Роль нарушения обмена жирных кислот в развитии дислипопротеинемий

Вид материала

Автореферат

Содержание Официальные оппоненты Ведущее учреждение 1. Общая характеристика работы 2. Материалы и методы исследования Биохимические методы исследования Статистическая обработка результатов 3. Результаты исследований Нарушение удаления ТГ-богатых частиц из плазмы крови Роль повышения уровня НЭЖК в развитии гипертриглицеридемии Список работ, опубликованных по теме диссертации

Подобный материал:

• План лекций по биологической химии для студентов стоматологического факультета на весенний, 22.38kb.
• Распределение глюкозы, жирных кислот и холестерина в организме человека. Этиология, 138.29kb.
• Существует ряд требований к павам, 171.81kb.
• «Клиническая лабораторная диагностика», 20.43kb.
• План лекций по биологической химии для студентов 2 курса ст на 3-й семестр 2011-2012, 14.16kb.
• План лекций стоматологического факультета на осенний семестр 2011-2012 учебного года, 24.58kb.
• Нарушения липидного обмена выявляются у людей с самыми различными заболеваниями. Эти, 238.5kb.
• Тема лекций Лектор 1 Введение в патологию. Предмет и методы патологии. Болезнь и здоровье., 78.3kb.
• План лекций фармацевтического факультета на осенний семестр 2011-2012 учебного года, 20.82kb.
• Липиды. Пероксидное окисления липидов цель, 139.7kb.

На правах рукописи

АГЕЕВА ЕЛЕНА ВИКТОРОВНА

РОЛЬ НАРУШЕНИЯ ОБМЕНА ЖИРНЫХ КИСЛОТ В РАЗВИТИИ ДИСЛИПОПРОТЕИНЕМИЙ

Специальность 03.00.04 – Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени

кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург

2009

Работа выполнена в отделе биохимии Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Денисенко Александр Дорофеевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Галебская Людвига Вячеславовна

доктор медицинских наук, профессор Дорофейков Владимир Владимирович

Ведущее учреждение:

Санкт-Петербургская государственная

медицинская академия им. И.И. Мечникова

Защита диссертации состоится «……»…………………. 2009 г. в «……» часов на заседании Диссертационного совета Д 001.022.03 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук при Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, Каменноостровский пр., д.69/71.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Научно-исследовательского института экспериментальной медицины СЗО РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д.12.

Автореферат разослан «……»………………2009 г.

Учёный секретарь

Диссертационного совета Д 001.022.03

доктор биологических наук, профессор Пучкова Л.В.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Сердечно-сосудистые заболевания справедливо называют эпидемией 20 века, которая, к сожалению, продолжается и в 21 веке. В течение многих десятилетий они являются ведущей причиной смертности населения в индустриально развитых странах, в том числе и в России [Оганов Р.Г., 2003].

В Государственном докладе о состоянии здоровья Российской Федерации в 2004 (доклад опубликован в 2006г) содержатся данные о том, что показатели смертности от сердечно-сосудистых заболеваний в России в 2-4 раза выше, чем в западноевропейских странах и пока наблюдается тенденция к росту смертности. За 2004 год население России уменьшилось на 0,7 млн. человек, из них от сердечно-сосудистых заболеваний умерло 47,6% .

К группе сердечно-сосудистых заболеваний относят ишемическую болезнь сердца (ИБС), инсульт, поражения периферических артерий и ряд других заболеваний. В структуре смертности от сердечно-сосудистых заболеваний около 85-90% приходится на долю инсульта и ИБС [Оганов Р.Г., 2003]. Ведущая роль в патогенезе этих заболеваний принадлежит атеросклерозу.

Изучение механизмов патогенеза атеросклероза по-прежнему остаётся актуальной проблемой современной медицинской науки.

Многочисленные экспериментальные, клинические и эпидемиологические данные убедительно свидетельствуют о ключевой роли дислипопротеинемий (ДЛП) в патогенезе атеросклероза и его клинических проявлений [Климов А.Н., 1980, Мамедов М.Н., 2006, Pejic R.N., Lee D.T., 2006].

Несмотря на то, что причина возникновения некоторых ДЛП хорошо изучена, тем не менее механизмы возникновения большинства ДЛП, в частности гипертриглицеридемий, а именно – несемейных форм комбинированной дислипопротеинемии (к-ДЛП) и изолированной гипертриглицеридемии (и-ГТГ), до настоящего времени не выяснены.

Предполагается, что одной из главных причин развития вышеперечисленных гипертриглицеридемий является нарушение в системе образования и транспорта неэстерифицированных жирных кислот (НЭЖК) в плазме крови.

Важную роль в регуляции метаболизма жирных кислот играют липопротеинлипаза (ЛПЛ) и гормон-чувствительная липаза (ГЧЛ), увеличение активности которых приводит к повышению концентрации жирных кислот в плазме крови. Однако механизм связи между активностью липопротеидлипазы и уровнем триглицеридов вплоть до настоящего времени недостаточно изучен.

Более двадцати лет назад в плазме крови был обнаружен белок, увеличивающий поступление жирных кислот в жировые и мышечные клетки за счет стимуляции внутриклеточного синтеза триглицеридов [Teng B. et al., 1983, Cianflone K. et al., 1989]. Данный белок получил название – стимулирующий ацилирование белок (САБ). Несмотря на то, что белок был открыт более двадцати лет назад, его функции до настоящего времени недостаточно изучены. Предполагается, что от концентрации этого белка зависит содержание в крови жирных кислот. Однако данные литературы относительно роли САБ организме весьма противоречивы.

Кроме того, известно, что важную роль в регуляции образования и транспорта НЭЖК играет инсулин [Ong J.M. et al., 1988] При инсулинорезистентности происходит увеличение концентрации НЭЖК в плазме крови, что в свою очередь приводит к развитию гипертриглицеридемии [Lewis G.F. et al., 1995].

