются систематические ошибки.
и контрольные мазки для контроля качества Точки, близкие к прямой W, показывают, что лаборатория работает стабильно. Точки, попав- микроскопических исследований осадка мочи.
шие в другие секции графика, не дают пред- В качестве контрольных материалов использу ставления о составе образца и свойственны ют: водные растворы веществ;
слитую мочу с консервантами;
искусственные растворы мочи случайным ошибкам.
Таким образом, график Юдена позволяет с добавками веществ, исследуемых в моче.
Контрольные препараты для микроскопии наглядно дифференцировать систематические и случайные ошибки, допущенные в работе лабо- осадков мочи должны содержать встречающие ся в моче соли, полиморфные эпителиальные раторий, а также установить, какие лаборатории клетки, различные виды цилиндров, лейкоциты, работают в допустимых пределах.
эритроциты, болезнетворные и неболезнетвор ные бактерии, грибы, животные паразиты. Кро 1.5.3. Особенности контроля качества ме того, целесообразно иметь препараты с осад отдельных видов лабораторных ками мочи, характерными при некоторых наибо исследований лее распространенных заболеваниях.
Пр и г о т о в л е н и е с т а б и л ь но й и а Различие методических подходов, используе- т и в н о й мочи. К 1 л свежей мочи добавляют мых в различных отраслях клинической лабора- 2 г ЭДТА и при тщательном перемешивании торной диагностики, определяет некоторые осо- приливают 5 мл раствора тимола (100 г тимола бенности приготовления контрольных материа- на I л изопропанола). Через 2 нед мочу центри фугируют для удаления слизи и незначительного Таблица 6. Перечень веществ и их количества солей мочевой кислоты. После такой концентрация в контрольных растворах обработки моча становится прозрачной и почти не имеет запаха. Полученный контрольный мате риал остается стабильным при комнатной темпе ратуре несколько лет.
Пр иг о т о в л е ние к о н т р о л ь н ых ма т е р иа л о в, и ми т и р у ющи х мо ч у. Раствор № 1: в мерную колбу вместимостью сыворотки с нормальной концентрацией белка;
1 г глюкозы;
0,5 мл ацетона;
0,1 мл гемолизата и вливают до метки дистиллированной воды.
Перемешивают до полного растворения. Полу ченный контрольный материал хранят при Ч20 С. Стабилен до 3 мес.
Для получения осадка все добавки промыва ют в холодном изотоническом растворе хлорида натрия с формалином (0,85 г NaCl+10 мл водного формалина и доводят до 100 мл дистил лированной водой). Фиксацию продолжают в те- Мочевой контроль для токсикологического чение ночи, затем центрифугируют и добавляют исследования. Мочевой контроль для токсиколо в контрольный материал. В качестве добавки гического исследования можно приготовить сле для формирования осадка мочи используют сле- дующим образом.
дующие фиксированные вещества: эритроциты, 1. Отбирают суточные пробы больных, не лейкоциты светлого слоя кровяного сгустка, не- курящих и не принимающих лекарств, н собира патогенные Е. coli, клетки дрожжей, сперматозо- ют слив объемом до 10 л. Хранят при температу иды, кристаллы цистина (получают путем пере- ре от 4 до 7 С.
кристаллизации из чистого порошка L-цистина), 2. Фильтруют через стеклянную вату для кристаллы трипельфосфатов (берут из проб исключения посторонних примесей.
больных), кристаллы оксалата кальция (берут 3. Исследуют часть сливной мочи на наибо из проб больных). лее часто применяемые лекарства, которые опре Раствор № 2: в мерную колбу вместимостью деляют в лаборатории. Слив используют в слу 2 л вносят хлорид натрия, глюкозу, мочевину чае отрицательной реакции.
и ацетон в количествах, указанных в табл. 4. К сливу мочи добавляют: морфина гидрох 6. Приливают 500 мл воды, перемешивают. Мик- лорид, кодеина фосфат, хинина гидрохлорид, ропипеткой вносят 0,2 мл цельной крови с вели- метадона гидрохлорид, глютетимид Ч по 20 мг чиной гематокрита от 40 до 45. Для того чтобы каждого и 30 мг амфетамина. Перед добавлени добавить 0,8 г сывороточного белка, используют ем в слив глютетимида его нужно растворить слитую сыворотку от больных или контрольную в 3 мл абсолютного этанола.
сыворотку с известным содержанием белка. Не- 5. Хорошо смешать и разлить по 10Ч15 мл в пузырьки. Хранить при Ч20 С. Такие сливы стабильны 8 мес.
6. Для использования в качестве контрольно го материала содержимое пузырька оттаивают и исследуют вместе с неизвестными образцами мочи.
Контроль качества гематологических иссле дований. Для контроля качества определений сыворотке. гемоглобина применяются следующие компонен Если используемая сыворотка содержит 7,5 г ты:
белка, то объем сыворотки, содержащий 0,8 г 1. Стандартный раствор гемоглобина с изве белка, будет равен: стной концентрацией.
2. Стерильный раствор гемолизата (консер вированная кровь). Для приготовления кон трольного раствора необходимо осуществить следующее:
а) отцентрифугировать 200 мл цитратной Затем приливают дистиллированную воду до крови для осаждения клеток, удалить суперна метки и хорошо перемешивают. Для консерва- тантную плазму;
ции в раствор добавляют 5 мл хлороформа. б) добавить 100 мл дистиллированной сте Хлороформ является хорошим консервантом рильной воды и встряхивать смесь на механиче для этих контрольных растворов. Другие консер- ской мешалке около 30 мин;
ванты могут интерферировать в одной или в не- в) поставить полученный раствор в глубокую скольких реакциях. заморозку (не ниже Ч20 С) на ночь;
Срок годности раствора Ч около года. г) на следующий день оттаять;
д) снова хорошо перемешать на мешалке Среднеквадратическое отклонение лаборатории, 30 мин;
рассчитанное контрольным центром, можно рас е) слить раствор через фильтр Millipore сматривать как отражение способности лабо в стерильный сосуд;
ранта производить правильные анализы. Это ж) разлить по 1 мл в стерильные пузырьки особенно верно, когда рассчитывают среднюю и заморозить при Ч 20 С. арифметическую всех среднеквадратических от В целом вся процедура приготовления дол- клонений для всех тестов. Эта средняя арифме жна проводиться в стерильных условиях. Сте- тическая может быть названа как комбиниро рильный раствор гемолизата стабилен около ванное Среднеквадратическое отклонение (KS).
