«Фармзащита»

Вид материала

Автореферат

Содержание Назаров Виктор Борисович Лесиовская Елена Евгеньевна Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук профессорЛуковникова Любовь Владимировна Целью исследования Научная новизна. Практическая значимость. Основные положения, выносимые на защиту Реализация результатов исследования. Апробация работы. Связь темы диссертации с плановой тематикой научно-исследовательской работы учреждений. Объем и структура диссертации. Материалы и методы исследования Результаты исследований и их обсуждение Практические рекомендации Список работ

На правах рукописи


ВЛАСЕНКО

Татьяна Николаевна


ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

ЭФФЕКТИВНОСТИ СОВМЕСТНОГО ПРИМЕНЕНИЯ

ПРЕПАРАТА Б-190 И ИНТЕРЛЕЙКИНА-1β

ПРИ ОСТРОМ ВНЕШНЕМ РАДИАЦИОННОМ ВОЗДЕЙСТВИИ


14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология

03.01.01  радиобиология


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук


Санкт-Петербург

2011


Работа выполнена в ФГУП НПЦ «Фармзащита» ФМБА России, ФГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М.Кирова» МО РФ.


Научные руководители:

доктор биологических наук Назаров Виктор Борисович

доктор медицинских наук профессор Гребенюк Александр Николаевич


Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор Лесиовская Елена Евгеньевна

доктор биологических наук Чигарева Наталия Григорьевна


Ведущая организация: Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова РАМН.


Защита диссертации состоится “ 19 ” апреля 2011 года в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 208.030.01 при ФГУН «ИНСТИТУТ ТОКСИКОЛОГИИ» ФМБА России (192019, г. Санкт-Петербург, ул. Бехтерева, д. 1)


С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГУН «ИНСТИТУТ ТОКСИКОЛОГИИ» ФМБА России.


Автореферат разослан “ 15” марта 2011 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук профессор

Луковникова Любовь Владимировна

Актуальность. Важными задачами современной фармакологии являются поиск и разработка новых эффективных лекарственных средств для
профилактики и лечения различных заболеваний, изучение механизмов их действия в экспериментах на животных и научное обоснование рациональных схем их применения. Для решения этих задач проводится поиск новых биологически активных фармакологических веществ среди природных и синтетических соединений, продуктов биотехнологии, генной инженерии, на экспериментальных моделях патологических состояний осуществляется оценка их эффективности и безопасности, изучается индивидуальная чувствительность к существующим и разрабатываемым лекарственным средствам [Середенин С.Б., Вальдман Е.А., 2003; Гуськова Т.А., 2010; Лесиовская Е.Е., 2010].

Одной из наиболее тяжелых патологий, требующей интенсивной фармакотерапии и профилактики, являются лучевые поражения, возникающие при остром внешнем радиационном воздействии [Бушманов А.Ю. и др., 2006; Гуськова А.К., 2008; Pellmar T.C., Rockwell S., 2005]. Возникновение таких поражений возможно при авариях и катастрофах на объектах атомной энергетики, в медицинских учреждениях, использующих источники ионизирующих излучений в диагностических или терапевтических целях, при диверсионном или террористическом применении радионуклидов [Аветисов Г.М., Гончаров С.Ф., 2002; Гребенюк А.Н. и др., 2009; Cirincione J. et al., 2002; Egger E., Münger K., 2004; Kuna P. et al., 2009]. Нельзя забывать и о необходимости предотвращения и лечения лучевых поражений у экипажей длительных пилотируемых космических экспедиций [Ушаков И.Б. и др., 2010; Seed T. et al., 2002]. Исходя из этого, одной из приоритетных задач современной фармакологии и радиобиологии становится разработка новых и совершенствование известных радиозащитных лекарственных препаратов, а также экспериментальное обоснование новых схем их применения.

В настоящее время наиболее изученными и высокоэффективными медицинскими средствами противорадиационной защиты являются радиопротекторы [Бутомо Н.В. и др., 2004; Васин М.В., 2006; Bump E., Malaker K., 1997; Seed Т., 2005]. Но их применение ограничено сроками использования (исключительно до радиационного воздействия), часто – малой терапевтической широтой и, как следствие, достаточно высокой токсичностью в оптимальных радиозащитных дозах. В качестве наиболее перспективных фармакологических средств для ранней терапии лучевой патологии рассматриваются препараты цитокинов и ростовых факторов [Чигарева Н.Г. и др., 2000; Легеза В.И. и др., 2001, 2010; Иванов А.А. и др., 2004; Neta R., 1997].

Цистамин, гаммафос и препарат Б-190 считают наиболее эффективными препаратами из группы радиопротекторов [Ильин Л.А. и др., 1994; Giambarresi L.J., Walker R.J., 1989; Kuna P. et al., 2004]. В ходе ликвидации последствий аварии на Чернобыльской атомной электростанции для профилактики радиационных поражений использовался препарат Б-190 – радиопротектор из группы биогенных аминов, реализующий свой эффект за счет прямого действия на α₁-адренорецепторы [Ильин Л.А. и др., 2001; Васин М.В., 2010]. К числу наиболее перспективных противолучевых средств из группы цитокинов относят рекомбинантный интерлейкин-1β, в экспериментальных исследованиях показавший высокую эффективность как для профилактики, так и для ранней терапии лучевых поражений [Рождественский Л.М., 2001; Симбирцев А.С., 2008; Neta R., 1997; Grebenyuk A. et al., 2010].

Однако до настоящего времени остается нерешенным вопрос о сохранении радиопротекторной эффективности препарата Б-190 при последующем введении интерлейкина-1β, не изучены эффекты комбинированного применения этих лекарственных препаратов на состояние костномозгового кроветворения, количественный состав и функционально-метаболическое состояние лейкоцитов периферической крови. Вместе с тем, решение этих вопросов необходимо для создания новых высокоэффективных схем фармакологической профилактики и терапии радиационных поражений.

