Книги, научные публикации
Pages: | 1 | ... | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | ... | 13 | СПРАВОЧНИК Лабораторные методы исследования в клинике Под редакцией профессора В.В.Меньшикова МОСКВА ДМЕДИЦИНА" 1987 ББК 53.4 М51 УДК 61б-074/-078:061.6 В. В. МЕНЬШИКОВ, Л. Н. ДЕЛЕКТОРСКАЯ, Р. П. ...
-- [ Страница 4 ] --вана, либо тонким ободком окружает ядро. Количество альвеолярных макрофагов оце нивают при микроскопическом исследовании не менее 2 препаратов. Критерий оценки: единич 2.4.4. Алгоритмический анализ ные в препарате альвеолярные макрофаги Ч мокроты мало (1), единичные скопления из нескольких клеток в поле зрения Ч среднее количество Метод Капрала. Пр и н ц и п. Для (2), большие скопления альвеолярных макро оценки степени активности воспалитель- фаговЧмного (3). В противоположность пре ного процесса в легких, выраженности дыдущим показателям число альвеолярных аллергического, и обструктивного компонентов макрофагов вычитают из суммы первых четырех в течение патологического процесса результатам показателей.
микроскопического исследования дают коли- Итогодую величину переносят в графиче чественную оценку, выраженную цифровыми ский показатель интенсивности воспалительного показателями. процесса. Максимальная активность воспаления Об о р у д о в а ни е то же, что и для обыч- выражается цифрой II. Уменьшение показателя ного микроскопического исследования, а также в процессе терапия говорит об ее эффективности, специальный бланк (см. с. 96) состоящий из II. Степень выраженности аллергического 3 отрезков (А, В и С), и клавишный счетчик компонента оценивают по количеству эозино клеток. фильных лейкоцитов и кристаллов ШаркоЧЛей Ход ис с л е д о в а ния. I. Оценка актив- дена. Критерий оценки: эозннофильные лейко ности воспалительного процесса. Измеряют су- циты единичные в препарате Ч 0, единичные не точное количество мокроты и результат вносят большие скопления в препарате Ч мало (1), не в графу бланка (отрезок А). Если за сутки выде- большие скопления по всему препарату Ч сред ляется менее столовой ложки (т. е. менее 15 мл), нее количество (2), если основной состав лейко то это оценивают как мало и обводят в бланке цитов представлен эозинофильными,Ч мно цифру 1;
если выделяется от 1 до 3 столовых го (3);
по такому же принципу производят коли ложек (15Ч45 мл), то это количество (лсред- чественную оценку числа кристаллов ШаркоЧ нее) оценивают цифрой 2;
более 3 ложек (т. е. Лейдена. Для окончательной оценки выражен более 45 мл) оценивают как обильное выделение ности аллергического компонента цифры сумми (лмного), что соответствует цифре 3. Получен- руют, и числовой показатель колеблется от ный результат выносят в клетку этого же ряда О до 6.
свободной колонки. III. Выраженность интенсивности обструк Характер мокроты оценивают следующим тивного компонента оценивают по наличию и образом: слизистая (1), слизисто-гнойная (2), количеству спиралей Куршмана и капель липи гнойная (3). Результат переносят в соответст- дов в альвеолярных макрофагах. Критерий вующий ряд свободной колонки в отрезке В. В оценки капель липидов: отсутствие липидов Ч отрезке С фиксируют, результаты специальных 0;
в цитоплазме макрофагов маленькие блестя дополнительных назначений и микроскопиче- щие капли липидов Ч 1, цитоплазма макрофа ских находок. гов заполнена липидамн Ч 2, блестящие капли Количество лейкоцитов определяют, произ- липидов видны не только в клетках, но и в окру водя подсчет в тонких нативных препаратах жающем их детрите Ч 3. Критерий оценки при равномерном распределении материала на числа спиралей Куршмана: спирали Куршмана предметном стекле. Клетки подсчитывают не не найдены Ч 0, единичные в нескольких (3Ч менее чем в 20 полях зрения (окуляр 7 X, объек- 4) препаратах Ч I, единичные в препарате Ч 2, тив 40 X). почти в каждом поле несколько спиралей Ч 3.
Критерий оценки: до 10 лейкоцитов в поле Показатель интенсивности обструктивного ком зрения Ч мало (1), от 10 до 50 в поле зрения Ч понента может колебаться от 0 до 6.
среднее количество (2), более 50Ч много (3).
Результат фиксируется по принципу предыду- Пр и ме ч а н и я. 1. Оценивать активность щих. воспалительного процесса можно только по Количество эритроцитов (микрокровохар- результатам исследования мокроты, прове канье) как показатель активности воспалитель- денного не позднее 2Ч3 ч после ее взятия.
ного процесса оценивают по отношению к числу 2. Наличие специальных бланков жела лейкоцитов (на 1000 лейкоцитов). Подсчет тельно, но не обязательно. 3. Если примесь ведут в разных местах тонких препаратов;
для крови в мокроте обнаруживают при макро облегчения можно использовать клавишный скопическом исследовании, то это обяза тельно следует отметить, так как в этих слу- в узкогорлую бутылку, приливают двойное ко чаях судить об активности воспаления по личество 0,5% раствора едкой щелочи, смесь числу эритроцитов нельзя. энергично встряхивают 10Ч15 мин. Затем до бавляют 1 мл ксилола (можно бензина, толуо ла) н около 100 мл дистиллированной воды для 2.4.5. Бактериоскопия разжижения мокроты и снова встряхивают 10Ч 15 мин. Доливают дистиллированную воду в та Этот этап исследования мокроты включает в ком количестве, чтобы уровень жидкости под себя микроскопию препаратов, окрашенных по нялся до горлышка бутылки. Оставляют на 1Ч ЦилюЧНильсену, для выявления микобактерий 2 ч для отстаивания. Образовавшийся верхний туберкулеза и препаратов, окрашенных по Гра- беловатый слой снимают по каплям пипеткой и ну, для изучения микрофлоры мокроты. Иногда наносят на предметные стекла, предварительно для выявления микобактерий туберкулеза при- подогретые до 60 "С (стекла для подогревания бегают к обогащению методом флотации. Препа- можно положить на металлический подносик раты мокроты для бактериоскопического иссле- и покрыть им водяную баню). Каждую после дования, приготовленные на предметном стекле, дующую каплю наносят на предыдущую под высушивают, фиксируют над пламенем горелки сушенную. Препарат фиксируют и красят по и затем окрашивают. ЦилюЧНильсену.
Окраска по ЦилюЧНильсену. Реакти- Наиболее достоверные результаты в обнару вы. 1. Карболовый фуксин: 1 г основного фукси- жении микобактерий туберкулеза дают бакте на растворяют в 10 мл этилового спирта, раствор риологические методы исследования. Другие выливают в 100 мл 5 % раствора карболовой бактерии, встречающиеся в мокроте, например кислоты. 2. 3 % спиртовой раствор НС1: 3 мл HCI стрептококки, стафилококки, диплобацнллы, и 97 мл этилового спирта. 3. Водный 0,5 % ра- палочки Фридлендера и пр., могут быть распо створ метиленового синего. знаны только методом посева. Бактериоскопиче Ход окраски. На препарат кладут ку- ское исследование препарата в этих случаях сочек фильтровальной бумаги л наливают раствор имеет только ориентировочное значение. Пре карболового фуксина, затем препарат нагревают параты красят метиленовым синим, фуксином над пламенем горелки до появления паров, или по Граму.
охлаждают и снова нагревают (3 раза). После Окраска по Граму. Ре а кт ив ы. 1. Карбо остывания препарата сбрасывают фильтро- ловый раствор генцианового фиолетового: 1 г вальную бумагу и опускают его в солянокислый генцианового фиолетового растворяют в 10 мл спирт для обесцвечивания. Обесцвечивают до 96% спирта, раствор выливают в 100 мл 1 Ч полного удаления краски, промывают водой и 2 % карболовой кислоты, взбалтывают, 2, Ра докрашивают метиленовым синим 20Ч30 С. створ Люголя: 1 г йода, 2 г йодида калия и 300 мл Снова промывают водой и высушивают на воз- дистиллированной воды;
йод и йодид калия ра духе. Микроскопируют с иммерсионной систе- створяют сначала в 5Ч8 мл воды, а затем прили мой.
вают остальную воду. 3. 96 % спирт или сырец.
Туберкулезные микобактерий окрашивают- 4. 10% раствор карболового фуксина: 10 мл ся, в красный цвет, все остальные элементы карболового фуксина н 90 мл дистиллированной мокроты и бактерии Ч в синий. Туберкулезные воды.
микобактерий имеют вид тонких, слегка изогну- Ход исследования. На фиксирован тых палочек различной длины с утолщениями на ный препарат кладут полоску фильтровальной концах или посередине, располагаются группа- бумаги и наливают раствор генцианового фио ми и поодиночке.
летового. Красят 1'/2Ч2 мин. Бумажку сбра При окраске по ЦилюЧНильсену в красный сывают и заливают препарат раствором Люголя цвет красятся также кислотоупорные сапрофн- на 2 мин, а потом прополаскивают препарат в ты. Дифференциальная диагностика туберку- спирту до сероватого цвета. Промывают водой лезных микобактерий и кислотоупорных сапро- и окрашивают 10% раствором карболового фитов ведется бактериологическими методами фуксина 10Ч15 с. После этого препарат опять исследования. промывают водой, высушивают и микроскопы руют с иммерсионным объективом.
Пр име ч а ние. При исследовании сле дует избегать: 1) приготовления толстых Литература. Альтгаузен А. Я. Клини мазков мокроты;
2) фиксации плохо высу- ческая лабораторная диагностика.Ч М., 1959;
шенных мазков;
3), недостаточной фикса- Калинин В. С. Методика лабораторных клини ции;
4) обугливания препарата при дли- ческих исследований.Ч М., 1932;
Руководство тельной фиксации. по клинической лабораторной диагностике /Под ред. М. А. Базарновой.Ч Киев, 1981;
Руковод Если микобактерий выделяется мало, то в ство по цитологической диагностике опухолей обычных мазках их не находят и прибегают к человека/ Под ред. А. С. Петровой, М. П. Пто методу накопления. хова.Ч М., 1976;
Экспресс-исследование мокро Метод флотации (всплывание) по Поттенд- ты (алгоритмический анализ): Методические жеру. Ход ис с ле дова ния. Свежевыде- рекомендации для врачей и клинических лабо ленную мокроту (не более 10^15 мл) помещают рантов.Ч Таллин, 1978.
4 п/р В. В. Меньшикова 2.5. ЭКССУДАТЫ И ТРАНССУДАТЫ Выпотные жидкости, которые скапливаются Ре а кт ивы. 1. 3% раствор сульфосали в серозных полостях (плевральной, брюшной, циловой кислоты. 2. 0,9 % раствор хлорида полости перикарда), добывают для исследова- натрия. 3. Стандартный раствор альбумина Ч ния пункцией полостей. Полученный при пунк- I % раствор.
ции материал собирают в чистую сухую посуду, Лиофилизированный альбумин (из челове добавляют цитрат натрия (из расчета 1 г на 1 л ческой или бычьей сыворотки) в количестве 1 г жидкости) или гепарин и тотчас все количество растворяют в небольшом количестве 0,9 % раст отправляют в лабораторию для исследования. вора хлорида натрия в мерной колбе вмести мостью 100 мл и доводят объем до метки раство ром хлорида натрия. Реактив нестойкий. Для 2.5.1. Виды пунктатов стабилизации к стандартному раствору прибав ляют 1 мл 5 % раствора азида натрия (NaNa).
Транссудаты появляются вследствие разно- В этом случае раствор хранят в течение 2 мес;
образных причин: 1) изменений сосудистых 1 мл раствора содержит 10 мг альбумина.
стенок;
2) повышения эндокапиллярного давле- Спе циа л ь но е оборудование :
ния;
3) гидремических изменений. Обычно это фотоэлектрокол ор и метр.
прозрачная жидкость слабощелочной реакции, Ход исследования. Ввиду высокого светло-желтого цвета;
изменения цвета и проз- содержания белка в транссудатах и экссудатах рачности можно наблюдать только в геморраги- перед определением их следует разводить 0,9 % ческих и хилезных транссудатах. Относительная раствором хлорида натрия. Степень разведения плотность жидкости колеблется от 1,002 до определяют ориентировочно по качественной 1,015;
транссудаты никогда не превышают этой пробе с сульфосалициловой кислотой. После верхней границы, всегда содержат белок в кон- проведения пробы готовят основное разведение центрации 5Ч25 г/л, лишь в некоторых случаях выпотной жидкости (1:100), для чего к 0,1 мл количество белка в асците может поднимать- выпотной жидкости приливают 9,9 мл 0,9 % ся до 40 г/л. раствора хлорида натрия. Из основного разве Экссудаты образуются в результате воспали- дения при высоком содержании белка можно тельных процессов, вызываемых разнообразны- делать еще большие. В конечное расчете учиты ми причинами. Это жидкость щелочной реакции, вают разведение.
относительная плотность которой больше 1,018, В пробирку вносят 1,25 мл разведенной в а концентрация белка больше 25Ч30 г/л. Сероз- 100 раз (или более) жидкости и 3,75 мл (до ные экссудаты прозрачные, желтого цвета, с 5 мл) 3 % раствора сульфосалнциловой кисло низкой концентрацией белка Ч около 30 г/л ты, пробу перемешивают. Через 5 мин измеряют (наблюдают чаще при туберкулезе легких). на фотоэлектроколориметре при длине волны Гнойные экссудаты мутные, желто-зеленого цве- 590Ч650 нм (светофильтр оранжевый или крас та, концентрация белка около 70Ч80 г/л, от- ный) в кювете с длиной оптического пути 0,5 см носительная плотность высокая. Геморрагиче- против контроля. Контроль: 1,25 мл разведен ские экссудаты коричневато-красноватого цвета ной жидкости и 3,75 мл 0,9 % раствора хлорида (при злокачественных новообразованиях плев- натрия.
ры). Хилезные и хилусоподобиые экссудаты Расчет производят по калибровочному гра имеют вид молока н содержат большое коли- фику. Для построения калибровочного графика чество жира. Помутнение таких экссудатов из стандартного раствора готовят разведения, исчезает после добавления едкого натра и встря- как указано ниже, и обрабатывают их, как опыт.
хивания с эфиром. Хилусоподобные жидкости Концентрация белка в экссудатах Ч от 30 до образуются не вследствие примеси хилуса, а 80 г/л, в транссудатах Ч 5Ч25 г/л.
благодаря распаду жироперерожденных клеток и освобождению липидов (наблюдают при хро нических воспалительных процессах оболочек Объем 0,9 % Объем стан- Концентра серозных полостей). Холестериновые экссудаты раствора № про дартного ра- ция белка, хлорида встречаются крайне редко (осумкованные выпо- бирки створа, мл мг/л натрия, мл ты давностью несколько лет) и представляют собой густую жидкость с желтоватым или корич неватым оттенком. При микроскопии видны 1 0,05 9,95 кристаллы холестерина.
2 0,1 9,9 3 0,2 9,8 4 0,5 9,5 2.5.2. Физико-химические свойства 5 1,0 9,0 Определение относительной плотности вы потных жидкостей см. 2.1.
Унифицированный метод определения белка по помутнению (1972). Пр инцип. Белок с сульфосалициловой кислотой дает помутнение, Пр и ме ч а н и е. Прямолинейная зависи интенсивность которого пропорциональна кон- мость калибровочного графика сохраняется центрации белка.
до концентрации белка 1000 мг/л.
Проба Ривальта. Проба используется для количестве в транссудатах, в экссудатах при отличия экссудатов от транссудатов. Последние злокачественных новообразованиях, а иногда содержат серомуцин (вещество глобулиновой при туберкулезе. В транссудатах большой дав природы), дающий положительную пробу Ри- ности клетки мезотелия могут быть в виде цито вальта. плазмы с эксцентрично расположенным ядром Ч Ход опре д е ле ния. В цилиндр вмести- так называемые перстневидные клетки.
мостью 100 мл с дистиллированной водой, под- Опухолевые клетки с выраженным полимор кисленной 2Ч3 каплями концентрированной ук- физмом расположены в препаратах обычно сусной кислоты, добавляют 1 Ч2 капли исследуе- конгломератами без четких клеточных границ.
мой жидкости. Если образующееся беловатое Другие клеточные элементы распознаются в облачко при добавлении жидкости опускается окрашенных препаратах. Помимо различных до дна цилиндра,Ч проба положительная. Если клеток, в нативных препаратах могут встречать падающие капли растворяются, исследуемая ся и неклеточные элементы.
жидкость не содержит серомуцина,Ч проба Детрит встречается в виде мелкозернистой отрицательная.
сероватой массы. Характерен для гнойных Проба Ривальта не всегда позволяет отли- экссудатов.
чить транссудат от экссудатов при исследовании Жировые капли имеют вид резко прелом смешанных жидкостей. Большое значение для ляющих свет круглых капель, окрашивающихся их отличия имеет микроскопическое исследо- судаком III. Их находят при гнойных экссуда вание. тах с большим клеточным распадом, при хилез ных и хилусоподобных экссудатах, Кристаллы холестерина Ч тонкие бесцвет 2.5.3. Микроскопия ные таблички с обрезанными углами. Обнару живаются при старых осумкованиых выпотах, Микроскопическое исследование выпотных чаще туберкулезного происхождения (холесте жидкостей производят после центрифугирова- риновые экссудаты).