Исходя из вышеизложенного, к настоящему времени известны несколько возможных причин возникновения недостаточно изученных вариантов гипертриглицеридемий. Вместе с тем, нужно отметить отсутствие объективного способа оценки работы всей системы образования и транспорта НЭЖК в плазме крови в целом. Это позволило бы определить роль не только ЛПЛ, но и проанализировать суммарный эффект всех факторов, участвующих в регуляции синтеза триглицеридов и их элиминации из плазмы крови.

Таким образом, изучение взаимосвязи вышеперечисленных факторов, влияющих на показатели липидного обмена, и поиск механизмов возникновения вышеперечисленных форм гипертриглицеридемий представляется весьма важным и актуальным.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлось изучение роли нарушения обмена жирных кислот в возникновении и-ГТГ и к-ДЛП и выяснение механизмов их развития. В связи с этим перед нами стояли следующие практические задачи:

1. Провести сравнительную оценку нарушения системы липолиза у больных с и-ГТГ и к-ДЛП.
   
2. Изучить взаимосвязь активности липопротеинлипазы с уровнем жирных кислот в плазме крови у обследованных пациентов. Разработать способ оценки эффективности действия липолитической системы в целом.
   
3. Провести сравнительную оценку связи САБ с уровнем триглицеридов (ТГ) у пациентов с и-ГТГ и к-ДЛП натощак и при жировой нагрузке. Изучить влияние этого белка на внутриклеточный синтез триглицеридов в мышиных и человеческих фибробластах.
   
4. Оценить взаимосвязь всех факторов, участвующих в регуляции синтеза триглицеридов и их элиминации из плазмы крови у пациентов с изучаемыми формами ДЛП.
   

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Активность липопротеинлипазы не отражает в полной мере эффективность липолитического действия фермента в плазме крови у пациентов с изучаемыми формами гипертриглицеридемий. Для оценки эффективности липолиза необходимо использовать коэффициент, показывающий количественное взаимоотношение между активностью ЛПЛ и гидролизованными ТГ (величина отношения количества гидролизованных частиц ТГ под действием фермента к активности липопротеинлипазы).
   
2. Важную роль в развитии гипертриглицеридемий у больных с и-ГТГ и к-ДЛП играет нарушение липолиза ТГ в плазме. Причем у лиц с и-ГТГ ведущее значение имеет дефицит ЛПЛ – несмотря на высокую эффективность функционирования фермента, его дефицит не позволяет обеспечивать адекватный гидролиз ТГ. У пациентов с к-ДЛП активность ЛПЛ остается в пределах нормы, однако, эффективность липолиза у этих пациентов ниже, чем при и-ГТГ, по-видимому, вследствие обогащения липопротеинов очень низкой плотности (ЛОНП) холестерином.
   
3. Концентрация САБ не связана с концентрацией ТГ в плазме крови у пациентов с изучаемыми формами гипертриглицеридемий. Данный белок является слабым активатором синтеза триглицеридов в мышиных и человеческих фибробластах.
   
4. Отношение концентрации неэстерифицированных жирных кислот к уровню триглицеридов снижено у больных с гипертриглицеридемиями по сравнению с лицами с нормолипидемией, что указывает на нарушение баланса процессов липолиза триглицеридов и эстерификации жирных кислот у больных с и-ГТГ и к-ДЛП.
   
5. Повышение уровня ТГ в крови у больных с изучаемыми формами ДЛП отражает развитие метаболического синдрома и связано с увеличением массы тела, инсулиновой резистентностью, увеличением концентрации в крови НЭЖК.
   

Научная новизна работы. Впервые показано, что в основе развития гипертриглицеридемии при некоторых формах изолированной гипертриглицеридемии и комбинированной дислипопротеинемии лежат сходные биохимические механизмы, которые связаны с развитием метаболического синдрома.

Впервые предложено использовать величину отношения количества гидролизованных триглицеридов к активности липопротеинлипазы в качестве показателя эффективности действия данного фермента. Впервые установлено, что важную роль в развитии гипертриглицеридемий у больных с и-ГТГ и к-ДЛП играет нарушение липолиза ТГ в плазме. Причем у лиц с и-ГТГ ведущее значение имеет дефицит ЛПЛ – несмотря на высокую эффективность функционирования фермента, его дефицит не позволяет обеспечивать адекватного гидролиза ТГ. У пациентов с к-ДЛП активность ЛПЛ в пределах нормы, однако эффективность липолиза у этих лиц ниже, чем при и-ГТГ, по-видимому, вследствие обогащения ЛОНП холестерином.

Предложен показатель нарушения баланса процессов липолиза – эстерификации: отношение уровня неэстерифицированных жирных кислот к концентрации триглицеридов (НЭЖК/ТГ). Этот показатель достоверно снижен у больных с изучаемыми формами гипертриглицеридемий по сравнению с нормолипидемией. В то же время отсутствует различие этого отношения между группами с и-ГТГ и к-ДЛП.

Показано, что концентрация САБ не влияет на степень повышения ТГ в плазме крови при жировой нагрузке. Однако в экспериментах на мышиных и человеческих фибробластах выявлено, что САБ вызывает слабую стимуляцию синтеза ТГ.

Теоретическое и практическое значение работы. Результаты настоящего исследования расширяют представления о механизмах развития некоторых форм дислипопротеинемий, таких как несемейные формы комбинированной дислипопротеинемии и изолированной гипертриглицеридемии. Установлено, что важную роль при этом играет комплекс обменных нарушений, связанных с метаболическим синдромом, что является важным для понимания роли каждого из этих показателей в развитии сердечно-сосудистых заболеваний.