Целью исследования явилось экспериментальное обоснование схемы фармакологической профилактики и терапии острых радиационных поражений, включающей комбинированное применение препарата Б-190 до облучения и интерлейкина-1β в ранние сроки после радиационного воздействия.

Для реализации поставленной цели предстояло решить следующие основные задачи исследования:

1. Оценить радиозащитную эффективность последовательного профилактического применения препарата Б-190 и раннего лечебного использования интерлейкина-1β по показателям выживаемости и средней продолжительности жизни облученных в дозах СД_50-100/30 мышей.

2. Изучить состояние костномозгового кроветворения у мышей, подвергнутых острому внешнему облучению без фармакологической защиты и в условиях последовательного применения препарата Б-190 до облучения и интерлейкина-1β после радиационного воздействия.

3. Определить модифицирующее влияние последовательного применения препарата Б-190 и интерлейкина-1β на динамику общего числа лейкоцитов, лимфоцитов и нейтрофилов в периферической крови мышей после радиационного воздействия.

4. Установить динамику содержания гликогена, активности миелопероксидазы и щелочной фосфатазы в нейтрофилах периферической крови мышей, подвергнутых облучению без фармакологической защиты и на фоне профилактического введения препарата Б-190 и раннего лечебного применения интерлейкина-1β.

Научная новизна. Впервые проведена комплексная оценка схемы фармакологической профилактики и терапии острых радиационных поражений, основанной на последовательном применении препарата Б-190 до облучения и интерлейкина-1β после острого внешнего радиационного воздействия.

Показано, что комбинированное применение препарата Б-190 и интерлейкина-1β позволяет увеличить число выживших после острого внешнего радиационного воздействия мышей в большей степени, чем изолированное введение этих фармакологических средств. Выявлено, что использование данной лечебно-профилактическая схемы позволяет снизить выраженность постлучевых нарушений костномозгового кроветворения, уменьшить глубину ранней постлучевой лейко-, лимфо- и нейтрофилопении, ускорить восстановление абсолютного содержания этих клеток в периферической крови. Установлен стимулирующий эффект комбинированного применения препарата Б-190 и интерлейкина-1 в отношении функционально-метаболического статуса нейтрофилов, измененного в результате облучения, который проявляется в поддержании более высокого уровня гликогена, уменьшении степени снижения активности миелопероксидазы и щелочной фосфатазы.

Практическая значимость. Экспериментально обоснован новый подход к повышению эффективности медицинской противорадиационной защиты посредством последовательного применения фармакологических средств радиопротектора препарата Б-190 за 15 мин до облучения и рекомбинантного интерлейкина-1β (беталейкина) через 15 мин после радиационного воздействия. В условиях острого внешнего радиационного воздействия комбинация этих фармакологических препаратов позволяет снизить глубину постлучевых нарушений гемопоэза, уменьшить выраженность лейкопении, ускорить восстановление основных субпопуляций лейкоцитов, нормализовать функционально-метаболический статус нейтрофилов, что, в конечном счете, приводит к увеличению выживаемости облученных в дозах СД_50-100/30 мышей.


Основные положения, выносимые на защиту

1. Последовательное введение препарата Б-190 до радиационного воздействия и интерлейкина-1β в ранние сроки после облучения позволяет увеличить выживаемость лабораторных животных, подвергнутых внешнему острому относительно равномерному облучению, в большей степени, чем их изолированное применение.

2. Механизм фармакодинамического взаимодействия лекарственных средств препарата Б-190 и интерлейкина-1β при их комбинированном применении для профилактики и терапии радиационных поражений реализуется снижением глубины постлучевых нарушений гемопоэза, уменьшением выраженности ранней постлучевой лейко-, лимфо- и нейтрофилопении, ускорением восстановления абсолютного числа лейкоцитов в периферической крови, стимуляцией функционально-метаболического статуса нейтрофилов.


Реализация результатов исследования. Результаты, полученные в ходе диссертационного исследования, используются в научно-исследовательской работе Научно-производственного центра «Фармзащита» ФМБА России, учебном процессе на кафедрах военной токсикологии и медицинской защиты Государственного института усовершенствования врачей МО РФ и Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова.

Апробация работы. Результаты исследования доложены на 3-й международной научной конференции «Экспериментальная и клиническая фармакология» (Минск, 2009), Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы взаимодействия медицинских служб Вооруженных Сил в условиях современных вызовов и угроз» (Светлогорск, 2009), международной научной конференции «Медико-биологические последствия Чернобыльской катастрофы» (Гомель, 2009), 5 съезде радиобиологического товарищества Украины (Ужгород, 2009), I Европейском конгрессе по военной медицине (Светлогорск, 2010), Third European International Radiation Protection Association Congress (Helsinki, 2010), VI съезде по радиационным исследованиям (Москва, 2010).

Связь темы диссертации с плановой тематикой научно-исследовательской работы учреждений. Исследование выполнялось в соответствии с плановой тематикой научно-исследовательских работ НПЦ «Фармзащита» ФМБА России (тема НИР №Р-167 шифр «Букашка», тема НИР №169 шифр «Комплекс», тема НИР №170 шифр «Синтетика») и Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (тема НИР № VMA.03.02.01.0808/0292 шифр «Гемопоэз», тема НИР № VMA.02.02.02.0810/0192 шифр «Цитокин»).

Личное участие автора. Автор принимала личное участие в планировании, организации и выполнении экспериментальных исследований, проводила учет и оценку их результатов, статистическую обработку, обобщение и анализ полученных данных.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 17 научных работ, в том числе 5 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата наук.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы собственных результатов, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. В диссертации представлены 7 таблиц и 10 рисунков. Список литературы содержит 200 библиографических источников, из них 135 отечественных и 65 иностранных публикаций.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные исследования выполнены на 160 самцах белых беспородных мышей и 556 самцах гибридах F₁ мышей линий (СВА х С57Вl) разводки питомника РАМН «Рапполово» (Ленинградская область).