ния н приготовления препаратов из осадка, Слизь обнаруживается крайне редко и явля Экссудат, доставленный в лабораторию в свер- ется указанием на наличие бронхопульмональ нувшемся виде, подвергают дефибринированию ного свища.
путем взбалтывания со стеклянными- бусами. Друзы актиномицетов можно найти в плев Исследование такой жидкости дает лишь ориен- ральном экссудате при актиномикозе.
тировочное представление о клеточном составе, Окрашенные препараты. Небольшую каплю так как часть клеток разрушается при дефибри- осадка жидкости помещают на предметное нированнн или остается в сгустках фибрина. стекло. Препарат готовят так же, как мазок кро Микроскопическое исследование жидкостей ви, высушивают на воздухе и окрашивают обыч следует производить в нативных и окрашенных ными гематологическими методами. В случае препаратах. геморрагического экссудата мазки следует гото Натнвные препараты. Исследование натив- вить из верхнего слоя осадка, содержащего лей ных препаратов (каплю осадка наносят на пред- коциты и другие клеточные элементы. Клеточные метное стекло и накрывают покровным стеклом) элементы экссудатов окрашиваются более ин дает возможность ориентировочно оценить ко- тенсивно, чем клетки крови, поэтому красить личество клеточных элементов, преобладание препарат следует не дольше 8Ч10 мин. Окра различных элементов, наличие клеток опухоле- шенный препарат просматривают с малым уве вой природы. Микроскопически в нативных личением, затем с иммерсионной системой.
препаратах можно обнаружить следующие эле- В мазках подсчитывают процентное соотноше менты.
ние отдельных видов лейкоцитов, исследуют Эритроциты являются постоянными клетка- морфологию других клеточных элементов.
ми жидкостей. В транссудатах и серозных экссу- В окрашенных препаратах обнаруживают датах эритроциты находятся в небольшом коли- следующие элементы.
честве;
их присутствие связано с травматической Нейтрофильные лейкоциты Ч преобладаю примесью крови (в момент прокола). Геморра- щие клетки гнойного экссудата. По морфологии гические экссудаты обычно содержат очень нейтрофилов можно судить о тяжести воспали много эритроцитов, что значительно затрудняет тельной реакции. Дегенеративные изменения исследование нативных препаратов. В этих слу- нейтрофилов (токсигенная зернистость и вакуо чаях надо готовить тонкие препараты или до- лизация протоплазмы, гиперсегментация и пик бавлять каплю слабого, раствора уксусной кис- ноз ядер и др.) с явлениями клеточного распада лоты (для гемолиза эритроцитов), но такой пре- наблюдаются при наиболее тяжелых случаях парат в дальнейшем красить нельзя. гнойного воспаления. Нейтрофилы с явлениями Лейкоциты содержатся в небольшом коли- фагоцитоза встречаются при более доброка честве (до 15Ч20 в поле зрения) в транссудатах чественных процессах. При серозном воспалении и в большом количестве в жидкостях воспали- нейтрофилы можно обнаружить в начальной тельного происхождения (особенно много их в стадии процесса, а также в случаях неблаго гнойных экссудатах). Соотношение отдельных приятного течения (туберкулезный экссудатив видов лейкоцитов исследуют в окрашенных пре- ный плеврит).
паратах.
Лимфоциты являются преобладающими эле Клетки меэотелия Ч крупные клетки разме- ментами серозного выпота (до 80Ч90 % всех ром до 25 мкм. Обнаруживаются в большом лейкоцитов). При экссудативном плеврите лю бой этиологии лимфоцитарный характер экссу- генеративные изменения этих клеток (вакуоли дата проявляется обычно на 2-й неделе заболе- зация цитоплазмы Ч так называемые перстне вания.
видные клетки и ее жировая дистрофия), Эозинофилы нередко встречаются в серозном Клетки опухоли, отличаются резко варьирую экссудате и рассматриваются как аллергическое щими размерами, выраженным клеточным поли проявление процесса. Преобладание эозинофи- морфизмом (различная величина, структура и лов (30Ч80 % всех лейкоцитов Ч эозинофиль- окраске ядра, крупные ядрышки, анизохромня ный плеврит) наблюдается при ревматических клеток и т. д.). Достоверными для диагноза выпотах, туберкулезе, травматическом плеврите, злокачественных новообразований являются опухолях, паразитарных заболеваниях. находки комплексов (конгломератов) опухоле Плазматические клетки могут обнаружи- вых клеток.
ваться в серозном или гнойном экссудате при затяжных воспалительных процессах и при травматических плевритах.
2.5.4. Бактериоскопия Гистиоциты Ч тканевые моноциты Ч клетки различного размера с базофнльной или серова Сухие фиксированные мазки окрашивают по то-голубой цитоплазмой и ядром моноцитонднон ЦилюЧНильсену, Граму и т. д. Для исследова формы. Их находят в значительном количестве ния на туберкулезные микобактерни экссудат в гнойных экссудатах, особенно я случаях подвергают длительному центрифугированию высоковирулентной флоры.
или обработке способом флотации (см. раз Макрофаги Ч крупные клетки, сходные с мо дел 2.4). При необходимости производят бакте ноцитами, с включениями в цитоплазме и с яд риологическое исследование.
ром неправильной формы Ч обнаруживаются при кровоизлияниях в плевральную полость, Лит е ра т у ра. Абрамов М. Г. Клиниче опухолях, гнойных плевритах.
ская цитология.Ч М.: Медицина, 1974;
Кали :
Клетки мезотелия Ч крупные клетки (до нин В. С. Методика лабораторных клинических 30 мкм).правильной формы, с центрально распо- исследований.Ч М., 1932;
Михеева А. И., Бого ложенным круглым ядром и широкой зоной дарова И. А.Ч Лабор. дело, 1969, № 7, 441;
цитоплазмы (от сероватого до темно-голубого Руководство по клинической лабораторной диаг цвета), иногда двуядерные и многоядерные Ч ностике/Под ред. М. А. Базарновой.Ч Киев, постоянно обнаруживаются в транссудатах, 1981;
Яновский Д. НД Челенова М. А. Атлас в экссудатах в начальной стадии воспалительно- цитологии экссудатов и транссудатов.Ч Киев, го процесса, при реактивном раздражении 1968;
Kingsburry F. В., Clark С. P., Williams /., плевры, а также при опухолях. В жидкостях Post A.^i. Lab. Clin. Med., 1926, vol. 11, большой давности отмечаются выраженные де- p. 981.
2.6. СПИННОМОЗГОВАЯ ЖИДКОСТЬ Получение. Для получения спинномозговой ная плотность 1,003Ч1,008;
содержит 0,2Ч жидкости производят люмбальную пункцию 0,3 г/л белка, хлоридов Ч 7Ч7,5 г/л, формен между остистыми отростками III и IV яли IV и ных элементов Ч от 0 до 3 в 1 мкл.
V поясничных позвонков. Для пункции больной укладывается на бок с сильно согнутым позво ночником, согнутыми в коленях и притянутыми 2.6.1. Физические свойства к животу ногами. Чтобы найти место пункции, необходимо соединить линией (йодным тампо- Цвет. Желтый цвет (ксантохромия), а также ном) высшие точки гребней подвздошных костей буровато-коричневый бывает обусловлен нали (линия Якобн);
эта линия обычно пересекает чием продуктов распада гемоглобина. Различа остистый отросток IV поясничного позвонка ют застойную и геморрагическую ксантохромию.
(верхний край V поясничного позвонка). Кожу Застойная ксантохромия Ч результат замедле тщательно дезинфицируют и вводят иглу с манд- ния тока крови в сосудах мозга, что приводит реном. Когда игла достигает подпаутинного К поступлению плазмы в ликвор. Геморрагиче пространства (расстояние от поверхности кожи ская ксантохромия обусловлена попаданием до канала 6Ч7 см), мандреи вынимают и соби- крови в ликворное пространство и сочетается с рают вытекающую жидкость. Количество жид- эрнтрохромней. Очень редко желтая окраска кости, извлекаемой без вреда для больного, Ч может быть обусловлена примесью лекарствен 8Ч10 мл. Место пункции закрывают стерильным ных веществ, например пенициллина.
материалом и больного оставляют в положении Красный цвет придает ликвору примесь на спине без подушки в течение 24 ч;
в течение неизмененной крови (эритрохромия), которая последующих суток больной может вставать, но может быть результатом кровоизлияния.
на короткое время.
Зеленоватая окраска ликвора может быть Ликвор представляет в нормальных усло- обусловлена окислением билирубина в биливер виях прозрачную, как вода, жидкость слабо- дин и примесью гноя, в последнем случае ликвор щелочной реакции Ч рН 7,35Ч7,4;
относитель- становится мутным. Мутность спинномозговой жидкости зависит от присутствия большого ко- Но р ма л ь ные величины. Нормаль личества форменных элементов, микроорганиз- ное содержание лейкоцитов (цитоз) в 3 мкл мов и фибриногена. спинномозговой жидкости следующее: в жидкос Фибринозная пленка образуется в ликворе ти из желудочков мозга 0Ч3 клетки, в жидкости при большой концентрации фибриногена. Сле- из большой цистерны Ч 0Ч2 клетки, в жидкос дует иметь в виду, что свертывается только ти, полученной при люмбальной пункции,Ч наружный слой фибриногена, образуя мешочек, 7Ч10 клеток. У детей цитоз выше, чем у взрос наполненный жидкостью. Мешочек разрывают лых, и с возрастом постепенно падает;
если у концом пипетки и исследуют излившуюся жид- ребенка до 3 мес в 1 мкл содержится 20Ч кость. При микроскопическом исследовании в клетки, а к году 14Ч15 клеток, то постепенно свернувшемся фибрине можно видеть клеточ- падает их число (приблизительно на 1 клетку ные элементы, а при туберкулезном менингите Ч за год жизни) и к 10 годам составляет 4Ч5 кле иногда обнаружить микобактерии туберкулеза.
ток в 1 мкл.
Кл инич е с к о е з на че ние. Повышен ный цитоз (плеоцитоз) наблюдают при воспа 2.6.2. Микроскопия лительных поражениях мозговых оболочек и органических поражениях вещества мозга.
Унифицированный метод подсчета количест- Количество эритроцитов подсчитывают в ва форменных элементов (1974). Пр инцип, счетной камере Горяева или ФуксаЧРозенталя.
При помощи микроскопа и счетной камеры под- Эритроциты могут быть обнаружены в прозрач считывают число в ликворе лейкоцитов после ной бесцветной жидкости. При наличии 900Ч разрушения эритроцитов.
1000 эритроцитов в 1 мкл наблюдается опалес Реакт ивы. 10% раствор уксусной кисло- ценция жидкости, при наличии 2000 эритроци ты, подкрашенной метиловым фиолетовым:
тов появляется едва заметное розовое окраши ледяной уксусной кислоты 5 мл, воды Ч до вание, при наличии 4000Ч5000 эритроцитов 50 мл, метилового фиолетового 0,1 мл. жидкость приобретает геморрагический харак Спе циа ль ное оборудование. 1. тер. Для диагностики внутричерепной геморра Микроскоп. 2. Камера ФуксаЧРозенталя. гии значение имеет не только абсолютное коли 3. Смесители для подсчета лейкоцитов (мелан- чество эритроцитов, но и нарастание их числа жеры).
при повторном исследовании спинномозговой Ход ис с л е д о в а ния. В меланжер жидкости.
(смеситель) для подсчета лейкоцитов набирают Дифференциация клеточных элементов в до метки л1 10 % раствор уксусной кислоты, счетной камере. В счетной камере с сухой систе подкрашенный метиловым фиолетовым;
затем мой (окуляр 15Х или 10Х, объектив 40Х) до метки II набирают спинномозговую жид- можно дифференцировать почти все клеточные кость. Раствор уксусной кислоты гемолизирует элементы. Реактив окрашивают ядра клеток в возможную примесь эритроцитов и подкраши- красновато-фиолетовый цвет, цитоплазма оста вает в синий цвет лейкоциты, что в дальнейшем ется бесцветной. При этом обращают внимание облегчает их подсчет. После Встряхивания за- На величину клеток, форму и расположение полняют содержимым меланжера, предвари- ядра, ядерно-цитоплазменное соотношение, на тельно выпустив первую каплю, камеру ФуксаЧ личие включений в цитоплазме и т. д. В практи Розенталя, которая состоит из 16 больших квад- ческой работе метод используют наиболее часто.
ратов, каждый из которых разделен на 16 ма- Дифференциация в окрашенных препара лых Ч всего 256 квадратов. Глубина камеры тах. Окра с ка по Роз иной. Жидкость 0,2 мм, общий объем камеры 3,2 мкл. При от- центрифугируют 7Ч10 мин. Надосадок сливают, сутствии смесителя допускается смешивание осадок помещают на обезжиренное стекло, ликвора с реактивом на часовом стекле: 10 ка- легким покачиванием распределяют его на по пель ликвора и 1 капля реактива. После тща- верхности стекла, через 1Ч2 мин жидкость тельного перемешивания полученной смесью сливают. При небольшом плеоцитозе (менее 50 в заполняют камеру. Лейкоциты считают во всех 3 мкл) осадок распределяют на участке. 1 см ;
256 квадратах и полученное число делят на при плеоцитозе, превышающем 100 в 3 мкл,Ч 3,2 (объем камеры). Результат соответствует на участке 1,5Ч2 см ;
при плеоцитозе 500 в количеству форменных элементов в 1 мкл ликво- 3 мкл Ч на участке 2Ч3 см. При очень'боль ра;
кроме того, полученный результат необхо- шом количестве клеточных элементов и наличии крови осадок распределяют на всей поверхности димо разделить на - - (степень разведения предметного стекла и тотчас сливают. Стекло ставят в вертикальное положение. При этом ликвора). Таким образом, формула для пере- достигается минимальная толщина мазка. Маз счета выглядит следующим образом:
ки высушивают в сушильном шкафу при темпе ратуре 40Ч50 С. Затем фиксируют метанолом 1Ч2 мин и красят по Романовскому: тонкий препарат с небольшим цитозом 6Ч7 мин, с 3,2- большим цитозом и кровью 10Ч12 мин. Затем где А Ч число форменных элементов в объеме краску сливают, мазок промывают дистиллиро над 256 квадратами.
ванной водой и высушивают. Если ядра имеют Ист очник ошибок. Длительное хра- бледно-голубой цвет, мазок докрашивают еще нение спинномозговой жидкости.
2Ч3 мин.
Окраска по Возной. Осадок выли- Макрофаги могут иметь ядра различной фор вают на стекло;
слегка покачивая его, жидкость мы, чаще ядро расположено на периферии клет равномерно распределяют на поверхности. Ма- ки, цитоплазма содержит включения и вакуоли.
зок высушивают при комнатной температуре в Величина от 7 до 17 мкм, иногда 20Ч30 мкм.
течение суток, фиксируют метиловым спиртом В нормальном ликворе макрофаги не встречают 5 мин, покрывают раствором азур-эозина (таким ся. Наличие макрофагов при нормальном цнтозе же, как для окраски крови, но разведенным в наблюдают после кровотечения или при воспали 5 раз). Красят в течение 1 ч. Если клетки блед- тельном процессе. Как правило, их встречают в ны, докрашивают неразведенной краской под послеоперационном периоде, что имеет прог контролем микроскопа от 2 до 10 мин. Чем ностическое значение н говорит об активной больше форменных элементов в ликворе, особен- санации ликвора.
но при наличии крови, тем больше надо допол- Зернистые шары (липофаги, клетки с жиро нительно красить. вой инфильтрацией, жировой дистрофией) Ч Окра с ка по Алексееву. На высох- это макрофаги с наличием в цитоплазме капель ший, но не фиксированный препарат наносят жира. В счетной камере они имеют различную бЧ10 капель красителя Романовского. Той же величину, чаще округлую форму, окрашены в пипеткой осторожно распределяют краску на темно-коричневый цвет, ядра клеток не видны.
весь препарат и оставляют на 30 с. Затем добав- В окрашенных препаратах клетки имеют неболь ляют на препарат (не сливая краски) 12Ч20 шое периферически расположенное ядро и круп капель дистиллированной воды, предварительно ноячеистую цитоплазму. Величина ячеек раз нагретой до температуры 50Ч60 С. Соотноше- лична и зависит от величины включенных капель ние капель краски и воды должно быть 1:2. жира. Перекладины ячеек могут быть в виде Покачиванием препарата.перемешивают краску тонких нитей или более грубой базофильной с водой и оставляют на 3 мин. Смывают краску сетки. Зернистые шары обнаруживаются в па струей дистиллированной воды, сушат препарат тологической жидкости, полученной из мозговых фильтровальной бумагой и микроскопируют. кист, в очагах распада мозговой ткани, при опу Метод пригоден для проведения срочного цито- холях.
