Микробиологические методы очистки городских почв и сточных вод от углеводородов 03. 02. 08 Экология (биологические науки)

Вид материала

Автореферат диссертации

Содержание Общая характеристика работы Защищаемые положения Научная новизна работы. Практическая значимость работы Личный вклад автора. Апробация работы Структура и объем диссертации. Содержание работы В первой главе «Обзор литературы» Во второй главе «Объекты и методы исследования» Деструкция фенантрена в жидких средах. Почвенный лабораторный эксперимент Почвенный полевой эксперимент. Оценка безопасности почвы, очищенной с помощью микроорганизмов. Статистическая обработка полученных экспериментальных данных Результаты исследований и их обсуждение Определение степени деструкции фенантрена и бенз(а)пирена в лабораторных условиях. Деструкция фенантрена в жидких средах Интенсивность трансформации бенз(a)пирена в почве выделенными культурами. Почвенный лабораторный эксперимент Опытно-полевые испытания отобранных штаммов и их ассоциации при очистке почвы, загрязнённой бенз(a)пиреном, нефтепродуктами и тя Идентификация штаммов микроорганизмов, их морфологические признаки ... Полное содержание

Подобный материал:

• Физико-химические методы очистки сточных вод Малкова С. В., Машкова С. А., Шапкин, 45.75kb.
• Методы очистки сточных вод, 28.89kb.
• Контроль различных форм азота в процессе очистки сточных вод, 76.68kb.
• Физико-химические методы очистки сточных вод с применением коагулянтов1, 44.5kb.
• Технологическая схема очистки хозяйственно-бытовых сточных вод г. Кыштыма, 49.54kb.
• Технология очистки сточных вод промышленных предприятий и фильтратов полигонов тбо, 19.26kb.
• Реферат установка для очистки сточных вод, 11.06kb.
• Задачи : изучить технологическую схему и методы очистки сточных вод; на примере коммунального, 360.67kb.
• Единый тарифно-квалификационный справочник работ и профессий рабочих, 4712.85kb.
• Охрана производственных сточных вод и утилизация осадков, 327.09kb.

На правах рукописи




Олейникова Анна Александровна


МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОЧИСТКИ ГОРОДСКИХ ПОЧВ И СТОЧНЫХ ВОД ОТ УГЛЕВОДОРОДОВ


03.02.08 Экология (биологические науки)


Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук


Хабаровск - 2012

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет)»


Научный руководитель: доктор химических наук,

профессор

Гарабаджиу Александр Васильевич


Официальные оппоненты: Кондратьева Любовь Михайловна

доктор биологических наук, профессор,

Заслуженный деятель науки РФ,

Институт водных и экологических проблем

ДВО РАН, заведующая лабораторией

Шамолина Ирина Игоревна

доктор технических наук, профессор,

ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский

государственный университет технологии и

дизайна», профессор кафедры инженерной

химии и промышленной экологии


Ведущая организация: Институт комплексного анализа региональных

проблем ДВО РАН


Защита состоится 30 мая 2012 г., в 14:30 часов на заседании диссертационного совета Д 005.019.01 при Институте водных и экологических проблем ДВО РАН по адресу: 680000, г. Хабаровск, ул. Ким Ю Чена, 65.

Факс (4212) 32-57-55; E-mail: amur21@ivep.as.khb.ru


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института водных и

экологических проблем ДВО РАН


Автореферат разослан « 24 » апреля 2012 года


Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор биологических наук Н.А. Рябинин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ


Актуальность темы. Важнейшей экологической проблемой является химическое загрязнение окружающей природной среды, способствующее накоплению экотоксикантов. Широко распространенными такими загрязнителями – поллютантами являются углеводороды, среди которых наиболее опасным для биосферы являются полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) - высокомолекулярные органические соединения бензольного ряда. Угроза многих ПАУ для живых организмов и здоровья человека обусловлена их канцерогенными, тератогенными и мутагенными свойствами, а также их длительной устойчивостью к естественной биодеградации. В загрязненных экосистемах ПАУ входят в пищевые цепи и вызывают функциональные расстройства в биоте различного уровня организации. В связи с этим их концентрация в окружающей среде является объектом постоянного мониторинга и экологические исследования, связанных с ПАУ, вызывают большой и широкий интерес.

ПАУ образуются в высокотемпературных процессах деструкции различных органических веществ. В настоящее время антропогенное загрязнение окружающей среды этими веществами при сжигании топлива, коксовании угля, нефтепереработке, проливах каменноугольных продуктов, нефти и нефтепродуктов, техногенных авариях является основным и намного превышает природное образование ПАУ при лесных пожарах и извержениях вулканов. Накоплению и длительному сохранению ПАУ в окружающей среде способствуют их малая летучесть в воздухе и незначительная растворимость в воде. В городских почвах доля ПАУ в загрязнениях может достигать 55%.

В России индикатором загрязнения среды ПАУ является бенз(а)пирен (Б(а)П), который обладает сильной биологической активностью, в том числе канцерогенной, наряду с высокой устойчивостью к деградации в окружающей среде. В почвах зон различного хозяйственного пользования города Санкт-Петербурга содержание Б(а)П превышает предельно допустимую концентрацию (ПДК, 20 мкг/кг) в среднем по городу в 6 раз, причем максимальное накопление Б(а)П отмечается, наряду с промышленными и в жилых зонах. По сравнению с обычным физико-химическим контролем концентрации индикаторного ПАУ более эффективными могут быть биологические методы мониторинга или их сочетание, например, в экологически допустимых нормативах (ЭДН), (Абакумов В.А., Сущеня Л.М.. 1991; Левич А.П., 1994; Кондратьева Л.М., 2001). Уменьшение уровня ПДК и ЭДН ПАУ в городских почвах и водах является актуальной экологической проблемой.

