Ик лазерная инактивация клеток и фотоповреждение биотканей, сенсибилизированных плазмонно-резонансными золотыми наночастицами и красителями 03. 00. 02-биофизика

Вид материала

Автореферат диссертации

Содержание Во второй главе Третья глава

Подобный материал:

• Физиология и биофизика возбудимых клеток, 2692.81kb.
• Ю. В. Штоцкий национальный исследовательский ядерный университет «мифи» Возможности, 9.58kb.
• Учебная программа Дисциплины р4 «Оптические методы диагностики биотканей» по направлению, 154.6kb.
• Цитоплазма: а органоиды, 266.57kb.
• Теоретическая и прикладная биофизика, 694.34kb.
• Государственный образовательный, 426.07kb.
• Исследование процессов взаимодействия молекул водорастворимого фуллерена с магнитными, 37.88kb.
• Развитие половых клеток, 130.49kb.
• Быков Владимир Павлович лекция, 48.35kb.
• Возможности физико-химической регуляции пула стволовых клеток, 187.05kb.

Глава 1. Альтернативой фотодинамической лазерной терапии в последние несколько лет стал метод фототермической плазмонной терапии на основе золотых наносфер, апробированный в 2003 [Л6]. Однако у золотых наносфер диаметром от 5до100 нм плазмонный резонанс находится в области 520-560 нм, но в этой зеленой спектральной области наблюдается сильное поглощение излучения естественным хромофором крови - гемоглобином эритроцитов, что приводит к разрушению не только патологических, но и нормальных клеток. Наиболее перспективным является лазерный фототермолиз на основе золотых нанооболочек и наностержней, имеющих плазмонный резонанс в окне прозрачности биотканей (750-1100нм) [Л2, Л5]. В главе представлены детальные экспериментальные исследования нагрева коллоидного раствора золотых нанооболочек (Au/SiO₂) и наностержней с плазмонным резонансом в спектральной области 750-850 нм, (синтезированных в ИБФРМ РАН в лаборатории проф. Хлебцова Н.Г.) при облучении полупроводниковым лазером с длиной волны 810 нм при уровне мощности 1-5 Вт и диаметре пучка 3-5 мм, работающем как в непрерывном режиме, так и в режиме генерации периодической последовательности импульсов с минимальной длительностью 200 мкс и регулируемой скважностью.

Компьютерное моделирование пространственного распределения поглощенных фотонов при распространении ИК электромагнитной волны через систему дискретных поглощающих и рассеивающих золотых нанооболочек (Au/SiO₂ 15/140 нм) в воде с учетом многократного светорассеяния осуществлялось методом Монте Карло при расчете траектории 10⁷ фотонов (проф. Максимова И.Л., асп. Скапцов А.А.). На рис.2 (а,б) представлены результаты пространственного распределения поглощенных фотонов и двумерные термограммы коллоидного раствора нанооболочек в воде для двух концентраций 2 (в,г).




(а) (б)



(в) (г)

Рис.1. Компьютерное моделирование (а,б) пространственного распределения поглощенной лазерной мощности в коллоидном растворе золотых плазмонно-резонансных нанооболочек (Au/SiO₂ 15/140 нм) в воде и соответствующий эксперимент (в,г) - 2D термограммы при лазерной мощности 1 Вт время 5 с; (а,в – концентрация наночастиц 5*10⁹ мл^-1; б,г – 1*10⁹ мл^-1).

Проведенные расчеты температурных полей, возникающих в результате поглощения энергии лазерного излучения наночастицами, показывают качественное согласие с экспериментом, что позволяет создавать технологии управляемого лазерного фототермолиза. Исследована динамика нагрева и остывания раствора золотых наночастиц при лазерном нагреве, что важно для создания технологии in vivo на животных.

Проведенные исследования нагрева раствора золотых нанооболочек и наностержней показали возможность управления температурными полями как по глубине, так и по уровню пространственного изменения температуры при регулировании концентрации наночастиц и плотности резонансной лазерной мощности.