Практическое значение работы состоит в том, что в качестве оценки системы липолиза – эстерификации предложено использовать величину отношения уровня неэстерифицированных жирных кислот в крови к концентрации триглицеридов, что открывает перспективу для применения данного показателя в клинике. Для использования в клинической практике также предложен показатель эффективности липопротеинлипазы – это отношение гидролизованных триглицеридов к активности данного фермента. Полученные результаты могут быть использованы для диагностики нарушений липидного обмена и определения способов коррекции этих нарушений.

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 6 работ, в том числе 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК.

Материалы диссертации докладывались и обсуждались на Российском национальном конгрессе кардиологов (Москва, 2008), на международном конгрессе – 6 ^th Metabolic Syndrome, type II Diabetes and Atherosclerosis Congress (Берлин, Германия, 2009), на международном симпозиуме по атеросклерозу – 2009 International Symposium on Atherosclerosis (Бостон, США, 2009). Результаты диссертации также были опубликованы в материалах научно-практической конференции с международным участием «Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, 2004).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, обсуждение результатов, заключение, выводы, список цитируемой литературы. Работа изложена на 106 страницах машинописного текста, иллюстрирована 10 рисунками и 9 таблицами. Библиографический список использованной литературы содержит 238 источников.

Личный вклад. Соискателем самостоятельно проведено большинство экспериментов, включая работу на клиническом материале. Соискателем также самостоятельно проведена статистическая обработка результатов исследований, включая дисперсионный, корреляционный, регрессионный анализ. Соискатель самостоятельно проводил анализ данных литературы и сопоставление их с результатами собственных исследований.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Пациенты и образцы плазмы крови

В исследование было включено 114 пациентов, находившихся в клинике липидологии НИИЭМ СЗО РАМН. У 110 (95%) обследуемых была артериальная гипертензия, у 61 (54%) – и ИБС. Пациенты были разделены на 3 группы: контрольная группа (лица с нормолипидемией), группа больных с несемейной к-ДЛП и группа больных с и-ГТГ. Фенотипирование гипертриглицеридемий производили по критериям, предложенным А.Н. Климовым и Н.Г. Никульчевой [1980]. Контрольная группа состояла из 51 практически здорового индивидуума в возрасте 52,5+13,11 лет, имеющих уровень ТГ в плазме крови <2,26 ммоль/л, общий холестерин (ОХС) < 6,46 ммоль/л, холестерин липопротеинов высокой плотности (ХС ЛВП) ≥0,93 ммоль/л и нормальную толерантность к глюкозе. В группу больных с несемейной к-ДЛП вошли 33 пациента с уровнем ТГ ≥2,26 ммоль/л, ОХС ≥ 6,46 ммоль/л. В группу больных с и-ГТГ были включены 30 пациентов с уровнем ТГ ≥2,26 ммоль/л, ОХС < 6,46 ммоль/л.

Из исследования были исключены лица, имеющие хронические заболевания печени и желчевыводящих путей, почек, гипо- и гиперфункцию щитовидной железы, сахарный диабет, принимавшие гиполипидемические препараты и имеющие кровных родственников с нарушением липидного обмена.

Забор крови проводили из локтевой вены, утром после 12-часового голодания. Полученную после центрифугирования (20 мин, +4C, 1500об/мин) плазму немедленно замораживали и хранили при -70⁰С. В качестве антикоагулянта использовали 0,1% ЭДТА.

У всех обследуемых измеряли рост и вес и рассчитывали величину индекса массы тела (ИМТ): ИМТ=масса тела(кг)/рост²(м²).

Автор приносит глубокую благодарность сотруднице отдела биохимии, д.м.н. Н.Г. Никульчевой за помощь при составлении групп обследуемых лиц.

Биохимические методы исследования

Содержание липидов (ОХС, ТГ, ХС ЛВП) в плазме крови определяли ферментативными методами (P.Z. CORMAY, Польша) на автоанализаторе «EOS-BRAVO» фирмы «Hospitex» (Швеция) [Bucolo G., David H., 1973, Allain C.C. et al., 1974, Lopes-Virella M.F. et al., 1977). Содержание холестерина липопротеинов низкой плотности (ХС ЛНП) в ммоль/л рассчитывали по формуле Фридвальда с модификацией [Шестов Д.Б., 1985]: ХС ЛНП=ОХС - (ТГ/2,2+ХС ЛВП) [Friedewald W. et al., 1972]. Концентрацию НЭЖК определяли ферментативным колориметрическим методом с использованием наборов фирмы «Wako Chemicals GmbH» (Германия), а содержание глюкозы – глюкозооксидазным методом с использованием наборов фирмы «Boehringer-Mahnheim GmbH» (Германия) на автоанализаторе «EOS-BRAVO» [Hosaka K. et al., 1981]. Уровень инсулина плазмы крови анализировали иммунноферментным методом с помощью набора «DSL-10-1600 ACTIVE Insulin ELISA» (США) с использованием универсального микропланшетного ридера Elx800 фирмы «Bio-Tek Instruments Inc» (США). Содержание апопротеинов (апо) А1 и В-100 в плазме крови оценивали методом количественного, «ракетного» иммуноэлектрофореза [Alaupovic P. et al., 1978] (Олейник И.А.). В качестве антител к апо А1 использовали антитела фирмы «AbD Serotec» (Великобритания), антитела к апо В-100 получены сотрудниками отдела биохимии НИИЭМ СЗО РАМН.

Показатель инсулиновой резистентности – HOMA-индекс (homeostasis model assessment) рассчитывали по формуле: HOMA-индекс = (концентрация глюкозы, ммоль/л * концентрация инсулина, мкЕд/мл)/22,5 [Matthews D.R. et al., 1985].

Жировую нагрузку (2 яйца и 200 мл 20% сливок) пациентам проводили утром натощак. Кровь для определения липидных параметров и САБ брали через 3 и 5 часов после жировой нагрузки [Saleh J. et al., 1998].