Наиболее перспективными методами решения данной проблемы считаются методы детоксикации и очистки, предполагающие использование деятельности живых микроорганизмов. Наличие ПАУ в биосфере обусловило существование микроорганизмов и бактерий, способных к использованию ПАУ в качестве основного источника энергии для жизнедеятельности, к трансформации и деградации молекул ПАУ. В настоящее время штаммы таких бактерий интенсивно изучаются в связи с их способностью к конверсии ПАУ.

Вопросам разработки микробиологических методов мониторинга и очистки почв, донных осадков и вод, загрязненных ароматическими соединениями, посвящены работы: Абакумова В.А., Антонюк Л.П., Бабошина М. А., Боронина А. М., Гарабаджиу А. В., Головлевой Л. А., Ивахнюка Г. К., Карасевич Ю.Н., Кондратьевой Л.М., Левича А.П., Плешаковой Е.В., Плотниковой Е.Г., Ровинского Ф.Я., Турковской О. В., Фишер Н.К., Юровской Е.М., Янкевич М.И., Bogan B.W., Boonchan S., Cerniglia C.E., Chung W.K., Juhasz A.L., Kanaly R.A., Kaushish L.M., Zhang H. и других авторов. Пристальное внимание уделяется изоляции и исследованию штаммов, способных к деградации высокомолекулярных ПАУ, (молекула которых содержит более трех ароматических колец), как особо опасных и для которых количество известных штаммов и систематическое разнообразие бактерий еще недостаточно для промышленного применения. Задача поиска и применения новых штаммов-деструкторов высокомолекулярных ПАУ является по-прежнему актуальной. Также недостаточно известно о влиянии различных условий на конверсию ПАУ микроорганизмами и скорость бактериальной деградации ПАУ. Например, распространенной особенностью загрязнений городских почв является сопряженность загрязнений ПАУ с загрязнениями другими углеводородами, например, нефтепродуктами, а также тяжелыми металлами. Изучение биодеградации ПАУ в этих усложненных условиях также требует дальнейшего детального моделирования и анализа наблюдаемых процессов и результатов.

Таким образом, тема исследования, посвященного разработке микробиологических методов сохранения экологической безопасности городских почв и вод, загрязненных углеводородами, является актуальной.

Цель работы: разработать экологически безопасные микробиологические методы очистки почв и сточных вод, загрязненных полиароматическими соединениями, углеводородами и тяжелыми металлами, на основе селекции штаммов.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Выделение из длительно загрязняемой углеводородами и тяжелыми металлами городской почвы штаммов бактерий, обладающих способностью к деструкции ПАУ, селекция штаммов и идентификация.
   
2. Исследование экологической безопасности почвы, очищенной селекционными штаммами и их ассоциацией, для растений и гидробионтов.
   
3. Разработка биопрепарата и методики его применения для очистки почв и сточных вод, содержащих ПАУ и нефтепродукты.
   
4. Изучение санитарно-гигиенических и токсилогических свойств ассоциации штаммов, входящих в состав биопрепарата.
   
5. Опытно-полигонные и промышленные испытания биопрепарата по очистке загрязненных почв и сточных вод.
   

Защищаемые положения:

1. Городские почвы содержат штаммы бактерий Micrococcus sp. и Bacillus sphaericus способных к конверсии широкого спектра ПАУ в почвах и сточных водах в условиях комбинированного загрязнения углеводородами и тяжелыми металлами.
   
2. Штамм вида Bacillus sphaericus обладает способностью к разрушению бенз(а)пирена и росту на нафталине, фенантрене и антрацене как единственном источнике углерода и энергии.
   
3. Биологическая очистка с применением изолированных штаммов не влияет на интегральную токсичность почв для растений и водных вытяжек для гидробионтов.
   
4. Разработан безопасный биопрепарат и методики его применения для очистки почв и сточных вод, содержащих ПАУ и нефтепродукты.
   

Научная новизна работы.

- впервые обнаружена способность вида Bacillus sphaericus к разрушению бенз(а)пирена и росту на нафталине, фенантрене и антрацене как единственном источнике углерода и энергии;

- впервые показана способность бактерий родов Micrococcus и Bacillus разрушать антрацен, фенантрен и бенз(а)пирен в условиях комбинированного загрязнения среды углеводородами и тяжелыми металлами.

Практическая значимость работы:

- создание ассоциации штаммов – деструкторов ПАУ, устойчивых к высоким концентрациям нефтепродуктов и тяжелых металлов, позволило повысить эффективность очистки производственных сточных вод транспортных и промышленных предприятий с использованием фильтрующих кассет;

- на основе созданной ассоциации микроорганизмов разработан и апробирован биопрепарат «Микобас» для комплексной очистки сильно загрязненных почв и методика его использования.

