Определение витамина В12 в биологических объектах
Дипломная работа - Химия
Другие дипломы по предмету Химия
?чению конъюгатой Альб- В12.
мг карбоксилатного производного цианкобаламина (7 мкмоль) растворяют в 2 мл абсолютного диметилформамида, и добавляют по 2 мг дициклогексилкарбодиимида(10 мкмоль). Реакционную смесь инкубируют в темноте в течение 2-х суток витамина В12 до выпадения кристаллов дициклогексилмочевины. Затем супернатант с N-гидрокси-сукцинимидилкобаламином юобавляют к 6,5 мл раствора БСА(10 мг/мл) в 0,1 М карбонатном буфере, рН 9,2. Реакцию конъюгирования проводят в течение 6 часов при комнатной температуре в темноте, после чего конъюгат диализируют в темноте при 4С против 0,01М трис-хлоридного буфера, рН 7,2, содержащего 0,15М хлорида натрия для удаления несвязавшихся продуктов реакции (соответственно цианкобаламина). Степень модификации БСА цианкобаламином определяли спектрофотометрически, используя коэффициент экстинкции 8700 М -1 см -1 при L=550 нм. В нашем случае она составила 0,3 моля на моль белка.
Твердофазным носителем служили иммунологические планшеты, которые были сенсибилизированы растворами конъюгатов. Стандартные растворы получают из конъюгатов Альб-В12, определяя их концентрацию спектрофотометрически. В данной системе был применен непрямой конкурентный метод иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител против витамина. Количество связавшихся антител определяют, используя конъюгат анти-IgG человека с пероксидазой хрена /анти-IgG-ПХ/, по его связыванию с твердой фазой. Субстратом реакции служил ТМВ.
Проводят работа по подбору эквивалентных концентраций всех реагентов, участвующих в реакции.
Ниже приводятся условия постановки реакции с указанием подобранных разведений для всех реагентов.
Сенсибилизацию планшетов проводили конъюгатами Альб-В12 и Альб-фолат в разведении 1:20 в фосфатном буфере с БСА в течение первых 3-х часов при 37 0С, а затем в течение ночи в холодильнике. Затем планшеты отмывают несколько раз ФСБ. Антигены, т.е. стандартные растворы и испытуемые образцы, предварительно прогревают при 100 0С в растворе 0,3N NaOH с KCN и с дитиотретолом /ДТТ/ для перевода всех дериватов в циан-форму и предотвращения денатурации при кипячении. Используют следующие концентрации стандартных растворов: 1300 пг/мл, 650 пг/мл, 300 пг/мл, 150 пг/мл и 75 пг/мл - для витамина В12 и 20нг/мл.
Стандартные растворы и испытуемые образцы - 0,1 мл - помещают в специальные пробирки и добавляют по 0,1 мл раствора NaOH(0,3 N) c KCN(1мг/мл) и ДТТ (50мкл ДТТ на 6 мл раствора щелочи). Пробирки закрывают крышечками из фольги и помещают на 10 мин в кипящую водяную баню. Затем все пробы охлаждают и вносят по 0,1 мл в сенсибилизированные планшеты. Реакцию проводят в течение 12-14 часов при 4-60 , после чего планшеты снова отмывают, а затем вносят соответственно по 0,1 мл антител против витамина В12 в разведении 1:1000. Планшеты снова помещают в холодильник на 12-14 часов, после чего их в очередной раз отмывают ФСБ. Затем во все лунки планшета вносили по 0,1 мл анти-IgG-ПХ в разведении 1:10000 и помещают в термостат на 2 часа, снова отмывают ФСБ и затем добавляют 0,1 мл ТМВ, а после развития окраски через 10-15 мин реакцию закрепляют 4% H2SO4. Результаты спектрофотометрируют на при L=450 nm. На основании стандартных разведений строят кривую, по которой затем определяют концентрацию исследуемого соединения(В12) в испытуемых образцах.
Ниже приведены стандартные кривые, полученные при использовании данного метода.
Всего определение витамина было проведено в образцах крови 25-ти доноров и 250-ти больных с различными видами анемий. Средние значения витамина В12 в норме составило 700 150 мг/мл (350-900).
ОПРЕДЕЛЕНИЕ В РАСТВОРАХ
Спектрофотометрический
Растворы, содержащие в 1 мл 0,03 мг, и растворы, со-0,1; 0,2; 0,5 или 1 мг в -1 мл, предварительно водой в .отношении 1:2, 1:4, 1:10 и 1:20, помещают в кювету спектрофотометра с толщиной слоя в 1 см и определяют оптическую плотность при длине волны 361 нм.
Содержание цианокобаламина в миллиграммах в 1 мл (х) вычисляют по формуле:
X=(E*10*v)/201
где v - разведение, 10- постоянный коэффициент, Е- найденная оптическая плотность.
Колориметрический метод
Испытуемый раствор наливают в кювету метра с толщиной слоя 1-2 см и находят величину оптической плотности раствора (зеленый светофильтр). По найденной величине, пользуясь калибровочным графиком, устанавливают содержание витамина В12 в 1 мл раствора прямым путем.
Для построения калибровочного графика берут растворы чистого кристаллического цианокобаламина, содержащие 0,02; 0,025; 0,03; 0,035; 0,04; 0,045; 0,05; 0,055; 0,065 и 0,07 мг в 1 мл и определяют оптическую плотность этих растворов.
На оси абсцисс откладывают содержание витамина B12, а на оси ординат-соответствующие плотности.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ В12 В КРИСТАЛЛИЧЕСКОМ ПРЕПАРАТЕ
(спектрофотометрический метод)
Около 0,02 г препарата (точная навеска) растворяют в воде в мерной колбе емкостью 500 мл и доводят водой до метки. Определяют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 361 нм в кювете с толщиной слоя 1 см, употребляя в качестве контрольного раствора воду.
Содержание витамина В12 а процентах (х) рассчитывают по формуле:
витамин цианокобаламин биологический
X=(c*500*100)/(207*100*a)
Где С - оптическая плотность раствора, а - навеска в граммах, 50 - разведение в мл, 100 - постоянный коэффициент, 100 - пересчёт в %.
Применение биологических методов
Определение цианокобаламина c Escherichia coli в драже или таблетках
Содержание цианокобаламина определяют микробиологическим методом с Escherichia coli 113-3