(а) (б)



(в) (г)

Рис.2. Термограммы ИК лазерного нагрева коллоидного раствора золотых плазмонно-резонансных нанооболочек (Au/SiO₂ 15/140 нм) в воде для различной концентрации при воздействии резонансного излучения полупроводникового лазера с плотностью мощности 10 Вт/см² в течении 2 мин (120 Дж):

(г) - максимальная концентрация N₀= 5 10⁹ см^-3; (в) N = N₀/4; (б) N= N₀/16, (а) – физраствор.

Для бесконтактного измерения температуры использовался тепловизор IRISYS 4010 (InfraRed Integrated System Ltd, UK).



(а) (б)

Рис.3. Концентрационные зависимости изменения максимальной температуры коллоидного раствора золотых плазмонно-резонансных нанооболочек ((Au/SiO₂ 15/140 нм) при облучении непрерывным излучением лазера GaAlAs (810 нм) мощностью 2 Вт в течение 2-х минут (240 Дж) (а); и (б) - динамика температуры в центре области облучения при лазерном нагреве водного раствора золотых плазмонно-резонансных наночастиц. ■А – начало лазерного воздействия, ■В – выключение лазера.


Впервые в [Л6] апробирован новый метод для селективного повреждения клеток-мишеней, основанный на использовании золотых наночастиц, которые нагреваются наносекундными лазерными импульсами для создания локализованного повреждения клеток. При импульсной лазерном нагреве появляются дополнительные управляющие параметры: длительность оптического импульса, временной интервал между импульсами. В работе представлены сравнительные исследования эффективности резонансного оптического нагрева при облучении коллоидного раствора золотых нанооболочек лазером, работающем в непрерывном и импульсном режиме с длительностью от сотен микросекунд до сотен миллисекунд с регулированной скважностью при одинаковом уровне вводимой оптической энергии (Рис.4).



(а) (б)



(в) (г)

Рис.4. Сравнительная динамика лазерного нагрева плазмонно-резонансных наночастиц ИК излучением лазера (810 нм), работающего в импульсном (длительность импульса 2 мс, скважность 7) и непрерывном режиме с мощностью 2 Вт при одинаковом уровне вводимой оптической энергии : (а), (в) - импульсный режим; (б), (г) - непрерывный: (а), (б) - 60 Дж; (в), (г)- 240 Дж.

Проведенные экспериментальные исследования показали, что при использовании раствора золотых плазмонно-резонансных наночастиц, подверженного воздействию ИК миллисекундных лазерных импульсов при скважности более 2-х, возможна реализация режима локального нагрева, когда облучаемый объем на 10-20 ⁰С более холодный, чем при непрерывном лазерном воздействии, что получило подтверждение и на биотканях, при этом температурная разница между режимами существенно уменьшается, если при увеличении скважности пропорционально увеличивается пиковая лазерная мощность.

Однако на лазерные импульсные технологии существуют ограничения по длительности и энергии лазерных импульсов. Нами впервые был обнаружен и интерпретирован эффект дефрагментации золотых нанооболочек (Au/SiO₂ 15/140 нм) при облучении одиночными лазерными (λ=1064 нм) импульсами длительностью τ=4 нс и плотностью энергии более 200 мДж/см², что вызывало в лазерном фокусе возникновение золотых наносфер и их кластеров. Значительно больший порог 6 Дж/см² для дефрагментации требуется в фемтосекундной области (Ti:Sp λ=800нм, τ=60фс).



Рис.5. Дефрагментация золотых нанооболочек (Au/SiO₂;15/140нм) при воздействии одиночных импульсов YAG:Nd λ=1064 нм лазера с энергией 2-10 мДж: а - коллоидный раствор золотых нанооболочек (Au/SiO₂ 15/140 нм), b - после воздействия лазерных импульсов, с - изменение спектральных характеристик, приводящем к смещению положения плазмонного резонанса из ИК (900нм) в зеленую (530 нм) область d – TEM изображения отдельных золотых наноболочек до облучения, e- после; [3].