Биопрепарат используется на предприятиях: ЗАО «Экопром», ООО «Экология Большого Города», ЗАО «СПБВЕРГАЗ» при биоремедиации загрязненных почв и очистке сточных вод

Личный вклад автора. Диссертационная работа является результатом исследований автора, выполненных согласно планам НИР Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета) и в рамках проекта подготовки кадров Комсомольского-на- Амуре государственного технического университета. Экспериментальные данные получены автором и при его непосредственном участии в лабораторных работах, включая отбор проб, подготовку специальных сред, проведение модельных экспериментов и опытно-полигонных испытаний, анализ и обобщение полученных результатов.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были представлены на Всероссийских и международных конференциях, в том числе, на 9-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология-наука ХХІ века» (Пущино, 2005); Международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005); Международной научно-практической конференции «Промышленные и бытовые отходы: проблемы хранения, захоронения, утилизации, контроля» (Пенза, 2007); Международной научно-практической конференции «XXXYIII неделя науки СПбГПУ» (Санкт-Петербург, 2009); IV Международной конференции молодых ученых «Биоразнообразие. Экология. Адаптация. Эволюция», посвященной 180-летию со дня рождения И.П. Сеченова (Одесса, 2009). По материалам конференций опубликованы тезисы докладов.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, в том числе две статьи в ведущих рецензируемых журналах из списка ВАК.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 154 страницах машинописного текста, включает 27 рисунков и 16 таблиц. Диссертация состоит из списка сокращений, введения, обзора литературы, экспериментальной части с описанием объектов и методов исследования, 5 глав с изложением полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, и библиографического списка, включающего 193 источника литературы.


СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ


Во «Введении» обоснована актуальность работы, сформулированы цель и задачи исследования, представлены сведения о защищаемых положениях, научной новизне и практической значимости результатов работы.

В первой главе «Обзор литературы» проводится анализ литературных источников по проблеме очистки почв и сточных вод от загрязнений углеводородами. Указаны приоритетные ПАУ, тяжелые металлы и нефтеуглеводороды, содержание которых контролируются государственными ведомствами по охране окружающей среды в США, Евросоюзе и России. Приведены основные химические и физические свойства ПАУ, характеристики их токсичности и канцерогенности, природные и техногенные источники эмиссии, пути распространения и поступления в биосферу, в том числе в почвы урбанизированных территорий, уровнях опасности различных ПАУ для животных и человека. Проанализированы особенности городских почв по уровню загрязнений и структуре бактериальных сообществ. Выполнен анализ данных по таксономии микроорганизмов-деструкторов ПАУ и механизмах биодеградации ПАУ. Отмечается отличительная особенность загрязнений городских почв, которая состоит в том, что загрязнения ПАУ в этих почвах обычно сопряжены с загрязнениями нефтепродуктами и тяжелыми металлами. Такой тип загрязнения можно назвать комбинированным загрязнением. Приведен обзор биопрепаратов и методов очистки загрязненных городских почв. Отмечается недостаточная эффективность этих биопрепаратов и методов при комбинированном загрязнении. Проанализированы вопросы экологической безопасности микробиологической очистки, биотестирования и фитотестирования почв и вод. Сделан вывод об обоснованности поставленной цели и задач исследования.

Во второй главе «Объекты и методы исследования» даны характеристики образцов почв, отобранные в экосистеме мегаполиса, и методы изоляции и идентификации штаммов бактерий, выделенных из данных образцов. Исследовались городские загрязненные почвы на территории мегаполиса (г. Санкт-Петербург).

Отбор проб производили по ГОСТ 17.4.4.02-84 из почв площадки под строительство в Московском районе рядом с Парком Победы и проезжей частью проспекта Московский, а также автозаправочной станции в Невском районе на проспекте Обуховской Обороны.

Выделение микроорганизмов - деструкторов ПАУ осуществляли методом накопительных культур: 2 г образца почвы помещали в 200 мл среды Раймонда с добавлением различных ПАУ (нафталин, фенантрен, антрацен), культивировали на качалке (16-18⁰С, 180-220 об/мин) в колбах Эрленмейера объемом 750 мл в течение 3 – 5 суток. Чистые культуры получали путем рассева накопительных культур, методом предельных разведений, на селективные агаризованные среды, содержащие в качестве единственного источника углерода и энергии нафталин или фенантрен или антрацен.

Деструкция фенантрена в жидких средах. В колбы Эрленмейера, содержащие по 100 мл дистиллированной воды вносили 0,2% минерального удобрения «Кемира Полевое», 100 мг/л фенантрена, 2 мл клеточной суспензии выделенной культуры, содержащую 7*10⁹ кл/мл. Параллельно ставили стерильный контроль. Инкубацию проводили при t = 16-18⁰С на качалке (180-220 об/мин). Остаточное содержание фенантрена проводили на «Флюорат – 02-3М» по методу Я.С. Каменцева.

Почвенный лабораторный эксперимент. Определяли способность культур к деструкции ПАУ в почве, загрязненной бенз(а)пиреном. Эксперимент проводился в течение 180 суток при комнатной температуре. Стерилизацию почвы проводили дробно, текучим паром, в автоклаве. Почву прогревали 3-5 раз по 10-15 минут, затем ставили в термостат и выдерживали при температуре 28-30⁰С в течение 8-12 часов. Такую процедуру повторяли в течение 3-5 суток. Определение концентрации бенз(а)пирена проводили методом ВЭЖХ с использованием «Флюорат-02» в качестве флуометрического детектора.


Почвенный полевой эксперимент. Полевой эксперимент проводили на территории действующей АЗС г. Санкт-Петербурга, р-н Невский, пр. Обуховской обороны, на почве, загрязненной бенз(а)пиреном, нефтепродуктами и тяжелыми металлами. Эксперимент проводился в изолированных лизиметрах, с закрытым дном, размером 20х20 см, высота насыпанного слоя почвы в лизиметрах составляла 30 см. Для предотвращения дополнительного загрязнения ПАУ и нефтепродуктами лизиметры укрывались защитной полиэтиленовой пленкой. Эксперимент состоял из следующих вариантов: контроля с добавкой минеральных удобрений и проведением агромероприятий - еженедельного рыхления почвы; контроля без использования удобрения и рыхления и 5-ти опытных вариантов, в которые вносились культуры, удобрения и проводились агромероприятия. Опытные варианты включали: использование 3-х монокультур и ассоциации из них в равном соотношении культур. Все варианты эксперимента увлажнялись до 60%. Продолжительность эксперимента - июнь, июль, август 2006 года, при среднесуточной температуре 15,3⁰ С.

