Роль эндогенных и микробных фитаз в процессе получения и сбраживания ржаного сусла
| Вид материала | Автореферат |
- Разработка технологии этанола из ик-обработанного ячменя на основе получения и сбраживания, 509.47kb.
- Ющие процессами образования земной коры в целом и составных ее частей, сложенных субстратом, 1117.81kb.
- Учебно-методический комплекс по дисциплине типы загрязнений окружающей среды, 339.18kb.
- Темы курсовых работ Экономическая сущность и роль финансов в воспроизводственном процессе., 51.84kb.
- Девтический этап получения знаний, который включает начальную школу и V-VII классы, 189.07kb.
- Министерство образования, 162.27kb.
- Совершенствование технологии ржаного и ржано-пшеничного хлеба на основе оптимизации, 307.38kb.
- Роль априорной информации в творческом процессе, 515.3kb.
- Оао "Булочно-кондитерский комбинат", 466.58kb.
- Задание на проектирование Рассчитать оборудование для стадии выщелачивания исходного, 48.05kb.
1.4. Практическая значимость
Данные, полученные в ходе проведения экспериментов, позволяют рационально использовать сырье и микробные ферментные препараты с активной фитазой в технологии этанола.
Предложенный дифференцированный способ переработки зерна ржи дает возможность эффективно гидролизовать фитин сырья и повысить качественные характеристики осахаренного сусла.
Рекомендуемые режимы и стадия внесения микробной фитазы позволяет интенсифицировать процесс сбраживания, увеличить выход спирта, при одновременном снижении летучих примесей в бражке.
1.5. Апробация работы
Материалы диссертации представлены на V и VI Научно-практических конференциях с международным участием «Высокоэффективные технологии, методы и средства их реализации» (Москва, 2007г., 2008г.); VІI Международной научно-технической конференции «Техника и технология пищевых производств» (Могилев, 2009г.).
1.6. Публикации
По материалам диссертационной работы опубликовано 7 печатных работ, в т.ч. 4 публикации в научных журналах рекомендованных ВАК.
1.7. Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов и библиографии, включающей 192 источника. Работа изложена на 165 страницах, содержит 23 таблицы и 34 рисунка.
2. Обзор литературы
В обзоре литературы обобщены сведения о строении и биохимическом составе зерна ржи, а также об особенностях его переработки в спиртовом производстве. Дана характеристика ферментативного комплекса зерна ржи и ферментных препаратов, применяемых в технологии этанола. Основное внимание уделено фитазам – ферментам, гидролизующих фитин. Рассмотрены вопросы, касающиеся влияния состава сусла на эффективность процесса его сбраживания.
3. Экспериментальная часть
3.1. Материалы и методы исследования
В работе использовали фуражное зерно ржи, полученное со спиртового завода ОАО «Алвист» (Тверская область).
Ферментные препараты:
- Термамил – термоустойчивая бактериальная α-амилаза (Novozymes);
- Коверзим – глюкоамилаза (Ende Industries);
- Кормофит – микробная фитаза, продуцируемая грибной культурой Penicillium canescens (Россия)
- Спиртовые дрожжи: S. cerevisiae раса XII, сухие дрожжи «Angel» (Китай) и «Фермиол» (США).
Показатели качества зерна ржи определяли в соответствии с ГОСТами. Содержание водорастворимого белка определяли по методу Лоури (Lowry et. al., 1951); аминный азот – методом формольного титрования, активность фитазы – колориметрическим методом (Синицин и др., 2006), в качестве стандартного субстрата использовали рисовый фитин (Sigma, США). Гель-хроматографию проводили с использованием геля Toyoperl HW-55F.
Бродильную активность дрожжей определяли весовым методом, содержание растворимых сухих веществ, кислотность и рН сусла – общепринятыми в спиртовой промышленности методами. Концентрацию спирта и действительного экстракта в зрелой бражке осуществляли дистилляционным методом. Определение побочных продуктов брожения проводили методом газовой хроматографии согласно ГОСТ 30536-97, с использованием газового хроматографа HP-FFAP (США).
3.2. Исследование фитазного комплекса зерна ржи
С целью прогнозирования режимных параметров процесса переработки зерна ржи, направленных на эффективный гидролиз фитина сырья необходимо было на первом этапе работы определить общее содержание данного компонента в зерна и его распределение в зерновке.
