Генетика микроорганизмов
Дипломная работа - Биология
Другие дипломы по предмету Биология
экспрессироваться в клетках бактерий или дрожжей, то обычно вначале выделяют соответствующую м-РНК. Как правило, осуществить прямую экспрессию генов животных в бактериальных клетках не удается, поскольку эти гены содержат интроны.
Некоторые гены животных, например, кодирующие а-лейкоцитарные интерфероны, не содержат интронов и могут прямо экспрессироваться в бактериальных и дрожжевых клетках. Если в качестве исходного объекта приходится использовать м-РНК, то прежде всего следует найти ее источник - ткань, в которой этот продукт образуется в наибольшем количестве. Иногда таким источником служат опухолевые ткани или же клетки в культуре, образующие необходимую м-РНК.
После транскрипции данной м-РНК и получения комплементарной ДНК (к-ДНК) необходимо определить, какие из множества молекул этой к-ДНК ген, подлежащий выделению из экспрессии. На этом этапе работы молекулы к-ДНК обычно вводят в состав плазмид или генома бактериофагов, которые служат векторами. Затем рекомбинантные плазмиды со встроенными молекулами к-ДНК переносят в клетки находящихся бактерий-хозяев.
Включение ДНК в плазмидные и фаговые векторы.
Обычно выбор вектора определяется штаммом хозяина, который используется для экспрессии клонированной ДНК. Если в роли хозяина выступает Е. coli, плазмидный вектор скорее всего представляет собой производное рВР322, а если хозяином является Bacillus spp., то векторные плазмиды получают из различных видов Bacillus или Staphylococcus. Вектор для Saccharomyces cereuisiae конструируют либо на основе плазмиды длиной 2 мкм, либо из фрагментов хромосом дрожжей, способных реплицироваться пироваться в одном или нескольких организмах-хозяевах. Применение таких векторов оказывается весьма перспективным в связи с тем, что нередко для наработки большого количества плазмид и для трансформации ДНК удобнее в роли хозяина использовать E. сoli.
Обычный метод клонирования ДНК основан на расщеплении плазмидной и встраиваемой ДНК одной и той же рестриктазой. При этом получаются молекулы с липкими концами, которые затем отжигают, получают кольцевую рекомбинантную молекулу и сшивают ДНК-лигазой фага Т4. в случае плазмиды рВР322 встраивание обычно осуществляют по генам устойчивости к антибиотикам, поскольку такие рекомбинантные молекулы легко распознать по их неспособности обеспечивать устойчивость.
ДНК-лигазу фага Т4 можно применять и для сшивания тупых концов молекул ДНК, хотя этот процесс осуществляется труднее, чем в случае липких концов.
Експрессия клонированных генов.
С помощью бактерий были получены с высоким выходом некоторые белки - продукты генов животных и их вирусов. Так, были созданы штамы E. сoli, у которых 20% всего белка составляли корковый антиген вируса гепатита В, гормон роста человека или главный капсидный антиген вируса ящура. У одного из конструируемых штаммов B. Subtilis, антиген составлял около 1% синтезируемого этой бактерией белка. Однако добиться экспрессии в бактериальных клетках генов некоторых белков животных или их вирусов совсем не просто, даже если эти гены сопряжены с сигналами инициации транпкрипции и трансляции, которые обеспечивают в норме высокий уровень экспрессии генов прокариот.
Литература
- Браун В. Генетика бактерий. М., 1968
- Пехов А.П. Генетика микроорганизмов. М, 1977
- Брода Э. Эволюция биоэнергетических процессов. М., 1978
- Иванова О.А. Генетика. М., 1974
- Дубинин Н.П. Общая генетика. М., 1970
- Петухов В.Л., Жигачев АИ., Назарова Г.А.Ветеринарная генетика с основами вариационной статистики. М., 1985
- Малахов А.Г., Вишняков СИ. Биохимия сельскохозяйственных животных. М, 1984
- Кемп П., Арме К. Введение в биологию. М., 1988
- Льюин Б. Гены. М., 1987
- Яблоков А.В., Юсуфов А.Г. Эволюционное учение. М., 1989
- Гринн Н., Стаут У., Тейлор Д. Биология. М., 1990
- Воробьев А.А., Быков А.С. Микробиология и иммунология. М., 1999
- Радчук Н.А., Дунаев Г.В. Ветеринарная микробиология и иммунология. М., 1991
- Новиков Д.К., Генералов ИИ. Медицинская микробиология. Витебск, 2002
- Общая микробиология и иммунология. Солонеко А.А., Гласкович А.А. Минск, 2002
- Галактионов ВТ. Иммунология. М., 2000