логического исследования. Нейтрофилы в камере идентичны по виду Морфология клеточных элементов. Лимфо- нейтрофилам периферической крови. Наличие циты по величине сходны с эритроцитами. в ликворе нейтрофилов даже в минимальных При дифференцировании клеток в камере лим- количествах указывает на бывшую или имею фоциты, окрашенные фуксином, имеют круглое щуюся воспалительную реакцию. Нейтрофилы ядро и узкий неокрашенный ободок цитоплазмы, могут обнаруживаться при наличии свежей кро иногда только с одной стороны. Лимфоциты в ви в ликворе и после операций на ЦНС. Благо небольшом количестве (8Ч10 в 3 мкл) встреча- даря цитологическим свойствам ликвора клетки, ются в нормальной жидкости. Количество их особенно нейтрофилы, подвергаются изменени нередко увеличивается.при опухолях ЦНС. ям (лизис ядра, распад клеток, наличие голых Значительный и резкий лимфоидный плеоцитоз ядер). Преобладание в ликворе неизмененных наблюдают при хронических воспалительных нейтрофилов свидетельствует об остром воспа процессах в оболочках (туберкулезный менин- лительном процессе, присутствие измененных Ч гит, цистицеркозный арахноидит и др.), в после- указывает на затухание воспалительного про операционном периоде (спустя несколько дней цесса, сочетание измененных нейтрофилов с после операции вслед за нейтрофильным плео- сохранившимися служит признаком продолжа цитозом) и пр. ющегося воспаления. Неизмененные нентрофилы Плазматические клетки. Фуксин хорошо ок- всегда обнаруживаются в ликворе с примесью рашивает ядро и цитоплазму, клетки крупнее свежей крови.
лимфоцита, ядро круглое, эксцентрично распо- Эоэинофилы в камере можно определить по ложенное, большое количество цитоплазмы при характерной равномерной блестящей зернис сравнительно небольшом размере ядра (размер тости. Эозинофилы встречаются при субарахно клеток 6Ч12 мкм). Плазматические клетки об- ндальных кровоизлияниях, токсических реактив наруживаются только в патологических случа- ных менингитах, туберкулезных и сифилитиче ях: при длительно текущих воспалительных ских менингитах, опухолях мозга, цистицеркозе.
процессах в мозге и оболочках (энцефалит, ту- Для последнего характерны лимфоидный плео беркулезный менингит, цистицеркозный арах- цитоз, небольшое количество тканевых моноци ноидит), в послеоперационном периоде при вяло тов, плазматических клеток и эозинофилов. Из текущем заживлении раны. мененные клетки и тени клеток сохраняют только Тканевые моноциты. Размер клеток от 7 до контуры цитоплазмы и остатки ядра. Опреде 10 мкм. В нормальной жидкости иногда могут лить природу таких клеток ни в камере, ни в встречаться в виде единичных экземпляров. окрашенных препаратах невозможно.
В большом количестве обнаруживаются после Эпителиальные клетки (мезотелиальные, оперативного вмешательства на ЦНС, при дли- арахноэндотелиальные), ограничивающие тельно текущих воспалительных процессах в подпаутннное пространство, встречаются редко.
оболочках (туберкулезный менингит, цистицер- Это довольно крупные клетки, чаще круглые, с коз) и др. Наличие тканевых моноцитов в после- небольшими круглыми или овальными ядрами.
операционном периоде говорит об активной В камере имеют сходство с клетками плоского тканевой реакции и нормальном заживлении эпителия, обнаруживаются при новообразова раны.
ниях, иногда при воспалительных процессах.
Опухолевые плетки и их комплексы находят встряхнуть. 2. Перед опытом целесообразно в камере и в окрашенном препарате. Злокачест- поставить реакцию Панди (качественная венные клетки могут относиться к следующим проба на белок), и если результат реакции видам опухолей: медуллобластоме, мультиформ- оценивают 3+ или 4+ то перед количест ной спонгиобластоме, астроцитоме, раку. Изу- венным исследованием ликвор надо развести чение этих клеток требует специальных знаний..изотоническим раствором хлорида натрия и Кристаллы встречаются в спинномозговой при расчете' учесть степень разведения.
жидкости редко. В случае распада опухоли в 3. Прямолинейная зависимость при построе содержимом кисты можно обнаружить кристал- нии калибровочного графика сохраняется лы гематоиднна, холестерина, билирубина. до 1 г/л, поэтому при более высоких кон Элементы эхинококка Ч крючья, сколексы н центрациях белка нквор следует разводить.
обрывки хитиновой оболочки пузыря Ч могут быть при множественном эхинококкозе оболочек Но р ма л ь ные в е л ич ины. Нормаль (их находят чрезвычайно редко).
ное содержание белка в ликворе из желудочков мозга 0,12Ч0,2 г/л, из большой цистерны Ч от 0,1 до 0,22 г/л, при люмбальной пункции Ч от 0,22 до 0,33 г/л.
2.6.3. Химическое исследование Клиниче ское значение. Повыше ние содержания белка отмечают при нарушении Унифицированный метод определения белка гемодинамики, воспалительных процессах, орга с сульфосалициловой кислотой и сульфатом нических поражениях ЦНС и оболочек мозга.
натрия (1972). Принцип. Интенсивность Наиболее характерно увеличение содержания помутнения при коагуляции белка сульфосали белка для экстрамедуллярно расположенных циловой кислотой пропорциональна его кон опухолей спинного мозга. Пониженное содержа центрации.
ние белка в ликворе наблюдают при гидроцефа Ре а кт ивы. 1. 6% раствор сульфосали лии и гиперсекреции ликвора.
циловой кислоты. 2. 14 % раствор безводного Белок спинномозговой жидкости состоит из сульфата натрия. Для анализа применяют све альбуминов и глобулинов, отношение глобули жеприготовленную смесь равных объемов этих нов к альбуминам колеблется в пределах реактивов (рабочий раствор). 3. Стандартный 0,2Ч0,3.
раствор альбумина Ч 1 % раствор: 1 глиофили Унифицированный метод определения глобу зированного альбумина (из человеческой или линов высаливанием (реакция НоннеЧАпель бычьей сыворотки) растворяют в небольшом ко та) (1974). Пр инцип. Реакция основана на личестве 0,9 % раствора хлорида натрия в свойстве солей в определенной концентрации мерной колбе вместимостью 100 мл и доводят осаждать избирательно глобулины.
объем раствором хлорида натрия до метки.
Ре а кт ивы. Насыщенный раствор сульфа Реактив нестойкий. Для стабилизации к стан та аммония х. ч.: 85 г соли растворяют в 100 мл дартному раствору прибавляют 1 мл 5 % раст воды при кипячении. Полученный раствор вы вора азида натрия (NaN3). В этом случае при держивают 48 ч при комнатной температуре и хранении в холодильнике реактив годен к упот после фильтрования употребляют для поста реблению в течение 2 мес;
1 мл раствора содер новки реакции. Реакция раствора нейтральная жит 10 мг альбумина. 4. 0,9 % раствор хлорида (рН 7,0Ч7,1).
натрия.
Спе циа л ь но е о б о р у д о в а ние не Спе циа ль ное оборудование: фо требуется.
тоэлектроколориметр.
Ход ис с ле д ов а ния. В пробирку Ход опре де ле ния. В пробирку нали вносят 0,5 мл ликвора, приливают 0,5 мл реак вают 5 мл свежеприготовленного рабочего тива н перемешивают (опыт). В контрольную раствора и 0,5 мл ликвора. Тщательно переме пробирку равного диаметра наливают 1 мл воды шивают. Через 10 мин интенсивность помутне (контроль).
ния измеряют на фотоэлектроколориметре в Оце нка ре з у ль т а т ов. Регистрацию кювете с длиной оптического пути 1 см против результатов реакции производят в течение 3 мин контроля, длина волны 410Ч480 им (сине-фио после смешивания ликвора с реактивом, так как летовый светофильтр). В контроль вместо в последующем помутнение может произойти и реактива берут 0,9 % раствор хлорида натрия.
в нормальной спинномозговой жидкости. Срав Расчет ведут по калибровочному графику. По нение опыта с контролем производят на темном строение калибровочного графика: из стандарт фоне. Для выражения результатов пользуются ного раствора готовят разведения и обрабаты системой 4 плюсов: значительное помутне вают их, как опыт. В 5 пробирок наливают ние 4 +. умеренное 3+, заметная опалесцен соответственно 0,05;
0,1;
0,2;
0,5 и 1 мл стандарт ция 2+, слабая опалесцеиция 1+.
ного раствора альбумина и в каждую из них Ис т о ч ни к и ошибок. 1. Неточная ве доливают до объема 10 мл 0,9 % раствора хло личина рН реактива. 2. Загрязнение посуды.
рида натрия. Концентрация белка в этих раство 3. Поздняя регистрация результатов.
рах составляет соответственно 0,05;
0,1;
0,2;
0,5 и Кл инич е с к о е з на че ние. Реакция 1 г/л.
дает относительное представление о нормальном Приме ча ния. 1. Если муть начинает осе- и патологическом содержании глобулинов в дать, перед измерением на фотоэлектроко- ликворе. Слабую опалесценцию иногда находят лориметре пробирку следует тщательно и в нормальной спинномозговой жидкости при небольшом повышении содержания общего вают 0,9 мл, а в остальные по 0,5 мл 0,45% белка (больше 0,2 г/л). Наиболее достоверное раствора хлорида натрия. В первую пробирку представление о содержании глобулинов и их приливают 0,1 мл исследуемой спинномозговой фракций можно получить при электрофорети- жидкости и после перемешивания 0,5 мл перено ческом исследовании ликвора, которое целесо- сят во вторую пробирку;
эту процедуру после образно проводить при положительной реакции довательно проделывают с 10 пробирками, из НоннеЧАпельта. последней 0,5 мл смеси удаляют. Таким образом Унифицированный метод определения глобу- получают серию разведений от 1:10 до 1:5120.
линов осаждением карболовой кислотой (реак- В 11-ю пробирку спинномозговую жидкость ция Пандн) (1974). Пр инцип. Реакция не добавляют, она является контролем. Во все основана на осаждении глобулинов насыщен- пробирки добавляют по 2,5 мл рабочего раство ным раствором карболовой кислоты. ра хлорного золота. После энергичного встряхи Ре а кт ивы. Насыщенный раствор карбо- вания пробирки оставляют на 16Ч18 ч при ловой кислоты: 100 г карболовой кислоты раст- комнатной температуре.
воряют В I л воды, встряхивают и оставляют Оце нка п о л у ч е нных ре з у ль т а в термостате при 37 С на бЧ8 ч. После пре- тов. Практически результаты регистрируют^ на бывания при комнатной температуре в течение следующий день после постановки реакции.
7 дней надосадочную жидкость сливают и ис- Если спинномозговая жидкость нормальная, пользуют в качестве реактива.
смесь во всех 11 пробирках остается пурпурно Спе циа л ь но е об ор у д ов а ние не красной или в одной из первых становится пур требуется. пурно-фиолетовой. При патологическом ликворе Ход ис с ле д ов а ния. На часовое на дне пробирок появляется осадок и цвет жид стекло, помещенное на черную бумагу, наливают кости меняется. Изменение цвета принято ре 1 мл реактива и по краю наслаивают 1Ч2 капли гистрировать цифрами: 0 Ч отсутствие измене ликвора. ния окраски, 1 Ч красно-фиолетовый цвет, 2 Ч Оце нка ре з ульт а т ов. В случае по- фиолетовый, 3 Ч красно-синий, 4 Ч синий и си ложительного результата в месте соприкосно- не-фиолетовый, 5 Ч светло-синий и голубой, вения реактива с используемой спинномозговой 6 Ч бесцветный.
жидкостью образуется молочно-белое облачко, Цифровое выражение по пробиркам отрица переходящее в муть. Для обозначения резуль- тельной реакции Ч 00000000000, дегенератив татов реакции Панди пользуются системой ной кривой Ч 66666543210, воспалительной Ч четырех плюсов: слабая опалесценция 1+, приблизительно 00124566530.
заметная опалесценция 2 +, умеренное помут- Кл и н и ч е с к о е з на ч е ние. Если соот нение 3 +, значительное помутнение 4 +. ношение белковых фракций ликвора не измене но, то реакция Ланге не обнаруживает отклоне Пр име ч а ние. Реакция Панди осаждает ний от нормы, при изменении альбумино-гло такие белковые фракции, которые остаются булинового коэффициента происходит измене неосажденными в реакции НоннеЧАпельта, ние коллоидной реакции. Воспалительный тип поэтому целесообразно ставить обе реакции реакции Ланге наблюдается при повышении со одновременно.
держания в основном (J- и -у-глобулинов, а Унифицированная коллоидная реакция с дегенеративный и дегенеративно-воспалитель хлорным золотом (реакция Ланге) (1974). ный тип реакции бывает за счет увеличения Принцип. Коллоидные растворы, не изменя- мелкодисперсной фракции белка Ч альбуминов ющиеся под влиянием различных разведений к снижения содержания глобулинов.
нормальной спинномозговой жидкости, в пато- Большое значение имеют глобулиновые реак логически измененной жидкости при тех же ции при дифференциальной диагностике орга условиях меняют степень дисперсности в зави- нических и функциональных нарушений, напри симости от разведения жидкости, при этом изме- мер неврастении и начинающегося прогрессив няется цвет, растворимость и может выпадать ного паралича или латентного сифилиса.
осадок. Реакция Фридмана. Пр инцип. Метод ос Ре а кт ив ы. 1. Хлорид натрия Ч 4,5 г на нован на окислительно-восстановительной реаг 1 л воды. 2. Хлорное золото Ч 1 % раствор в цни раствора перманганата калия и осаждения воде. 3. Цитрат натрия (C H Na -5H O)- белка трихлоруксусной кислотой.
6 5 3 I % раствор в воде. 4. Рабочий раствор хлорного Ре а кт ивы. 1. 1% водный раствор пер золота: к 95 мл воды приливают 1 мл 1 % хлор- манганата калия, приготовленный на бидистил ного золота, нагревают до 90Ч95 С, прибав- лированной воде и постоявший не менее 2Ч ляют 5 мл 1 % раствора цитрата натрия и кипя- 3 нед. 2. 20 % раствор трихлоруксусной тят до появления вишнево-красного окрашива- кислоты х. ч.
ния. В процессе кипячения окраска раствора Ход ис с л е д о в а ния. К 1 мл ликвора меняется, переходя из синей в фиолетовую, прибавляют 0,05 мл (1 каплю) реактива 1, смесь затем красную и вишневую. Приготовленный хорошо взбалтывают. В нормальной спинномоз раствор можно хранить в темном месте 2 мес.
говой жидкости наблюдается яркое фиолетовое Специальное оборудование не окрашивание, которое долго сохраняется. Цвет требуется. не меняется от прибавления 2Ч3 капель реак Ход исследования. Готовят разведе- тива 2.
ние спинномозговой жидкости в 11 пробирках Кл и н и ч е с к о е з на ч е ние. Реакция следующим образом: в первую пробирку нали- используется для ранней диагностики менинги та. В ранней стадии менингита при смешивании в крови, и ликворе определяют на спектрофото ликвора с раствором перманганата калия фиоле- метре при длине волны 542 нм. Количество крови товый цвет очень быстро (в течение 1Ч2 мин) рассчитывают по формуле:
переходит в красно-желтый и коричнево-желтый' цвет. При добавлении трихлоруксусиой кислоты (реактив 2) в случаях гнойного менингита цвет доходит до светло-желтого или наступает полное обесцвечивание с одновременным помутнением и осаждением белка. Изменения цвета по типу менингитической реакции не наступает при раствора оксигемоглобина крови и спинномозго других органических поражениях мозга: травме, вой жидкости;
V Ч объем жидкости.
опухолях мозга, сифилисе мозга, рассеянном У больных с-кровоизлиянием в головной мозг склерозе и др., протекающих без менингеаль- количество крови находится в пределах 1 Ч ных симптомов. 123 мкл/мл.
Количественное определение крови. Прин- Определение в спинномозговой жидкости цип. Метод основан на сравнении уровня гемо- концентрации глюкозы, хлоридов, электролитов, глобина в периферической крови и спинномоз- активности ферментов производят так же, как говой жидкости. М. М. Гунер использовал для при исследовании крови;
эти методы описаны в определения гемоглобина в ликворе 0,04 % соответствующих разделах справочного руко раствор аммиака, предложенный для фотомет- водства.
рического определения гемоглобина в пери ферической крови. Лит е ра т у ра. Бургман Г. П., Возная Ход опре д е ле ния. 5 мл геморраги- А. Ц. Практическое руководство по исследова ческой спинномозговой жидкости центрифуги- нию спинномозговой жидкости.Ч М., 1956;
руют 10 мин при 1500 об/мин, осадок растворяют Бургман Г. П., Лобкоеа Т. Н, Исследование в 5 мл 0,04 % раствора аммиака (необязательно спинномозговой жидкости,Ч М., 1968;
Гунер М.
брать 5 мл жидкости, важно, чтобы количество М. Определение-количества крови в спинномоз жидкости и раствора аммиака было одинако- говой жидкости.Ч Лаб. дело, 1972, № 3, с. ITS вым). Кровь из пальца в количестве 20 мкл ISO;
Калинин В. С. Методика лабораторных (пипетка Сали) смешивают с 5 мл 0,04 % клинических исследований,Ч М., 1932;
Фрид раствора аммиака. Концентрацию гемоглобина ман А. П. Основы ликворологии.^ М., 1971.
Раздел МЕТОДЫ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ Анализ крови является одним из самых рас- распространен укороченный анализ крови Ч так пространенных лабораторных исследований.
называемая тройка (исследование количества Наиболее широко применяется так называемый гемоглобина, подсчет числа лейкоцитов и опре общий клинический анализ, включающий иссле- деление СОЭ), который проводят при профи дование концентрации гемоглобина в 1 мкл лактических осмотрах, направлении на санатор крови (в 1 л по системе СИ), подсчет числа но-курортное лечение, диспансеризации опреде эритроцитов в 1 мкл крови, вычисление цвето- ленных контингентов рабочих и служащих в раз вого показателя, подсчет числа лейкоцитов в личных отраслях народного хозяйства.