В качестве объектов исследования использовали помол ржи, а также фракции периферических частей зерна, которые получали двумя способами:
– рассевом помола с выделением крупки;
– последовательным снятием с зерновки внешних оболочек с получением образцов шелухи.
Установлено (табл. 1), что максимальное количество фитина содержится в образце Шелуха III (15% снятия). В данной фракции концентрируется около 90% от общего количества фитина сырья.
Таблица 1 – Содержание зольных соединений и фитина в зерне и
его периферических частях
| Сырье | Массовая доля фракции, % | Массовая доля, % на с. в. | Процент от исходного в зерне, % | ||
| Зола | Фитин | Зола | Фитин | ||
| Зерно | 100 | 1,20 | 0,40 | 100 | 100 |
| Крупка | 15 | 1,97 | 1,43 | 24,6 | 53,6 |
| Шелуха I | 5 | 6,20 | 0,76 | 25,8 | 9,5 |
| Шелуха II | 10 | 4,72 | 1,39 | 39,3 | 34,8 |
| Шелуха III | 15 | 4,39 | 2,32 | 54,9 | 87,0 |
| Шелуха IV | 20 | 2,95 | 1,80 | 49,2 | 90,0 |
Далее в работе была определена фитазная активность зерна ржи и его периферических частей (табл. 2).
Таблица 2 – Фитазная активность зерна ржи и его периферических частей
| Сырье | Фитазная активность | |
| FTU, ед/г сырья | FTU ед/г фитина сырья | |
| Зерно | 0,03 | 7,50 |
| Крупка | 0,08 | 5,61 |
| Шелуха I | – | – |
| Шелуха II | 0,06 | 4,29 |
| Шелуха III | 0,19 | 8,33 |
| Шелуха IV | 0,14 | 8,06 |
Установлено, что фитазная активность в образцах шелухи в первую очередь определяется процентом снятия наружных частей зерна. Так в образце Шелуха I (5% снятия) фитазная активность практически не определяется. Максимальная активность фитазы выявлена в образце Шелуха III (15% снятия), она превышает активность в целом зерне более чем в 6 раз. Именно поэтому данный образец использован для выделения зерновой фитазы.
3.3. Выделение и очистка фитазы из оболочек зерна ржи
Разработанная схема выделения и очистки фитазы ржи включала следующие этапы: экстракцию водой в соотношении 1 : 10, ступенчатое осаждение сульфатом аммония, гель-хроматографию на колонке с TSK- gel Toyopearl HW – 55F.
На рисунке 1 представлены данные по гель-хроматографии белковой фракции, полученной осаждением сульфатом аммония от 40 до 60% насыщения. Из шести основных фракций фитазная активность обнаруживается лишь в одной – 18 фракция (II пик), выходящей с объемом элюции 76 мл, что соответствует 80000 Да.
Рисунок 1 Фракционирование зерновой фитазы методом гель-хроматографии
На рисунке 2 приведена схема выделения и очистки фитазы ржи, по которой был получен препарат фитазы из зерна ржи со степенью очистки 105 раз (табл. 3).
Таблица 3 – Очистка фитазы из зерна ржи
| Этап | Белок по Лоури, мг/мл | Фитазная активность | Удельная активность, ед/мг белка | Степень очистки |
| [РО4 3−], г/л | ||||
| 1. Экстракция Н2О | 0,077 | 0,075 | 0,97 | 1 |
| 2. Осаждение (NH4)2SO4 40 - 60% насыщения | 0,041 | 0,280 | 6,83 | 7,04 |
| 3. Гель-хроматография на колонке c TSK-gel Toyopearl HW-55F | 0,018 | 1,84 | 102,3 | 105,3 |
Рисунок 2 Схема выделения и очистки препарата фитазы из зерна ржи
Экспериментально установлено, что фитаза ржи имеет оптимум рН 4,5 – 5,0, как при действии на стандартном субстрате, так и зерновой смеси. Подкисление затора до рН 3,0, либо проведение процесса при естественном рН замеса 6,3 снижает уровень фитазной активности до 40%. Температурный оптимум составляет 40-450С. Температура 65-700С – вторая основная пауза механико-ферментативного способа обработки сырья характеризуется активностью фитазы на зерновом субстрате на уровне 40-50% от максимальной, на стандартном – снижается до остаточной 5-10%. Прогрев замеса при температуре выше 700С приводит почти к полной инактивации фитазы ржи.