Животных содержали в условиях вивария, не более чем по 20 мышей в клетке. Стандартный гранулированный корм они получали 1 раз в сутки с 10.00 до 13.00, воду – ad libitum. Перед проведением каждого эксперимента животные находились под наблюдением (в карантине) в течение не менее 14 сут. После окончания карантина мышей распределяли на группы методом рандомизации, больных и ослабленных животных в эксперимент не брали. При проведении исследования выполняли требования нормативно-правовых актов о порядке экспериментальной работы с применением животных, в том числе – по гуманному отношению к ним.

В работе использовали препарат Б-190 производства НПЦ «Фармзащита» ФМБА России (г. Химки, Московской обл.) и препарат рекомбинантного интерлейкина-1β человека, созданный методами генной инженерии в НИИ особо чистых биопрепаратов ФМБА России (г. Санкт-Петербург). Радиопротектор Б-190 мышам вводили однократно внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг в 0,2 мл 0,25% раствора винной кислоты за 15 мин до облучения. Интерлейкин-1, растворенный в 0,2 мл физиологического раствора, мышам вводили внутрибрюшинно в дозе 50 мкг/кг через 15 мин после облучения. Животным контрольных групп в те же сроки внутрибрюшинно вводили растворители в том же объеме.

Для экспериментального моделирования острых радиационных поражений животных подвергали общему внешнему однократному γ- или рентгеновскому облучению. Общее равномерное воздействие γ-излучением ¹³⁷Cs на животных с 4 сторон осуществляли на установке ИГУР-1 с мощностью экспозиционной дозы 0,703 мА/кг (130 Р/мин), кожно-фокусное расстояние 1 м. Общее относительно равномерное рентгеновское облучение мышей осуществляли на рентгенотерапевтической установке РУМ-17 при следующих условиях: напряжение 180 кВ, сила тока 15 мА, фильтр 0,5 мм Cu + 1,0 мм Al, мощность экспозиционной дозы 0,292 мА/кг (52,2 Р/мин), кожно-фокусное расстояние 50 см, облучение одностороннее в направлении спина-грудь. Дозиметрический контроль γ-излучения и рентгеновского воздействия осуществляли с помощью индивидуального дозиметра ИД-11 с последующей оценкой показаний прибора на аппарате ГО-32.

Оценка радиозащитной и лечебной эффективности препаратов проводилась путем последовательного изучения 30-суточной выживаемости, средней продолжительности жизни погибших животных и динамики их гибели; количества сохранивших жизнеспособность гемопоэтических клеток костного мозга; абсолютного числа лейкоцитов, содержания нейтрофилов и лимфоцитов в циркулирующем пуле крови; постлучевых изменений функционально-метаболического статуса нейтрофилов периферической крови.

Оценка параметров выживаемости мышей, облученных без применения препарата Б-190, интерлейкина-1β или их комбинации и на фоне их введения, осуществлялась в ходе 30-суточного наблюдения за белыми беспородными мышами-самцами и самцами мышей-гибридов F₁ (CBA x C57Bl).

В методиках эндогенного и экзогенного кроветворения [Till J.E., McCulloch E.A., 1961; Бутомо Н.В., 1992] по числу колоний, выросших в селезенках облученных мышей-гибридов F₁ (CBA x С57В1) на 9-е сут после радиационного воздействия, анализировали состояние гемопоэза у животных, подвергнутых острому внешнему облучению без фармакологической защиты и в условиях применения препарата Б-190 и/или интерлейкина-1β. В ходе определения числа экзогенных колониеобразующих единиц на селезенке (КОЕ-С₉) реципиентов облучали в дозе 8,5 Гр, доноров – в дозе 4,0 Гр. Через 60 мин после окончания введения препаратов доноров подвергали эвтаназии, извлекали по одной бедренной кости и готовили суспензию костного мозга. Содержание миелокариоцитов (мкц) во взвеси определяли в камере Горяева после разведения исходной суспензии костного мозга от необлученных мышей в 100 раз, от облученных в дозе 4,0 Гр – в 40 раз. Реципиентам опытных групп через 1 сут после их облучения в хвостовую вену вводили по 0,5 мл суспензии костного мозга от облученных или необлученных доноров, получавших Б-190, интерлейкин-1β, оба препарата или растворитель (физиологический раствор), мышам контрольной группы (эндогенный фон) – 0,5 мл раствора Хэнкса.

Определение общего количества лейкоцитов осуществляли меланжерным методом с последующим подсчетом клеток в камере Горяева. Для исследования лейкоцитарной формулы использовали способ быстрой окраски мазков крови краской Романовского [Альтгаузен А.Я., 1964]. Подсчет абсолютного количества нейтрофилов и лимфоцитов осуществляли на основании данных о числе лейкоцитов в периферической крови и относительного содержания нейтрофилов и лимфоцитов в лейкоцитарной формуле.

Оценку ключевых показателей функционально-метаболического статуса нейтрофилов периферической крови проводили путем цитохимического определения содержания гликогена, активности миелопероксидазы и щелочной фосфатазы при помощи соответствующих наборов реагентов «Диахим-ЦитоСтейн» производства НПФ «Абрис+» (г. Санкт-Петербург).

Полученные в ходе экспериментальных исследований данные подвергали стандартной статистической обработке с вычислением среднего значения показателя и его ошибки с помощью компьютерной программы «Statistica 6». Достоверность различий средних значений оценивали с использованием точного метода Фишера и t-критерия Стьюдента. Вероятность ошибки p < 0,05 и менее считали достаточной для вывода о статистической значимости различий полученных данных. ФИД под влиянием введения препаратов рассчитывали методом пробит-анализа по Финни с помощью компьютерной программы «StatPlus». Данные в таблицах представлены в виде М  m_x.


РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В результате проведенных исследований установлено, что последовательное применение препарата Б-190 за 15 мин до облучения и интерлейкина-1β через 15 мин после радиационного воздействия позволяет увеличить выживаемость облученных мышей и сохранить в системе кроветворения у них больше клеток-предшественников, чем при изолированном использовании каждого из этих препаратов.

Эксперименты, направленные на определение показателей выживаемости и средней продолжительности жизни облученных животных, проводили на белых беспородных мышах-самцах, которых подвергали воздействию γ-излучения в дозах 6,3; 6,8 и 7,3 Гр. Профилактическое применение препарата Б-190 позволяло защитить часть мышей, подвергнутых действию γ-излучения, от лучевой гибели (рис. 1). Так, при дозе 6,3 Гр выживаемость мышей, которым за 15 мин до облучения вводили препарат Б-190, увеличилась на 10%, а при облучении в дозе 6,8 Гр – на 15% по сравнению с контролем. При радиационном воздействии в дозе 7,3 Гр использование Б-190 позволяло спасти от лучевой гибели более 30% облученных животных, в то время как в контрольной группе погибали все мыши.

Раннее терапевтическое применение интерлейкина-1β по этому критерию было одинаково или менее эффективно, чем профилактическое введение препарата Б-190: при облучении в дозе 6,3 Гр выживаемость леченных животных выросла на 10%, при облучении в дозе 6,8 Гр – на 8,3%, а при облучении в дозе 7,3 Гр интерлейкин-1β повышал выживаемость облученных животных на 20%.

При последовательном применении препарата Б-190 и интерлейкина-1β число выживших после радиационного воздействия мышей по сравнению с облученным контролем значительно увеличивалось: при облучении в дозе 6,3 Гр – на 40%, при облучении в дозе 6,8 Гр – почти на 60%, при облучении в дозе 7,3 Гр – более чем на 45%.



Рисунок 1 – Влияние препарата Б-190 и интерлейкина-1β (ИЛ-1β) на 30-суточную выживаемость белых беспородных мышей-самцов, подвергнутых острому γ-облучению в дозах 6,3; 6,8 и 7,3 Гр

* отличие от группы «Облучение (контроль)» достоверно, p < 0,05.


Следует также отметить, что ни одна из изученных схем профилактики и терапии радиационных поражений не оказала существенного влияния на среднюю продолжительность жизни погибших от облучения животных. Большая часть мышей погибала на 10–14-е сут после облучения, что соответствует типичным срокам гибели мелких лабораторных животных при костномозговой форме острой лучевой болезни.

Эффективность совместного применения препарата Б-190 и интерлейкина-1β была подтверждена экспериментальными исследованиями на мышах-самцах гибридах F₁ (CBA x C57Bl), подвергнутых рентгеновскому облучению в дозе 8,0 Гр. В частности, при изолированном профилактическом введении препарата Б-190 выживаемость облученных мышей увеличилась на 26,7%, раннее терапевтическое использование интерлейкина-1β позволило повысить выживаемость на 40%. В то же время, профилактическое введение Б-190 за 15 мин до облучения и лечебное введение интерлейкина-1β через 15 мин после радиационного воздействия увеличивало выживаемость облученных в дозе СД_80/30 мышей-гибридов на 53,3% по сравнению с контролем (табл. 1).


Таблица 1 – Влияние препарата Б-190 и интерлейкина-1β на 30-суточную выживаемость и среднюю продолжительность жизни мышей-самцов гибридов F₁ (CBA x C57Bl), подвергнутых рентгеновскому облучению в дозе 8 Гр

Условия эксперимента	Число животных в группе	Выжива-емость, %	Средняя продолжительность жизни погибших животных, сут
Биологический контроль	15	100	–
Облучение (контроль)	15	20,0	9,4 ± 2,4
Б-190 + облучение	15	46,7	9,9 ± 3,9
Облучение + ИЛ-1β	15	60,0	13,5 ± 4,3
Б-190 + облучение + ИЛ-1β	15	73,3 *	9,5 ± 3,5
* отличие от группы «Облучение (контроль)» достоверно, p < 0,05.

Оценку радиозащитной и лечебной эффективности изолированного и комбинированного применения данных препаратов в методиках эндогенного и экзогенного колониеобразования проводили на мышах-гибридах.

В результате этого этапа работы установлено, что препарат Б-190, интерлейкин-1β и их комбинация частично предотвращали постлучевую депрессию кроветворения. При этом число колоний в селезенках мышей-гибридов, оцененных в методике эндогенного колониеобразования (рис. 2), было выше в группе мышей, которым вводили комбинацию препаратов, по сравнению с группами животных, получавших только Б-190 или только интерлейкин-1β.

Как видно из рисунка 2, радиационное воздействие вызывало зависимое от дозы облучения понижение количества эндогенных колоний, выросших в селезенках облученных мышей-гибридов. Профилактическое применение препарата Б-190 за 15 мин до облучения позволяло сохранить в 3,1-3,5 раза больше колоний, чем у мышей контрольных групп (облучение). Использование интерлейкина-1β через 15 мин после радиационного воздействия было менее эффективно, чем применение Б-190, но, тем не менее, также позволяло сохранять в 2,5-3,1 раза больше колоний, чем у животных контрольных групп.



Рисунок 2 – Влияние препарата Б-190 и интерлейкина-1β (ИЛ-1β) на количество 9-суточных эндогенных колоний в селезенках мышей-самцов гибридов F₁ (CBA x C57Bl), подвергнутых рентгеновскому облучению в дозах 6,5; 7 и 7,5 Гр

* отличие от группы «Облучение (контроль)» достоверно, p < 0,05;

# отличие от группы «Б-190 + облучение» достоверно, p < 0,05;

" отличие от группы «Облучение + ИЛ-1β» достоверно, p < 0,05.


