Определение витамина В12 в биологических объектах
Дипломная работа - Химия
Другие дипломы по предмету Химия
еделяемого компонента. В качестве индикаторов применяются микроорганизмы (бактерии, дрожжи, плесневые грибы), водоросли и высшие растения, водные беспозвоночные и позвоночные животные (простейшие, ракообразные, моллюски, личинки комаров, олигохеты, пиявки, рыбы., насекомые, черви, а также ткани, различные органы и системы (нервная, кровеносная, половая и др.) теплокровных. Питательная среда может быть естественной, искусственной или синтетической.
Биологические методы основаны на определении того минимального количества витамина, которое при добавлении к искусственной диете, лишенной только данного изучаемого витамина, предохраняет животное от развития авитаминоза или излечивает его от уже развившейся болезни. Это количество витамина условно принимают за единицу (в литературе известны голубиные, крысиные единицы). Большое место в количественном определении ряда витаминов: фолиевой, пара-аминобензойной кислот и др. - в биологических жидкостях, в частности в крови, занимают микробиологические методы, основанные на измерении скорости роста бактерий; последняя пропорциональна концентрации витамина в исследуемом объекте. Количество витаминов принято выражать, кроме того, в миллиграммах, микрограммах, международных единицах (ME, или IU).
Из пищевых продуктов витамины выделяют, используя полярные и неполярные растворители. Для разделения витаминов используются хромотаграфические методы - разделение и анализ смесей анализируемых веществ сорбционными методами в динамических условиях. Метод основан на различном распределении веществ между двумя несмешивающимися фазами - подвижной и неподвижной.
3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ В12 РАЗЛИЧНЫМИ МЕТОДАМИ
Рассмотрим возможность применения этих методов для определения цианокобаламина в биологических обьектах.
Применение физико-химических методов
Хроматография
Цианкобаламин накапливается в клетках бактерий, поэтому операции по выделению витамина заключаются в следующем: сепарирование клеток, экстрагирование водой при рН 4,5-5,0 и температуре 85-90?С, в присутствии стабилизатора (0,25% раствор натрия нитрита), Экстракция протекает в течение часа, после чего водный раствор охлаждают, нейтрализуют раствором едкого натра, добавляют коагулянты белка - хлорид железа трехвалентного и алюминия сульфат с последующим фильтрованием. Фильтрат упаривают и дополнительно очищают, используя методы ионного обмена и хроматографии, после чего проводят кристаллизацию витамина при 3-4С из водно-ацетонового раствора.
Итак, в данном случае в качестве аналитического метода используют тонкослойную хроматографию. Этот тип определения отличается простотой осуществления и экономией времени. Он основан на том, что растворимость биологически активных веществ весьма различна. Знание этой величины играет большую роль как при экстракции, так и при нанесении и разделении. Водорастворимые витамины на высушенном слое силикагеля значительно стабильнее жирорастворимых витаминов, что облегчает нанесение и количественное определение.
Условия разделения и результаты
При использовании смеси Генсхирта и Мальзахера на силикагеле цианкобаламин остается в точке старта (см. табл. 1), а водой перемещается (Rf * 100 е^22).
Обнаружение и возможности определения
Табл 1. Ориентировочная величина Rf x 100 и непосредственное обнаружение витамина В12 с использованием различных источников освещения на слоях силикагеля с флуоресцирующей добавкой
ВИТАМИНRf * 100ОКРАСКАГРАНИЦЫ ОПРЕДЕЛУксусная к-та-ацетон-метанолводав УФ-свете (254мм)в УФ-свете (365мм)Дневной свет В12 (циклокобаламин)022тёмнаяфиолетовакрасная1-0,5-0,3
Рис. 2. Одномерная хроматограмма водорастворимых витаминов.
Разделение водой на слое силикагель + флуоресцентный индикатор (время анализа около 40 мин); снято в коротковолновом УФ-свете. 1 - 30 мг тиамина НС1; 2 - 3 мг рибофлавина;7-10 дг цианокобаламина
Для идентификации относительно больших количеств цианкобаламина можно рассматривать подобную хроматограмму при различном освещении. При дневном свете по красной окраске можно определить еще 0,3 мг, в Уф-свете при длине волны 365 мм - 0,5 мг и при длине волны 254 мм - 1 мг в виде темных пятен на флуоресцирующем фоне. После хлорирования и опрыскивания раствором о-толидин - иодид калия (реактив № 32) можно еще обнаружить даже 0,2 мг в виде фиолетовых пятен. Для микроопределения следует также использовать биоавтографию.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНА В12 ИММУНОФЕРМЕНТНЫМ И СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДАМИ
Поскольку содержание кобаламинов в организме крайне незначительно, определение их возможно современными высокочувствительными методами - радиоиммунными, энзимоиммунными и иммунофлюоресцентными. Большинство наборов, выпускаемых фирмами в данное время, приспособлено для автоматизированных закрытых систем и очень дороги, поэтому разработка относительно недорогого иммуноферментного метода, приспособленного для открытой системы, является весьма актуальной проблемой. Применяют твердофазный иммуноферментный метод, используя моноклональные антитела против витамина В12. Поскольку витамин В12 является гаптеном, для проведения иммуноэнзимного анализа требуется получение конъюгатов этого соединения с бычьим сывороточным альбумином.
Получение конъюгатов проводили карбодиимидным методом. Для конъюгата витамина В12 использовали его карбоксильное производное. Ниже приводится описание метода по пол?/p>