года. Раствор используют для контроля воспро- Величину KS рассчитывают за определенный изводимости исследований гемоглобина. отрезок времени (полгода, год) для каждого 3. Консервированная кровь с фиксированны- лаборанта и дают грубую оценку аналитической ми клетками крови или раствор с искусственны- способности каждого.
ми частицами, имитирующими клетки крови Лаборатории фиксируют результаты анали (для контроля качества подсчета клеток крови). зов контрольных материалов за определенный 4. Контрольные мазки (окрашенные и не- промежуток времени, идентифицируя каждый окрашенные) с нормальной и патологической тест с именем лаборанта, который выполнял лейкоцитарной формулой (для контроля каче- тест. После истечения установленного срока ства подсчета лейкоцитарной формулы). приготовляют оценочные листы для каждого Мазки многократно просчитываются квали- лаборанта, как показано в табл. 7.
фицированными специалистами (не менее 20 раз). Из полученных данных рассчитывают Та блица 7. Результаты исследования статистические критерии определения точности контрольной сыворотки лаборантом А за 1 год подсчета мазка. Для удлинения срока хранения мазков используют клей БФ-6, который облада ет свойством образовывать тонкую прозрачную пленку, герметически приклеивающуюся к по верхности мазка и стекла и предохраняющую препарат от внешних воздействий. Предложена методика приготовления мазков на отмытой рен тгеновской пленке, нарезанной по размеру пред метного стекла. Мазки, приготовленные таким образом, можно пересылать в конверте, что весь ма удобно при проведении межлабораторного контроля качества подсчета лейкоцитарной фор мулы.
1.5.4. Контроль качества Комбинированное Среднеквадратическое от работы лаборантов клонение за год составляет 0,52. На оценочном Оценка качества работы лаборантов должна листе регистрируют название теста, выполняе быть частью программы внутрилабораторного мого лаборантом, полученный им результат, контроля качества. Могут быть использованы истинное значение и Среднеквадратическое от следующие методы: 1) метод, использующий клонение, сообщаемое контрольным центром. Из результаты межлабораторного контроля каче- этих величин рассчитывают разницу между ства;
2) метод дублированных анализов;
3) ме- истинной величиной и полученной лаборантом тод случайных проб;
4) метод разведения;
5) ме- и делят на Среднеквадратическое отклонение.
тод, использующий результаты внутрнлабора- Затем рассчитывают комбинированное средне торного контроля качества. квадратическое отклонение, которое является Методы перечислены в порядке возрастания средней всех среднеквадратических отклонений.
времени, затрачиваемого на каждый метод заве- Как видно из табл. 7, лаборант А в первой пробе дующим лабораторией. Методы 1 и 2 можно для натрия получил результат 132 ммоль/л.
использовать почти во всех лабораториях без Средняя величина, сообщенная контрольным особых трудностей и больших расходов. центром, равна 132,7 ммоль/л. Среднеквадрати Лаборатории, участвующие в межлабора- ческое отклонение среди участников контроля Ч торных экспериментах по контролю качества 1,7 ммоль/л. Чтобы рассчитать 5 лаборанта А, исследований, могут использовать результаты нужно решить следующее уравнение:
контроля для оценки работы лаборантов. Метод 132-132, зависит от расчета правильности всех определе = -0,4.
ний, выполненных лаборантами в контрольном 1, материале в течение определенного промежутка времени. Нельзя делать выводы о качестве рабо- Число, полученное в последнем столбце, показы ты лаборанта на основании одного анализа. вает, что величина, полученная лаборантом А, Однако если лаборант выполнил 10 или 20 ана- на 0,4 единицы S меньше истинной величины лизов, то есть возможность оценить работу (если допустить, что средняя контроля есть лаборанта на основании аналитических резуль- истинная величина). Отрицательные знаки в по татов, если истинная величина проб известна. следнем столбце игнорируют.
Величина KS указывает на способность ла- Метод случайной пробы похож на предыду боранта выполнить лабораторные исследования щий. Вместо анализа всех проб в дубликате с хорошей точностью. Чем ниже величина KS, каждый лаборант анализирует одну или две тем лучше работа лаборанта. Величину K.S мож- пробы в дубликате за неделю. Эти пробы выби но использовать для ранжирования лаборантов раются случайно заведующим лабораторией, по качеству работы. Величину KS от 0 до без ведома лаборанта. Результаты дублирован 0,5 можно считать очень хорошей, от 0,5 до 1 Ч ных анализов, выполняемые каждым лаборан хорошей, от 1 до 1,5 Ч допустимой, от 1,5 до 2 Ч том, заносят в таблицу за определенный проме плохой и выше 2 Ч очень плохой. жуток времени, после чего для каждого лабо Первым требованием для применения метода ранта рассчитывают среднеквадратическое от является обязательное участие лаборатории во клонение, значения которых заносят в таблицу всех программах межлабораторного контроля против каждого лаборанта. Оценка техники ис качества, чтобы каждый лаборант имел возмож- следования такая же, как в предыдущем методе.
ность выполнить не менее 10 тестов в контроль- В небольших лабораториях, где исследуют ной сыворотке за год. Во-вторых, этот метод менее 10 проб на один тест, трудно выбрать менее перспективен в полностью автоматизиро- случайную пробу без ведома лаборанта. В таких ванных лабораториях. В-третьих, заведующий случаях используют метод разведения, который лабораторией должен гарантировать качество состоит из выбора случайной пробы и разведе оборудования и реактивов. Чтобы использовать ния ее водой или нормальным изотоническим этот метод, лаборатория должна внедрить про- раствором хлорида натрия. Лучше растворять грамму контроля качества исследований внутри пробу не более чем на 20%. Пробы, приготов своей лаборатории. При ранжировании лабо- ленные таким образом, под вымышленным име рантов нужно, чтобы число исследуемых тестов, нем передают лаборанту для исследования. Ре выполняемых лаборантами, было равнознач- зультаты заносят в таблицу, как в методе слу чайных проб, рассчитывают среднеквадратиче ным.