Наибольшее число колоний, выросших в селезенках облученных мышей (то есть наибольшее число сохранивших жизнеспособность стволовых кроветворных клеток) было зарегистрировано у животных, получавших оба препарата. Так, последовательное профилактическое применение Б-190 и раннее лечебное применение интерлейкина-1β позволило сохранить в селезенках у мышей-гибридов, облученных в дозе 6,5 Гр, в 4 раза больше колоний. Количество эндогенных колоний у мышей-гибридов, облученных в дозах 6,5 и 7,0 Гр, получавших комбинированную фармакологическую защиту путем введения радиопротектора и стимулятора гемопоэза, было в 1,2-1,3 раза выше, чем после профилактического применения одного препарата Б-190, и в 1,3-1,7 раза выше, чем при лечебном введении интерлейкина-1β. При облучении в дозе 7,5 Гр последовательное введение Б-190 и интерлейкина-1β позволило увеличить количество эндогенных колоний более чем в 5 раз по сравнению с животными контрольной группы (облученные мыши без фармакологической защиты), и в 1,5 раза по сравнению с введением только Б-190 или только интерлейкина-1β.

Таким образом, последовательное профилактическое применение Б-190 за 15 мин до облучения и раннее лечебное применение интерлейкина-1β через 15 мин после облучения позволяет эффективно уменьшить постлучевое снижение количества колоний, выросших в селезенках облученных мышей на 9 сут после облучения в методике эндогенного колониеобразования.

Установлено также, что изолированное применение препарата Б-190 или ИЛ-1β не оказывало существенного влияния на количество 9-суточных колониеобразующих единиц (КОЕ-С₉) в селезенках мышей-самцов F₁ (CBA x C57Bl), выявленных в методике экзогенного колониеобразования (табл. 2).


Таблица 2 – Влияние препарата Б-190 и интерлейкина-1β (ИЛ-1β) на число миелокариоцитов (мкц) и количество КОЕ-С₉, выявленных в методике экзогенного колониеобразования у мышей-самцов гибридов F₁ (CBA x C57Bl), подвергнутых рентгеновскому облучению в дозе 4,0 Гр

Условия эксперимента	Число МКЦ, х 106/бедро	Количество КОЕ-С9
		в 1 бедре	на 106 мкц
Облучение	18,3	64 ± 16	3,5 ± 0,9
Б-190 + облучение	20,0	88 ± 24	4,4 ± 1,2
Облучение + ИЛ-1β	20,8	72 ± 16	3,5 ± 0,8
Б-190 + облучение + ИЛ-1β	22,3	136 ± 8 *	6,1 ± 0,4 *
Физиологический раствор	23,8	320 ± 100	13,4 ± 4,2
Б-190	25,3	400 ± 140	15,8 ± 5,5
ИЛ-1β	22,8	380 ± 40	14,9 ± 1,8
Б-190 + ИЛ-1β	20,8	520 ± 60	25 ± 2,9
*отличие от группы «Облучение» достоверно, p < 0,05.

В то же время у облученных мышей-гибридов, которым вводили препарат Б-190 и интерлейкин-1β, число КОЕ-С₉ было в 2 раза выше, чем у животных контрольной группы (облучение), в 1,4 раза выше, чем у животных, получавших только Б-190, и в 1,7 раз выше, чем у животных, леченных только интерлейкином-1β. Полученные в ходе этого эксперимента данные также свидетельствуют о том, что последовательное введение препарата Б-190 за 15 мин до облучения и интерлейкина-1β через 15 мин после облучения способствует более выраженному уменьшению постлучевых нарушений костномозгового кроветворения, чем изолированное применение препаратов.

На следующем этапе наших исследований было установлено, что последовательное введение препарата Б-190 и интерлейкина-1β предотвращало снижение общего числа лейкоцитов, нейтрофилов и лимфоцитов периферической крови у облученных в дозе 8,0 Гр мышей в ранние сроки после облучения и ускоряло темп их восстановления. К 30 сут наблюдения уровень лейкоцитов в периферической крови облученных мышей, получавших препарат Б-190 и интерлейкин-1β, практически не отличался от аналогичного показателя фона (табл. 3).

Как видно из данных, представленных в таблице 4, как изолированное, так и последовательное применение препаратов Б-190 и интерлейкина-1β оказывало стимулирующее влияние на нейтрофилы периферической крови облученных животных, что проявлялось в достоверном увеличении содержания гликогена, повышении активности миелопероксидазы и щелочной фосфатазы в этих клетках по сравнению с аналогичными показателями контрольных групп.

Так, острое внешнее радиационное воздействие в дозе 8,0 Гр вызывало снижение содержания гликогена в нейтрофилах с 1 по 9 сут наблюдения, с последующей тенденцией к восстановлению данного показателя. Профилактическое применение препарата Б-190, как и раннее терапевтическое использование интерлейкина-1β практически полностью повторяло динамику содержания гликогена в нейтрофилах облученных мышей. Изучаемая схема профилактики и ранней терапии радиационных поражений по этому критерию оказалась более эффективной: через 4 сут и 9 сут после облучения содержание гликогена в нейтрофилах мышей, получавших комбинацию двух препаратов, достоверно (p < 0,05) превышало соответствующие показатели групп контроля (облучения) и изолированного применения препарата Б-190 или интерлейкина-1β.

Применение препарата Б-190, интерлейкина-1β и их комбинации способствовало также снижению глубины раннего постлучевого ингибирования миелопероксидазы и более быстрой нормализации активности данного фермента. При этом статистически значимых различий в выраженности эффекта изучаемых препаратов при их изолированном применении по сравнению с их последовательным введением ни в один из сроков исследования не выявлялось.

Кроме того, применение изучаемых фармакологических препаратов позволяло уменьшить глубину снижения активности щелочной фосфатазы и ускорить темп ее восстановления. Однако статистически значимые отличия по сравнению с контролем (облучением) регистрировались только при использовании схемы фармакологической профилактики и терапии радиационных поражений, включающей последовательное применение препарата Б-190 до облучения и интерлейкина-1β после радиационного воздействия.