Определение САБ проводили методом иммуноферментного анализа [Cianflone K. et al., 1994, Cianflone K., Maslowska M., 1995]. Выделенный из плазмы крови человека САБ был любезно предоставлен сотрудником Гос НИИ особо чистых биопрепаратов проф. Кетлинским С.А.

Опыты на человеческих и мышиных фибробластах проводились сотрудниками отдела биохимии НИИЭМ СЗО РАМН Диже Э.Б. и Виноградовым А.Г. Фибробласты инкубировали с разными концентрациями САБ при 37^оС в течение 1ч. Затем к культуре клеток добавляли С¹⁴-олеиновую кислоту и продолжали инкубацию еще 2 ч. в тех же условиях. О скорости синтеза ТГ судили по включению меченой олеиновой кислоты во внутриклеточные ТГ с помощью тонкослойной хроматографии (пластины Силикагель 60, «Merck», Германия).

Активность ЛПЛ, полученной из плазмы крови, взятой из локтевой вены спустя 15 минут после введения гепарина (гепариновая проба) в дозе 50 МЕ/кг и замороженной при –70ºС, определяли по освобождению жирных кислот из триглицеридов Интралипида фирмы «Vitrum» (Швеция) [Hosaka K. et al., 1981, Bengtsson-Olivecrona G., Olivecrona T., 1992]. Предварительно в образцы добавляли антитела к печеночной триглицеридлипазе для подавления ее липолитической активности.

Статистическая обработка результатов

Статистический анализ данных проводился с использованием пакета программ “Statistica 7.0” Результаты обрабатывались обычными методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента для сравнения 2 групп, однофакторного дисперсионного анализа (one-way ANOVA test) при сравнении трех групп для нормально распределенных признаков. Перед проведением однофакторного дисперсионного анализа проводился анализ равенства дисперсий исследуемого параметра с помощью теста Левена. В случае различия дисперсий (p<0,05) проводился непараметрический дисперсионный анализ ANOVA по Краскелу-Уоллису. При обнаружении различий между группами применяли апостериорные сравнения средних попарных значений групп с помощью критерия Шеффе.

При распределении признака отличного от нормального применялся U-критерий Манна-Уитни для сравнения 2 групп, либо использовался анализ ANOVA по Краскелу-Уоллису для сравнения 3 групп. В случае обнаружения различий показателей между группами при использовании ANOVA по Краскелу-Уоллису проводилось парное сравнение групп с использованием непараметрического теста Манна-Уитни, применяя поправку Бонферрони при оценке значения p.

При анализе трех связанных (зависимых) групп применялся непараметрический метод Фридмена. В случае имеющегося различия медиан (p<0,05) между группами проводился непараметрический тест Вилкоксона, применяя поправку Бонферрони при оценке значения р.

Данные представлены в виде средних значений ± стандартное отклонение (M±Sd), средних значений ± ошибка средних значений (M±m).

При анализе корреляций применялись как параметрические (простой линейной корреляции Пирсона), так и непараметрические коэффициенты (метод корреляции Спирмена).

Для анализа значимых компонентов использовался метод множественного регрессионного анализа. Все данные подвергались анализу вида их распределения с помощью теста Шапиро-Уилка. Найденные в работе различия считались достоверными при уровне значимости p<0,05.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Выяснилось, что у пациентов с и-ГТГ и к-ДЛП помимо повышенного уровня в крови ТГ наблюдалось снижение содержания ХС ЛВП (табл. 1). При этом концентрация апо А-1 была достоверно уменьшенной лишь у пациентов с и-ГТГ. Это может свидетельствовать о том, что при и-ГТГ понижается концентрация обеих фракций ЛВП, тогда как при к-ДЛП уменьшается преимущественно ЛВП₂.

В обеих группах пациентов с гипертриглицеридемией отмечалось небольшое увеличение содержания глюкозы по сравнению с контролем, однако достоверности это увеличение достигало только у больных с к-ДЛП. У лиц с к-ДЛП и и-ГТГ повышено содержание в крови инсулина, увеличен ИМТ. Подобные изменения являются признаками инсулинорезистентности. Помимо этого, у лиц с к-ДЛП достоверно увеличено содержание в плазме крови НЭЖК, в то время как у лиц с и-ГТГ наблюдалась лишь тенденция к повышению.

Увеличенная концентрация НЭЖК на фоне предполагаемой инсулинорезистентности может приводить к усилению продукции ТГ-богатых липопротеинов у обследованных групп пациентов.

Важной находкой является обнаружение сниженной активности ЛПЛ у пациентов с и-ГТГ, тогда как у лиц с к-ДЛП, у которых также значительно повышен уровень ТГ в крови, изменения активности ЛПЛ не наблюдалось.

Таблица 1

Характеристика пациентов с нормолипидемией, и-ГТГ и к-ДЛП (M±Sd)

Показатель	Контроль (n=20)	и-ГТГ (n=12)	к-ДЛП (n=14)
ТГ (ммоль/л) ОХС (ммоль/л) ХС ЛВП (ммоль/л) ХС ЛНП (ммоль/л) НЭЖК (ммоль/л) Глюкоза (ммоль/л) Инсулин(мкЕд/мл) Активность ЛПЛ (ммоль/л/ч) Апо В(мг/дл) Апо А1(мг/дл) ИМТ (кг/м2)	1,3+0,5 4,4+0,8 1,14+0,23 2,7+0,9 0,47+0,17 5,3+0,9 5,0+2,3 9,0+3,2 50,9+15,0 165,6+25,6 26,2+4,0	4,2+1,1* 5,3+1,0 0,72+0,14* 2,7+1,1 0,65+0,26 5,9+1,0 12,2+7,4* 5,6+3,4* 58,5+17,2 135,9+34,8* 31,1+4,7*	5,8+2,2*# 8,2+1,6*# 0,90+0,14* 4,7+1,2*# 0,88+0,24*# 6,8+1,0* 11,0+4,7* 9,6+3,7# 65,9+22,9 172,6+27,8# 30,0+2,0*

Примечание: * р<0,05 по сравнению с группой контроля;

# р<0,05 между группами и-ГТГ и к-ДЛП


У
*

*

*
читывая, что липопротеиновая частица содержит только одну молекулу аполипопротеина В, нами было рассчитано отношение ТГ к апо В как показатель степени обогащения липопротеиновых частиц триглицеридами (рис. 1).