Для сравнения качества работы лаборантов ское отклонение в целях оценки качества работы можно использовать результаты дублированных лаборантов и затем высчитывают разницу меж анализов. Принцип метода состоит в следую- ду полученной и ожидаемой величиной для щем: разница между результатами дублиро- разведенной сыворотки.
ванных анализов обратно пропорциональна ка- Другой вариант того же метода Ч использо честву выполнения лаборантом исследований. вание двух проб сыворотки больных, смешанных Лучшие лаборанты получают, как правило, не- 1:1. Для расчета среднеквадратического откло большую разницу между результатами дублиро- нения используют разницу между расчетной ванных анализов, тогда как менее старательные и аналитической величиной. Для смешивания получают большую разницу. и разведения может быть также использована ежедневная контрольная сыворотка.
Результаты исследования контрольной сыво ротки с известным содержанием компонентов, проводимого в соответствии с программой внут рилабораторного контроля качества исследова ний, можно собрать за определенный отрезок времени и таким же образом, как и результаты межлабораторного контроля, использовать как способ оценки качества работы лаборантов.
В паспорте к сыворотке содержится средняя величина и среднеквадратическое отклонение.
После исследования этой сыворотки в лаборато рии можно рассчитать величину S для лабо где d Ч разница между результатами дублиро- ранта, используя S Из паспорта.
ванных анализов;
п Ч число анализируемых Например, лаборант при исследовании холе проб;
2n Ч общее число анализов. стерина в сыворотке получил результат Рассчитанное среднеквадратическое откло- 4,7 ммоль/л. В паспорте к сыворотке даны следу нение характеризует аналитическую ошибку, ющие значения: X = 4,8 ммоль/л, 5=0, присущую самому методу исследования, и ошиб- ммоль/л при использовании того же метода.
ку лаборанта. Когда величина аналитической Разница между полученным и паспортным зна ошибки постоянна, вариации, обнаруживаемые чением составит: 4,8Ч4,7=0,1 ммоль/л.
в величине среднеквадратнческого отклонения, полученные разными лаборантами, будут полу чаться вследствие вариации в ошибке лабо ранта. Другими словами, величина среднеквад ратического отклонения обратно пропорцио нальна квалификации лаборанта.
Этот метод оценки можно использовать толь- Из среднеквадратических отклонений, вы ко для сравнения качества работы лаборантов, считанных за определенный промежуток време но нельзя использовать для ранжирования, так ни, рассчитывают KS, которые затем можно как невозможно точно сказать, какое средне- использовать для ранжирования и оценки каче ства работы лаборантов.
квадратическое отклонение лучше.
1.6. ХАРАКТЕРИСТИКА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ПРИНЦИПОВ МЕТОДОВ И АППАРАТУРЫ КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРИЙ Подавляющее большинство результатов ла- для непрерывного измерения различных пара бораторных анализов получают с помощью той метров внутренней среды Ч pO2, глюкозы, мо или иной аппаратуры, чаще всего микроскопов лочной кислоты и т. д., в которых используются принципы потенциометрии и амперметрии.
и фотометров (другие приборы используются реже). Органолептические методы, для выполне- В каждом, или почти в каждом, лабора ния которых не требуется никаких приборов торном измерительном приборе имеются приспо и аппаратов, имеют лишь вспомогательное зна- собления и устройства, облегчающие работу чение. Чтобы грамотно применять эту сложную лаборанта, однако в некоторых они настолько медицинскую технику, нужно знать не только совершенны, что функция аналитика сведена практические приемы, что легко постигается в к минимуму, все остальное выполняется автома процессе работы, но и физические принципы тически. Такие приборы называются автомати измерений, так как они определяют оптимальные ческими анализаторами;
они бывают двух типов:
диапазоны измеряемых величин, возможные по- непрерывные, когда все пробы обрабатываются грешности и способы борьбы с ними, правила последовательно, как на конвейере, и дискретные, контроля за технической стороной измерений когда одновременно обрабатывается серия из и т.д. определенного количества проб, причем следую По способу использования все лабораторное щую серию можно анализировать только тогда, оборудование делится на измерительные прибо- когда анализ окончен. Работа автоматического ры, которые выдают количественные результаты анализатора управляется процессором Ч спе и поэтому подлежат метрологическому контро- циальной вычислительной машиной;
результаты лю, и прочую, иногда очень сложную, аппарату- работы автоматического анализатора сравни ру, которая метрологический контроль не прохо- тельно легко могут быть переданы цифровой дит, например микроскопы. Ниже приводится вычислительной машине, поэтому автоматиза описание физических принципов работы и ция работы неизбежно ведет к насыщению клини устройства некоторых наиболее распространен-, ческих лабораторий вычислительной техникой ных лабораторных измерительных приборов. К числу измерительных приборов должны В клинической лабораторной диагностике быть отнесены и более сложные устройства, чаще всего используются оптические измери- в которых объединены две функции: разделения тельные приборы. К ним относятся приборы для веществ и определения их количества в различ измерения светопоглощения Ч фотометры и ных фракциях. Это приборы для электрофореза спектрофотометры;
для измерения окраски и и различные хроматографы. Поскольку эти при светопропускания пленок Ч денситометры;
для боры чаще всего используются в научной работе, измерения флюоресценции Ч флюорометры, в настоящем разделе они не рассматриваются, спектрофлюорометры, поляризационные флюо- так же как не рассматривается другой очень рометры;
для измерения интенсивности свето- важный класс аналитической аппаратуры Ч ве излучения (окраски пламени, эмиссии) Ч пла- сы, поскольку взвешивание используется в лабо менные фотометры;
для измерения количества раториях почти исключительно для приготовле излученного света Ч люминометры;
для измере- ния растворов, а не для анализа состава биоло ния поглощения света раскаленными газами Ч гических жидкостей, как это делается в весовом атомные абсорбциометры;
для измерения свето- анализе.