Таблица 3 – Влияние препарата Б-190 и интерлейкина-1β (ИЛ-1β) на абсолютное количество лейкоцитов, нейтрофилов и лимфоцитов в периферической крови у мышей-самцов гибридов F₁ (CBA x C57Bl), подвергнутых рентгеновскому облучению в дозе 8,0 Гр (n = 6)

Показатель	Условия облучения	Сроки исследования, сут
		До облучения	После облучения
			1	4	9	18	30
Лейко-циты, х 109/л	Облучение (контроль)	5,53±0,08	1,48±0,06	0,82±0,04	0,39±0,07	1,17±0,05	3,40±0,13
	Б-190 + облучение	5,48±0,07	2,12±0,06*	1,65±0,06*“	0,61±0,01*	2,42±0,06*"	4,35±0,07*
	Облучение + ИЛ-1β	5,46±0,07	2,10±0,08*	1,38±0,06*	0,57±0,04*	2,13±0,06*	4,40±0,12*
	Б-190 + облучение +ИЛ-1β	5,56±0,08	2,29±0,09*#“	1,76±0,05*#“	0,60±0,03*	2,82±0,02*#“	5,16±0,16*#“
Нейтрофилы, х 109/л	Облучение (контроль)	1,46±0,19	1,19±0,12	0,58±0,02	0,14±0,01	0,66±0,11	1,29±0,19
	Б-190 + облучение	1,40±0,12	1,77±0,12*	1,00±0,13*“	0,17±0,02	1,23±0,13*	1,81±0,27
	Облучение + ИЛ-1β	1,41±0,15	1,53±0,20*	0,62±0,13	0,15±0,01	1,24±0,26*	2,28±0,22*
	Б-190 + облучение +ИЛ-1β	1,49±0,21	1,71±0,11*	0,91±0,11“	0,16±0,02	1,38±0,35*	2,23±0,34*
Лимфо-циты, х 109/л	Облучение (контроль)	4,06±0,24	0,18±0,05	0,18±0,06	0,14±0,03	0,51±0,16	2,11±0,13
	Б-190 + облучение	4,08±0,19	0,35±0,10	0,44±0,09*	0,25±0,06	1,19±0,21*	2,54±0,29
	Облучение + ИЛ-1β	4,05±0,21	0,61±0,14*#	0,70±0,07*	0,20±0,04	0,89±0,20*	2,12±0,33
	Б-190 + облучение +ИЛ-1β	4,07±0,20	0,58±0,14*#	0,84±0,08*	0,19±0,03	1,43±0,33*	2,93±0,27*“
* отличие от группы «Облучение (контроль)» достоверно, p < 0,05; # отличие от группы «Б-190+облучение» достоверно, p < 0,05; “ отличие от группы «Облучение+ИЛ-1β» достоверно, p < 0,05

Таблица 4 – Влияние препарата Б-190 и интерлейкина-1β (ИЛ-1β) на содержание гликогена, активность миелопероксидазы и щелочной фосфатазы в нейтрофилах периферической крови мышей-самцов гибридов F₁ (CBA x C57Bl), подвергнутых рентгеновскому облучению в дозе 8,0 Гр (n = 6)

Показатель	Условия облучения	Сроки исследования, сут
		До облучения	После облучения
			1	4	9	18	30
Гликоген, усл. ед.	Облучение (контроль)	1,92 ± 0,09	1,37 ± 0,07	1,24 ± 0,06	1,20 ± 0,05	1,30 ± 0,06	1,42 ± 0,06
	Б-190 + облучение	1,90 ± 0,07	1,41 ± 0,05	1,32 ± 0,09	1,24 ± 0,06	1,37 ± 0,09	1,48 ± 0,08
	Облучение + ИЛ-1β	1,94 ± 0,07	1,43 ± 0,08	1,35 ± 0,10	1,28 ± 0,05	1,40 ± 0,10	1,51 ± 0,05
	Б-190 + облучение +ИЛ-1β	1,91 ± 0,08	1,45 ± 0,07	1,40 ± 0,07*	1,35±0,07*	1,42 ± 0,08	1,52 ± 0,07
Миелопероксидаза, усл. ед.	Облучение (контроль)	1,36 ± 0,08	1,11 ± 0,04	1,18 ± 0,05	0,74 ± 0,05	1,25 ± 0,05	1,35 ± 0,05
	Б-190 + облучение	1,34 ± 0,09	1,24 ± 0,06*	1,27 ± 0,05	0,98 ± 0,08*	1,32 ± 0,04	1,43 ± 0,09
	Облучение + ИЛ-1β	1,37 ± 0,07	1,26 ± 0,05*	1,29 ± 0,06	1,01 ± 0,07*	1,34 ± 0,07	1,44 ± 0,08
	Б-190 + облучение +ИЛ-1β	1,35 ± 0,10	1,31 ± 0,08*	1,31 ± 0,04*	1,05± 0,09*	1,36 ± 0,06	1,44 ± 0,06
Щелочная фосфатаза, усл. ед.	Облучение (контроль)	1,77 ± 0,08	1,55 ± 0,05	1,54 ± 0,07	1,51 ± 0,07	1,60 ± 0,06	1,72 ± 0,05
	Б-190 + облучение	1,74 ± 0,05	1,61 ± 0,08	1,60 ± 0,09	1,61 ± 0,08	1,68 ± 0,09	1,77 ± 0,09
	Облучение + ИЛ-1β	1,75 ± 0,07	1,62 ± 0,07	1,61 ± 0,08	1,64 ± 0,09	1,68 ± 0,08	1,77 ± 0,08
	Б-190 + облучение +ИЛ-1β	1,76 ± 0,06	1,66 ± 0,04*	1,64 ± 0,08	1,67 ± 0,07*	1,72 ± 0,07*	1,81 ± 0,07
* отличие от группы «Облучение (контроль)» достоверно, p < 0,05

Полученные нами данные о радиопротекторной эффективности препарата Б-190 и ранней терапевтической активности интерлейкина-1β совпадают с результатами ранее проведенных исследований [Васин М.В., 2006; Рождественский Л.М., 2007; Тимошевский А.А., 2009; Neta R., 1997] и дополняют их, расширяя представления о механизмах действия этих препаратов.