1 мкл крови, исследование лейкоцитарной фор- При необходимости, особо в экстренных слу мулы (процентного соотношения различных лей- чаях (при подозрении на воспалительный про коцитов) и определение скорости оседания эри- цесс, острую кровопотерю и др.), исследуют троцитов (СОЭ) в миллиметрах за 1 ч. Такие только один показатель (подсчет числа лейкоци исследования проводят всем стационарным боль- тов в крови, определение содержания гемогло ным и по показаниям Ч амбулаторным. Весьма бина).
3.1. ВЗЯТИЕ КРОВИ Для исследования крови на общий клини- 2. Тщательно протерев кожу мякоти пальца ческий анализ кровь берут из пальца обычно (лучше IV пальца) ватным шариком, смочен утром, желательно до физической нагрузки и ным спиртом, делают укол индивидуальным сте различных диагностических процедур. Некото- рильным копьем до упора.
рые авторы рекомендуют для избежания пище- 3. Первую выступившую каплю крови выти варительного лейкоцитоза брать кровь натощак, рают, из следующих капель крови, выступаю хотя это представляется и нестрого обязатель- щих из мест укола при легком надавливании, ным. быстро набирают необходимое количество кро Ре а кт ив ы. 1.5% раствор трехзамещен- ви. Начинают взятие обычно с разведения крови ного цитрата натрия;
хранят 1Ч2 нед, при по- для определения СОЭ, так как для этого иссле мутнении негоден. 2. Трансформирующий раст- дования требуется наибольшее количество крови.
вор (см. 3.2.1). 3. Изотонический раствор нат- 4. Для определения СОЭ в капилляр от ап рия хлорида или реактив Гайема (см. 3.3.1). парата Панченкова, промытый в реактиве 1, 4. 3Ч5 % раствор уксусной кислоты. 5. Спирт. набирают кровь до метки 0 (100 делений) и тща 6. Йод. тельно выдувают ее в пробирку с подготовлен Об ору д ов а ние. 1. Копье для укола ным раствором цитрата натрия (соотношение пальца (необходимо стерилизовать сухим жаром при этом крови и реактива 4: 1), пробирку в течение I ч при 160 С или автоклавированием встряхивают. Мякоть пальца вытирают сухим в течение 30 мин при 1,5 атм или кипячением не ватным шариком и после надавливания соби менее 30 мин). 2. Пробирки. 3. Пипетки вмести- рают выступившую каплю крови.
мостью 0,02 мл (стерильные). 4. Капилляры от 5. Для определения концентрации гемогло аппарата Панченкова (стерильные). 5. Пипетки бина в сухую стерильную пипетку вместимостью вместимостью 5 и 1 мл (для разводящих жид- 0,02 мл набирают кровь до метки, выдувают костей) или бюретки. 6. Предметные стекла, ее в пробирку с раствором 2 и несколько раз шлифованные стекла. ополаскивают пипетку в этом растворе, запол Спос об в з я т ия крови. 1. Заранее няя ее и выдувая раствор. Снова вытирают наливают в пробирки соответствующие реак- место укола и выдавливают свежую каплю тивы: для определения СОЭ Ч в капилляр Пан- крови.
ченкова набирают (до метки 0,75) реактив 1;
6. Для подсчета числа эритроцитов кровь для определения концентрации гемоглобина Ч берут в количестве 0,02 мл в пипетку и выдувают 5 мл реактива 2;
для подсчета числа эритро- в пробирку с реактивом 3.
цитов Ч 4 мл реактива 3, для подсчета числа Применявшиеся ранее смесители (мелан лейкоцитов Ч 0,4 мл реактива 4.
жеры) для взятия крови с целью подсчета эритроцитов и лейкоцитов в настоящее время за- у нескольких лиц. При недостаточном количе менены пробирочным методом, так как он точнее, стве микропипеток рекомендуется применять ча проще и удобнее при мытье посуды. совые стекла или лунки, при атом у каждого В целях более точного разведения крови пациента кровь берут стерильным индивидуаль (в 200 раз) пипетку после выдувания крови ным капилляром от аппарата П'анченкова, поме несколько раз промывают раствором, находя- щают в часовое стекло или лунку, из которых щимся в пробирке. быстро набирают кровь для соответствующего 7. Для подсчета лейкоцитов кровь берут пи- разведения, необходимого для того или иного петкой до метки (0,02 мл) и выдувают ее в про- исследования.
бирку с раствором 4, промывают несколько раз В настоящее время в связи с появлением ге в растворе уксусной кислоты (разведение крови матологических автоматов стали шире исполь в 20 раз). Для взятия крови у одного пациента зовать для общего клинического анализа веноз можно пользоваться одной пипеткой вмести- ную кровь. Кровь из вены берут либо в специ мостью 0,02 мл, но обязательно набирать кровь альные пластиковые пробирки одноразового для лейкоцитов в последнюю очередь (так как пользования с порошком ЭДТА, либо в стеклян уксусная кислота гемолизирует эритроциты). ные пробирки с другим антикоагулянтом. Необ 8. Для исследования лейкоцитарной фор- ходимо тотчас после взятия крови закрыть про мулы, морфологии эритроцитов, лейкоцитов, бирку пробкой и несколько раз тщательно пере тромбоцитов готовят мазки крови: вытирают мешать кровь, не взбалтывая ее (опрокидывая место укола сухим шариком ваты и наносят пробирку сначала пробкой вниз, затем пробкой каплю крови на сухое обезжиренное предметное вверх). Тщательное перемешивание крови по стекло, затем быстро готовят тонкие мазки с по- зволяет избежать образования сгустков, нали мощью шлифованного стекла, краем которого чие которых искажает результаты исследования.
быстрым движением продвигают по предмет ному стеклу каплю крови (см. 3.3.2). Лит ерат ура. Бейер Б. А. Краткое пособие Для профилактики сывороточного гепатита по гематологии. 2-е изд.Ч Л., 1967, с. 219;
При запрещается брать кровь одной микропипеткой каз Министерства здравоохранения СССР № 300 от 08.04.77 г.
3.2. ГЕМОГЛОБИН Гемоглобин Ч основной дыхательный пиг- Поданным М. С. Кушаковского (1968), при мент эритроцитов, относящийся к хромопротеи- суммировании различных погрешностей этого дам и обеспечивающий ткани кислородом;
со- метода ошибка при определении гемоглобина стоит из белка Ч глобина и тема Ч соединения составляет 30 %. Поэтому в настоящее время протопорфирина IX с железом. Последний при- метод не может быть рекомендован.
дает гемоглобину характерную окраску. Присое- В качестве унифицированного метода в на динение к тему различных химических групп со- шей стране принят гемнглобинцианидный метод провождается изменением окраски, на этом ос- с применением ацетонциангидрина.
новано и определение концентрации гемогло- Унифицированный гемиглобинцианидный ме бина в крови.
тод (1974). Пр и н ц и п. Гемоглобин окисляют в метгемоглобин (гемиглобин) железосинероди етым калием (красная кровяная соль);
образую 3.2.1. Содержание гемоглобина щийся с ацетонциангндрином окрашенный циан метгемоглобин (гемиглобинцианид) определяют Исследование содержания гемоглобина в колориметрически.
крови (гемоглобинометрия) включает определе- Ре а кт ив ы. 1. Трансформирующий раст ние гемоглобина и его дериватов, которые при- вор: ацетонциангидрин Ч 0,5 мг;
калий железо сутствуют в крови здоровых людей или появ- синеродистый Ч 0,2 г;
натрия гидрокарбонат Ч ляются при различных патологических состоя- I г;
дистиллированная вода Ч до 1 л. Раствор ниях. У здоровых в крови гемоглобин находится желтого цвета, прозрачный. При обесцвечива главным образом в виде оксигемоглобина, вос- нии или появлении осадка непригоден. Стабилен становленного гемоглобина и в небольшом ко- в течение нескольких месяцев при хранении в личестве Ч метгемоглобина, карбоксигемогло- посуде из темного стекла при комнатной темпе бина и вердоглобина.
ратуре. 2. Калибровочный раствор гемиглобин Для определения содержания гемоглобина в цианида. Можно использовать стандартный крови предложено много различных методов.
раствор фирмы Имуна> (ЧССР) с концентра Наибольшее распространение получили колори- цией гемиглобинцианида 61,23 мг/100 мл и метрические, основанные на колориметрии про- фирмы сРеанал (ВНР) с концентрацией веще изводных гемоглобина. Наиболее простым и ши- ства 59,75 мг/100 мл. Это соответствует концент роко распространенным в прошлом методом рации гемоглобина в крови 15,4 г/100 мл и была колориметрия солянокислого гематина, на 15 г/100 мл при разведении ее в 251 раз. Стан котором основан метод Сали. Метод чрезвы- дартные растворы хранят в холодильнике (в не чайно прост и быстро выполним, но недоста- замороженном виде) в защищенном от света точно точен. месте.
Спе циа л ь но е оборудование. Фо- характерно для острой кровопотери, гипопла тоэлектроколориметр (ФЭК-56М или другой). стической анемии, гемолитической анемии в ста Ход опре де ле ния. В пробирку к 5 мл дни гемолитического криза, рецидива В|2-дефи трансформирующего раствора добавляют цитной анемии (5Ч8 г/100 мл, или 50Ч80 г/л).
0,02 мл крови (разведение в 251 раз). Содержи- Следует, однако, иметь в виду, что диагностика мое пробирки тщательно перемешивают и анемии ни в коей мере не может быть проведена оставляют стоять на 10 мин. Измеряют на фото- лишь на основании определения концентрации электроколориметре при длине волны 500Ч гемоглобина в крови. Это исследование устанав 560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с тол- ливает только факт наличия малокровия. Для щиной слоя 1 см против холостой пробы (транс- уточнения его характера необходимо исследо формирующий раствор). Измеряют при тех же вание количества эритроцитов, цветового пока условиях стандартный раствор. зателя, других расчетных индексов эритроцитов, Расчет содержания гемоглобина производят морфологии эритроцитов.
по калибровочному графику (см. ниже), по- Повышение концентрации гемоглобина в строенному по стандартному раствору гемигло- крови может наблюдаться при миелопролифера бинцианида, или по формуле: тивных заболеваниях и симптоматических эрит роцитозах, сопутствующих различным состоя ниям. Среди миелопролиферативных заболева ний наиболее характерно повышение гемогло бина при эритремин, концентрация которого может быть в пределах 18Ч21 г/100 мл (180Ч стннкция стандартного раствора;
С Ч концент- 210 г/л). Для диагностики эритремии важно рация гемнглобинцианнда в стандартном раст- исследование и количества эритроцитов, лейко воре, мг%;
К Ч коэффициент разведения крови;
цитов, тромбоцитов в крови, которые, как пра 0,001 Ч коэффициент для пересчета мг/100 мл вило, при этом заболевании повышаются.
в г/100 мл. Симптоматические реактивные эритроцитозы могут быть абсолютными (обсусловлены проли ферацией элементов эритропоэза) и относитель ными (гемокониентрацнонные). Физиологиче ское увеличение содержания гемоглобина свой ственно новорожденным.
Лит е ра т у ра. Кушаковский М. С. Кли нические формы повреждения гемоглобина.Ч Л., 1968, с. 22;
Грибова И, А. Гематологическая норма.Ч В кн.: Руководство по гематологии /Под ред. А. И. Воробьева, Ю. И. Лорие. М.:
Медицина, 1979, с. 52.
Измеряют против холостой пробы.
Определение содержания гемоглобина с по- 3.2,2. Фракции гемоглобина мощью счетчика к гематологического автомата.
Пр и н ц и п см. Унифицированный гемигло- У здорового человека имеется три основных бинцианидный метод. типа гемоглобина: примитивный Ч Р, феталь Оборудова ние. Счетчик или гематоло- ный Ч F и взрослый А, каждый из которых де гический автомат.
лится на подтипы. Гемоглобин Р, характерный Ход- ис с ле дов а ния соответствует ин- для ранней эмбриональной стадии, состоит из струкции, приложенной к прибору.
подтипов Говер I я Говер П. В составе гемогло Но р ма л ь ные ве личины. У здоро- бина Р, кроме основной, выделены еще две фор вых людей концентрация гемоглобина в крови мы: 1) Фессаса и Папаспиру и 2) Александра:
составляет 13,2Ч16,4 г/100 мл (132Ч164 г/л Гемоглобин А имеет несколько фракций: A, I в международной системе единиц Ч СИ) у муж- А, А. У здорового взрослого человека фрак 2 З чин и 11,5Ч14,5 г/100 мл (115Ч145 г/л) у жен- ция A является основной, составляя %Ч98 %;
щин [Грибова И. А., 1979].
фракция А не превышает 3 %,А Ч в виде сле 2 Кл инич е с к о е з начение. Снижение дов, гемоглобин F не более 2 %. Фракция A де I концентрации гемоглобина в крови является лится на несколько подфракций: A, А, А, Iа 1б 1с основным лабораторным симптомом анемии.
А. У плода до 3-месячного возраста преобла 1d При этом содержание гемоглобина варьирует дает тип Р, который затем заменяется гемогло в широких пределах в зависимости от формы бином F, а у новорожденного последний состав анемии и ее степени. Так, при наиболее частной ляет всего 20 %, остальной представлен типом А.
форме малокровия Ч железодефицитной ане- В дальнейшем гемоглобин F продолжает умень мии Ч у большинства больных отмечается от- шаться и к 4Ч5 мес достигает величин взрослого носительно умеренное снижение гемоглобина человека (1Ч2%).
(8,5Ч11,4 г/100 мл, или 85Ч114 г/л), а более Гемоглобин F отличается от А значительной выраженное уменьшение (6Ч8,4 г/100 мл, или устойчивостью к действиям щелочи. Химическое 60Ч84 г/л) наблюдается реже. Значительное различие состоит в структуре полипептидных снижение концентрации гемоглобина в крови цепей глобина: в гемоглобине А имеются 2а и 2в-цепи (а, в ), в гемоглобине F в-цепи заме- где Е1 Ч зкстинкция общего раствора гемогло 2 нены у-цепями (а, у ). бина;
Е2 Ч экстинкция раствора гемоглобина F;
2 Метод Зингера [Singer et al., 1951]. Ез Ч экстинкция холостой пробы.
Пр инцип. Определение основано на щелоче- Менее точное представление о содержании устойчивости гемоглобина F;
с помощью щелочи гемоглобина F дает цитохимическое исследова проводят денатурацию гемоглобина A, a F опре- ние (метод Бетке) (см. 3.3.9).
деляют спектроскопически.
Кл инич е с ко е з на че ние. Повыше Реактивы. 1. Раствор едкого натра 1/12 н. ние гемоглобина F является важным критерием (рН 12,7);
хранят в парафинированном сосуде для диагностики Р-талассемии, при которой одно в холодильнике. 2. Раствор сульфата аммония;
временно повышается и содержание гемоглоби к 350 г аммония (NН ) SO добавляют 500 мл на A2. Особенно высокие цифры гемоглобина F 4 2 дистиллированной воды, дают постоять и сме- могут быть при гомозиготной в-талассемии до шивают 400 мл этого раствора с равным объе- 20Ч90 %. При гетерозиготной в-талассемии со мом дистиллированной воды. Затем к 800 мл держание гемоглобина F может быть нормаль полунасыщенного раствора добавляют 2 мл 10н. ным или умеренно повышенным (2,5Ч7 %).
НС1. 3. 5 % раствор цитрата натрия. Однако надо иметь в виду, что повышение Спе циа л ь но е обору дова ние.
гемоглобина F не является специфичным для Спектрофотометр. Р-талассемии. Оно встречается при различных Ход определения. Приготовление ге- формах малокровия: других гемолитических моглобинового раствора Ч гемолизата: 0,2Ч1 мл анемиях, железодефицитной анемии, гипопла исследуемой крови помещают в пробирку с 3 мл стической анемии, лейкозах и других состояниях, 5 % раствора цитрата натрия, перемешивают и сопровождающихся гипоксией. Возможно, что центрифугируют в течение 5 мин при 3000 об/мин. повышение гемоглобина F при этих заболева Верхний слой отсасывают и повторно 2Ч3 раза ниях развивается компенсаторно.
отмывают эритроциты с центрифугированием до Гемоглобин А2 отличается от гемоглобина А полного обесцвечивания надосадочного слоя. более медленной миграцией при электрофорезе, Затем добавляют к осадку равный объем дистил- на этом основаны методы его определения. Хи лированной воды, хорошо перемешивают, Цент- мическая структура полипептидных цепей гло рифугируют 15Ч20 мин при 6000 об/мин. Отоб- бина у гемоглобина А2 характеризуется нали ранный верхний слой исследуют. Гемолизат чием двух цепей а и двух цепей б (а, б ). Иссле 2 можно хранить в холодильнике несколько недель. дование гемоглобина А наиболее информативно В 1 мл дистиллированной воды разводят при использовании электрофореза на ацетатцел 0,2 мл гемолизата с приблизительной концент- люлозе (см. исследование белков).
рацией 10 г% (100 г/л). Определяют общее со- Клиниче с кое значение. Повыше держание гемоглобина (A + F) на спектрофото- ние содержания гемоглобина А характерно для метре при длине волны 541 нм в кювете с толщи- р-талассемии;
при гетерозиготной форме болез ной слоя 1 см.