рассеивания Ч нефелометры. Ниже приводятся сведения, которые должны Другую группу составляют приборы для знать лабораторные работники, чтобы успешно электрохимических измерений Ч потенциомет- заниматься фотометрией (в том числе спектро ры, полярографы и т. д. По установившейся фотометрией), флюорометрией и потенциомет традиции прибор для измерения электрического рией (практически измерением рН). Некоторые потенциала при минимальном значении текуще- вопросы, касающиеся других методов измере го тока называется потенциометром, а метод Ч ний, рассмотрены в соответствующих разделах.
потенциометрией. Если же измеряется сила тока при постоянном значении электрического напря 1.6.1. Фотометрия жения Ч это амперметрия, если в процессе из мерения величина потенциала изменяется по и фотометрическая аппаратура тому или иному закону, такой метод называется вольтамперметрней или полярографией, измере- Биохимические аналитические методы чаще ние же количества электричества называется всего оканчиваются цветной реакцией, в резуль кулонометрией. Из электрохимических приборов тате которой прозрачный раствор приобретает непременной принадлежностью почти каждой окраску, т. е. способность избирательно погло лаборатории крупной больницы являются рН- щать (абсорбировать) свет с определенной дли метры и их разновидности Ч приборы для изме- ной волны. Разумеется, что тот свет, который не рения показателей кислотно-щелочного состоя- поглотился, проходит через раствор, поэтому ния (АЗИВ, прибор Аструпа и т. д.). К ним же субъективно воспринимаемая окраска является примыкает быстрорастущая группа датчиков дополнительным цветом относительно того, ко торый поглотился. Так, если интенсивно погло щается красный свет, то раствор бывает зеле ным или синим, если поглощается фиолетовый свет, раствор желтый и т. д. График, изобра жающий поглощение света с разными длинами волн, называется спектральной кривой;
обычно для фотометрии используют область, где погло щение света наибольшее, т. е. максимум спект ральной кривой. Форма кривой, количество видно из этих формул, ни количество прошедше максимумов на ней и их положение могут очень го света, ни количество поглощенного света, ни варьировать, но обычно в видимой области не бывает больше одного-двух максимумов, поэто- доля поглощенного света относительно падаю му выбрать участок спектра, наиболее подходя- щего непропорциональны концентрации иссле дуемого раствора. Она прямо пропорциональна щий для измерения, несложно.
Для аналитических целей пригодны только те логарифму отношений прошедшего через раст цветные реакции, в которых развивается окра- вор и падающего света:
ска, пропорциональная концентрации исследуе мого вещества. В этом случае посредством фото метрии измеряется количество поглощаемого света и по этим данным рассчитывается искомая Величина Е называется экстинкцией, или опти концентрация. Однако количественные резуль- ческой плотностью раствора;
большинство фото таты удается получать лишь в определенном метрических приборов устроено так, что они диапазоне концентраций, про который говорят, непосредственно указывают эту величину. Как что в нем соблюдается закон Ламберта-Бера. правило, имеется возможность отсчитывать ре Если в растворе имеются непрозрачные зультаты и по другой шкале Ч в процентах частицы, рассеивающие свет, он выглядит мут- поглощенного или прошедшего света относи ным. В этом случае, строго говоря, фотометрия тельно фоновых величин. На широко распро невозможна, так как трудно узнать, сколько страненном фотометре ФЭК шкала оптических света поглотилось, а сколько рассеялось. Суще- плотностей нанесена красной краской, а шкала ствуют разные способы уменьшить ошибку, вы- процентов пропускания Ч черной (в просторе званную мутностью, но все они эффективны чии так и указывают: "отсчет по красной шка лишь в известной мере. В то же время рассеива- ле, имея в виду шкалу оптических плотностей).
ние света может быть использовано для опреде- Если оптическая плотность 1, это значит, что ления количества рассеивающих частиц, а так- через раствор прошло только 10 % света, а же их размеров;
такой анализ называется остальные 90 % поглотились в нем. Для боль нефелометрией, или турбидиметрией. шинства приборов высокого класса это крайняя Закон поглощения света окрашенными величина, выше которой уже трудно получить растворами (Ламберта-Бера). Между концен- надежные результаты, но для обычных лабора трацией окрашенного вещества в растворе, тол- торных приборов она находится вне диапазона щиной раствора и долей света, которая в этом достоверных данных. Во всех предназначенных растворе поглощается, существует сложная ло- для измерения оптической плотности приборах наибольшая точность достигается при значени гарифмическая зависимость:
ях экстинкцин около 0,3 (т. е. когда проходит примерно половина падающего света);
по мере удаления в ту и другую сторону точность измере ния, а следовательно, и достоверность результа раствор (т. е. то его количество, которое улавли- тов уменьшаются.
вается приемником света);
/0 Ч количество све- Экстинкция раствора, т. е. величина оптиче та, падающего на раствор (т. е. величина холо- ской плотности, есть произведение концентрации стого опыта, когда окрашенного вещества нет, на толщину слоя раствора. Поэтому не имеет но все остальные потерн остаются);
с Ч концен- значения, фотометрируется данный раствор в трация;
/ Ч толщина слоя;
k Ч характеристика кювете с длиной оптического.пути 1 см или тот поглощающего вещества Ч так называемый ко- же раствор, разведенный в два раза, но в кювете эффициент экстинкции, или коэффициент опти- с длиной оптического пути 2 см и т. д. Удлинение ческой плотности. Если толщина слоя выражена оптического пути приводит к повышению чув в сантиметрах, а концентрация в молях в 1 см3, ствительности лишь в том случае, если объем то коэффициент k имеет размерность см2/моль раствора остается прежним и сокращается попе (в результате перемножения всех трех величин речное сечение кюветы. Но возможности тут должен получиться безразмерный параметр);
ограничены, так как чем уже и длиннее кювета, эта величина называется молярным коэффици- тем большие требования предъявляются к фоку ентом экстинкции и соответствует количеству сировке и юстировке пучка света. Поэтому боль молей (или его долей) вещества, находящегося шинство биохимических методик рассчитано в 1 см светового потока. Заметим, что эта так, чтобы фотометрия проводилась в кювете величина в 1000 раз меньше той, которая полу- с длиной оптического пути I см;
значительно чится, если использовать более привычные раз- реже используются кюветы с длиной оптическо мерности, т. е. выражать концентрацию в молях го пути 0,5 см, а кюветы с длиной оптического в 1 л, а длину кюветы в сантиметрах: пути 2 см Ч практически никогда.