Ранее высокая степень противолучевой защиты при применении препарата Б-190 была установлена в экспериментальных исследованиях на многих видах лабораторных животных: мыши, крысы, сирийские хомячки, морские свинки, кролики, собаки и обезьяны [Васин М.В., 2006]. Противолучевые свойства Б-190 связаны с прямым действием этого препарата на α₁-адренорецепторы, развитием вазоконстрикторного эффекта, снижением напряжения кислорода в подкожной клетчатке и костном мозге. Возможным механизмом является также усиление потребления кислорода, что при наличии фармакологической циркуляторной гипоксии может существенно усилить гипоксию в клетках и тем самым резко повысить их радиорезистентность [Васин М.В., 2008]. Для стимулятора гемопоэза интерлейкина-1β этот механизм не является существенным. Однако его введение мышам после облучения позволяет увеличить радиопротекторную эффективность препарата Б-190, оцененную по критериям выживаемости облученных мышей. В ходе нашего исследования было показано, что последовательное профилактическое применение препарата Б-190 и раннее терапевтическое введение интерлейкина-1β позволяет увеличить выживаемость мышей, облученных в дозах СД_50-100/30, на 40–60%, хотя и не оказывает существенного влияния на среднюю продолжительность жизни погибших животных.

Одним из наиболее важных механизмов, лежащих в основе радиозащитного эффекта последовательного применения данных препаратов, по нашему мнению, является активация под влиянием интерлейкина-1β пролиферации и дифференцировки стволовых кроветворных клеток, в большем числе сохранившихся в костном мозге облученных мышей вследствие протекторного действия препарата Б-190, а также стимуляция функционального потенциала клеток периферической крови. Подтверждением справедливости этого суждения является тот факт, что как изолированное применение интерлейкина-1β, так и его совместное применение с препаратом Б-190 способствует снижению выраженности постлучевых нарушений костномозгового кроветворения. То, что интерлейкин-1β действует, преимущественно, на стволовой кроветворный пул, сохраняя часть клеток от гибели и/или интенсифицируя его пролиферацию, было показано и ранее [Рождественский Л.М. и др., 2002; Neta R., 1997]. Однако в ходе наших исследований было выявлено, что наибольшее количество КОЕ-С₉ у облученных мышей определялось при последовательном применении препарата Б-190 до облучения и интерлейкина-1β после радиационного воздействия.

Таким образом, в результате проведенных нами исследований установлено, что последовательное профилактическое введение препарата Б-190 до лучевого воздействия и раннее терапевтическое применение интерлейкина-1β после облучения может рассматриваться в качестве новой высокоэффективной схемы фармакологической профилактики и лечения радиационных поражений от острого внешнего относительно равномерного облучения.


ВЫВОДЫ


1. В условиях острого внешнего радиационного воздействия лечебно-профилактическая схема противорадиационной защиты, включающая применение за 15 мин до радиационного воздействия препарата Б-190 в дозе 50 мг/кг и раннее (через 15 мин после радиационного воздействия) лечебное использование интерлейкина-1β в дозе 50 мкг/кг, позволяет увеличить выживаемость облученных в дозах СД_50-100/30 мышей, подвергнутых γ- или рентгеновскому облучению, на 40–60%, не оказывая существенного влияния на среднюю продолжительность жизни погибших животных.

2. Как изолированное, так и комбинированное применение препарата Б-190 и интерлейкина-1 способствует снижению выраженности постлучевых нарушений костномозгового кроветворения у мышей, подвергнутых рентгеновскому облучению в дозах СД_70-90/30. Наибольшее количество колониеобразующих единиц на селезенках облученных мышей в методиках эндогенного и экзогенного колониеобразования определяется при последовательном введении препарата Б-190 до облучения и интерлейкина-1 после радиационного воздействия.

3. При рентгеновском облучении мышей в дозе 8,0 Гр последовательное применение препарата Б-190 и интерлейкина-1β позволяет уменьшить выраженность ранней постлучевой лейко-, лимфо- и нейтрофилопении и ускорить восстановление абсолютного содержания лейкоцитов, нейтрофилов и лимфоцитов в периферической крови мышей после радиационного воздействия.

4. Стимулирующий эффект комбинированного применения препарата Б-190 и интерлейкина-1 в отношении показателей функционально-метаболического статуса нейтрофилов, измененных в результате облучения, проявляется в поддержании более высокого уровня гликогена, предотвращении постлучевого снижения активности миелопероксидазы и щелочной фосфатазы.


ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Результаты проведенных исследований позволяют рекомендовать дальнейшее изучение эффективности схемы фармакологической профилактики и терапии радиационных поражений, включающей последовательное применение препарата Б-190 до облучения и интерлейкина-1 после радиационного воздействия в экспериментах на крупных лабораторных животных (собаки, обезьяны).

2. Алгоритм, включающий последовательное изучение выживаемости, средней продолжительности жизни и динамики гибели облученных лабораторных животных, состояния их костномозгового кроветворения, количества лейкоцитов, нейтрофилов и лимфоцитов циркулирующего пула, содержания гликогена, активности миелопероксидазы и щелочной фосфатазы в нейтрофилах периферической крови, может быть рекомендован для оценки эффективности новых схем фармакологической профилактики и терапии радиационных поражений, формирующихся при остром внешнем облучении.