- Характеристика ферментного препарата фитазы микробного происхождения
Ферментный препарат фитазы под названием Кормофит, разработан учеными РАН и используется как кормовая добавка к сухим кормам. Помимо фитазы, продуцируемой грибной культурой Penicillium canescens, препарат содержит карбогидразы – ферменты, расщепляющие полисахариды, такие как целлюлоза, β-глюканы, ксиланы, гемицеллюлозы, декстрозы.
Методом гель-хроматографии на колонке c TSK-gel Toyopearl HW-55 была определена молекулярная масса микробной фитазы, которая составила 12000 − 23000 Да.
При изучении влияния рН на активность исследуемого препарата Кормофит установлено, что оптимум рН при гидролизе фитина зернового субстрата сдвигается в кислую область относительно стандартного субстрата и соответствует рН 4,5 – 5,0, в то время как на стандартном имеет значение оптимума 5,5.
Также можно отметить, что в целом расширяется диапазон рН, при котором Кормофит работает достаточно активно. При рН 4,0 и 6,0 на зерновом субстрате активность составляет около 80% от максимальной (рис. 3).
Рисунок 3 Влияние рН на активность ферментного препарата Кормофит
При исследовании влияния температуры (рис. 4) на активность ферментного препарата Кормофит установлено, что температурный оптимум при действии на стандартный субстрат имеет четко выраженный пик при 45°С. Снижение температуры до 35°С и увеличение ее до 55°С сопровождается уменьшением фитазной активности соответственно до 70% и 50%.
Исследование влияния температуры на активность препарата, проведенное на зерновом субстрате, показало, что оптимум температуры сдвигается в область более высоких температур, также расширяется диапазон варьирования температур, при которых Кормофит проявляет достаточно высокую активность.
Рисунок 4 Влияние температуры на активность ферментного
препарата Кормофит
3.5. Получение ржаного сусла с использованием зерновой фитазы
Получение ржаного сусла проводили по механико-ферментативному способу (режим Регламента). В соответствии с ним измельченное зерно поступает в смеситель, куда подают воду в соотношении 1:3 (1:4) и α-амилазу. Замес выдерживают при температуре около 500С в течение 20-30 мин (первая пауза). Затем его быстро нагревают до 70-750С и выдерживают в течение 120-150 мин. (вторая пауза) при постоянном перемешивании. Далее готовый замес подогревают до 95-980С и выдерживают в непрерывном потоке при перемешивании в течение 90-120 мин (третья пауза).
Общая продолжительность водно-тепловой обработки замеса составляет 3-4 часа. Ферментные препараты дозируются в зависимости от их активности на 1 г. условного крахмала: 1,5-2,0 ед. АС (либо 0,2-0,4 ед. АС при использовании термостабильных препаратов) и 6,0-6,5 ед. ГлС на стадию осахаривания (четвертая пауза), которая протекает при температуре 56-580С в течение 30 мин.
Данная технологическая схема использована в качестве базовой для разработки режимов получения сусла из ржи с участием собственных ферментов зерна, в частности фитазы. Для этого снижена температура обработки замеса на первой паузе с 500С до 40–450С, так как данный температурный интервал является, как установлено, оптимальным для действия зерновой фитазы и увеличена ее продолжительность с 30 мин до 2-х часов.
Кроме того, в работе исследовано влияние исходной активной кислотности замеса на процесс получения сусла из зерна ржи.
Установлено (табл. 4), что предложенное изменение режима не оказывает влияния на активную кислотность сусла. Вероятно, ферментативный гидролиз фитина сырья под действием собственных фитаз ржи при данном способе получения сусла протекает слабо. Причиной тому может быть недостаточная фитазная активность ржи, равная, в зависимости от партии зерна ржи, 0,03-0,04 ед. FTU/г зерна и незначительная концентрация фитина в перерабатываемом сырье, а также его реологические характеристики. Известно, что ржаные замесы обладают повышенной вязкостью.