Рис. 1 Отношение ТГ/апо В у пациентов с нормолипидемией, и-ГТГ и к-ДЛП


П
римечание: * р<0,05 по сравнению с группой контроля


При этом учитывалось, что натощак в среднем около 90% всех плазменных ТГ находится в ЛОНП, тогда как в другой фракции апо В-содержащих липопротеинов – ЛНП транспортируется не более 10% ТГ плазмы [Климов А.Н., Никульчева Н.Г., 1999]. Оказалось, что у пациентов с и-ГТГ и к-ДЛП отношение ТГ/апо В было значительно увеличено, по сравнению с лицами с нормолипидемией. В то же время достоверных различий между группами с гипертриглицеридемиями не наблюдалось.

Далее был проведен корреляционный анализ. Оказалось, что у пациентов с нормолипидемией имеет место отрицательная взаимосвязь между отношением ТГ/апо В и активностью ЛПЛ (r = -0,56, p < 0,01). В то время как у пациентов с и-ГТГ и к-ДЛП она отсутствует. Эти данные свидетельствуют о том, что у пациентов с нормолипидемией в отличие от больных с гипертриглицеридемиями насыщенность липопротеинов триглицеридами (или размер частицы) зависит главным образом от активности ЛПЛ.

Далее, обращают на себя внимание значимые положительные корреляции между отношением ТГ/апо В и концентрациями НЭЖК (r = 0,57, p < 0,05) и глюкозы (r = 0,57, p < 0,05) у пациентов с к-ДЛП. Это свидетельствует о том, что насыщенность триглицеридами ЛП возрастает при увеличении концентрации НЭЖК и глюкозы, что обычно наблюдается при развитии инсулинорезистентности.

У пациентов с и-ГТГ также выявлена прямая корреляция между отношением ТГ/апо В и содержанием НЭЖК (r = 0,70, p < 0,05) Кроме этого, в данной группе обнаружены отрицательные корреляции между ТГ/апо В и такими параметрами как концентрации ХС ЛВП (r = -0,59, p < 0,05), апо-А1 (r = -0,59, p < 0,05), ОХС (r = -0,60, p< 0,05) и ХС ЛНП (r = -0,85, p < 0,001).

Таким образом, как и ожидалось, в норме насыщенность липопротеинов триглицеридами связана с активностью ЛПЛ, в то время как при гипертриглицеридемиях – с концентрацией НЭЖК. Повышенная концентрация НЭЖК на фоне предполагаемой инсулинорезистентности способствует увеличению продукции печенью обогащенных триглицеридами липопротеинов у пациентов с гипертриглицеридемиями.

Нарушение удаления ТГ-богатых частиц из плазмы крови

Как известно, основную роль в удалении из крови ТГ-богатых частиц играет липопротеинлипаза – фермент, расположенный на эндотелии сосудов. Замедление гидролиза ТГ-богатых частиц данным ферментом может являться одной из основных причин нарушения катаболизма этих частиц.

Нужно отметить, что до настоящего времени остается недостаточно выясненным вопрос о характере связи активности ЛПЛ с развитием дислипопротеинемии. С этой целью в настоящей работе была определена не только активность фермента, но и проанализирована эффективность липолиза у пациентов с различными нарушениями липидного обмена.

Как указывалось выше, было выявлено снижение средней активности ЛПЛ у лиц с и-ГТГ, тогда как у пациентов с к-ДЛП активность этого фермента не отличалась от таковой у лиц с нормолипидемией. Это позволило предположить, что у пациентов с и-ГТГ важной причиной повышения концентрации ТГ в плазме крови является нарушение липолиза ТГ в ЛОНП вследствие низкой активности ЛПЛ.

Причины снижения активности фермента у лиц с и-ГТГ остаются неясными. Ранее было показано, что мутации гена ЛПЛ, влекущие за собой изменение активности фермента, встречаются довольно редко в нашей популяции [Демидова Д.В. и др., 2001]. Как было отмечено (табл. 1), повышение концентрации НЭЖК и инсулина, которые могут подавлять активность ЛПЛ, у пациентов с к-ДЛП было как минимум не менее выраженным по сравнению с пациентами с и-ГТГ, однако не оказывало существенного влияния на активность фермента.

Помимо определения активности фермента по отношению к стандартному субстрату (Интралипиду) нами проводилась оценка эффективности липолиза плазменных ТГ in vivo. С этой целью пациентам вводили гепарин, который освобождает ЛПЛ, фиксированную на эндотелии сосудов, и способствует таким образом ее активации. Об эффективности липолиза судили по уменьшению концентрации ТГ в крови в течение 15 мин.

Было выявлено, что абсолютное снижение концентрации ТГ после введения гепарина было близким в обеих группах пациентов с гипертриглицеридемиями и более чем в 2 раза превышало таковое в контроле. И это вполне естественно, поскольку концентрации субстратов липолиза (ТГ) существенно отличались в указанных группах. Однако при этом в контрольной группе снижение уровня ТГ по отношению к исходному составило 20% , у лиц с и-ГТГ – 19%, а у пациентов с к-ДЛП – 17%.