СПИСОК РАБОТ,

ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ


Статьи в научных изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Гребенюк А.Н. Влияние последовательного применения препарата Б-190 и интерлейкина-1β на выживаемость и костномозговое кроветворение облученных мышей / А.Н. Гребенюк, В.В. Зацепин, Т.Н. Власенко и др. // Радиационная биология. Радиоэкология. – 2010. – Т. 50, № 4. – С. 475-480.
   
2. Зацепин В.В. Экспериментальное обоснование комплексного применения препарата Б-190 и интерлейкина-1β при остром облучении / В.В. Зацепин, Т.Н. Власенко, В.Б. Назаров, А.Н. Гребенюк // Военно-медицинский журнал. – 2010. – Т. 331, № 8. – С. 48-49.
   
3. Власенко Т.Н. Современные подходы к фармакологической профилактике радиационных поражений / Т.Н. Власенко, В.Б. Назаров, А.Н. Гребенюк // Биомедицинский журнал «Medline.Ru». – 2010. – Т. 11. – С. 230-253. (режим доступа – ne.ru, доступ свободный).
   
4. Власенко Т.Н. Современные подходы к ранней фармакотерапии радиационных поражений / Т.Н. Власенко, В.Б. Назаров, А.Н. Гребенюк // Биомедицинский журнал «Medline.Ru». – 2010. – Т. 11. – С. 503-517. (режим доступа ne.ru, доступ свободный).
   
5. Гребенюк А.Н. Современные возможности медикаментозной профилактики и ранней терапии радиационных поражений / А.Н. Гребенюк, В.В. Зацепин, В.Б. Назаров, Т.Н. Власенко // Военно-медицинский журнал. – 2011. – Т. 332, № 2. – С. 13-17.
   

Статьи в журналах, сборниках трудов, тезисы докладов:

6. Власенко Т.Н. Экспериментальная фармакология современных противолучевых средств / Т.Н. Власенко, В.Б. Назаров, А.Н. Гребенюк и др. // Экспериментальная и клиническая фармакология: Тез. докл. III междунар. науч. конф. – Минск, 2009. – С. 24-25.
   
7. Власенко Т.Н. Перспективные направления совершенствования схемы комплексной профилактики и терапии лучевых поражений / Т.Н. Власенко, А.Н. Гребенюк, В.В. Зацепин и др. // Актуальные вопросы взаимодействия медицинских служб Вооруженных Сил в условиях современных вызовов и угроз: Тез. докл. междунар. науч.-практ. конф. – М., 2009. – С. 37-38.
   
8. Гребенюк А.Н. Новые подходы к фармакологическому обеспечению противорадиационной защиты / А.Н. Гребенюк, Н.В. Аксенова, Т.Н. Власенко и др. // Медико-биологические последствия Чернобыльской катастрофы: Материалы междунар. науч. конф. – Гомель, 2009. – С. 27-29.
   
9. Власенко Т.Н. Экспериментальная оценка радиозащитной эффективности индралина и интерлейкина-1β по критерию выживаемости облученных животных / Т.Н. Власенко, А.Н. Гребенюк, В.Б. Назаров и др. // VI Съезд радиобиологического товарищества Украины: Тез. докл. – Ужгород, 2009. – С. 156.
   
10. Grebenyuk A. Radioprotective efficiency from consecutive application of indralin and interleukin-1β at the acute irradiation / A. Grebenyuk, V. Nazarov, T. Vlasenko et al. // Third European International Radiation Protection Association Congress: Abstracts. – Helsinki, 2010. – P. 221.
    
11. Grebenyuk A. Radioprotective efficiency from consecutive application of indralin and interleukin-1β at the acute irradiation / A. Grebenyuk, V. Nazarov, T. Vlasenko et al. // Third European International Radiation Protection Association Congress: – Helsinki, 2010. – 7 p. (Full papers of poster presentations; режим доступа ссылка скрыта, доступ свободный).
    
12. Гребенюк А.Н. Особенности медицинской защиты при ликвидации последствий химических и радиационных аварий / А.Н. Гребенюк, Д.Ю. Минаев, Т.Н. Власенко // I Европейский конгресс по военной медицине: Тез. докл. – М., 2010. – С. 43.
    
13. Гребенюк А.Н. Стратегия принятия решений по медицинской защите лиц, привлекаемых к ликвидации радиационных аварий / А.Н. Гребенюк, В.В. Зацепин, Д.Ю. Минаев, Т.Н. Власенко // Актуальные вопросы радиационной гигиены: Материалы науч.-практ. конф. с междунар. участием. – СПб., 2010. – С. 31-33.
    
14. Зацепин В.В. Оценка радиозащитного эффекта комплексного применения радиопротекторов и стимуляторов гемопоэза / В.В. Зацепин, А.Н. Гребенюк, В.Б. Назаров, Т.Н. Власенко // Современные проблемы радиобиологии: Материалы междунар. науч. конф. – Минск, 2010. – С. 57-58.
    
15. Власенко Т.Н. Радиопротекторный эффект препарата Б-190 при его комбинации с интерлейкином-1 и лакоцином / Т.Н. Власенко, Н.В. Аксенова, В.В. Зацепин и др. // VI Съезд по радиационным исследованиям: Тез. докл. – М., 2010. – Т. 1. – С. 179.
    
16. Власенко Т.Н. Сравнительная оценка эффективности изолированного и совместного применения препарата Б-190 и интерлейкина-1 для защиты мышей при остром облучении / Т.Н. Власенко // VI Съезд по радиационным исследованиям: Тез. докл. – М., 2010. – Т. 1. – С. 180.
    
17. Гребенюк А.Н. Интерлейкин-1 в системе медицинской противорадиационной защиты / А.Н. Гребенюк, А.А. Тимошевский, Т.Н. Власенко и др. // VI Съезд по радиационным исследованиям: Тез. докл. – М., 2010. – Т. 1. – С. 182.