Генетика микроорганизмов

Дипломная работа - Биология

Другие дипломы по предмету Биология



экспрессироваться в клетках бактерий или дрожжей, то обычно вначале выделяют соответствующую м-РНК. Как правило, осуществить прямую экспрессию генов животных в бактериальных клетках не удается, поскольку эти гены содержат интроны.

Некоторые гены животных, например, кодирующие а-лейкоцитарные интерфероны, не содержат интронов и могут прямо экспрессироваться в бактериальных и дрожжевых клетках. Если в качестве исходного объекта приходится использовать м-РНК, то прежде всего следует найти ее источник - ткань, в которой этот продукт образуется в наибольшем количестве. Иногда таким источником служат опухолевые ткани или же клетки в культуре, образующие необходимую м-РНК.

После транскрипции данной м-РНК и получения комплементарной ДНК (к-ДНК) необходимо определить, какие из множества молекул этой к-ДНК ген, подлежащий выделению из экспрессии. На этом этапе работы молекулы к-ДНК обычно вводят в состав плазмид или генома бактериофагов, которые служат векторами. Затем рекомбинантные плазмиды со встроенными молекулами к-ДНК переносят в клетки находящихся бактерий-хозяев.

Включение ДНК в плазмидные и фаговые векторы.

Обычно выбор вектора определяется штаммом хозяина, который используется для экспрессии клонированной ДНК. Если в роли хозяина выступает Е. coli, плазмидный вектор скорее всего представляет собой производное рВР322, а если хозяином является Bacillus spp., то векторные плазмиды получают из различных видов Bacillus или Staphylococcus. Вектор для Saccharomyces cereuisiae конструируют либо на основе плазмиды длиной 2 мкм, либо из фрагментов хромосом дрожжей, способных реплицироваться пироваться в одном или нескольких организмах-хозяевах. Применение таких векторов оказывается весьма перспективным в связи с тем, что нередко для наработки большого количества плазмид и для трансформации ДНК удобнее в роли хозяина использовать E. сoli.

Обычный метод клонирования ДНК основан на расщеплении плазмидной и встраиваемой ДНК одной и той же рестриктазой. При этом получаются молекулы с липкими концами, которые затем отжигают, получают кольцевую рекомбинантную молекулу и сшивают ДНК-лигазой фага Т4. в случае плазмиды рВР322 встраивание обычно осуществляют по генам устойчивости к антибиотикам, поскольку такие рекомбинантные молекулы легко распознать по их неспособности обеспечивать устойчивость.

ДНК-лигазу фага Т4 можно применять и для сшивания тупых концов молекул ДНК, хотя этот процесс осуществляется труднее, чем в случае липких концов.

Експрессия клонированных генов.

С помощью бактерий были получены с высоким выходом некоторые белки - продукты генов животных и их вирусов. Так, были созданы штамы E. сoli, у которых 20% всего белка составляли корковый антиген вируса гепатита В, гормон роста человека или главный капсидный антиген вируса ящура. У одного из конструируемых штаммов B. Subtilis, антиген составлял около 1% синтезируемого этой бактерией белка. Однако добиться экспрессии в бактериальных клетках генов некоторых белков животных или их вирусов совсем не просто, даже если эти гены сопряжены с сигналами инициации транпкрипции и трансляции, которые обеспечивают в норме высокий уровень экспрессии генов прокариот.

Литература

  1. Браун В. Генетика бактерий. М., 1968
  2. Пехов А.П. Генетика микроорганизмов. М, 1977
  3. Брода Э. Эволюция биоэнергетических процессов. М., 1978
  4. Иванова О.А. Генетика. М., 1974
  5. Дубинин Н.П. Общая генетика. М., 1970
  6. Петухов В.Л., Жигачев АИ., Назарова Г.А.Ветеринарная генетика с основами вариационной статистики. М., 1985
  7. Малахов А.Г., Вишняков СИ. Биохимия сельскохозяйственных животных. М, 1984
  8. Кемп П., Арме К. Введение в биологию. М., 1988
  9. Льюин Б. Гены. М., 1987
  10. Яблоков А.В., Юсуфов А.Г. Эволюционное учение. М., 1989
  11. Гринн Н., Стаут У., Тейлор Д. Биология. М., 1990
  12. Воробьев А.А., Быков А.С. Микробиология и иммунология. М., 1999
  13. Радчук Н.А., Дунаев Г.В. Ветеринарная микробиология и иммунология. М., 1991
  14. Новиков Д.К., Генералов ИИ. Медицинская микробиология. Витебск, 2002
  15. Общая микробиология и иммунология. Солонеко А.А., Гласкович А.А. Минск, 2002
  16. Галактионов ВТ. Иммунология. М., 2000