Величина коэффициента, характеризующего эффективность липолиза (отношение абсолютного снижения ТГ к единице ферментативной активности ЛПЛ), была максимальной у пациентов с и-ГТГ, тогда как величина этого показателя у пациентов с к-ДЛП была примерно в 2 раза меньше. Эффективность липолиза наиболее низкой оказалась у лиц с нормолипидемией (табл.2).

Полученные данные позволяют сделать несколько заключений. Во-первых, в норме у человека активность ЛПЛ избыточна по отношению к концентрации ТГ в крови натощак, о чем свидетельствует низкая концентрация ТГ и высокая активность ЛПЛ при низкой эффективности липолиза. Такая ситуация позволяет быстро справляться с резким повышением концентрации ТГ в крови после приема пищи.

Во-вторых, низкой активности ЛПЛ, обнаруженной у пациентов с и-ГТГ, несмотря на очень высокую эффективность работы фермента, недостаточно для адекватного гидролиза ТГ, что и приводит накоплению последних в крови.

Таблица 2

Активность ЛПЛ и эффективность липолиза у обследованных пациентов (M+m)

Показатели	1. Контроль (n=20)	2. и-ГТГ (n=12)	3. к-ДЛП (n=14)
ТГ1 (ммоль/л)	1,29+0,11	4,23+0,32	5,78+0,59	P1-P2 < 0,001 P1-P3 < 0,001 P2-P3 < 0,05
ТГ2 (ммоль/л)	1,03+0,10	3,41+0,36	4,80+0,61	P1-P2 < 0,001 P1-P3 < 0,001
 ТГ (ммоль/л)	0,27+0,02	0,76+0,16	0,83+0,22	P1-P2 < 0,001 P1-P3 < 0,001
ЛПЛ (ммоль/л/ч)	9,03+0,71	5,57+0,99	9,63+1,00	P1-P2 < 0,01 P2-P3 < 0,01
 ТГ/ЛПЛ	0,04+0,01	0,20+0,05	0,09+0,02	P1-P2 < 0,001 P1-P3 < 0,001
Корреляция	 ТГ и ЛПЛ: r = -0,52; p = 0,02	 ТГ и ЛПЛ: r = 0,20; p = 0,54	 ТГ и ЛПЛ: r = 0,10; p = 0,74

Примечание: ТГ1 – концентрация ТГ до введения гепарина, ТГ2 – концентрация ТГ через 15 мин после введения гепарина,  ТГ = ТГ1-ТГ2


Самая интересная картина наблюдается при к-ДЛП. Несмотря на высокую активность ЛПЛ концентрация ТГ в крови повышена. Одной из причин этого может быть низкая эффективность липолиза, наблюдаемая у этих пациентов. И действительно, активность ЛПЛ у них примерно в 1,7 раз более высокая, чем у пациентов с и-ГТГ, в то время как эффективность работы фермента ЛПЛ у пациентов с к-ДЛП в 2,2 раза более низкая по сравнению с пациентами с и-ГТГ, что в итоге приводит к сравнимому повышению концентрации ТГ в крови. Можно предположить, что низкая эффективность липолиза у лиц с к-ДЛП связана с тем, что их ЛОНП обогащены холестерином и вследствие этого являются менее подходящим субстратом для ЛПЛ, чем в норме или при и-ГТГ.

Суммируя вышеизложенное, следует подчеркнуть, что эффективность липолиза зависит не только от активности ЛПЛ. Так, при и-ГТГ наблюдалось снижение активности ЛПЛ в 1,6 раз по сравнению с нормолипидемией, однако эффективность липолиза у этих пациентов была самой высокой (в 5 раз больше по сравнению с нормолипидемией). Это, на наш взгляд, свидетельствует о том, что у этих пациентов снижено количество фермента, расположенного на эндотелии сосудов, при его нормальной функциональной активности. Причины снижения количества ЛПЛ остаются невыясненными. В то же время у пациентов с к-ДЛП на фоне нормальной активности ЛПЛ наблюдалась относительно низкая эффективность липолиза. Эти данные свидетельствуют, во-первых, о различиях в механизмах нарушения липолиза при разных типах ДЛП, а, во-вторых, о целесообразности определять эффективность липолиза наряду с определением активности ЛПЛ для оценки механизмов нарушения метаболизма ТГ в крови.

Таким образом, полученные результаты позволяют говорить о том, что нарушение гидролиза ТГ является одной из причин повышения концентрации ТГ в крови при изученных типах ДЛП. При этом, у лиц с и-ГТГ замедление катаболизма ТГ обусловлено снижением количества нормально функционирующей ЛПЛ, тогда как у пациентов с к-ДЛП причиной накопления ТГ в крови является снижение эффективности липолиза, связанное скорее всего с изменением физико-химического состояния субстрата липолиза (ЛОНП).

Стимулирующий ацилирование белок

Около 20 лет назад был открыт белок, стимулирующий включение жирных кислот в триглицериды – САБ. На основании экспериментальных и клинических данных было постулировано, что САБ вносит существенный вклад в регуляцию (стимуляцию) включения НЭЖК в ТГ (ацилирование глицерина) и как следствие регулирует захват НЭЖК жировой тканью. Предполагается, что снижение количества САБ приводит к замедлению удаления НЭЖК из крови, что, посредством подавления активности ЛПЛ, способствует нарушению гидролиза ТГ.

В опытах на мышиных и человеческих фибробластах нами было показано, что САБ в концентрации 10-30 мкг/мл повышал включение ¹⁴С-олеиновой кислоты в ТГ на 14-36% (p<0,05). Эти данные свидетельствуют о том, что САБ способен активировать синтез ТГ, хотя степень этой активации была весьма невысокой. Было показано также отсутствие видовой специфичности в действии САБ на синтез ТГ в фибробластах.