Оценка безопасности почвы, очищенной с помощью микроорганизмов. Оценивали токсичность водных вытяжек из загрязненной бенз(а)пиреном, очищенной и чистой контрольной почвы в остром опыте на дафниях (Daphnia magna) [ФР.1.39.2007.03222 2007]. Оценивали фитотоксичность почвы на семенах ячменя и овса. Оценку проводили по всхожести семян, по росту корня и зеленой части стебля на чистой (контрольной), загрязненной бенз(а)пиреном и очищенной почве [МР 2.1.7.2297-07/2008].

Идентификация выделенных штаммов. Идентификацию выделенных штаммов микроорганизмов проводили методом 16S РНК. Была определена нуклеотидная последовательность (500 н.о.) гена 16S р-РНК. Поиск в GenBank осуществлялся с помощью программы MEGA 4.

Для определения морфологических признаков, использовали определитель бактерий Берджи (1997г.).

Оценка санитарно-гигиенических показателей выделенных штаммов.

Оценку проводили на теплокровных животных [ФР.1.39.2007.03222, ГОСТа 12.1.007, МУ № 2102-79, МУ № 1.1.578-96]. Острую токсичность оценивали введением биопрепарата в желудок крысы; кожно-раздражающее действие - нанесением биопрепарата на кожу крысы; кожно-резорбтивное действие - погружением 2/3 хвоста мыши в биопрепарат; раздражающее действие биопрепарата на слизистые оболочки глаз проводили на крысах; сенсибилизацию оценивали методом гиперчувствительности замедленного типа - вводили биопрепарат в хвост и подушечку задней лапки мыши.

Статистическая обработка полученных экспериментальных данных вычисления и построение графиков производилось в программе Exel, уровень значимости применяли α = 5%, число повторностей от 3 до 5.


РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ


Глава 3. Выделение и идентификация штаммов микроорганизмов, способных к конверсии широкого спектра ПАУ и углеводородов в городских почвах и сточных водах.

Накопительные культуры получали из образцов загрязненной почвы с последующим рассевом на агаризованные селективные среды, содержащие в качестве единственного источника углерода и энергии нафталин. На этом этапе было выделено 120 штаммов. Дальнейшую селекцию штаммов производили по скорости прироста диаметра колонии культуры на агаризованных средах с нафталином, фенантреном и антраценом.


Таблица 1. Рост культур на агаризованных ПАУ-содержащих средах

№ п/п	Куль- тура	Диаметр колоний, см
		Нафталин		Фенантрен		Антрацен
		25 мг/л	50 мг/л	25 мг/л	50 мг/л	25 мг/л	50 мг/л
1	1	1,0	0,3	0,3	0,3	0,3	0,3
2	1г	1,6	1,5	1,5	1,5	1,0	1,0
3	1а	1,6	1,5	1,3	1,3	0,6	0,3
4	1а-1	1,0	0,9	0,5	0,5	0,3	0,3
5	2	1,6	1,5	0,6	0,6	0,5	0,5
6	2а	1,0	1,0	0,8	0,8	0,3	0,3
7	2б	1,7	1,6	1,0	1,0	0,3	0,3
8	3	0,8	0,6	0,5	0,5	0,3	0,3
9	3г	1,5	1,5	1,1	1,1	0,5	0,5
10	3б	1,5	1,5	1,3	1,3	0,3	0,3
11	3а-1	2,0	2,0	2,0	1,5	1,5	1,5
12	4	1,0	1,0	0,5	0,5	0,3	0,3
13	4а	1,0	0,6	0,5	0,5	0,3	0,3
14	4б	0,5	0,5	0,5	0,5	0,3	0,3
15	4г	1,5	1,5	0,8	0,8	0,3	0,3
16	5	1,0	1,0	1,0	1,0	0,5	0,3
17	5-1	2,0	2,0	1,5	1,5	1,3	1,0
18	5-4	2,0	2,0	1,5	1,0	1,0	1,0
19	5-2	0,8	0,8	0,5	0,5	0,3	0,3
20	5-3	1,0	1,0	0,8	0,5	0,3	0,3

В результате были отобраны 20 штаммов наиболее эффективных деструкторов (табл. 1), среди которых наиболее эффективно растущими оказались 6 штаммов - 1г; 2б; 3б; 3а-1; 5-1 и 5-4, которые и были использованы в дальнейшей работе.

Определение степени деструкции фенантрена и бенз(а)пирена в лабораторных условиях. Деструкция фенантрена в жидких средах. Следующим критерием отбора эффективных штаммов-деструкторов ПАУ служила остаточное содержание фенантрена в жидких средах. В колбы Эрленмейэра, содержащие по 100 мл дистиллированной воды вносили 0,2% минерального удобрения «Кемира Полевое», (г/л): NO3  - 0,17; NH4  - 0,2; P2O5  - 0,154; K2O -0,34; S - 0,014;  Ca - 0,011;  B - 0,0018;  Zn - 0,00018; Cu - 0,0016;  Fe - 0,0032; Mn - 0,0032; Mo - 0,00016, фенантрен в концентрации 100 мг/л и клеточные суспензии. Начальная концентрация микроорганизмов в среде составляла 7х10⁹ КОЕ/мл. Параллельно ставили стерильный контроль. Инкубацию клеток проводили в течение 3-х и 7 суток при t = 16-18⁰С в динамических условиях на качалке. Остаточное содержание фенантрена в культуральной жидкости определяли на «Флюорат – 02-3М».