ни содержание As составляет 4,2Ч8,9 %.
Для изоляции гемоглобина F в пробирку с Лит е ра т у ра. Kunkel Н. С., Wal 3,2 мл 1/12 н. раствора едкого натра, предвари lenius G Ч Sciense, 1955, vol. 122, p. 288;
Sin тельно помещенную в водяную баню на 10 мин ger K., ChernoffA., Singer L.Ч Blood, 1951, vol.
при 20 С, быстро вливают 0,2 мл гемолизата, 6, p. 413;
Vella F.Ч Nature, 1959, vol. 184, p. 272.
сильно взбалтывают в водяной бане в течение 10 с, затем включают секундомер. Через 1 мин добавляют 6,8 мл раствора сульфата аммония.
3.2.3. Патологические формы Смесь хорошо Перемешивают, переворачивая гемоглобина пробирку до 6 раз, и затем фильтруют через двойной слой обеззоленных фильтров. На фильт К настоящему времени известно, более ре остается гемоглобин А, а фильтрат содержит форм патологических гемоглобинов, отличаю гемоглобин F, который определяют спектроско щихся от нормальных структурой полипептид пически в тех же условиях, что и раствор общего ной цепи глобина, когда одна или несколько гемоглобина.
аминокислот заменены другими или отсутст Проводят также и холостой опыт Ч оп вуют, ределяют экстинкцию смеси 3,2 мл 1/12 н. едкого Наиболее частой наследственной патологией натра, 6,8 мл раствора сульфата аммония н является гемоглобинопатия S (серповиднокле 0,2 мл воды.
точная анемия), которая может быть подтвер Расчет проводят по формуле:
ждена пробами на серповидность эритроцитов (см. 3.3.2). Исследование патологических гемо глобинов является трудоемким и проводится в специализированных лабораториях.
3.3. ЭРИТРОЦИТЫ Эритроциты Ч наиболее многочисленные в горизонтальном положении 1 мин (для оседа форменные элементы крови, основное содержи- ния эритроцитов).
мое которых составляет гемоглобин. Мембрана Для подсчета эритроцитов, не меняя гори клеток имеет двойной слой липидных и белко- зонтального положения камеры, помещают ее вых компонентов и содержит большой набор на столик микроскопа и с помощью малого уве ферментов. Зрелые эритроциты человека и мле- личения микроскопа (объектив 8Х, окуляр копитающих двояковогнутой формы, не имеют 10Х) находят верхний левый край сетки (для ядра. Эритроциты обладают антигенными свой- лучшего контрастирования следует опустить ствами, участвуют в гемостазе, но основная роль конденсор и прикрыть диафрагму). Счет произ их Ч снабжение тканей кислородом и участие водят в 5 больших квадратах, разделенных на в транспорте углекислоты. малых, т. е. в 80 малых квадратах. Рекоменду ется считать клетки в квадратах сетки, располо женных по диагонали. Для того чтобы одни и те 3.3.1. Подсчет количества же эритроциты, лежащие на линиях, не попали дважды в счет, принято для каждого квадрата, В качестве унифицированных методов под- кроме элементов, лежащих внутри квадрата, счета эритроцитов в крови приняты два метода;
считать расположенные на определенных двух подсчет в счетной камере и в автоматическом линиях (например, на левой и верхней).
счетчике. Расчет количества эритроцитов в 1 мкл крови Унифицированный метод подсчета в счетной производят, исходя из разведения крови (200), камере (1972). Пр инцип. Подсчет эритроци- числа сосчитанных квадратов (80) и объема тов под микроскопом в определенном количе I малого квадрата ( мюп, последующей стве квадратов счетной сетки и пересчет на 1 мкл крови, исходя из объема квадратов и разведе формуле:
ния крови.
Р е а к т и в ы. 0,9 % раствор хлорида натрия или раствор Гайема: ртуть хлористая 0,5 г, на трия сульфат 5 г, натрия хлорид 1 г, вода ди стиллированная до 200 мл.
Спе циа л ь но е обору д ов а ние.
где X Ч число эритроцитов в 1 мкл крови;
а Ч 1. Счетная камера Горяева. 2. Микроскоп.
число сосчитанных эритроцитов.
Ход ис с л е д о в а ния. Разводят иссле- В результате сокращения Х = а-10 000.
дуемую кровь в 200 раз. Для этого в сухую про- Подсчет эритроцитов в счетной камере явля бирку отмеривают 4 мл реактива 1 или 2. Пипет- ется трудоемким и недостаточно точным мето кой набирают 0,02 мл крови. Кончик пипетки вы- дом. На результатах подсчета сказываются ма тирают фильтровальной бумагой или марлей и лейшая неточность при взятии крови в пипетку, кровь выдувают на дно пробирки;
пипетку тща- неудовлетворительная градуировка пипеток, не тельно промывают в верхнем слое жидкости, равномерное заполнение камеры, любое отклоне повторно набирая ее и выдувая в пробирку, ние от правил подготовки счетной камеры, ее содержимое пробирки перемешивают и остав- заполнения и подсчета клеток.
ляют стоять до момента счета (рекомендуется Унифицированный метод автоматического считать эритроциты в ближайшие 2Ч3 ч после подсчета эритроцитов (1972) с помощью счет взятия крови, а при гемолитических и В12-дефи- чика форменных элементов облегчает выполне цитных анемиях Ч сразу после взятия, так как ние этого исследования и делает его более произ эритроциты могут разрушиться). Недопустимо водительным. Отечественный гематологический оставлять взятую кровь с несосчитанными эри- комплекс КГ-2, а также многочисленные зару троцитами на следующий день, так как эритро- бежные образцыЧПикоскел (ВНР), Tur циты частично разрушаются. (ГДР), Celloscope (Швеция), "Cell-Counter Подготавливают счетную камеру: протирают (ФРГ), СС-1006 (Япония) и др.Ч предусматри насухо камеру с сеткой и покровное стекло, за- вают в своей программе подсчет количества тем покровное стекло притирают к камере, слегка эритроцитов в крови.
надавливая на стекло таким образом, чтобы по Помимо счетчиков форменных элементов, краям его появились радужные полосы (это сви- подсчет эритроцитов включен в программу всех детельствует о требуемой высоте камеры Ч существующих гематологических автоматов:
0,1 мм). SMA-7a, "Гемалог-8 фирмы Technicon Заполняют счетную камеру разведенной (США), Coulter Counter S фирмы Coult кровью: предварительно несколько раз тщатель- ronics France SA (Франция) и др.
но встряхивают содержимое пробирки, затем При использовании счетчиков разведение пастеровской пипеткой или стеклянной палочкой крови (подготовка пробы для подсчета) осуществ отбирают каплю разведенной крови и подносят ляется вручную. При использовании гематологи ее к краю покровного стекла, следя за тем, чтобы ческих автоматов отбор пробы крови и ее разве она равномерно без пузырьков воздуха запол- дение происходят автоматически.
нила всю поверхность камеры с сеткой, не зате- Пр и н ц и п работы большинства счетчиков кая в бороздки. Заполненную камеру оставляют основан на кондуктометрическом методе. Опреде ленное количество разведенной изотоническим 3.3,2. Исследование морфологии раствором натрия хлорида или другим электро эритроцитов литом крови пропускают через микроотверстие.
Проходящая клетка увеличивает сопротивление между электродами, возникающий импульс пе- Морфологию эритроцитов можно исследо редается на счетное устройство с цифровой ин- вать в световом микроскопе в нативных препа дикацией. ратах и в окрашенных мазках крови. В клини Ход ис с л е д о в а ния соответствует ин- ческой практике морфологию эритроцитов обыч струкции, приложенной к прибору. но исследуют в окрашенных мазках крови, Но р ма л ь н ые в е л и ч и ны. Количест- Приготовление мазков крови унифицирован во эритроцитов в крови, по данным В. В. Соко- ным методом (1979). Мазки крови готовят на лова, а также И. А. Грибовой (1979), состав- предметных стеклах, которые предварительно 6 6 | ляет 4-10 Ч5,1-10 в 1 мкл (4-10 /Ч5,1 X моют и обезжиривают.
| 2 6 Х10 /л) у мужчин и 3,7-10 Ч4,7-10 в 1 мкл Подготовка стекол. Реактивы. 1. Хозяйствен 12 (или 3,7-10 /л Ч 4,7-10 /-") у женщин. ное мыло Ч 2 % раствор или раствор стирального Кл и н и ч е с к о е з на че ние. Снижение порошка: 20 г растворить в 975 мл воды и доба числа эритроцитов в крови является одним из ос- вить 20 мл пергидроля. 2. Смесь Никифорова:
новных лабораторных критериев анемии. Однако равные части этилового спирта % % и диэтило степень эритроцитопении широко варьирует при вого эфира.
разных формах малокровия. Так, при наиболее Спе циа л ь но е о б о р у д о в а ние не распространенном заболевании Ч железодефи- требуется.
цитной анемии на почве хронических кровопо- Ход о б р а б о т к и стекол. Стекла (но терь Ч количество эритроцитов может быть нор- вые и бывшие в употреблении) помещают в эма мальным или нерезко сниженным (3-10 Ч лир9ванную посуду в 2 % раствор хозяйствен 6 |2 3,6-10 в 1 мкл, или 3-10 /л Ч3,6-10 /л). ного мыла или стирального порошка на 8Ч10 ч.
При острой кровопотере, Вп-дефицитной анемии Кипятят в указанном растворе 5Ч10 мин, ста (в стадии рецидива), гипопластической анемии, рые мазки предварительно стирают ветошью или гемолитических анемиях (в период криза) число ватным тампоном. Более длительное кипячение эритроцитов в крови может значительно сни- или использование алюминиевой посуды не ре 6 | зиться и достигнуть 1 Х 10 в 1 мкл, или I Х 10 /л комендуют, так как стекла мутнеют. Промывают и менее. в проточной воде. Насухо вытирают и помещают Повышение количества эритроцитов в кро- в смесь Никифорова на 30Ч60 мин. Насухо вы ви Ч эритроцнтоз Ч может быть обусловлен тирают чистым полотенцем и хранят в широко многими причинами. Значительный эритроцитоз горлой чистой посуде с притертой пробкой. Чи 6 6 (6,5-10 -8,5-10 в 1 мкл, или 6,5.10' /л- стые стекла рекомендуется брать либо пинцетом, 8,5-10' /л крови) является одним из важных либо за края (соприкосновение пальцев с по лабораторных симптомов эритремии. Другие ге- верхностью стекла оставляет жирные следы).
мобластозы миелопролиферативной природы Те х ника пр иг о т о в л е ни я маз (сублейкемический миелоз или миелофиброз и ков. На сухое подготовленное описанным выше хронический миелолейкоз) реже сопровождают- способом предметное стекло наносят мазок кро ся эритроцитозом и только в начальной стадии ви следующим образом. На стекло ближе к ко заболевания. роткой стороне наносят стеклянной палочкой Вторичный (симптоматический) эритроцитоз (или непосредственно из места укола пальца) может сопутствовать широкому кругу различ- небольшую каплю крови. Оставляют стекло в го ных заболеваний и бывает абсолютным (связан- ризонтальном положении и размазывают каплю ный с усилением нормального эритропоэза) и от- крови по стеклу с помощью чистого шлифован носительным (гемоконцентрационный). Абсо- ного стекла, помещая его под углом 45;
корот ким ребром, подождав, пока вся кровь расплы лютные эритроцитозы сопутствуют хроническим обструктивным заболеваниям легких, врожден- вется по нему, быстро проводят по предметному ным порокам сердца, первичной легочной гипер- стеклу. Не следует сильно нажимать на стекло, тензии, синдрому Пиквика, наследственным ге- так как при этом травмируются форменные моглобинопатиям, гнпернефроидному раку, ге- элементы крови.
мангиобластоме мозжечка, гепатоме, гормо- Мазки высушивают на воздухе и маркируют нально-активным опухолям, заболеваниям, со- (лучше простым карандашом). Высохший мазок провождающимся стенозом почечных артерий, должен быть равномерно тонким, желтоватого заболеваниям ЦНС и др. Вторичные относитель- цвета, достаточной величины (располагаться на ные эритроцитозы связаны с нарушением гемо- IЧ1,5 см от краев, занимать почти всю длину концентрации и характеризуются нормальным стекла) и оканчиваться метелочкой>. Толстые объемом циркулирующих эритроцитов при сни- (густо-розового цвета) мазки не следует ис жении массы циркулирующей крови и массы пользовать, так как в них морфология клеток циркулирующей плазмы. плохо различима.
Более качественные мазки крови получаются при использовании автоматических устройств:
Лит е ра т у ра. Грибова И. А. Гематоло- cHemaprep фирмы Oplon (ФРГ), Slide гическая норма.Ч В кн.: Руководство по гема- Spinner фирмы Corning Scientific Instru тологии / Под ред. А. И. Воробьева, Ю. И. Ло- ments: (США) и др., предназначенных для при рие. М.: Медицина, 1979, с. 53. готовления мазков. Благодаря такому устрой ству мазки получаются равномерные и имеют Окра с ка по Па ппе нг е йму. Сухие стандартные размер и толщину. нефиксированные мазки помещают в кювету Фиксация и окраска мазков унифицирован- с раствором МаяЧГрюнвальда на 3Ч5 мин (или ным методом (1979). В качестве унифицирован- наливают на.мазок, помещенный на рельсы ных приняты методы окраски по Нохту и Пап- высоким слоем). Контейнер с мазками ополас пенгейму. кивают в кювете с дистиллированной водой (или Реактивы для фиксации: метиловый спирт на мазок, помещенный на рельсы, не сливая х. ч. или раствор эозинметиленового синего по краситель, добавляют дистиллированную воду Маю Ч Грюнвальду. на 1 мин). Помещают контейнер с мазками в Ре а кт ив ы для о к р а с к и ма з ков кювету с азур-эозиновой краской по Нохту (или по Нохту. 1. Основной раствор азура II: 1 г наливают на мазок краску) на 8Ч15 мин. Смы краски растворяют в 1000 мл дистиллированной вают краску водопроводной водой. Мазки высу воды. Оставляют в посуде из темного стекла на шивают на воздухе.
12Ч14 дней при комнатной температуре, после Ок р а с к а по Ро ма но в с к о му Ч чего используют. 2. Основной раствор эозина Г и м з е производится так же, как и по Нохту;
калия: 1 г краски растворяют в 1000 мл дистил- в качестве красителя используют готовый раст лированной воды. Оставляют в посуде из тем- вор РомановскогоЧГимзы, который перед упот ного стекла при комнатной температуре на 12Ч реблением разводят из расчета 1 капля краски 14 дней, затем используют. 3. Фосфатный буфер на 1 мл дистиллированной воды. Время окраски (смесь Вейзе) рН 7,4Ч7,5: смешивают 0,49 г ка- устанавливают опытным путем для каждой но лия фосфата однозамешенного безводного вой партии красителя (25Ч40 мин).
(КН РО4) и 0,909 г натрия фосфата двузаме- Ав т о ма т и ч е с к а я окра с ка маз щенного безводного. (Na2HPO4 и дистиллиро- ков может. быть осуществлена с помощью ванной воды 1000 мл. 4. Рабочий раствор азур- специальных устройств: Hematek фирмы эозина: перед употреблением смешивают 25 мл Ames (США), WL-600 фирмы Veb Kombinat основного раствора азура II, 20 мл основного Medirin und Labortechnik (ГДР) и др., в кото раствора эозина калия и 55 мл буферного раст- рые ручным способом загружают нефиксирован вора (пропорции красителей могут варьировать, ные мазки. Последующее автоматическое дози их устанавливают опытным путем при приготов- рование красителей и буферных растворов обес лении свежих партий основных растворов). печивает стандартную и равномерную окраску Ре а к т ив ы для о к р а с к и ма з к о в мазков.
по Па пп е нг е йму. 1. Раствор эозин-метиле- Исследование морфологии эритроцитов.
нового синего по Маю Ч Грюнвальду. При от- Пр инцип. Исследование окрашенных мазков сутствии готового раствора красителя его можно крови с помощью иммерсионной системы микро приготовить, растворив 1 г сухого красителя скопа.
в 1000 мл метилового спирта. Раствор готов к Сп е ц и а л ь но е обору д ов а ние.
употреблению через 4 дня. 2. Рабочий раствор Микроскоп.
азур-эозина по Нохту. Реакт ивы. 1. Иммерсионное масло.
2. Диэтиловый эфир.
Спе циа л ь но е обору дова ние.
Кювета для фиксации и окраски мазков со шта- Ход ис с ле дов а ния. Предметное стек тивом-контейнером (при отсутствии используют ло с окрашенным, высохшим на воздухе мазком эмалированные лотки с установленными для крови помещают на столик микроскопа и с по стекол рельсами из пары стеклянных палочек, мощью малого увеличения (окуляр 7Х, объек соединенных резиновыми трубками). тив 8Х) находят край мазка. Не меняя положе Фик с а ци я мазков. Фиксатор мазков ния стекла, наносят каплю иммерсионного масла наливают либо в кювету, либо в широкогорлую на край мазка на место, расположенное под посуду с притертой пробкой. Высушенные на объективом. Переводят иммерсионный объектив воздухе мазки помещают в контейнер, который в положение, вертикальное к мазку, при этом опускают в кювету с фиксатором (или кладут по объектив погружается в каплю масла.