При обследовании пациентов не было обнаружено достоверных различий в среднем содержании САБ между изучаемыми группами (нормолипидемия, и-ГТГ и к-ДЛП). При проведении корреляционного анализа не было обнаружено связи между концентрацией САБ, с одной стороны, и содержанием ТГ и ИМТ, с другой стороны, во всех группах пациентов, в том числе и у лиц с нормолипидемией.

Ранее было показано, что концентрация САБ увеличивается после приема пищи [Cianflone K. et al., 1989, Charlesworth J.A. et al., 1998]. Это позволило авторам высказать предположение, что увеличение концентрации САБ является физиологической реакцией организма на постпрандиальное повышение концентрации ТГ в крови, направленной на обеспечение быстрого удаления из крови НЭЖК, освобождающихся в процессе липолиза, и их депонирование в жировой ткани. Эти сведения послужили основанием для изучения изменений концентрации САБ на фоне постпрандиальной гиперлипидемии.

Оказалось, что у лиц с нормолипидемией после жировой нагрузки уровень САБ существенно не изменялся на всех сроках наблюдения, в то время как у пациентов с гипертриглицеридемией содержание САБ в плазме крови имело тенденцию к снижению как на 3 ч. (в среднем на 25%), так и на 5ч. (на 35%) наблюдения (рис. 2).

Таким образом, полученные результаты не подтверждают необходимость повышения содержания САБ в крови для обеспечения удаления НЭЖК из крови при нормолипидемии. В то же время, парадоксальное снижение концентрации САБ в крови при постпрандиальном повышении транспорта жирных кислот в крови у пациентов с гипертриглицеридемий, возможно, свидетельствует об истощении этой системы регуляции обмена жирных кислот при ДЛП.




Рис. 2 Изменение величин САБ и ТГ под влиянием жировой нагрузки у лиц с нормолипидемией (А) и гипертриглицеридемией (Б)


Суммируя вышеизложенное, следует отметить, что САБ является стимулятором синтеза ТГ в фибробластах. Однако изучение концентрации САБ в крови у лиц с различными типами ДЛП натощак и после жировой нагрузки не подтверждает предположение о существенной роли САБ в регуляции удаления НЭЖК и ТГ из кровотока.

Роль повышения уровня НЭЖК в развитии гипертриглицеридемии

Ранее мы отмечали (табл.1) повышение концентрации НЭЖК, глюкозы, инсулина, ИМТ у лиц с гипертриглицеридемиями по сравнению с контролем. По данным корреляционного анализа, выявлены положительные корреляции уровня в крови ТГ с концентрацией НЭЖК (r = 0,67, p < 0,05), с ИМТ (r=0,47, p<0,05), и с содержанием инсулина (r = 0,42, p < 0,05). Помимо этого уровень ТГ отрицательно коррелировал с содержанием ХС ЛВП (r = -0,58, p < 0,05) и положительно – с концентрацией общего ХС (r = 0,76, p < 0,05). Концентрация НЭЖК коррелировала с уровнями инсулина (r = 0,55, p < 0,05), ОХС (r = 0,52, p < 0,05) и ИМТ (r = 0,44, p < 0,05). Изменения уровня инсулина в крови наиболее сильно были связаны с величиной ИМТ (r = 0,59, p < 0,05), который в свою очередь отрицательно коррелировал с содержанием ХС ЛВП (r = -0,43, p < 0,05).

Чтобы установить, какой из изучаемых показателей является независимым предиктором высокой концентрации ТГ, был проведен множественный регрессионный анализ. В качестве зависимой переменной включали уровень ТГ в плазме крови. Независимыми переменными были ИМТ и показатели липидного и углеводного обмена. Выяснилось, что концентрация ТГ в плазме зависит от содержания НЭЖК (β = 0,32, p < 0,05) и от уровня ХС ЛВП (β = -0,35, p < 0,05). В свою очередь, уровень НЭЖК определяется только концентрацией инсулина (β = 0,32, p < 0,05). Наконец, концентрация инсулина зависит, главным образом, от ИМТ (β = 0,43, p < 0,01) и содержания НЭЖК (β = 0,40, p < 0,05).

Представленные данные согласуются с гипотезой, что первичным нарушением у обследованных пациентов является увеличение массы тела, которое приводит к нарастанию концентрации инсулина в крови. Последнее является свидетельством инсулинорезистентности, которая ведет к повышению уровня в крови жирных кислот. Их усиленное поступление в печень вызывает увеличение продукции ЛОНП и, соответственно, повышение концентрации ТГ в плазме крови. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что в основе гипертриглицеридемии у пациентов с изучаемыми вариантами ДЛП лежат биохимические механизмы, которые связаны с развитием метаболического синдрома.

На основании полученных результатов и данных литературы можно представить следующую схему, описывающую роль нарушения обмена жирных кислот в развитии гипертриглицеридемий (рис.3). Прежде всего, следует отметить влияние повышенной концентрации НЭЖК на синтез ТГ-богатых частиц печенью и активность ЛПЛ. Далее, длительное повышение концентрации НЭЖК может приводить к развитию инсулинорезистентности. При инсулинорезистентности не наблюдается ингибирования ГЧЛ, что приводит к ещё большему возрастанию уровня НЭЖК. Длительное повышение концентрации НЭЖК способствует также нарушению синтеза инсулина поджелудочной железой вследствие апоптоза β-клеток с последующим развитием сахарного диабета.


НЭЖК













В мышцах:


нарушение захвата

глюкозы и нарушение действия инсулина


гиперинсулинемия и/или инсулино-резистентность

В жировой ткани:


резистентность к САБ


уменьшение захвата ЖК


нарушение супрессии гормончувствительной липазы

В поджелудочной железе:


инсулин

В печени:

новосинтезированные ЖК

апо В

ТГ

ЛОНП


В плазме крови:


ЛПЛ

ТГ-богатые ЛП






















Рис. 3 Роль нарушения обмена жирных кислот в развитии гипертриглицеридемий

Параметр НЭЖК/ТГ как показатель адекватности системы липолиза-эстерификации

Д
*
ля оценки адекватности системы липолиза ТГ и поглощения НЭЖК клетками представлялось целесообразным рассмотреть дополнительный параметр НЭЖК/ТГ как величину, которая, как мы полагаем, отражает отношение суммарного количества НЭЖК плазмы крови к уровню в крови ТГ (рис.4).