В литературе имеется много описаний раз- нужны кюветы из специальных сортов стекла Ч личных микросистем, в которых повышение чув- так называемые увиолевые;
в коротковолновой ствительности фотометрии достигается путем ультрафиолетовой области пригодны только кю использования узких и длинных кювет и значи- веты из кварца и сапфира. По внешнему виду тельного сокращения объема фотометрируемого они плохо различимы, поэтому узнать, из какого раствора. Но надо иметь в виду, что если объем материала изготовлена кювета, можно только раствора меньше 0,5 мл, точность отмеривания после определения диапазона длин волн, кото падает, возрастают ошибки в результате испаре- рые она пропускает..При получении новых пар ния растворов в ходе анализа и т. д., поэтому тий кювет, или если их почему-либо перепута надо принимать специальные меры предосто- ли, надо измерить оптические плотности кювет, рожности. Опыт работы показывает, что опти- заполненных водой, по отношению к пустому мальными в смысле чувствительности, точности кюветодержателю через каждые 20 им, начиная и удобства работы оказываются объемы 0,5Ч от 400 нм, в сторону коротких волн до конца 1 мл при длине оптического пути кюветы шкалы прибора. Практически можно работать I см. Эти параметры и реализованы в большин- на данной длине волны, если оптическая плот стве современных прецизионных приборов. ность кюветы не более 0,2Ч0,3. В связи с тем что Точность фотометрии значительно возраста- кюветы из кварца или сапфира очень дороги, ет, если нет необходимости каждый раз выни- надо стремиться работать в видимой области мать кювету для заполнения ее новой порцией только со стеклянными кюветами, а в ближней исследуемого раствора. Существуют различные ультрафиолетовой области Ч только с увиоле конструкции проточных кювет, из которых ис- выми.
следуемый раствор отсасывают после окончания Последовательность операций при работе на измерения и заполняют кювету новой порцией, спектрофотометрах или фотометрах различных не вынимая ее из гнезда прибора. Выполнять конструкций несколько различается, но принцип серийные анализы на таких приборах проще остается одним. Сначала устанавливают длину и быстрее, чем при использовании съемных кю- волны, выбирая светофильтр на фотометре или вет. Но надо помнить, что количество раство- вращая соответствующую рукоятку на спектро ра должно быть достаточным, чтобы промыть фотометре. Чтобы точно и правильно установить кювету. длину волны, надо идти от меньших длин к боль Фотометрические приборы делятся на две шим, так как прн движении в обратном на большие группы: фотометры и спектрофотомет- правлении ошибка возрастает. Следующий этап ры. В фотометрах нужные спектральные диапа- измерения Ч установка нуля, т. е. определение зоны выделяются при помощи светофильтров, величины Iо в формуле1. Для этого в кювето поэтому число участков спектра, в котором мо- держателе устанавливают кювету, заполненную жет проводиться измерение, равно числу свето- растворителем или раствором, полученным в ре фильтров. В спектрофотометре участки спектра зультате холостого опыта;
изменяя ширину ще выделяются при помощи призм или дифракци- ли, добиваются того, чтобы показания прибора онных решеток, поэтому можно установить лю- соответствовали величине, предусмотренной ин бую длину волны в заданном диапазоне. Обычно струкцией (обычно это нуль), после чего холо спектрофотометры Ч это приборы более высоко- стую пробу заменяют опытной и производят го класса, чем фотометры, в них можно выделить отсчет величины оптической плотности.
более узкий (более монохроматический) участок Щелью спектрофотометра выделяется опре спектра, однако все зависит от конкретной кон- деленный интервал длин волн: чем шире щель, струкции прибора. Так, например, спектрофото- тем шире и спектральный интервал. Если изме метр Спекол фирмы Цейс (ГДР) хотя и по- рение делается в той области, где чувствитель зволяет делать измерения на любой длине волны ность прибора или прозрачность кювет мала, в диапазоне от 400 до 700 нм, но имеет настолько чтобы вывести прибор на нуль, необходимо уве слабый монохроматор, что более узкие области личить ширину щели. Это чревато возможно выделять труднее, чем на хорошем фильтровом стью такой ошибки, когда свет проходит с длина фотометре. ми волн, соседними с выбранной. Если исследуе Чаще всего в клинической биохимии фото- мый объект для них прозрачен, то результаты измерений оказываются ошибочными, так как метрия проводится в области 400Ч700 нм Ч это фактически регистрируется сила света не на Так называемая видимая область спектра. Свет избранной длине волны, а на соседней.
с большей длиной волны относится к ближней Чтобы уменьшить ошибки, вызванные при инфракрасной области, измерения в которой сутствием в растворе посторонних окрашенных приходится делать чрезвычайно редко. Свет с длиной волны короче 400 нм относится к ультра- веществ или его мутностью, используют двух или трехволновые методы измерений. Сущность фиолетовому диапазону, причем различают трехволнового метода видна на рис. 2;
оптиче ближнюю область с длиной волны 300Ч400 нм скую плотность измеряют при трех длинах волн;
и коротковолновый диапазон 220Ч300 нм. Осо на месте максимума пропускания и на равном бенно широко распространено определение вос расстоянии от него в сторону длинных и корот становленного NADH и NADPH по поглощению ких волн. При этом предполагается, что рассеи света с длиной волны 340 нм, т. е. в ближнем ультрафиолетовом диапазоне. Для фотометри ческих измерений в видимой и ближней инфрак расной области пригодны кюветы из обычного стекла;
для ближней ультрафиолетовой области См. с. 26.
правило, что флюорометрни должны подвер гаться относительно разбавленные растворы.