одному в посуду) на 5Ч10 мин. Вынимают кон- Осторожно слегка вращают макровинт до тейнер со стеклами из кюветы (или вынимают появления изображения в поле зрения микро пинцетом стекла и устанавливают в штативе), скопа. Затем с помощью микровинта устанавли оставляют на воздухе до полного высыхания. вают четкую видимость препарата (критерием Окра с ка по Нохту. Высохшие фикси- правильно подобранного для каждого глаза фо рованные мазки, не вынимая из контейнера, по- кусного расстояния будет ясное изображение мещают в кювету с рабочим раствором краски клеток с четкими границами и внутриклеточной на строго определенное время, подобранное для структурой). После установки микроскопа при каждой партии красителя (от 20 до 45 мин). При ступают к исследованию морфологии эритроци отсутствии кюветы с контейнером стекла поме- тов, обращая внимание на форму, размеры кле щают горизонтально на рельсы (мазком квер- ток, интенсивность их окраски, наличие внутри ху) и наливают высокий слой (3Ч4 мл на мазок) клеточных включений и пр. Поскольку клетки рабочего раствора краски. Вынимают контейнер имеют определенный объем, для лучшего их со стеклами из кюветы с красителем и поме- рассмотрения надо постоянно менять фокусное щают его в кювету с водопроводной водой (при расстояние с помощью микровинта.
отсутствии кюветы краску со стекол смывают, Для получения полного представления о мор не снимая их с рельсов, водопроводной водой). фологии эритроцитов необходимо просмотреть Высушивают мазки на воздухе. несколько полей зрения, передвигая мазок либо Таблица 24. Характеристика эритроцитов при некоторых формах анемий Эритроциты Цветовой Ретику ло- Ядерные Формы анемий показатель циты.формы форма диаметр объем Железодефицит- Гипохромия Пойкилоци- Микроциты Нормаль- Нормаль- Отсутствуют ные ты ный или ные или снижен снижены Часто мега В is- и фолиеводе- Гиперхро- > Макроцнты, Резко по- Снижены лобласты, фицитные мня мегалоциты вышен нормоблас ты Ги попла стические Нормохро- > Макроциты Нормаль- Резко сни- Часто нор i мия ный или по- жены мобласты вышен Гемолитические:
> наследственный Сфероциты Микроциты Повышен Резко повы- То же шены ми кросфе роцитоз талассемия Гипохромня Мишене- Снижен Повышены Единичные вндные нормоблас ты рукой, либо с помощью крестообразного устрой- микроцитозом (табл. 24). Гипохромия эритро ства. Рассматривать морфологию эритроцитов цитов сопутствует и более редким формам мало надо только в тонких местах мазка, где эритро- кровия, не связанным с дефицитом железа;
циты расположены одиночно, не образуют мо- свинцовому отравлению, талассемии и другим нетных столбиков>. наследственным повреждениям эритроцитов.
По окончании микроскопии с.помощью мак- Следует иметь в виду, что гипохромия эритро ровиита поднимают тубус микроскопа, снимают цитов может наблюдаться не только при сни стекло с предметного стекла, стирают масло жении концентрации гемоглобина и числа эри с иммерсионного объектива н предметного стек- троцитов в крови, но и при нормальных коли ла марлей, смоченной эфиром, чественных показателях. Реже встречается уси У здоровых людей эритроциты имеют при- ленная окраска эритроцитов Ч гиперхролмия, мерно одинаковый размер. Для более точного связанная с повышенным насыщением эритро представления о размере клеток проводят эрнт- цитов гемоглобином и сочетающаяся с увели роцитометриюЧ измерение диаметра эритроци- ченным их размером Ч макроцитозом, мегало тов (см. 3.3.3). Эритроцит имеет форму двояко- цитозом. Эти изменения эритроцитов характер вогнутого диска. В окрашенных препаратах ны для дефицита таких факторов кроветворения, эритроциты круглой формы, розового цвета. Ок- как витамин Ви, фолиевая кислота, и наблю сифилия клетки обусловлена присутствием гемо- даются при анемии Аддисона Ч Бирмера, дифил глобина, поэтому по интенсивности окраски лоботриозе, органических заболеваниях желуд можно судить о степени насыщенности эритро- ка, кишечника, алкоголизме, беременности и др.
цитов гемоглобином. Эритроциты здоровых лю- Изменение окраски в виде полихроматофилии дей имеют равномерную окраску и небольшое (эритроциты сероватого цвета) обусловлено просветление в центре (нормохромня). окраской кислыми и основными красителями.
Кл инич е с к о е з на че ние. Измене- В норме встречаются единичные полихромато ния морфологии эритроцитов в виде появления фильные эритроциты. Их число повышается при эритроцитов разного размера (анизоцитоз), усиленном эритропоэзе (постгеморрагнческие разной формы (пойкилоцитоз), разной окраски анемии, гемолитические анемии и др.).
(анизохромия) являются важными морфологи- При талассемни и других формах малокро ческими симптомами различных форм анемии. вия встречаются так называемые мишеневидные Наиболее часто наблюдается бледная окрас- эритроциты Ч с окрашенным участком в центре ка эритроцитов с более широкой неокрашенной клетки на фоне неокрашенной зоны.
центральной частью Ч гипохромия эритроцитов, Появление базофильной пунктации в эритро которая обусловлена низким насыщением эрит- цитах связано с патологическим кроветворением роцита гемоглобином и характерна для распро- и характерно для свинцового отравления, но страненных форм малокровия, связанных с де- встречается при других формах анемии. Эритро фицитом железа (постгеморрагические анемии, циты с ядром Ч нормобласты, эритробласты Ч анемии беременных, при опухолях, сепсисе и встречаются в мазках крови при различных других тяжелых инфекционных заболеваниях, анемиях. Большое количество нормобластов ха заболеваниях желудочно-кишечного тракта и рактерно для гемолитических анемий, метаста пр.). При этом гипохромия, как правило, соче- зов опухоли в костный мозг. Гигантские ядерные тается с уменьшением размера эритроцитов Ч эритроциты Ч мегалобласты Ч свидетельствуют о патологическом кроветворении, связанном с рометра, совпадающих с тем или иным коли дефицитом витамина В12, фолиевой кислоты. чеством делений шкалы объект-микрометра, 'и При этих же.состояниях наблюдаются и эритро- определяют цену одного деления. Например:
циты с остатками ядер Ч кольца Кебота, тельца 40 делений шкалы окуляр-микрометра совпали Жолли. Последние формы постоянно обнаружи- с б делениями объект-микрометра, т. е. соот вают в мазках крови У| больных после удаления ветствуют 60 мкм;
одно деление -г^.= 1,5 мкм.
селезенки.
Шаровидная форма эритроцитов, отличаю- Это определение проводят один раз для опреде щаяся уменьшенным диаметром и интенсивной, ленного микроскопа, с помощью которого в без просветлений окраской, Ч микросфероци- дальнейшем производят эритроцитометрию.
тоз Ч является патогномоиичным морфологиче- На сухой окрашенный мазок наносят каплю ским признаком гемолитической анемии Ч на- иммерсионного масла, погружают в нее иммер следственного микросфероцитоза (см. табл. 24). сионный объектив и микроскопируют с макси В небольшом количестве микросфероциты могут мально освещенным полем зрения.
встречаться и при других гемолитических ане- В тонком месте мазка (где эритроциты рас миях. положены изолированно) измеряют, диаметр не Большое диагностическое значение имеет об- менее 100 эритроцитов, отмечая, какое коли наружение в мазках крови эритроцитов серпо- чество делений шкалы окуляр-микрометра укла видной формы. Этот симптом характерен для дывается в эритроцит. Отмечают результат из серповидноклеточной анемии, относящейся к мерения каждого эритроцита (удобно пользо группе наследственных гемоглобинопатии (S-гe- ваться 11-клавишным счетчиком, условно ис моглобиноз). пользуя разные клавиши для определенного В сомнительных случаях, когда число серпо- числа делений шкалы).
видных эритроцитов в мазках невелико, сле- Зная цену одного деления и количество эрит дует проводить пробы на серповидность эритро- роцитов с одинаковым числом делений, выража цитов, основанные на использовании веществ ют результат в процентах.
(метабисульфит натрия, янусовый зеленый, ме- Пример: эритроциты с диаметром 4,5 мкм Ч тиленовый синий), понижающих содержание 5 %, 6 мкм Ч 10 %, 7,5 мкм Ч 70 %, 9 мкм кислорода в препаратах. 11 %, 10,5 мкм Ч 4 %. Результат можно пред На стекле смешивают каплю крови и каплю ставить и в виде эритроцитометрической кривой одного из указанных веществ, накрывают по- (кривая Прайс-Джонса), при этом на оси абс кровным стеклом. Просматривают под микро- цисс откладывают диаметр в микронах, а на оси скопом через 10Ч15 мин, затем 24Ч48 ч. В по- ординат Ч процент эритроцитов. При необходи ложительных случаях в препаратах количество мости результат выражают в виде среднего эритроцитов серповидной формы увеличивается. диаметра эритроцитов (см. 3.3.5).
Определение с помощью счетного аппарата.
Лит е ра т у ра. Циркина А. С.Ч В кн.;
В счетном аппарате Целлоскоп и др. можно Справочник по клиническим лабораторным ме подсчитать число частиц определенного размера тодам исследования/Под ред. Е. А. Кост. 2-е в 1 мкл жидкости.
изд.Ч М.: Медицина, 1975, с. 17.
Пр инцип. Подсчет эритроцитов разного диаметра в 1 мкл крови с помощью дискримина тора и при необходимости построение эритро 3.3.3. Эритроцитометрия цитометрической кривой.
(измерение- диаметра эритроцитов) Ход о пр е д е л е ни я соответствует ин струкции, приложенной к прибору.
Унифицированный микроскопический метод с При сопоставлении эритроцитометрических помощью окуляр-микрометра (1972). Прин- кривых, построенных после подсчета в аппарате цип. Измерение диаметра эритроцитов в окра- и с помощью окуляр-микрометра у здоровых шенном мазке крови с помощью окуляр-микро- людей, обнаружено их совпадение. При патоло метра. гии, особенно при различных анемиях, циррозах Сп е ц и а л ь н о е обору дова ние. 1. печени, гемолитических кризах, выявлены раз Микроскоп. 2. Окуляр-микрометр Ч окуляр, на- личия в форме и высоте кривых. Это может быть саживаемый на тубус микроскопа, с круглой связано прежде всего с тем, что эритроцито стеклянной пластинкой и нанесенной на ней метрическая кривая после использования оку шкалой, разделенной на 50 делений. 3. Объект- ляр-микрометра выведена на 100 эритроцитов, микрометр Ч предметное стекло со шкалой дли- а в счетном аппарате Ч на абсолютные вели ной 2 мм, разделенной на 200 делений (каждое чины эритроцитов в 1 мкл крови;
кроме того, не деление 10 мкм). исключено, что при патологии в морфологически Ход о пр е д е л е ния. Перед началом ра- измененных эритроцитах изменяются свойства боты определяют цену одного деления шкалы электропроводности, на принципе которой осно окуляр-микрометра,, которая зависит от длины вано исследование эритроцитов во многих счет тубуса микроскопа и увеличения объектива. Оп- ных приборах.
ределение проводят с помощью объект-микро- Но р ма л ь н ые в е л и ч и н ы. У здоро метра, который устанавливают на столик микро- вых нормоциты (эритроциты диаметром 7,5 мкм) скопа таким образом, чтобы шкалы окуляр-ми- составляют 68 0,4%, микроциты (диаметр крометра и объект-микрометра сбвпалн. Затем 6,9 мкм и меньше) Ч 15,30,42 % и макроциты отсчитывают число делений шкалы окуляр-мик- (диаметр 8 мкм и больше) Ч 16,90,47 %.
Кл инич е с к о е з на че ние. Резуль- дующим определением результата по градуиро таты эрнтроцитометрии являются важными для ванным капиллярам.
уточнения характера анемии (см. табл. 24). Ре а кт ив ы те же.
При железодефицитной анемии, как правило, Обору дов а ние. 1. Центрифуга. 2. Пи имеют место микроцитоз эритроцитов до 30Ч50 % петки от аппарата Панченкова (с отрезанным и соответственно сдвиг эритроцитометрической верхним концом и длиной 10Ч11 см).
кривой влево. Увеличение процента микроцитов Ход опре де ле ния. В обработанную наблюдается также при наследственном мнкро- антикоагулянтом и высохшую пипетку набирают сфероцитозе, талассемии, свинцовом отравле- кровь из пальца (или венозную) до верхней мет нии. Увеличение числа макроцитов является ки (100 делений). Пипетку укупоривают, обтя признаком макроцитарной анемии, наблюдаю- гивая ее резиновым кольцом, и центрифугируют щейся при В[2-дефицитных и фолиеводефицит- 30Ч40 мин при. 3000 об/мин. Результат отме ных состояниях. Количество макроцитов при чают по градуировке капилляра, вычитая из этих анемиях может достигать 50 % и более, высоту столбика эритроцитов.
при этом в небольшом числе (1Ч3 %) обнару- Определение с помощью автомата. Иссле живают и мегалоциты (эритроциты с диаметром дование гематокрита входит в программу всех 12 мкм и более). Макроцитоз эритроцитов может известных гематологических автоматов и многих наблюдаться независимо от анемии при алко- счетных приборов.
голизме, диффузных поражениях печени. Пр и нц и п. В автоматах используется кон дуктометрический метод (автомат SMA-7a) Лит е ра т у ра. Гольдберг Д. И., Гольд либо центрифужный метод (автомат Гемалог берг Е. Д. Справочник по гематологии. 6-е 8"). В некоторых автоматах н счетных приборах изд.Ч Томск, 1980, с. 72.
гематокрит определяют расчетным путем, исходя из количества эритроцитов в 1 мкл крови и сред него объема одного эритроцита в 1 мкм.
3.3.4. Общий объем эритроцитов Ход ис с л е д о в а ния соответствует ни-, (гематокритная величина) струкции, приложенной к прибору.
Гематокритная величина, или показатель ге- Но р ма л ь н ые в е л ич ины. У здоро матокрита, дает представление о соотношении вых гематокрит венозной и капиллярной крови между объемами плазмы и форменных элемен- равен 40Ч48 % (или 0,40Ч0,48) для мужчин тов крови (главным образом эритроцитов), по- и 36Ч42 % (или 0,36Ч0,42) для женщин.
лученном после центрифугирования крови. При- Кл и ни ч е с к о е з на че ние. Показа нято гематокритнои величиной выражать объем тель широко используют для суждения о степени эритроцитов. В качестве унифицированных ме- анемии, при которой, как правило, отмечается тодов определения гематокритнои величины (ге- его снижение, иногда до значительных цифр матокрита) утверждены два метода: с помощью (20Ч25%). Выраженное повышение (55Ч65%) микроцентрифуги и микрометод в модификации характерно для эритремии, менее резкое увели И. Тодорова. чение (50Ч55 %) наблюдается при симптома Унифицированный метод с помощью мнкро- тических эритроцитозах, сопутствующих вро цеитрнфуги (1979). Пр инцип. Центрифуги- жденным порокам сердца, легочной недостаточ рование крови определенное время при постоян- ности, некоторым гемоглобинопатиям. Показа ном числе оборотов центрифуги с последующим тель гематокрита дает представление о гемокон определением результата по специальной шкале.
центрационных сдвигах, он снижается при гемо Ре а кт ивы. Антикоагулянты: гепарин Ч дилюции. Используют гематокрнт для расчетных 5000 ЕД/мл разводят дистиллированной водой показателей, отражающих различные характе в соотношении 1 : 5 или этилендиаминтетраук- ристики эритроцитов: средний объем, средняя сусной кислоты динатриевая соль (ЭДТА Na2, концентрация гемоглобина (см. ниже), а также трнлон Б), 40 г/л. для ряда биохимических показателей.
Обору дова ние. 1. Микроцентрифуга Литература. Тодоров Я. Клинические МЦГ-8. 2. Капиллярные трубки (в комплекте лабораторные исследования в педиатрии. 3-е с центрифугой). Можно использовать капил изд.Ч София, 1961, с. 263.
ляры для определения С-реактивного белка.
Ход опре де ле ния. Предварительно обработанный антикоагулянтом и высушенный 3.3.5. Индексы эритроцитов капилляр заполняют кровью из пальца (или ве нозной) на /8 длины. Укупоривают капилляр В клинической практике используют различ с одного конца специальной пастой (можно ные расчетные характеристики, отражающие пластилином). Помещают в ротор центрифуги физико-химические свойства эритроцитов. Наи так, чтобы укупоренные концы упирались в ре- более широко применяют расчет цветового по зиновую прокладку, и центрифугируют 5 мин казателя.
при 8000 об/мин. По отсчетной шкале, прило- Цветовой показатель. Индекс отражает от женной к центрифуге МЦГ-8, определяют гема- носительное содержание гемоглобина в эритро токритную величину. цитах. Вычисляют цветовой показатель опреде Унифицированный микрометод (модифика- лением отношения двух частных, полученных от ция Я. Тодорова) (1979). Принцип. Цент- деления количества гемоглобина на количество рифугирование крови определенное время при эритроцитов в норме и в исследуемой крови по постоянном числе оборотов центрифуги с после- следующей формуле:
центрации гемоглобина в I мкл крови на число эритроцитов в том же объеме.
Пример: концентрация гемоглобина в крови равна 12 г/100 мл, количество эритроцитов в 1 мкл крови Ч 4 000 000.