Разработанные технологии ИК резонансного нагрева золотых нанооболочек и наностержней были реализованы при фототермолизе биотканей животных in vivo, включая спонтанные опухоли при интерстициальном и внутривенном введении наночастиц [1,2]. Лазерный фототермолиз поверхностных тканей крысы при внутрикожном, подкожном и внутримышечном введении резонансных наночастиц (800нм) представлен на Рис.6.




(а) (б)



(в) (г)

Рис.6. Термограммы лазерной гипертермии поверхностных тканей крысы а - без наночастиц, б - при внутрикожном, в - подкожном и г - внутримышечном введении 0.1 мл физраствора с золотыми плазмонно-резонансными нанооболочками (Au/SiO₂ 15/140 нм 10⁹см^-3) при воздействии резонансным излучением полупроводникового лазера (810 нм) с мощностью 1 Вт в течении 3 мин (180 Дж).

Совместно с первой ветеринарной клиникой Саратова апробированы технологии лазерного фототермолиза с золотыми плазмонно-резонансными наночастицами различных спонтанных опухолей мелких животных (плоско-клеточный рак, базально-клеточный рак, меланома и др.) и получены положительные результаты, подтвержденные гистологически.

В настоящее время реализованы в основном цитологическеские исследования по лазерному фототермолизу биотканей на основе золотых плазмонно-резонансных частиц [Л2]. В работе представлены экспериментальные результаты лазерному фототермолизу клеток крови человека при использовании технологии золотых наноболочек и определены уровни мощности



(а) (б)

Рис.7. ИК лазерный фототермолиз эритроцитов микрокапли (20 мкл) цельной крови человека при введении золотых плазмонно-резонансных нанооболочек (Au/SiO₂ 15/140 нм) при концентрации 3 10⁹ см^-3 и облучения препарата непрерывной лазерной мощностью 2 Вт в течении 60 сек при диаметре лазерного пучка в 5 мм: а-темнопольная микроскопия; б- оптическое изображение в проходящем свете.

Для селективного накопления функционализированных моноклональными антителами золотых наночастиц необходимо их внутривенное введение, при этом необходимо исследование влияния наночастиц на гемостаз. Нами впервые обнаружен размерный эффект влияния золотых наночастиц на функциональную активность тромбоцитов крови крыс и человека при использовании лазерного тромбоцитарного агрегометра, который необходимо учитывать при внутривенном введении наночастиц [10].



Рис.8. Блок-схема установки (BIOLA) для измерения динамики АДФ индуцированной агрегации тромбоцитов при введении золотых наночастиц и результаты измерений: 1 - без наночастиц; 2 - золотые нанооболочки (Au/ SiO₂ 15/140 nm); 3 - золотые наносферы 2-3 нм.

^ Во второй главе обсуждаются апробированные методы визуализации наночастиц такие как электронная, атомно-силовая, туннельная микроскопия и экспресс метод диагностики отдельных золотых плазмонно-резонансных наносфер, нанооболочек и наностержней и их кластеров в растворах и в гистологических срезах [Л2] на основе оптической темнопольной микроскопии. Приводятся результаты визуализации в объеме золотых нанооболочек и наностержней с плазмонным резонансом в ближней ИК области (800 нм) с помощью низко-когерентного оптического томографа до глубины 2-х мм. Предложен и запатентован способ определения концентрации наночастиц в диапазоне от 10⁹/мл-10⁶/мл и их пространственного распределения, причем верхняя граница определяется условием, когда в объем когерентности, определяемый произведением длины продольной когерентности зондируемого излучателя (суперлюминесцентного диода) на размер фокального пятна, попадает не более одной наночастицы. Метод ОСТ позволяет количественно определить величину обратного отражения от отдельных наночастиц и кластеров.