При флюорометрии длина волны вторичного излучения обычно устанавливается на максиму ме интенсивности, так как это излучение ма лоспецифично, в то время как длина волны первичного света (возбуждения флюоресцен ции) должна приходиться на наиболее специ фичный для исследуемого вещества участок спектра, который необязательно совпадает с максимумом (мешающие вещества могут быть причиной ложного максимума).
Физический эффект флюоресценции заклю Рис. 2. Введение поправки на неспецифическое чается в том, что молекула исследуемого веще поглощение (трехволновый метод). На оси ства поглощает квант света возбуждения и при ордииат Ч величины светопоглощения (Е);
на этом переходит в новое, энергетически более оси абсцисс Ч длина волны света. богатое состояние;
через некоторый микропро Ч величина светопоглощения. характеризую- межуток времени она излучает избыточную щая количество определяемого вещества;
Е1, Е, энергию в виде кванта света флюоресценции ЕзЧ светопоглошение при волнах разной длины.
(эмиссии). В связи с тем что энергия кванта света обратно пропорциональна длине волны, длина волны возбуждающего света всегда коро че излучаемого. Промежуток времени между ванне света или неспецифическая окраска рав поглощением света и его излучением очень мал, номерно изменяется с изменением длины волны, и в обычных флюоресцентных методах на него не поэтому истинную оптическую плотность вычис обращают внимания, но он достаточен, чтобы на ляют по формуле:
молекулярном уровне успели произойти некото рые события, в частности, чтобы молекула могла изменить свое положение в пространстве. На этом основан метод молекулярной вискозимет рии путем измерения поляризации света флюо ресценции.
1.6.2. Флюорометрия Эффект флюоресценции заключается в том, 1.6.3. Пламенная фотометрия что исследуемый объект светится под влиянием и атомная абсорбцнометрия облучения светом с более короткой длиной во ны. Излучаемый свет называется светом флюо ресценции, или вторичным излучением;
тот свет, Соли металлов, попадая в пламя, способны которым объект облучается, называется светом окрашивать его. Это происходит потому, что при возбуждения флюоресценции, или первичным. высокой температуре пламени молекулы распа Форма спектра флюоресценции обычно зеркаль- даются на отдельные ионы, электроны которых но отображает форму спектра возбуждения, при непрерывно переходят из одного квантового со этом спектр возбуждения флюоресценции бли- стояния в другое, что сопряжено с испусканием зок к спектру поглощения раствора и поэтому или поглощением кванта света. Минимальная характерен для данного флюорофора, в то время температура, необходимая для того, чтобы эти как спектр флюоресценции малоспецифичен. процессы проходили достаточно интенсивно, за Аналитические методы, использующие флюорес- висит от природы исследуемого элемента и в ценцию, основаны на предположении, что при меньшей степени от того, в состав какого соеди освещении светом одинаковой интенсивности си- нения в растворе оно входит. Некоторые эле ла света флюоресценции пропорциональна со- менты, например калий и натрий, начинают держанию исследуемого вещества. Однако та- интенсивно излучать свет, попадая в сравни кая пропорциональность имеется только в отно- тельно низкотемпературное пламя, которое по сительно узком диапазоне концентраций, из лучается при сгорании метана в воздухе (так которого на практике очень легко выйти, поэто- называемое метаново-воздушное пламя);
дру му при налаживании флюорометрических иссле- гие же, как, например, кальций, начинают интен дований надо всегда с особой тщательностью сивно излучать свет и поглощать его лишь при проверять линейность калибровочного графика значительно более высокой температуре, кото во всем диапазоне возможных величин. Наруше- рая создается при сгорании ацетилена. При ние линейности бывает вызвано в первую оче- сгорании метана (т. е. бытового газа) на возду редь явлением гашения флюоресценции, которое хе можво определять кальций лишь после его обусловлено тем, что по мере углубления пучка предварительного выделения, но методика эта возбуждающего света в раствор интенсивность сложна, ненадежна и практически не использу его уменьшается вследствие поглощения. Чем ется.
концентрированнее раствор, тем поглощение это Метод, в котором изучается окраска пламе больше, поэтому сила возбуждающего света ни, т. е. излучение, возникающее в результате оказывается также уменьшенной. Отсюда общее перехода атома из энергетически более высокого состояния в низкое, называется пламенной фото- Как при фотометрии пламени, так и при метрией. Можно изучать и обратный процесс, атомной абсорбции важнейшим этапом анализа т. е. измерять поглощение света при переходе является распыление исследуемого раствора и атома с более низкого на более высокий энерге- введение его в пламя горелки. Для этого исполь тический уровень;
этот метод называется атом- зуют различные эжекторы из стекла или металла ной абсорбциометрией.
(аналогичные пульверизаторам), в которых Аппаратура, необходимая для пламенной струя воздуха засасывает через узкую трубку фотометрии, относительно проста и дешева, но исследуемый раствор и распыляет его в неболь метод оправдывает себя лишь при исследовании шом объеме, через который проходит струя наиболее легковозбудимых щелочных элемен- воздуха (или кислородно-воздушной смеси), тов Ч лития, натрия, калия, так как можно предназначенная для поддержания горения.