12 г % = 12000 мг/100 мл=12 мг в 1 мкл = нормальное количество эритроцитов.
Если принять, что в норме в 100 мл крови со держится 16,7 % гемоглобина и 5000000 эрит роцитов в 1 мкл крови, то рассчитывают по фор муле:
надо содержание гемоглобина в г/100 мл умно жить на 10 и разделить на число миллионов эритроцитов в крови. Расчет показателя можно произвести по номограмме (по Мазону). В сов ременных гематологических автоматах этот по казатель (МСН)' определяют расчетным путем.
Нормальные величины составляют 24Ч33 пг.
Кл и ни ч е с к о е з на че ние. Снижение В практической работе удобно пользоваться отражает гипохромию и наблюдается при желе для подсчета цветового показателя пересчет зодефицитных анемиях, повышение имеет место ными таблицами, а также номограммами.
при макроцитарных и особенно мегалоцитарных Но р ма л ь н ые в е л ич ины. У здоро анемиях.
вых цветовой показатель находится в пределах Лит е ра т у ра. Тодоров Я. Клинические 0,86Ч1,05.
лабораторные исследования в педиатрии. 3-е Кл и нич е с к о е з на че ние. По вели изд., русск.ЧСофия, 1961, с. 272.
чине цветового показателя принято делить ане мии на гипохромные, иормохромные и гипер Средняя концентрация гемоглобина в эрит хромные. Гипохромные анемии (с цветовым по роците. Показатель отражает степень насыще казателем менее 0,86} широко распространены ния эритроцита гемоглобином в процентах. Вы н наблюдаются прежде всего при дефиците же числяют путем деления концентрации гемогло леза, вызванном различными причинами. Осо бина в г/100 мл на гематокритную величину и бенно выраженной гипохромией (0,6 Ч 0,5 и умножения на 100.
ниже) характеризуются железодефицитные ане Пример: концентрация гемоглобина мии, обусловленные хроническими кровопоте 12 г/100 мл, гематокрит 40 об. %.
рями.
Средняя концентрация. гемоглобина Менее выраженная гипохромия эритроцитов (0,7 Ч 0,8) наблюдается при железодефицитной анемии беременных, при инфекциях, опухолях, Редко встречаются гипохромные анемии, не свя- Можно легко рассчитать, используя номо занные с дефицитом железа и обусловленные грамму по Мазону (рис. 6). Показатель включен нарушением синтеза гемоглобина в результате в программу современных гематологических ав свинцового отравления или наследственного по- томатов.
вреждения синтеза порфиринов и цепей глобина Но р ма л ь н ые в е л ич ины. МСНС ко (b-талассемии, а-талассемии н др.). леблется в пределах 30Ч38 %. Величина наибо Повышение цветового показателя Ч гипер- лее константная, насыщения выше 38 % не хромия Ч является характерным лабораторным бывает.
признаком различных Виг-дефицитных и фолие- Кл и н и ч е с к о е з на ч е ние. Снижение водефицитных анемий. Особенно выражена ги- показателя отражает абсолютную гипохромию перхромия эритроцитов (1,2 Ч 1,3) при рецидиве и является характерным для железодефицитных анемии Аддисона Ч Бирмера. Нормохромные анемий. Чувствительность этого индекса эритро анемии наблюдаются при некоторых гемолитиче- цитов при железодефицитных анемиях состав ских формах малокровия, острых кровопотерях, ляет 85 %. Снижение показателя выявлено так лейкозах, сопутствуют циррозу печени. же при макроцитарных и особенно мегалоцитар Среднее содержание гемоглобина в эритро- ных анемиях, когда объем эритроцитов увеличен ците. Показатель отражает абсолютное содер- непропорционально более значительно по срав жание гемоглобина в одном эритроците в пико- нению с увеличением насыщения эритроцитов граммах (пг). Определяют путем деления кон- гемоглобином.
1 Для выявления гипохромии необходимым МСН Ч Mean Corpuscular Hemoglobin.
условием является правильный подсчет числа МСНС Ч Mean Corpuscular Hemoglobin эритроцитов в крови. Concentration.
Рис. 6. Номограмма для вычисления индексов эритроцитов по Мазону [из кн.: М. М, Wintrobe.
Clinical Hematology. Ed. 4.ЧFiladelphia: Lea Fiebiger, 1956]. Объяснение в тексте.
Лит е ра т у ра. Тодоров И. Клинические лабораторные исследования в педиатрии.Ч Со фия, 1966, с. 341.
Средний объем эритроцитов. Показатель яв Практически для вычисления показателя ляется важным при диагностике различных надо величину гематокрита разделить на число форм малокровия. Вычисляют путем деления re эритроцитов в миллионах н умножить на 10.
матокритной величины на общее количество эритроцитов в крови. Средний объем эритроци Можно расчет вести по номограмме.
тов (MCV) ' выражают в кубических микронах В программе современных гематологических или кубических микрометрах.
комплексов и автоматов этот параметр опреде Приме р: гематокрит Ч 40 об.% (или 3 3 ляют либо кондуктометрически (отечественный 0,40 мм, или 400000000 мкм );
эритроциты гематологический комплекс КГ-2), либо расчет 4 500 000 в 1 мкл;
ным путем.
Нормальные величины составляют 75Ч ' MCV Ч Mean corpusculare Volume. 95 мкм.
П Кл инич е с к о е з на че ние. Повыше- непосредственно на стекле или в пробирке ние показателя наблюдается при наследственном (1972). Пр инцип. Суправитальная окраска микросфероцитозе, макроцитарных и мегалоци- красителями, выявляющими зернисто-ннтчатую тарных анемиях, особенно высокое значение субстанцию ретикулоцитов.
(более 130 мкм ) выявлено при В12-дефицитных Ре а кт ив ы. Можно использовать один из анемиях. Объем эритроцитов часто увеличен следующих красителей.
при диффузных поражениях печени, алкого- 1. Насыщенный раствор бриллиантового кре лизме. Снижение наблюдается при микроци- зилового синего в абсолютном спирте (для при тарных анемиях, талассемии. готовления абсолютного спирта надо выдержать этанол 96 % в нескольких сменах прокаленного Лит е р а т у р а. Тодоров И. Клинические порошка медного купороса). На 100 мл абсолют лабораторные исследования в педиатрии.Ч Со ного спирта берут 1,2 г краски.
фия, 1966, с. 341.
2. Раствор азура I, предложенный П. Н. Ко Средний диаметр эритроцитов. Вычисляют риковым: азур 1 Ч 1 г, аммония оксалат Ч 0,4 г, из результатов эритроцитометрии путем умно натрия хлорид Ч 0,8 г, этиловый спирт 96 % Ч жения каждого процента клеток с определенным 10 мл, дистиллированная вода Ч 90 мл. Раствор диаметром на его значение в мкм, суммирова краски в закрытом флаконе помещают на 2Ч нием этих произведений н делением на 100.
дня в термостат при 37 С и периодически энер Приме р: при эритроцитометрии 100 эрит гично взбалтывают. Затем охлаждают до ком роцитов выявлено 10 % эритроцитов с диамет натной температуры и фильтруют через бумаж ром 6 мкм, 70 % Ч с диаметром 7,5 мкм и ный фильтр. Раствор сохраняют в посуде из 20 % Ч с диаметром 9 мкм.
темного стекла. При появлении осадка краску Средний диаметр эритроцитов (СДЭ) вычис следует снова профильтровать.
ляют следующим образом:
3. Раствор азура II следующего состава:
азур II Ч 1 г, натрия цитрат Ч 5 г, натрия хло рид Ч 0,4 г, дистиллированная вода Ч 45 мл.
Раствор оставляют в термостате при 37 С на 2 сут, периодически помешивая. Для ускорения растворения краску можно прогреть на слабом огне в течение 15Ч20 мин, не доводя до кипения.
Но р ма л ь н ые в е л и ч и н ы СДЭ Охлаждают до комнатной температуры и фильт 7,550,009 мкм.
Кл и ни ч е с к о е з на ч е ние. Показа- руют.
тель значительно менее информативен, чем раз- Хранят в посуде из темного стекла.
Спе циа л ь ное оборудование.
вернутые данные эритроцитометрии. Снижение СДЭ наблюдается при резко выраженных же- Микроскоп.
лезодефицитных анемиях, повышение Ч при ре- Ход опре де ле ния. Окраска на стекле.
Хорошо вымытое и обезжиренное предметное цидиве анемии Аддисона Ч Бирмера и других стекло подогревают над пламенем горелки. Стек В12 дефнцитных анемиях.
Г лянной палочкой наносят на стекло каплю од ного из красителей и готовят мазок из краски шлифованным стеклом. Маркируют сторону 3.3.6. Ретикулоциты стекла, на которую нанесен мазок краски, стек Ретикулоцнты Ч молодые эритроциты, обра- лографом. В таком виде стекла можно загото зующиеся после потери нормобластами ядер. вить впрок и хранить в сухом темном месте.
Характерной особенностью ретикулоцитов явля- Наносят каплю крови на мазок краски, готовят ется наличие в цитоплазме зернисто-нитчатой из нее тонкий мазок и тотчас помещают во влаж субстанции, представляющей агрегированные ную камеру на 3Ч4 мин (можно пользоваться рибосомы и митохондрии. Эта субстанция выяв- чашкой Петри с уложенными по краям валиками ляется при специальном методе окраски Ч суп- смоченной ваты или фильтровальной бумаги).
равитальном, т. е. без предварительной фикса- Затем высушивают мазки на воздухе.
ции клеток. Зернисто-нитчатая субстанция в В приготовленных таким образом мазках различных рётикулоцитах отличается полимор- эритроциты окрашены в желтовато-зеленова физмом;
чем клетка моложе, тем субстанция тый цвет, зернисто-нитчатая субстанция Ч в си более обильная. У самых молодых ретикуло- ний цвет.
цитов она имеет форму густого клубка, у более Окраска в пробирке. Метод 1: перед упот зрелых клеток выявляется в виде сеточки, от- реблением готовят в пробирке рабочий раствор дельных нитей и затем отдельных зерен. В маз- бриллиантового крезилового синего из расчета ках, окрашенных обычными гематологическими на каплю 1 % раствора оксалата калия 4 капли методами, ретикулоциты серовато-розового цве- раствора краски 1. В краску добавляют 0,04 мл та Ч полихроматофильны, т. е. окрашены раз- крови (две пипетки до метки 0,02). Смесь тща ными красителями.
тельно, но осторожно перемешивают и остав Определение количества ретикулоцитов про- ляют на 30 мин. Перемешивают и готовят тонкие изводится при микроскопии специально окра- мазки.
шенных мазков.
Метод 2: в пробирку помещают 0,05 мл раст Унифицированный метод подсчета количест- вора краски 3 и 0,2 мл крови. Смесь тщательно ва ретикулоцитов после окраски их бриллиан- перемешивают и оставляют на 20Ч30 мин. Пе товым крезиловым синим, азуром I или азуром II ремешивают и готовят тонкие мазки.
Метод 3: в пробирку помещают 0,3Ч0,5 мл бует немного времени;
благодаря яркому свече раствора краски 2 и 5Ч6 капель крови пипеткой нию ретикулоциты легко подсчитать.
от аппарата Паиченкова. Пробирку закрывают Но р ма л ь н ые в е л ич ины. У здоро резиновой пробкой, смесь тщательно, но осто- вых число ретикулоцитов составляет 2Ч12 / о, ч или 0,2Ч1,2 %.
рожно перемешивают и оставляют на I Ч l'/ (лучше окрашиваются ретикулоциты при экс- Клиниче с кое значение. Число рети позиции 1 1/2Ч3 ч). Перемешивают и готовят кулоцитов в крови отражает регенеративные тонкие мазки. свойства костного мозга, и оценка его широко Подсче т р е т ик у л о цит о в. В маз- используется при различных анемиях (см.
ках эритроциты окрашены в желтовато-зелено- табл. 24). Повышение количества ретикулоци ватый цвет, зернисто-нитчатая субстанция Ч в тов наблюдается после кровопотери, при гемо синий или синевато-фиолетовый цвет. литических анемиях, особенно в период криза Приготовленные одним из указанных выше (количество ретикулоцитов может быть 20Ч способов мазки микроскопируют с иммерсион- 30 %), а также на фоне лечения анемии Адди ным объективом. Необходимо подсчитать не ме- сонаЧБирмера витамином В12 (ретикулоци нее 1000 эритроцитов и отметить среди них коли- тарный криз Ч подъем числа ретикулоцитов на чество эритроцитов, содержащих зернисто-нит- 4Ч8-й день лечения). Снижение количества чатую субстанцию. Практически для большей ретикулоцитов характерно для гипопластиче точности пользуются специальным окуляром, в ской анемии, редицива анемии АддисонаЧ котором можно уменьшить поле зрения до тре- Бирмера.
буемых размеров. При равномерных тонких маз- Определение количества ретикулоцитов мо ках, в которых эритроциты расположены в один жет быть использовано для определения про ряд, подбирают такое поле зрения, в котором дукции эритропоэза и вычисления срока жизни имеется, например, 50 эритроцитов, и затем про- эритроцитов.
считывают 20 таких полей зрения.
Литература. Гомзякова Н. В. Лаб, дело, При отсутствии готового окуляра его можно 1960, № 5, с. 38Ч39;
Зубжицкий Ю. Н. Лаб.
легко приготовить, для чего отвинчивают окуляр дело;
1967, № 2, с. 35;
Кориков П. Н. Лаб. дело, 7Х, вкладывают в него кусок бумаги с выре 1961, № 4, с. 10.
занным небольшим квадратиком и завинчивают.
Количество подсчитанных ретикулоцитов выра жают на 1000 или на 100 эритроцитов.
Подсч|ет количества ретикулоцнтов при по 3.3.7. Резистентность эритроцитов мощи люминесцентной микроскопии. Прин цип. Использование способности субстанции ретикулоцитов флюоресцировать после обра- Для оценки физико-химических свойств эрит ботки крови акридиновым оранжевым.
роцитов исследуют стойкость (резистентность) Реактивы. 1. Раствор акридинового эритроцитов к различным воздействиям. Наи оранжевого на изотоническом растворе хлорида большее распространение в клинической прак натрия и концентрации 1 : 5000. Для приготов- тике получило исследование осмотической ре ления изотонического раствора рекомендуют ис- зистентности эритроцитов.
пользовать дистиллированную воду рН 5,8Ч6,8, Унифицированный метод определения осмо Раствор акридинового оранжевого должен быть тической резистентностн эритроцитов в модифи свежим;
хранят его не более 3Ч5 дней в темном кации Л. И. Идельсона (1974). Пр инцип.
флаконе с притертой пробкой. 2. Нефлюоресци- Количественное определение степени гемолиза рующее иммерсионное масло. Можно использо- эритроцитов в забуферных гипотонических раст вать афлуоль или обычное иммерсионное масло ворах хлорида натрия.
с флюоресценцией, погашенной нитробензолом Ре а кт ивы. Основной раствор (по своей (0,3 мл нитробензола на 1 мл масла). Ю. Н. Зуб- осмотической концентрации соответствует 10 % жицкий в качестве нефлюоресцирующего масла раствору хлорида натрия) имеет рН 7,4, состав предлагает использовать перегнанный анизол.
раствора: двузамещенный фосфат натрия Спе циа л ь но е обору д ов а ние.
Микроскоп ультрафиолетовый МУФ-ЗМ или лю минесцентный.
Ходопре де ления. Кровь смешивают с 180 г, дистиллированная вода Ч до 2 л. Раствор акридиновым оранжевым в пробирке или смеси- можно хранить в закрытой посуде в холодиль теле в соотношении 1 часть крови и 10 частей нике в течение нескольких месяцев.
краски (смесь можно хранить не более 5 ч). Основной раствор разводят в 10 раз и полу Смесь перемешивают в течение 2 мин, каплю чают раствор, соответствующий по своей осмо смеси наносят на предметное стекло и накрыва- тической концентрации 1 % раствору хлорида ют покровным стеклом. Микроскопируют с по- натрия. Из этого раствора готовят рабочие раст мощью светофильтра ЖС-17. В препарате воры хлорида натрия следующих концентраций:
эритроциты не флюоресцируют, а в ретикулоци- 0,85;
0,75;
0,70;
0,65;
0,60;
0,55;
0,50;
0,45;
0,40;
тах зернисто-нитчатая субстанция светится 0,35;
0,30;
0,20;
0,10%. Можно приготовить ярко-красным цветом. Замечено, что в крови, по 100 мл этих рабочих растворов и сохранять стабилизированной гепарином или цитратом их в холодильнике. Годны в течение 2 нед.
натрия, флюоресценции ретикулоцитов не на- Спе циа ль ное оборудование. 1.
блюдается. Метод отличается простотой и тре- Фотоэлектроколориметр. 2. Термостат на 37 "С.
Ход опре де ле ния. В две стерильные тивности ферментов в эритроцитах. В эритро пробирки с предварительно внесенными 2 кап- цитах содержатся ферменты гликолиза, пенто лями гепарина берут по 1,5 мл крови, перемеши- зофосфатного цикла, системы глютатиона, аде вают и одну используют для исследования, вто- ниловой системы и других реакций обмена, бло рую Ч оставляют на сутки в термостате. В ряд када которых может быть связана с дефицитом центрифужных пробирок (14 штук) разливают ферментов.