Две из исследованных культур (5-1 и 5-4) оказались способны к деструкции фенантрена на 40,8 % и 39 %, соответственно, третья культура (3а-1) – на 35,2 %, четвертая (1г) на 30 %, пятая (2б) – на 27% деструкции, и шестая (3б), показала самый минимальный уровень деструкции – 5 %. Результаты 7 - суточного культивирования показали, что наиболее высокую степень деструкции имеют 3 культуры: 5-4; 5-1; 3а-1 от 89,7 % до 96,4 % (табл.2).


Таблица 2. Остаточное содержание фенантрена при деструкции в жидких средах

№	Вариант опыта	Концентрация фенантрена
		3-х суточный эксперимент		7-ми суточный эксперимент
		мг/л	Степень деструкции, %	мг/л	Степень деструкции, %
1	контроль	98,50	0	92,80	0
2	3а-1	65,80	35,20	3,38	96,40
3	5-1	58,27	40,80	6,30	93,20
4	5-4	60,40	39	9,56	89,70
5	1г	68,95	30	12,40	86,60
6	2б	71,78	27,13	35,17	62,10
7	3б	93,4	5	67,20	27, 60

Интенсивность трансформации бенз(a)пирена в почве выделенными культурами. Почвенный лабораторный эксперимент. Определяли способность культур и составленной из них искусственной ассоциации к деструкции бенз(а)пирена. Эксперимент проводился в течение 180 суток с культурами 3а-1, 5-1, 5-4 с начальным содержанием бенз(а)пирена в загрязненной - 2,2 мг/кг = 110 ПДК. В эксперименте использовали стерильную почву, чтобы избежать влияния местной микрофлоры и быть уверенными в работе интродуцированных микроорганизмов.


Таблица 3. Деструкция бенз(а)пирена в почве в лабораторных условиях в течение 180 суток

№	Концентрация бенз(а)пирена, мг/кг			Деструкция, % (по сравнению с контролем)
	Вариант опыта	Исходное содержание	Остаточное содержание
1	контроль	2,20	2,20	0
2	5-4	2,20	0,38	82,7
3	5-1	2,20	0,47	78,6
4	3а-1	2,20	0,32	85,5
5	Ассоциация из 3х культур	2,20	0,35	85,5

Остаточное содержание бенз(а)пирена в опытах составляло от 0,32 до 0,47мг/кг. Самими эффективными оказались варианты опыта с культурой 3а-1 и ассоциацией (табл.3). В обоих случаях степень деструкции составляла 85,5 % за все время эксперимента

Опытно-полевые испытания отобранных штаммов и их ассоциации при очистке почвы, загрязнённой бенз(a)пиреном, нефтепродуктами и тяжелыми металлами. Заключительным этапом селекции выделенных микроорганизмов являлся полевой эксперимент, который проводился на территории действующей АЗС города Санкт-Петербурга на почве, загрязненной бенз(а)пиреном: 492 мкг/кг = 24.6 ПДК, нефтепродуктами - 705 мг/кг = 300мг/кг и тяжелыми металлами Pb⁺² - до 91 мг/кг = 32 мг/кг ПДК; Cu⁺² - до 65,0 мг/кг = 3 мг/кг ПДК; Ni⁺² - до 9,0 мг/кг = 4 мг/кг ПДК; Cr⁺³ - до 11 мг/кг = 6 мг/кг ПДК; Zn⁺² - до 72 мг/кг = 23 мг/кг ПДК.


Таблица 4. Оценка эффективности микробиологической деструкции бенз(a)пирена и нефтеуглеводородов в почве городской АЗС за 90 суток

№ п/п	Вариант опыта (культура)	Бенз(а)пирен, мг/кг	Степень деструкции, %	Нефте-углеводо-роды, мг/кг	Степень деструк-ции, %
1	Исходное содержание	0,492	0	705	0
2	Контроль №1 (без удобрений и агромероприятий) – К1	0,485	1,40	640	9,22
3	Контроль №2 (с агромероприятиями и удобрениями) - К2	0,478	1,45	220	68,79
4	Культура 3а-1 (с агромер. и удобр.), относительно К1 / относительно К2	0,360	25,8 / 24,7	150	76,6 / 31,8
5	Культура 5-1 (с агромер. и удобр.), отн.К1/отн. К2	0,344	29,1 / 28,0	160	75,0 / 27,3
6	Культура 5-4 (с агромер. и удобр.), отн. К1/отн. К2	0,348	28,3 / 27,2	150	76,6 / 31,8
7	Ассоциация культур (3а-1, 5-1, 5-4) (с агромер. и удобр.), отн. К1/отн. К2	0,268	44,7 / 43,9	160	75,0 / 27,3

Результаты эксперимента показали, что использование при очистке данных культур позволяет снизить содержание бенз(а)пирена во всех опытных вариантах на 25-44,8% (табл. 4). В то время, как в контрольных вариантах содержание бенз(а)пирена оставалось практически неизменным. Уменьшение нефтепродуктов в контроле с агромероприятиями связано с работой аборигенной нефтеокисляющей микрофлорой, которая присутствует в почвах, загрязненных нефтяными углеводородами. Однако, внесение микроорганизмов способствует одновременному уменьшению концентрации и бенз(а)пирена и нефтяных углеводородов. Таким образом, использование данных культур является перспективным для деструкции полиароматических углеводородов, а также способствует деградации нефтяных углеводородов. Самая высокая степень деструкции бен(а)пирена – до 44% достигалась в варианте №6 с использованием ассоциации из 3-х культур.