работать с легкодоступным низкотемператур- При этом в пламя попадает только очень неболь ным пламенем, которое образуется при сгорании шая часть распыленного раствора, а остальной бытового газа. Химические методы определения раствор стекает на дно распылителя. Интенсив этих элементов сложны и неточны, поэтому ка- ность распыления, а следовательно, и количе лин и натрий определяют в клинических лабора- ство вещества, поступающего в пламя, зависят ториях практически только путем фотометрии не только от условий работы эжектора Ч его пламени. регулировки и давления воздуха, которое, ко При атомной абсорбциометрии исследуемый нечно, должно тщательно регулироваться и под образец вносят в пламя, в результате чего оно держиваться постоянным на протяжении всего начинает поглощать свет с длиной волны, ха- измерения, но и от вязкости раствора. Возбуж рактерной для данного элемента. Особенность дение атомов в пламени в известной мере зави этого процесса состоит в том, что поглощается сит от природы молекулы, в.которую входит очень узкая полоса света, измеряемая долями исследуемый элемент, а также от присутствия нанометра, поэтому для измерения поглощения в пламени других элементов, т. е. фона. Поэтому необходим соответствующий линейчатый источ- все условия проведения анализа должны тща ник света. В качестве такого источника служит тельно соблюдаться;
при исследовании сыво специальная лампа, внутри баллона которой ротки крови или других богатых белком жидко находятся разогретые пары того самого элемен- стей разведение должно быть всегда одним и тем та, концентрация которого определяется. Благо- же. Не следует думать, что если имеется пропор даря этому источник света излучает только тот циональность между концентрацией калиброво свет, поглощение которого должно быть иссле- чного раствора и показаниями прибора, то такая довано;
этим достигается очень высокая избира- же пропорциональность сохранится и при раз тельность физического эффекта и специфич- личных разведениях сыворотки, поскольку при ность метода, однако для каждого исследуемого разведении сыворотки изменяются также вяз элемента должна быть специальная лампа, из- кость раствора, а значит, и условия распыления.
лучающая нужные линии спектра. Поэтому при В составе пламенного фотометра обязатель боры для атомного абсорбционного анализа но имеется блок, обеспечивающий подачу возду выпускаются с набором ламп, число которых ха (или, реже, кислородно-воздушной смеси) равно числу элементов, которые можно опреде при постоянном давлении, которое регулируется лять на данном приборе.
в пределах 2Ч4 атм, а также горючего газа при В некоторых приборах используется обычная давлении, измеряемом сантиметрами ртутного газовая горелка, в пламя которой распыляется столба. Воздух подается в распылитель, оттуда раствор, содержащий исследуемый элемент. Ре- в смеситель и в горелку. Свет, излучаемый го же для получения раскаленных паров исследуе- релкой, через систему зеркал, линз и светофиль мого вещества используется специальная графи- тров попадает на один или два фотоэлемента, товая камера, стенки которой нагреваются элек- ток которых измеряется прибором. Устройство тричеством, а во внутреннее пространство прибора обязательно предусматривает возмож распыляется раствор исследуемого образца. Та- ность визуального контроля пламени и его юсти кая система сложнее, чем обычная горелка, но ровки. При налаживании прибора и включении позволяет изменять температуру поглощающих его надо сначала создавать давление воздуха, свет паров исследуемого элемента. Необходи- а потом уже включать газ и зажигать пламя, так мость устанавливать для каждого исследуемого как в противном случае газ может проникнуть элемента свой источник освещения конструктив- через смеситель в распылитель, где образуется но осложняет прибор, так как путем простого взрывоопасная газовоздушная смесь. В прибо поворота головки можно менять 3Ч4 лампы, ре также обязательно имеется отстойник, в кото а если число измеряемых элементов достигает рый стекает жидкость, оседающая на дно распы 15Ч20, каждую лампу приходится отдельно лителя во время работы. Давление воздуха устанавливать и юстировать. Атомные абсорб- в отстойнике во время работы всегда несколько циометры Ч значительно более дорогие прибо- выше атмосферного, поэтому жидкость оттуда ры по сравнению с пламенными фотометрами. удаляется через водяной запор. Во время рабо Многие элементы, которые определяются с их ты пространство внутри отстойника не должно помощью, могут быть определены и посредством непосредственно сообщаться с атмосферным обычных цветных реакций, хотя и с большей воздухом, иначе давление там упадет и из го затратой труда и часто менее точно, поэтому релки может засосаться взрывоопасная смесь.
атомная абсорбциометрия оказывается методом Помимо этих блоков, обязательных для всех выбора. приборов, некоторые могут быть снабжены раз личными дополнительными сервисными устрой- Как уже отмечалось, в то время как опреде ствами: электрическим поджигателем газовой ление калия и натрия методом пламенной фото горелки, автоматическим разбавителем проб, метрии является обязательным анализом для устройством, печатающим результаты, и т, д. всех крупных лабораторий, определение других Существует несколько возможных схем ра- металлов: кальция, магния, железа и т. д.Ч боты на пламенном фотометре. В самом простом может быть выполнено как обычными химиче случае, который обычно и практикуется при скими методами, так и посредством атомно исследовании мочи или плазмы крови, исследуе- абсорбционного анализа, который тем самым мый материал разводят водой в 50 или 100 раз, является методом выбора и сравнительно мало свет, образующийся при его сжигании в пламе- используется в клинических лабораториях.
ни, проходит через светофильтр и попадает на Здесь надо иметь в виду еще и то обстоятель фотоэлемент, интенсивность тока которого реги- ство, что в биологических жидкостях такие стрируется. В связи с тем что иногда бывает элементы, как кальций и магний, лишь частично трудно достаточно хорошо выделить нужную находятся в биологически активном ионизиро спектральную линию, используют также так на- ванном состоянии, а атомно-абсорбционный зываемый компенсационный метод, когда с по- анализ позволяет определять лишь общее их мощью зеркал и линз формируется два пучка содержание. Однако при определении микроэле света: один проходит через светофильтр, выде- ментов: меди, марганца, цинка, а также токсиче ляющий характерную для исследуемого элемен- ских веществ, особенно ртути, преимущества та линию спектра, а второй Ч линию того эле- атомно-абсорбционного анализа проявляются в мента, который создает помехи, затем из показа- полной мере. Особенно удобны те варианты ме теля первого фототока вычитают второй. тода, в которых применяется беспламенная ато Можно также использовать метод внутрен- мизация, так как выпаривание пробы, ее озоле него стандарта, когда исследуемую биологиче- ние и перевод в парообразное состояние про скую жидкость разводят не водой, а слабым исходят в одном и том же устройстве. При раствором элемента, которого нет в биологиче- определении веществ, которые находятся в био ском материале, чаще для этого используют логическом материале в ультрамикроколиче соли лития. В процессе анализа делают два ствах, чувствительность метода иногда оказыва измерения: со светофильтром, пропускающим ется недостаточной, в этих случаях применяют излучение измеряемого элемента, и со свето- концентрирование путем образования комплек фильтром, пропускающим излучение внутренне- сных соединений с пирролидондитиокарбоматом го стандарта;
если показания внутреннего стан- аммония (ПДКА), которые экстрагируют мети дарта отличаются от того, что было при ка- лизобутилкетоном (МИБК).