по 5 мл рабочих растворов хлорида натрия кон- Наиболее распространенной наследственной центраций от 1 до0,10 %. В каждую центрифуж- ферментопатией эритроцитов является дефицит ную пробирку добавляют по 0,02 мл перемешан- глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФД), от кой гепаринизнрованной крови и оставляют при носящейся к ферменту пентозофосфатного цик комнатной температуре на 30 мин. Центрифуги- ла. Для диагностики дефицита Г-6-ФД наиболее руют смесь крови с растворами хлорида натрия достоверным является количественное опреде при 2000 об/мин в течение 5 мин. Из каждой ление активности ферментов в эритроцитах. В пробирки сливают надосадочную жидкость и из- условиях практической работы могут быть вы меряют на фотоэлектроколориметре при длине полнены качественные пробы, имеющие ориен волны 500Ч56O нм (зеленый светофильтр) в кю- тировочное значение.
вете с толщиной слоя 10 мм против холостой Тест на образование телец ГейнцаЧЭрлиха пробы. по Дейчи. Пр и н ц и п. Инкубация эритроци Холостая проба Ч надосадочная жидкость тов с метиловым фиолетовым и появлением окра в пробирке, содержащей 1 % раствор хлорида шенных телец в большом количестве в патоло натрия. гических эритроцитах.
Расчет. За 100% гемолиз принимают Ре а кт ивы. 0,5 % раствор метилового гемолиз в пробирке, содержащей 0,1 % раствор фиолетового в изотоническом растворе хлорида хлорида натрия. Вычисляют процент гемолиза в натрия.
каждой пробирке, сравнивая величины экстинк- Спе циа ль ное оборудование.
ции надосадочной жидкости с экстинкцией, при- Микроскоп.
нятой за 100 %, по формуле: Ход опре д е л е ния. Смешивают в про бирке равные количества крови н раствора ме тилового фиолетового. Тщательно перемеши вают и оставляют на 10 мин. Готовят мазки на предметном стекле, накрывают покровным и микроскопируют с иммерсионным объективом.
Но р ма л ь ные в е л ич ины. У здоро цент гемолиза в пробирке с 0,1 % раствором хло- вых наблюдается образование в эритроцитах рида натрия. единичных красного цвета телец.
На следующий день повторяют исследование Кл инич е с к о е з на че ние. В патоло с кровью, инкубированной 24 ч при 37 С. гических Г-6-ФД-дефицитных эритроцитах по Но р ма л ь н ые в е л ич ины. У здоро- является большее количество телец (4Ч6). Про вых в свежей крови начало гемолиза отмечают ба не является специфичной для дефицита при концентрации хлорида натрия 0,50Ч0,45 %, Г-6-ФД, так как тельца Гейнца появляются при а полный гемолиз Ч при 0,40Ч0,35 % растворе передозировке сульфаниламидов, при отравле хлорида натрия. нии анилиновыми красителями, при дефиците Кл инич е с к о е з на ч е ние. Исследо- других ферментов (глютатион-редуктазы, 6-фос вание проводят при подозрении на гемолити- фоглюкоиатдегидрогеназы), у носителей неста ческую анемию. Понижение осмотической ре- бильных гемоглобинов.
зистентности, т. е. появление гемолиза эритроци- Качественный метод МотульскогоЧКемп тов при более высокой, чем в норме, концентра- беля. Пр и н ц и п. В присутствии Г-6-ФД об ции хлорида натрия (0,70Ч0,75 %), наблюда- разуется NADPH, который обесцвечивает брил ется при наследственном мнкросфероцитозе и лиантовый крезиловый синий.
некоторых наследственных несфероцитарных ге- Ре а кт ив ы. 1, Раствор натриевой солн молитических анемиях, а также иногда при ауто- глюкозо-6-фосфата (825 мг в 100 мл дистилли иммунной гемолитической анемии. В ряде случа- рованной воды). 2. Раствор NADP (50 мг в ев понижение осмотической резистентности вы- 100 мл дистиллированной воды). 3. Раствор является только при исследовании инкубирован- бриллиантового крезилового синего (32 мг в ной крови. Повышение осмотической резистент- 100 мл дистиллированной воды). 4. Трис-буфер ности характерно для талассемии, гемоглобино- ная смесь рН 8,5 (8,96 г в 97мл дистиллирован патии. ной воды + 3 мл концентрированной НС1). 5. Па рафин.
Лит е ра т у ра, Идельсон Л. И, В кн.:
Спе циа л ь но е обору дова ние. Не Справочник по функциональной диагностике / требуется.
Под ред. И. А. Кассирского.Ч М., Медицина, Ход определения. В пробирке сме 1970, с. 401.
шивают: 0,1 мл реактива 1;
0,1 мл реактива 2;
3.3.8. Пробы на ферментопатню 0,25 мл реактива 3;
0,2 мл реактива 4. В другую пробирку, куда заранее внесен 1 мл дистиллиро эритроцитов ванной воды, добавляют 0,02 мл крови из паль При несфероцитарных гемолитических ане- ца. Смешивают содержимое обеих пробирок, миях возникает необходимость исследования ак- смесь покрывают 1Ч2 мл жидкого парафина и ставят на водяную баню при 37 С. Отмечают Сидероциты и сидеробласты Ч это эритро время обесцвечивания смеси.
циты и эритробласты (нормобласты), содержа Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы. У здоро- щие в цитоплазме негемоглобиновое железо в вых раствор обесцвечивается черта 40Ч55 мин. виде гемосидерина и ферритина.
Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Замедле- Пр и н ц и п. Окраска с помощью реакции ние обесцвечивания более 90 мин свидетель- на берлинскую лазурь и образование внутри ствует о дефиците Г-6-ФД. При гемолитической клеточных гранул синего цвета.
энзимодефицитной анемии обесцвечивание на- Р е а к т и в ы. 1. 2% раствор железисто ступает через 3Ч24 ч. синеродистого калия. 2. 0,1 н. раствор НС Качественный метод по Бернштейну. Пр и н - (8,2 мл концентрированной НС1 и дистиллиро цип тот же, что и в методе МотульскогоЧ ванной воды до 1 л). 3. 0,1 % раствор сафрани Кемпбеля, но окраска бриллиантовым крезило- на. 4. Метиловый спирт.
вым синим заменена дихлорфенилиндофенолом.
Сп е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а ние.
Ре а к т и в ы. 1. Раствор 2,6-дихлорфени- Микроскоп.
линдофенола (14,5 мг на 100 мл буферного Ход о п р е д е л е н и я. Фиксируют мазки раствора трис НС1, рН 8,0). Буферный раствор в метиловом спирте 10Ч20 мин и высушивают состоит из следующих компонентов: 1,48 М раст- на воздухе. Помещают в смесь равных частей вор трисоксиметиламинометана (43,27 г на растворов 1 и 2 при температуре 50Ч56 С 250 мл воды) и 1,48 М раствор HCI (2 ампулы на 15Ч20 мин. Промывают в проточной воде фиксанала, содержащего 0,1 г-экв, доводят во- 10Ч15 мин и ополаскивают дистиллированной дой до 135 мл). К 230 мл раствора трис добав- водой. Докрашивают раствором сафранина 3Ч ляют 110 мл раствора НС1 и доводят водой до 5 с.
460 мл. 2. Раствор феназинметасульфата (2 мг Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы. В перифе на 100 мл воды). 3. Раствор NADP (2,3 мг в рической крови число сидероцитов не превы 1 мл воды). 4. Раствор глюкозо-6-фосфата шает 1,1 % и составляет в среднем 0,6 + 0,04%, (15,2 мг натриевой соли Г-6-Ф в 1 мл воды). в костном мозге их несколько большеЧ0,9 + Из этих растворов готовят реактивную смесь + 0,09% (в среднем 0,2Ч2,1%), количество следующего состава: реактив 1Ч8 частей, реак- сидеробластов (ядерных эритроцитов с железо тив 2Ч1 часть, реактив 3Ч0,5 части и реактив содержащими гранулами) в костном мозге 4Ч0,5 части.
23,7 + 2,4 %.
Сп е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а н и е. Не Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Снижение требуется.
сидероцитов и сидеробластов характерно для Ход о п р е д е л е н и я. В пробирку с 1 мл железодефицитных анемий. Повышение железо дистиллированной воды вносят 0,02 мл крови содержащих клеток наблюдается при гемолити из пальца. После наступления гемолиза добав- ческих анемиях, гипопластических анемиях, по ляют 0,5 мл реактивной смеси. Оставляют на сле операции спленэктомии.
15Ч20 мин при комнатной температуре. Через Ли т е р а т у р а. Цитологические аспекты 15Ч20 мин оценивают изменение цвета смеси.
заболеваний системы крови/Под ред. Э. И. Те Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы. Обесцвечи рентьевой, Г. И. Козинца.Ч М.: Медицина, вание смеси происходит через 15Ч20 мин.
1978, с. 162.
Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Более позднее обесцвечивание смеси свидетельствует Фетальный гемоглобин. Метод Ветке.
о дефиците Г-6-ФД в эритроцитах. Неполное Пр и н ц и п. Элюция гемоглобина кислотой с обесцвечивание через 30 мин соответствует докраской мазков дает возможность отличить уменьшению активности Г-6-ФД, а отсутствие эритроциты, содержащие фетальный гемогло обесцвечивания к этому времени свидетель- бин, по сохраненной окраске в отличие от обес ствует о резком снижении активности цвеченных эритроцитов, содержащих гемогло фермента. бин А.
Ре а к т и в ы. 1. Цитратно-фосфатный бу Л и т е р а т у р а. Тодоров И. Клинические фер (рН 3,2): 24,7 мл 0,2 М раствора Na HPO 2 лабораторные исследования в педиатрии. 5-е (35,6 г Na HPO Х 2Н О и до 1 л дистиллирован 2 4 изд. (русск.) Ч София, 1966, с. 313, 389;
Идель- ной воды) и 75,3 мл 0,1 М раствора лимонной сон Д. И.,Катоян Э. Р. Лабор. дело, 1970, № 7, кислоты (21,01 г лимонной кислоты и до 1 л ди с. 428.
стиллированной воды). 2. 1 % раствор метило вого фиолетового или 1 % раствор эозина. Луч шие результаты дает докраска метиловым фио 3.3.9. Цитохимические исследования летовым. 3. Этиловый спирт 80 %.
эритроцитов Сп е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а н и е. 1.
Микроскоп. 2. Термостат на 37 С.
Цитохимические исследования отличаются Ход о п р е д е л е н и я. Фиксируют мазки простотой, не требуют специального оборудова- крови в 80 % этиловом спирте 5 мин. Промы ния и дают ориентировочное представление о ко- вают дистиллированной водой и высушивают.
личестве исследуемого вещества. Исследования Погружают мазки на 5 мин в прогретый при эритроцитов проводят с целью выявления раз- 37 С в течение 30 мин цитратно-фосфатный личных внутриклеточных включений, наличия буфер (для элюции гемоглобина), периодически разных форм гемоглобина, ферментных нару- помешивая раствор стеклянной палочкой для шений. удаления пузырьков воздуха. Ополаскивают мазки дистиллированной водой, высушивают нийЧ эритроциты, верхний Ч плазма). При фильтровальной бумагой. Докрашивают реакти- этом СОЭ, т. е. величина столбика плазмы, бы вом 2 в течение 2Ч3 мин. Промывают дистил- вает различной в зависимости от изменений лированной водой и высушивают.
физико-химических свойств крови.
Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы. У взрослых Р е а к т и в ы. 5 % раствор трехзамещенного встречаются единичные окрашенные эритроциты цитрата натрия (C H O7Na Х 5Н О). Раствор 6 5 3 (содержащие гемоглобин F);
увеличение числа фильтруют (рН должен быть нейтральным или окрашенных эритроцитов наблюдается у ново- слабощелочным). При помутнении реактив него рожденных и детей до 5-месячного возраста.
ден.
Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Увеличе- С п е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а н и е. Ап ние числа эритроцитов с гемоглобином F наблю- парат Панченкова, состоящий из штатива и дается у больных талассемией, особенно при капилляров. Пробирки и капилляры должны гомозиготной форме.
быть химически чистыми, т. е. необходимо их промыть хромовой смесью, многократно после Ли т е р а т у р а. Исаева Е. Г., Короле этого вымыть водопроводной водой и 2Ч3 ра ва А. М. Лаб. дело, 1965, № 4, с. 201;
Betke R., за Ч дистиллированной.
Kleinhauer E. Blut, 1958, Bd 5, S. 241.
Ход о п р е д е л е н и я. Перед использова Активность Г-6-ФД (К.Ф.1.1.1.49). Пр и н - нием химически чистый капилляр промывают цип. Окисление глюкозо-6-фосфата в присут- цитратом натрия и заполняют им пробирку на ствии Г-6-ФД при участии NADP, который 1/4 (до метки 0,75).
восстанавливается в NADP-H;
под влиянием Кровь из мякоти пальца (или венозную) последнего тетразолий выявляется в виде гра- набирают полный капилляр (до метки 0) и пере нул формазана.
носят в пробирку с цитратом (усиленно выдувая Ре а к т и в ы. 1. 10% раствор формалина.
всю кровь). При этом получают соотношение 2. Инкубационная среда: глюкозо-6-фосфат Ч крови и цитрата 4:1. Можно брать вдвое боль 3 мг в 1 мл, NADP Ч 1 мг в 1 мл, магния шее количество цитрата и крови, т. е. половину хлорид Ч 0,1 М в 0,2 мл, нитросиний тетразо- капилляра цитрата (до метки 0,5) и два полных лий Ч 1 мг в 1 мл, трис-буфер 0,25 М (рН 7,6) Ч капилляра крови. Перемешивают содержимое 2,3 мл, феназин-метасульфат Ч 0,5 мл. пробирки и набирают до метки 0 смесь крови Сп е ц и а л ь н о е о б о р у д о в а н и е.
с цитратом. Закрыв пальцем верхний конец 1. Термостат на 37 С. 2. Микроскоп.
капилляра, осторожно, чтобы кровь из капил Ход и с с л е д о в а н и я. На нефиксиро- ляра не вылилась, устанавливают капилляр в ванные мазки крови наносят 0,1Ч0,2 мл инку- штатив строго вертикально, упирая нижний его бационной среды и помещают мазки в гори- конец в резиновую прокладку и прижимая верх зонтальном положении в термостат на 1 ч ний конец прокладкой или пробкой. Через час 15 мин. Фиксируют в 10 % растворе формалина отмечают скорость оседания эритроцитов по вы 10 мин при комнатной температуре. Высушива- соте отстоявшегося слоя плазмы в миллиметрах.
ют на воздухе и микроскопируют.
Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы. У мужчин Но р м а л ь н ы е в е л и ч и н ы. В эритро- 1 Ч10 мм/ч, у женщин 2Ч15 мм/ч.
цитах обнаруживают 10Ч20 гранул формазана. При снижении температуры (<20С) поме Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Снижение щения, в котором проводится исследование, числа гранул формазана в эритроцитах или их СОЭ замедляется, при повышении Ч увеличи отсутствие указывает на дефицит Г-6-ФД. вается.
Кл и н и ч е с к о е з н а ч е н и е. Увеличе ние СОЭ наблюдается при различных воспали 3.3.10. Скорость оседания тельных процессах, интоксикациях, острых и эритроцитов (СОЭ). хронических инфекциях, при инфаркте миокар да, опухолях, после кровопотери, оперативных Исследование СОЭ является одним из самых вмешательств. Особенно выраженное ускорение распространенных в лабораторной практике и СОЭ (60Ч80 мм/ч) характерно для парапроте входит в состав общего клинического анализа инемических гемобластозов (миеломная бо крови. Кроме того, нередко проводится одновре- лезнь, болезнь Вальденстрема и др.) и симпто менно с определением концентрации гемоглоби- матических парапротеинемий, сопутствующих на и количества лейкоцитов в крови при про- злокачественным новообразованиям, хрониче филактических осмотрах. скому активному гепатиту, циррозу печени, ту Унифицированный микрометод Панченкова беркулезу, амилоидозу, коллагенозам. Замед (1972). Пр и н ц и п. Смесь крови с цитратом ление СОЭ наблюдается при эритремии и симп при стоянии разделяется на два слоя (ниж- томатических эритроцитозах.
3.4. ЛЕЙКОЦИТЫ Лейкоциты Ч клетки крови, отличающиеся и структуре ядра, характеру цитоплазмы, ее характерной структурой и сложным внутрикле- грануляции, ядерно-цитоплазматического соот точным метаболизмом. Различные формы зре- ношения, тинкториальным свойствам;
эти приз лых лейкоцитов являются объектом лаборатор- наки являются основными критериями при иссле ных исследований. Они различаются по форме довании лейкоцитов в окрашенных мазках крови.
Лейкоциты Ч высокоспециализированные кровь). Кончик пипетки вытирают фильтроваль клетки, обладающие различными защитными ной бумагой или марлей, следя за тем, чтобы функциями. Благодаря фагоцитарной активно- из пипетки кровь не вылилась. Выдувают кровь сти, участию в клеточном и гуморальном имму- из пипетки на дно пробирки, тщательно переме нитете, обмене гистамина, гепарина, реализу- шивают (повторно набирая и выдувая смесь ются антимикробные, антитоксические, антите- крови с уксусной кислотой). Маркируют про лообразующие и другие важнейшие компоненты бирку и оставляют до момента счета (допуска иммунологических реакций.
ется счет лейкоцитов не более чем через 2Ч4 ч Количество лейкоцитов в крови изменяется после взятия крови).
Pages: | 1 | ... | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | ... | 13 | Книги, научные публикации