Таблица 4 – Влияние продолжительности обработки замеса на активную и титруемую кислотность сусла
| Время обработки замеса, при 40-450С, мин | рН сусла | Кислотность сусла, град. |
| 30 | 6,3 | 0,23 |
| 60 | 6,1 | 0,25 |
| 120 | 6,2 | 0,28 |
| 180 | 6,2 | 0,30 |
Альтернативным вариантом получения сусла может быть выделение фракции из зерна, в которой сосредоточены фитин и фитаза ржи и ее предварительная обработка. Ранее установлено, что дифференцированная переработка зерна является эффективным способом в спиртовой отрасли.
Принципиальная процессуальная схема предлагаемого способа переработки зерна ржи приведена на рисунке 5. Она включает в себя стадию шелушения зерна и обработку шелухи в смеси с водой, в том числе с подкислением до рН 5,0, и обработкой при t=40-450С. Дифференцированный способ переработки ржи позволяет, во-первых, повысить уровень фитазной активности в расчете на 1 г сырья до 0,20-0,25 ед. FTU; во-вторых, сократить затраты, связанные с использованием серной кислоты, вносимой для подкисления и создания оптимального уровня рН для действия фитазы ржи; в-третьих, такое техническое решение дает возможность сохранить или снизить незначительно рН всего замеса, что в свою очередь, определяет эффективность гидролиза крахмала термостабильной α-амилазой препарата Термамил, имеющей оптимум рН в нейтральной зоне.
| З  ерно ржи |
Шелушение (15%)
| Фракция шелухи | | Фракция эндосперма |
Н2SO4
обработка смеси одноступенчатое дробление
при t=40-450С, рН 5,0-5,2
| Помол |
-амилаза
-
Замес
В
одно-тепловая и ферментативная обработка| Разваренная масса |
-
Осахаренное сусло
Рисунок 5 Процессуальная схема получения ржаного сусла на основе дифференцированного способа переработки зерна
В работе были получены и проанализированы по основным показателям качества следующие образцы осахаренного сусла.
Контроль I – режим получения сусла из исходного зерна ржи по Регламенту.
Контроль II – режим получения сусла из исходного зерна ржи по Регламенту с измененной первой паузой (t=40-450С, Т=3 часа).
Опыт I – предлагаемый способ с выделением 15% шелухи, ее смешиванием с водой при гидромодуле 1 : 10 и обработкой при естественном рН замеса в течение 3-х часов при t=40-450С, вводом обработанного затора из шелухи в смесь измельченной фракции эндосперма с водой и дальнейшем проведением процесса по режиму Регламента.
Опыт II – процесс вели аналогично Опыту I, но с подкислением замеса из шелухи до рН 5,0.
Опыт III – вели аналогично Опыту II с увеличением продолжительности обработки шелухи до 10-ти часов.
Сравнительная характеристика образцов осахаренного сусла, приведенная в таблице 5, показывает, что дифференцированная подготовка сырья улучшает технологические показатели сусла: повышается массовая доля сухих веществ в среднем на 0,9-2,1%, сбраживаемых углеводов на 0,9-2,0%, растет видимая доброкачественность сусла.
Лучшим является Опыт III, в котором на стадии обработки шелухи смесь подкисляли до рН 5,0 (оптимум для действия фитазы ржи) и увеличивали продолжительность выдержки до 10-ти часов.
Таблица 5 – Сравнительная характеристика образцов осахаренного сусла
| Показатели | Вариант получения сусла | ||||
| Контроль I | Контроль II | Опыт I | Опыт II | Опыт III | |
| Массовая доля сухих веществ, % | 14,2 | 14,8 | 15,1 | 15,9 | 16,3 |
| Массовая доля сбраживаемых углеводов, % | 10,9 | 11,4 | 11,8 | 12,5 | 12,9 |
| Массовая доля сахаров, % | 4,9 | 5,5 | 4,9 | 5,2 | 6,5 |
| Массовая доля аминного азота, % | 0,061 | 0,074 | 0,055 | 0,055 | 0,079 |
| Титруемая кислотность, град. | 0,18 | 0,24 | 0,19 | 0,20 | 0,25 |
| Видимая доброкачественность, % | 76,7 | 77,0 | 78,1 | 78,6 | 79,1 |