либровке, то вносят соответствующую поправку и в измеряемый ток. Такой порядок работы позволяет избежать ошибок, связанных с не- 1.6.4. Иммунохимические методы стандартными условиями распыления;
это быва ет важно в том случае, когда исследуются При взаимодействии антигена и специфиче жидкости, вязкость которых может значительно ского иммуноглобулина, который по традиции колебаться (слюна, желудочный сок и т. д.).
называется антителом, образуется высокомоле Чтобы создать одинаковые условия возбуж кулярный комплекс, растворимый как в избытке дения исследуемого элемента при анализе проб, антител, так и в избытке антигена (рис. 3);
его в которых содержание других составных частей можно использовать, чтобы судить о содержа значительно колеблется, используют также раз нии антигена, но это не простая задача. Долгое ведение исследуемых проб так называемым фо время не могли найти подходящего решения ном, т. е. раствором, содержащим такие количе этой задачи и иммунохимические методы были ства элемента, определенным образом влияюще лишь качественными или в лучшем случае полу го на интенсивность свечения исследуемого количественными. Однако за последние 30 лет элемента, чтобы возможные колебания состава найдено несколько путей для преодоления в той посторонних веществ в пробе уже не сказыва или иной степени возникших трудностей. Это лись.
делает антитела очень чувствительными и специ В клинической лабораторной практике метод фическими реактивами для определения чрезвы внутреннего стандарта и разведения проб фо- чайно широкого класса органических веществ, ном, как правило, не используется;
компенса- в первую очередь белков. Чаще всего использу ционный метод измерения используется только ют три способа: 1) преципитацию в геле, 2) свя в том случае, если это предусмотрено конструк- зывание меченых веществ и 3) изучение физиче цией прибора. Для того чтобы анализы сыво- ских характеристик образующихся макромоле ротки крови и мочи были выполнены с необходи- кулярных комплексов.
мой точностью, практически достаточно пра- Существует огромное количество вариантов вильно приготовить комплексный калибровоч- метода преципитации в геле. Однако в любом ный раствор, который одновременно содержит случае в прозрачной желеобразной среде тем и калий, и натрий в концентрациях, близких или иным способом создается либо градиент к тем, которые бывают в исследуемом материа- концентрации антигена при постоянной концен ле. Однако в моче и плазме крови соотношение трации антител, либо градиенты концентраций этих элементов различное, поэтому калибровоч- той и другой компоненты. В том месте, где их ный график для мочи не может быть использо- содержание эквивалентно, выпадает осадок Ч ван для сыворотки и наоборот. образуется зона преципитации, заметная нево оружейным глазом. Ее форма и положение говорят о составе и концентрациях антигенов.
- Связывание меченых веществ также суще ствует во многих вариантах, оно составляет основу метода конкурентного связывания, или сатурационного анализа. В этом случае образо вание комплекса антиген Ч антитело проводят так, чтобы в него включился весь исследуемый антиген и еще некоторое количество меченого соединения. Затем комплекс отделяют от непро реагировавших составных частей и по количе ству метки судят о содержании антигена.
Третий путь основан на том, что размер молекулы комплекса значительно больше, чем Рис. 3. Образование преципитата при иммуно молекулы антитела или антигена, поэтому и фи- химических реакциях. На оси ординат Ч коли зические свойства: растворимость, способность чество осадка комплекса антигенЧантитело;
рассеивать свет и флюоресцировать Ч иные. на оси абсцисс Ч отношение количеств анти Проще всего исследовать светорассеивание генЧантитело в условных единицах.
(т. е., попросту говоря, помутнение раствора) I Ч зона избытка антитела;
11 Ч зона избытка анти в результате выпадения осадка. Но чтобы оса- гена.
док образовывался количественно, нужны спе циальные условия, которые долгое время были неизвестны. Оказалось, что в присутствии кол лоидов свободный объем раствора, в котором пропитывается антителами и в луику вносят могут присутствовать белковые молекулы, исследуемую жидкость. Однако в данном вари уменьшается и реакция антиген Ч антитело анте антиген перемещается в гель не в результа идет значительно быстрее и с лучшим количе- те простой диффузии, а под влиянием нало ственным выходом.
женного электрического поля, т. е. так же, как Методы преципитации в геле. Наиболее рас- при электрофорезе. Благодаря этому образова пространены четыре перечисленные ниже вари- ние преципитата идет значительно быстрее, зона анта методов определения антигенов преципита- преципитации имеет характерную форму за цией в геле. остренных языков, отдаленно напоминающих 1. Радиальная иммунодиффузия по Манчи- контуры космических ракет на старте (отсюда ни: в этом случае прозрачный гель в чашке и название: по-английски ракета rocet). Рас Петри пропитывается антителами, в нем выреза- стояние от лунки до верхушки зоны примерно ют лунку, куда помещают исследуемый раствор: пропорционально концентрации антигена.
Антиген диффундирует из лунки в гель, где 4. Классический иммуноэлектрофорез по создается неравномерная концентрация Ч вы- Грабарю или Вильямсу дает наиболее разверну сокая по краям лунки, убывающая обратно тую картину антигенного состава исследуемой пропорционально квадрату расстояния от ее жидкости. В этом случае исследуемую жидкость, краев. В том месте, где концентрация антигена например сыворотку крови, подвергают обычно и антитела эквивалентны, образуется зона пре му электрофорезу в геле, при этом белки выстра ципитации в виде кольца. Чем выше концентра- иваются в линию соответственно своей электро ция антигена в лунке, тем больше радиус кольца.
форетической подвижности. После этого прово 2. Встречная или двойная, иммунодиффузия дят встречную иммунодиффузию в поперечном по Оухтерлони отличается от радиальной тем, направлений против поливалентной иммунной что слой геля предварительно не пропитывается сыворотки, в результате образуется сложная антителами, а их раствор вносят в специальную система дуг преципитации.
Pages: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | ... | 13 | Книги, научные публикации