Идентификация штаммов микроорганизмов, их морфологические признаки. Для определения видовой и родовой принадлежности была определена нуклеотидная последовательность (500 н.о.) гена методом 16S р-РНК выделенных штаммов-деструкторов 5-1, 5-4, 3а-1. Поиск в GenBank с помощью программы MEGA показал 99/98% сходство нуклеотидной последовательности 16S РНК штамма 3а-1 с представителями рода Micrococcus sp., 97/98% сходство нуклеотидной последовательности 16S РНК штамма 5-1 и 5-4 с представителями рода Bacillus. Штаммы 5-1 и 5-4 объединяется в единый кластер с типовыми штаммами вида В. sphaericus. Штаммы Micrococcus sp. и В. sphaericus являются бактериальными, грамположительными.  Штамм 5-1 рода Bacillus, вида В. sphaericus на агаризованных средах СПА через 24 ч роста образует выпуклые блестящие колонии с ровными краями размером 3…4 мм. При микрокопировании наблюдали клетки молодых колоний (8 часов), представленные одиночными неправильными палочками, длинной 4-6 мкм, в плотном чехле, с зернистой поверхностью. Через 24 часа наблюдали правильные палочки, полярные клетки, возможно наличие нитевидных структур (жгутики) по поверхности клетки. Старые культуры (4 суток) содержат неправильные палочки, располагающиеся одиночно. Бактерии не спорообразующие, аэробные. Штамм 5-4 рода Bacillus, вида В. sphaericus на агаризованных средах - СПА через 24 ч роста образуют выпуклые блестящие колонии с ровными краями размером 5-6 мкм. При микроскопировании наблюдали клетки молодых колоний (8 часов), представленные одиночными неправильными палочками, длинной 4-5 мкм, в плотном чехле. Через 24 часа наблюдали правильные палочки, полярные клетки. Старые культуры (4 суток) содержат неправильные палочки, располагающиеся одиночно. Бактерии не спорообразующие, аэробные. Штамм 3а-1 рода Micrococcus sp. на плотных питательных средах - СПА через 24 ч роста образуют круглые, гладкие непрозрачные матовые колонии желтого цвета, с ровным круглым краем. При микрокопировании в молодых колониях (8 часов) клетки представлены кокками по четыре в слизистом чехле. Через 24 часа кокки выходят из чехла по четыре и по две штуки диаметром 0,5-0,8 мкм. Старые культуры (4 суток) содержат кокковидные формы диаметром 0,6-1,0 мкм, располагающиеся одиночно, парами и в скоплениях неправильной формы. Бактерии спорообразующие, аэробные.

Глава 4. Токсичность загрязненных углеводородами городских почв и очищенных с помощью консорциума штаммов Micrococcus sp. и В. sphaericus. Определение токсичности водных вытяжек из почв по смертности гидробионта. Для биотестирования использовали почву полигона у городской АЗС. Проводили тестирование токсичности водных вытяжек из исходной загрязненной Б(а)П, нефтеуглеводородами и тяжелыми металлами почвы; из почвы, очищенной с помощью ассоциации штаммов Micrococcus sp. и B. sphaericus; и из чистой, контрольной почвы, лесопарковой зоны «Сосновка» пригорода Санкт-Петербурга. В качестве тест-объекта использовали микроорганизм Daphnia magna. Критерием острой токсичности служила гибель 50% и более дафний за 48 ч в исследуемой суспензии, при условии, что в контроле гибель не превышала 10% (ЛКР 50-48)




Рис. 1. Выживаемость дафний в водных вытяжках очищенной и загрязненной почвы в зависимости от разбавления


Из приведенных на графике данных видно, что водная вытяжка из почвы, длительно загрязняемой Б(а)П, нефтеуглеводородами и тяжелыми металлами оказывает острое токсическое действие; водная вытяжка из почвы, очищенной за 90 сут. с помощью консорциума штаммов Micrococcus sp., B. Sphaericus, не оказывает острого токсического действия.

Определение безопасности почв по фитотоксичности на семенах высших растений. В качестве модельных тест-растений использовали семена овса и ячменя. Фитотоксичность почвы оценивали по биологическому действию её водного экстракта. Результаты тестирования представлены на рис. 2.





Рис. 2. Фитотест почв на всхожесть семян овса и ячменя


Из рис. 2 видно, что в загрязненной почве всхожесть семян овса и ячменя падает более чем на 27 и 22%, соответственно, по сравнению с чистой почвой. Это доказывает фитотоксичность загрязненной почвы. Через 90 сут. очистки ассоциацией штаммов Micrococcus sp., B. Sphaericus эффект торможения по показателю всхожести семян овса и ячменя не наблюдается.

На рис. 3 представлены данные по длине корней прорастающих семян овса и ячменя, из которых видно, что для загрязненной почвы эффект торможения на пятые сутки для овса достигает 34,8%, ячменя - 41,4 %. Это доказывает фитотоксичное действие загрязненной почвы. В то же время очищенная с помощью ассоциации штаммов Micrococcus sp. и B. sphaericus, почва практически не оказывает фитотоксичного действия по показателю роста корней овса и ячменя.




Рис. 3. Средняя длина корней проростков овса и ячменя в экстрактах почв


Результаты микровегетационного эксперимента (10-суточная вегетация посаженных в почвы семян, предварительно пророщенных на экстракте из чистой почвы), представлены на рис. 4.