*

Рис.4 Средние величины коэффициента НЭЖК/ТГ в различных группах


Примечание: * р<0,001 по сравнению с группой контроля


При анализе данных, полученных при обследовании пациентов с гипертриглицеридемиями, было обнаружено, что величина отношения НЭЖК/ТГ почти в 3 раза меньше у пациентов с и-ГТГ и к-ДЛП по сравнению с контролем. В то же время между группами пациентов с изучаемыми формами гипертриглицеридемий достоверных различий по данному параметру выявлено не было. Таким образом, в обеих группах ГТГ имеет место нарушение баланса процессов липолиза-эстерификации.

Заключение

Результаты данного исследования свидетельствуют о важной роли нарушения липолиза в повышении концентрации ТГ в крови. Причем при разных типах ДЛП нарушение гидролиза ТГ имеет разную природу: при и-ГТГ ведущее значение имеет дефицит ЛПЛ, а при к-ДЛП – нарушение ее нормального функционирования, т.е. эффективности липолиза.

Помимо этого, существуют и другие механизмы, способствующие развитию гипертриглицеридемии. При совокупном рассмотрении всех факторов, которые могут приводить к развитию гипертриглицеридемии, было показано, что первичным нарушением у обследованных пациентов является увеличение массы тела с последующей гиперинсулинемией и повышением концентрации в крови НЭЖК, что свидетельствует о развитии у них метаболического синдрома. Гиперхолестеринемия у больных с к-ДЛП является, по-видимому, вторичной по отношению к возрастанию уровня ТГ в плазме крови. В связи с этим, дальнейшее изучение механизмов развития гипертриглицеридемий на фоне метаболического синдрома, в частности несемейных форм изолированной гипертриглицеридемии и комбинированной дислипопротеинемии, позволит разработать новые подходы и пути лечения этих заболеваний.

4. ВЫВОДЫ

1. У больных с и-ГТГ и с к-ДЛП отмечено нарушение липолиза ТГ в плазме крови. Причем у лиц с и-ГТГ ведущее значение имеет дефицит ЛПЛ – несмотря на высокую эффективность функционирования фермента, его дефицит не позволяет обеспечивать адекватного гидролиза ТГ. У пациентов с к-ДЛП активность ЛПЛ остается в пределах нормы, однако эффективность липолиза у этих пациентов ниже, чем при и-ГТГ, по-видимому, из-за обогащения ЛОНП холестерином.
   
2. Группы больных с несемейными формами гипертриглицеридемий – изолированной гипертриглицеридемии и комбинированной дислипопротеинемии (и-ГТГ и к-ДЛП), несмотря на выявленные различия, имеют много общего в механизмах развития нарушений обмена ТГ.
   
3. САБ вызывает слабую стимуляцию синтеза ТГ у мышиных и человеческих фибробластов. Вместе с тем, концентрация в крови данного белка не взаимосвязана с параметрами липидного обмена.
   
4. Согласно регрессионному анализу, концентрации НЭЖК и ХС ЛВП являются независимыми детерминантами уровня ТГ. При этом концентрация инсулина оказывает независимое влияние на уровень НЭЖК. Концентрация НЭЖК и ИМТ являются независимыми детерминантами уровня инсулина.
   

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Фролова Ю.В., Агеева Е.В., Виноградова Т.В, Олейник И.А., Жданова О.Ю., Зайцева Н.С., Калашникова Н.М., Денисенко А.Д. Роль активности липопротеидлипазы, гиперинсулинемии и уровня неэстерифицированных жирных кислот в развитии дислипопротеидемий. Мед. акад. журн. – 2005. – Т5. – №4. – С.43-49.

2. Агеева Е.В., Зайцева Н.С., Жданова О.Ю., Фролова Ю.В. Характеристика метаболических изменений, наблюдающихся при комбинированной дислипидемии. Материалы научно-практической конференции для молодых ученых. «Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». Астрахань, 2004. – С.65-67.

3. Агеева Е.В., Фролова Ю.В., Никульчева Н.Г., Денисенко А.Д. Интенсивность (эффективность) липолиза у пациентов с различными формами гипертриглицеридемий. Кардиоваск. тер. и профилакт. – 2008. – Т.7(6). – Прилож. № 1. – С.16.

4. Агеева Е.В., Фролова Ю.В., Зайцева Н.С., Жданова О.Ю., Виноградова Т.В., Никульчева Н.Г., Денисенко А.Д. Взаимосвязь различных показателей липидного и углеводного обмена в развитии гипертриглицеридемий. Кардиоваск. тер. и профилакт. – 2008. – Т.7(6). – Прилож. № 1. – С.17.

5. Ageeva E.V., Frolova Yu.V., Bondar K.V., Denisenko A.D. The role of lipoprotein lipase activity, hyperinsulinemia and free fatty acids in genesis of combined hyperlipoproteinemia and hypertriglyceridemia. Abstract of Metabolic Syndrome, type II Diabetes and Atherosclerosis Congress-2009, Berlin, Germany, P.84.

6. Ageeva E.V., Frolova Yu.V., Denisenko A.D. The role of lipoprotein lipase activity, hyperinsulinemia and free fatty acids in genesis of dyslipidemias. Abstract of International Symposium on Atherosclerosis-2009, Boston, USA. Atheroscler. Suppl. – 2009. – Vol.10(2).