(а) (б)

Рис.9. Двумерный ОСТ скан коллоидного раствора золотых плазмонно-резонансных нанооболочек (Au/SiO₂ 15/140 нм для двух значений концентраций: а-1/32 10⁹cм^-3 и б- 1/128 10⁹cм^-3 , измеренный с помощью ОСТ (Stratus-3000 Carl Zeiss, длина когерентности 10 мкм, диаметр фокального пятна 20мкм, глубина кюветы 1мм).

Экспериментально обнаружено, что в коллоидном растворе золотых плазмонно-резонансных наночастиц с концентрацией более 10⁹/мл ОСТ существенно искажает информацию о пространственном распределении наночастиц (Рис.10), что качественно подтверждают результаты компьютерного моделирования процессов поглощения и рассеяния фотонов в такой дискретной наносреде. Предложено использовать коллоидный раствор золотых наночастиц как управляемый фантомный объект для тестирования потенциальных возможностей ОСТ.



(а) (б) (в)

Рис.10. Двумерный ОСТ скан коллоидного раствора золотых плазмонно-резонансных нанооболочек (Au/SiO₂ 15/140 нм) для трех концентраций: (а)-2∙10¹⁰/мл,(б)1/2∙10¹⁰/мл,(в)1/16∙10¹⁰/мл при равномерном распределении наночастиц в объеме (коэффициент отражения закодирован в цвете-шкала справа).

Проведены исследования по визуализизации золотых наночастиц в микронном и субмикронном объеме с помощью конфокальных лазерных томографов, зондирующие излучение которых совпадает с плазмонным резонансом. Эксперименты на фантомах из агара и биотканях in vitro показали наличие существенного уровня оптического шума от оптических неоднородностей.

Для детектирования золотых наночастиц в биотканях in vivo были проведены тестовые измерения с помощью магнито-резонансного и рентгеновского томографа, которые показали возможность визуализации золотых наночастиц при концентрации 10⁹/мл, однако реально такое количество наночастиц в биотканях не накапливается. Для количественной оценки содержания золота в различных биотканях лабораторных крыс впервые использовался атомно-абсорбционный метод на основе спектрофотометра AAS-3 (Карл Цейс, Германия) с лампой типа ЛТ-6М с разрядом в полом катоде паров золота. Соизмеримая чувствительность по обнаружению золота (0,01 мкг/мл) в биотканях крысы была достигнута в работе [ Л14 ] при использовании индукционно-плазменной масс-спектрометрии (ICP-MS).

Обнаружено, что через сутки максимальная концентрация золотых наночастиц накапливается в печени и селезенке и практически не проникает в мозг.

^ Третья глава посвящена исследованию фототермической терапии с помощью известного фотосенсибилизатора - индоцианина зеленого (ICG-C₄₃H₄₇N₂O₆S₂Na), интенсивно поглощающего оптическое излучение в ближней инфракрасной области и сравнению с технологией резонансного лазерного нагрева с золотыми плазмонно-резонансными нанооболочками при управлении соответствующими концентрациями и уровнем лазерного воздействия.

Проведены детальные исследования пространственного нагрева раствора ICG от концентрации и уровня плотности лазерной мощности, как в непрерывном режиме (Рис.11), так и в импульсном (Рис.13).



(а) (б)



(в) (г)



(д) (е)

Рис.11.Термограммы резонансного лазерного нагрева раствора ИК фотосенсибилизатора типа Индоцианин зеленый (ICG) для различной его концентрации при воздействии излучения полупроводникового лазера (810нм) с мощностью 1 Вт в течении 3 мин (180 Дж): а-вода; б- ICG 1/128 мкМ/мл; в- ICG 1/64 мкМ/мл; г- ICG 1/32 мкМ/мл; д- ICG 1/16 мкМ/мл ; е- ICG 1/8 мкМ/мл .