Рис. 4. Средняя длина стебля овса и ячменя на разных почвах

Из рис. 4 следует, что на загрязненной почве наблюдается значительное угнетение роста стебля (уменьшении среднеарифметической длины относительно контрольной), более чем на 29 % для овса и 28% для ячменя. На очищенной почве ингибирование длины стебля овса и ячменя снизилось соответственно до 9% и 7%.

Таким образом, длительно загрязняемая Б(а)П, нефтеуглеводородами и тяжелыми металлами почва является токсичной для модельных тест-растений (овес, ячмень). Через 90 сут. очистки с помощью консорциума штаммов Micrococcus sp., B. Sphaericus почва по всем изученным показателям была нетоксичной для данных тест-растений.

Глава 5. Санитарно-гигиеническая безопасность консорциума штаммов Micrococcus sp. и В. sphaericus в составе биопрепарата и его опытно-промышленные испытания. Согласно вышеизложенным результатам исследуемый консорциум штаммов Micrococcus sp. (3а-1), Bacillus sphaeric (5-1, 5-4) может быть положен в основу биопрепарата для биоремедиации почв и очистки других сред, загрязненных ПАУ и нефтеуглеводородами. Такой биопрепарат был создан и получил рабочее название «Микобас». Согласно нормативным документам производство, применение и хранение нового биопрепарата сопряжено с доказательством его безопасности по действующим санитарно-гигиеническим нормам. Испытаниям подвергалась наработанная опытная партия биопрепарата "Микобас», клеточный титр клеток консорциума штаммов составил в среднем 6*10⁸ КОЕ/мл. Полученные результаты лабораторных исследований представлены в табл. 5.

Состояние животных в подопытных группах сравнивалось с состоянием соответствующих животных в контрольной группе. Из табл.5 следует, что по параметрам острой токсичности биопрепарат «Микобас» следует отнести к веществам IY класса опасности – малоопасные по ГОСТ 12.1.007; при однократном и повторном нанесении не оказывает раздражающего действия на кожу и слизистые оболочки глаз – биопрепарат относится к 0 классу по МУ № 2102-79; летучие компоненты не вызывают раздражения слизистых оболочек глаз и верхних дыхательных путей, кожно-резорбтивного и сенсибилизирующего действия не выявлено – биопрепарат не аллергоопасен по МУ № 1.1.578-96; биопрепарат «Микобас» удовлетворяет требованиям, предъявляемым к промышленным препаратам.


Таблица 5. Санитарно-гигиенические показатели биопрепарата «Микобас»

№ п/п	Определяемые показатели	Результаты исследований	Нормативы
1	Острая токсичность Токсичность летучих компонентов	При введении максимальной дозы все животные живы, DL50 > 5000,0 мг/кг Летучие компоненты не вызывают раздражения слизистых оболочек глаз и верхних дыхательных путей	ГОСТ 12.1.007
2	Кожно-резорбтивное действие	Не выявлено	Отсутствует
3	Раздражающее действие: на кожу: однократное повторное на слизистые оболочки глаз	0 баллов 0 баллов Не раздражает	МУ № 2102-79
4	Сенсибилизация (индекс ГЗТ-мыши)	Не выявлена	МУ № 1.1.578-96
5	Класс опасности	IY	ГОСТ 12.1.007

Опытно-промышленные испытания биопрепарата «МИКОБАС» при очистке сточных вод

Результаты исследований, изложенных в главе 3 по сути являются опытно-промышленной апробацией препарата «Микобас» для очистки городских почв от углеводородов. Испытания этого биопрепарата по очистке сточных вод от углеводородов на предприятии ЗАО «СПБВЕРГАЗ» (г. Санкт-Петербург) проводились в течение 3 квартала 2010 г. и 3 квартала 2011 г. В экспериментах испытывали наработанную опытную партию жидкой формы биопрепарата "Микобас» (суспензия клеток плотностью 6,0×10⁷ КОЕ/мл в жидкой среде культивирования). Разработанный способ внесения препарата в поток загрязненной воды заключался в помещении в сточный колодец заряженной кассеты фильтров из волокнисто-пористого полиэтилена с угольным сорбентом, которые за сутки до использования пропитывались «Микобасом» - в среднем 3,0×10⁷ КОЕ/см². Результаты нашего мониторинга и замеры Горводоканала за 2011 г. приведены в табл. 6.

Полученные результаты испытаний являются опытно-промышленной апробацией разработанного биопрепарата «Микобакс» для микробиологической очистки загрязненных сточных вод от углеводородов.

Таблица 6. Данные химико-аналитических исследований сточной воды

Ингредиенты	ПДК, мг/л	Выпуск в горколлектор (до установки кассет) 07.08. 2011г.	Выпуск в горколлектор (после установки фильтров) 16.08.2011г.
		Концентрация, мг/л	Концентрация, мг/л	Эффективность очистки, %
Водородный показатель, рН	6-9	7,5	7,2	норма
Железо общее	1,1	3,8	1,7	55,2
Медь	0,04	0,55	0,038	93,9
Марганец	0,1	1,4	0,81	42,1
Цинк	0,1	0,14	0,08	20,0
Нефтепродукты	0,7	3,3	0,4	87,9
Алюминий	0,5	0,37	0,26	29,7

1. Принципиальные схемы микробиологической очистки почв и сточных вод от углеводородных загрязнений
   

Апробация биопрепарата «Микобас» при очистке почв и сточных вод загрязненных ПАУ, нефтеуглеводородами и тяжелыми металлами позволяет разработать принципиальные схемы очистки загрязненных городских почв и сточных вод. Согласно схеме очистки почв должны быть выполнены следующие этапы: химико-аналитический анализ почвы на определение уровня превышения ПДК углеводородов; определение объема рабочей суспензии биопрепарата по степени превышения ПДК и площади (объема) очистки; определение веса биогенных солей, обеспечивающих жизнедеятельность микроорганизмов препарата в почве; внесение биопрепарата и солей в почву; периодическое рыхление и полив почвы водой для поддержки достаточных условий аэрации и уровня рН; периодический контроль концентрации загрязнений в очищаемой почве; периодический контроль жизнеспособности микроорганизмов препарата в загрязненной почве – численности бактерий в единице объема почвы; ландшафтный дизайн очищенного участка почвы.