Как показали исследования по резонансному лазерному нагреву раствора ICG выбором концентрации и уровня лазерной мощности возможно управление локальной температурой и ее пространственным распределением, причем как уровень температуры, так и ее пространственное распределение в объеме может быть соизмеримо с лазерным нагревом золотых плазмонно-резонансных наночастиц (Рис.1.). Проведенные эксперименты по ИК резонансному лазерному фототермолизу при введении ICG лабораторным крысам показали возможность осуществления управляемой локальной гипертермии.



(а) (б)



(в) (г)

Рис.12. Термограмма ИК лазерной гипертермии биотканей лабораторной крысы in vivo при внутрикожном (а), подкожном (б), внутримышечном (в) введении фотосенсибилизатора Индоцианина –зеленого (ICG 0,78 мг/мл) и контроль (г) при непрерывном облучении лазерным пучком (810 нм) мощностью 1 Вт в течении 1 мин.

Экспериментально проведено детальное сравнение резонансного ИК лазерного нагрева двух принципиально разных сред: коллоидного раствора золотых плазмонно-резонансных нанооболочек, представляющей модель дискретной поглощающей и рассеивающей объемной среды и ИК фотосенсибилизатора – Индоцианина зеленого (ICG)-модель поглощающей оптически однородной среды. В результате проведенных исследований было установлено, что выбором концентрации наночастиц и красителя в случае непрерывного резонансного лазерного облучения (810нм) можно получить соизмеримые результаты нагрева как фантомах, так и на лабораторных животных in vivo. Однако, в импульсном режиме облучения при одинаковой средней оптической мощности по сравнению с непрерывным режимом, для плазмонно-резонансных частиц наблюдается существенно меньший нагрев объемной среды по сравнению с фотосенсибилизаторами и это отличие возрастает с уменьшением длительности лазерных импульсов и увеличении скважности, что потенциально делает технологию лазерного импульсного фототермолиза, основанную на плазмонно резонансных частицах наиболее перспективной для локального термолиза патологических клеток (Рис.13).



(а) (б)



(в) (г)



(д) (ж)

Рис.13.Сравнительные термограммы ИК резонансного лазерного нагрева коллоидного раствора золотых плазмонно-резонансных наноболочек (Au/SiO₂ - 30/140 нм с массовым содержанием золота 37мкг/мл) (а,в,д) и ИК фотосенсибилизатора - Индоцианина зеленого (ICG) c концентрацией 78 мкг/мл) (б,г,ж) при воздействии на кювету типа Эппендорф излучения полупроводникового лазера(810 нм) со средней энергией 180 Дж .(а,б)-непрерывный режим; ((г,д)-длительность импульса 1 мс, скважность 2, (д,ж)- длительность 1 мс, скважность 4.

Предложен неинвазивный метод оценки функциональной гибели клеток апробированный для эритроцитов цельной крови человека при лазерном фототермолизе, основанный на анализе в реальном времени субклеточного комбинационного рассеяния, измеренного с помощью лазерного конфокального томографа. При воздействии пучка синего лазерного излучения (λ=473 нм), резонансного для молекул гемоглобина и сфокусированного до размера длины волны на поверхности эритроцита достаточно мощности не более 20 мВт и времени воздействия менее 10 секунд для локального фототермолиза с образованием карбонизации (локальная температура >180 ⁰С). Спектры КР одного эритроцита до (а) и после (б) соответствующего лазерного фототермолиза представлены на Рис. 14. (масштаб по оси абсцисс в волновых числах 10³ см^-1)



(а) (б)

Рис.14. Спектры КР одного эритроцита до (а) и после (б) соответствующего лазерного фототермолиза.

Предлагаемый метод позволяет исследовать спектры КР любых форменных образований крови, включая лейкоциты и тромбоциты при воздействии лазерного излучения и контролировать необратимый процесс гибели клеток.