Очистка сточных вод включает в себя следующие этапы: химико-аналитический анализ воды на определение уровня превышения ПДК углеводородов; определение объема рабочей суспензии биопрепарата по степени превышения ПДК и объема очистки; определение веса биогенных солей, обеспечивающих жизнедеятельность микроорганизмов препарата; иммобилизация клеток бактерий биопрепарата на волокнисто-пористом фильтре; внесение биогенных солей в угольный наполнитель кассеты фильтров; установка и закрепление заряженного фильтра в колодце сточной канализации; периодический контроль концентрации загрязнений в очищаемой воде; периодический контроль жизнеспособности микроорганизмов биопрепарата на фильтре – численности бактерий на единицу площади; периодическая смена фильтров по данным контроля.


ВЫВОДЫ

1. Изолированы и идентифицированы штамм бактерий Micrococcus sp. и два штамма Bacillus sphaericus способных к конверсии широкого спектра ПАУ в почвах и сточных водах в условиях комбинированного загрязнения углеводородами и тяжелыми металлами.
   
2. Установлена способность штамма вида Bacillus sphaericus к разрушению бенз(а)пирена и росту на нафталине, фенантрене и антрацене как единственном источнике углерода и энергии.
   
3. Изучено влияние биологической очистки с применением изолированных штаммов на интегральную токсичность почв для растений и водных вытяжек для гидробионтов.
   
4. Разработан биопрепарат и методики его применения для очистки почв и сточных вод, содержащих ПАУ и нефтепродукты. Изучены токсилогические свойства ассоциации штаммов, входящих в состав биопрепарата.
   

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:


Статьи, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах

1. Олейникова А.А., Суржко Л.Ф., Гарабаджиу А.В. Биотехнологические методы очистки почв от ПАУ // Вестник ДВО РАН, 2008, №1, с. 85-90.

2. Олейникова А.А, Суржко Л.Ф., Гарабаджиу А.В. Биопрепарат «МИКОБАС» для очистки почв от полиароматических углеводородов // Известия ВУЗов. Технология легкой промышленности, 2008, №2, с. 51-55.


Статьи, опубликованные в отечественных периодических изданиях и региональных сборниках


3. Олейникова А.А. Обнаружение и отбор штаммов-деструкторов ПАУ из загрязненных почв городской территории // Вестник ГОУВПО «КнАГТУ», 2005, вып.5, ч.2, с. 97-99.


Работы, опубликованные в материалах международных и региональных конференций


4. Олейникова А.А., Янкевич М.И., Гарабаджиу А.В. Очистка территорий, загрязненных полиароматическими соединениями // Биология - наука ХIХ века. Тезисы докл. 9-й международной школы-конференции молодых ученых 18-22 апреля 2005г. - Пущино, 2005. С.292.

5. Олейникова А.А., Янкевич М.И., Суржко Л.Ф., Гарабаджиу А.В. Биоремедиация городских территорий, загрязненных ПАУ // Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды: Материалы международной конференции. - Саратов, 2005. С.83-84.

6. Гарабаджиу А.В., Козлов Г.В., Олейникова А.А., Якшилов Д.С. Экологические аспекты использования микроорганизмов для очистки почв от загрязнений // Промышленные и бытовые отходы: проблемы хранения, захоронения, утилизации, контроля. Сб. статей ХІ Международной научно-практической конференции. - Пенза, 2007г.- С. 12-13.

7. Ивахнюк Г.К., Гарабаджиу А.В., Якшилов Д.С., Олейникова А. А. Особенности биотестирования фитотоксичности некоторых органических супертоксикантов // Промышленные и бытовые отходы: проблемы хранения, захоронения, утилизации, контроля. Сб. статей ХІ Международной научно-практической конференции - Пенза, 2007г.- С. 23-24.

8. Олейникова А.А, Суржко Л.Ф., Гарабаджиу А.В. Микроорганизмы для биоремедиации почв, загрязненных ПАУ // Материалы пятого съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. – Москва, 2008. – С.148-149.

9. A.A. Oleinikova, L.F. Syrgko, A.V. Garabadgiu. Bioremediation soil, polluted PAHs // Proceedings of the IV International Yong scientists conference «Biodiversity/ Ecology. Adaptation. Evolition». Odesa, September 16-19. 2009 .-Odesa: Pechatniy dom, 2009. - p. 106.

10. Олейникова А.А, Гарабаджиу А.В., Суржко Л.Ф. Очистка почв от полиароматических углеводородов микроорганизмами // XXXVIII неделя науки СПбГПУ: Материалы международной научно-практической конференции. - Санкт-Петербург, 2009. - С. 138-139.


Подписана к печати 23.04.2012.

Формат 60х84/16. Бумага писчая. Ризограф RIZO ЕZ 570E

Усл. печ. л.1,4 Уч.-изд.л. 1,35. Тираж 100. Заказ 24818


Полиграфическая лаборатория Федерального государственного

бюджетного образовательного учреждения

высшего профессионального образования

«Комсомольский-на-Амуре государственный технический университет

6810113, Комсомольск-на-Амуре, Ленина, 27