Генетика микроорганизмов
Дипломная работа - Биология
Другие дипломы по предмету Биология
Вµт служить покрытие дельта-вируса белком вируса генотипа В-Hbs- антигеном.
Фенотипическое смешивание - это процесс при котором геном одного из вирусов оказывается заключенным в капсид другого. Фенотипическое смешивание наблюдают при совместном культивировании вирусов.
13. Методы молекулярно-генетического анализа
Изучение генома микроорганизмов осуществляют с помощью методов молекулярно-генетического анализа. Известные в наше время методы этого анализа характеризуются сложностью, высокой чувствительностью и точностью.
Основным способом генетического анализа считают метод молекулярной гибридизации. Сущность способа заключается во взаимодействии комплементарных цепей ДНК или РНК, в результате которого образуются двунитчатые структуры. Гибридизация может осуществляться между комплементарными молекулами ДНК и ДНК, ДНК и РНК, РНК и РНК. Гибридизация осуществляют поэтапно. Сначала деспирализуют генетический материал с целью получения одноцепочных структур, затем адсорбируют его на нитроцеллюлозной мембране. Следующим этапом является обработка материала зондом, который представляет собой короткую последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарной исследуемой кислоте и меченную радиоактивным фосфором. После обработки материала зондом, исследуемые пробы помещают в специальный счетчик. Искомую последовательность нуклеиновой кислоты в материале определяют по степени радиоактивности пробы. Метод высокочувствителен, т. к. позволяет выявить до 10-10 г. нуклеиновой кислоты в 1 г. материала.
В начале 80-х годов К. Мюллисом был разработан способ под названием полимеразная цепная реакция (ПЦР). Суть этого метода сводится к следующему. Исследуемый материал нагревают до 90-100 С, что приводит к раскручиванию 2-х цепочной ДНК на отдельные цепи. После расхождения цепей ДНК, к ним добавляют набор всех пуриновых и пиримидиновых оснований, праймеры и термостабильную ДНК, комплементарные той нуклеиновой кислоте, которую амплифицируют (накапливают). Затем смесь ДНК и праймеров охлаждают. При этом праймеры при наличии в смеси ДНК искомого гена связываются с его комплементарными участками. В результате синтезируются две копии гена. После этого цикл повторяют снова и снова. При каждом повторе цикла количество ДНК гена будет увеличиваться в 2 раза. Для проведения реакции необходимы специальные приборы - амплификаторы.
Этот метод позволяет обнаружить 100 молекул ДНК или РНК в 1 г. исследуемого материала, т. е. является самым высокочувствительным методом из всех известных в настоящее время.
ПЦР применяют для диагностики вирусных и бактериальных инфекций, анализ рекомбинаций фагов
Естественно, что гибридизация фагов, происходящая в период их внутриклеточного размножения, не может быть обнаружена, если клетка заражается фаговыми частицами одного генотипа. Не обнаруживается она и при смешанном заражении мутантом и нормальным фагом, так как гибридизация может быть выявлена лишь по рекомбинации признаков фагов двух генотипов. Накопление различных мутантных линий фагов оказалось необходимой предпосылкой проведения гибридизационной работы с фагами.
Очевидно, что для изоляции рекомбинантов необходимо различие между исходными формами минимум по двум признакам. Такой опыт был впервые проведен с фагом Т2 при смешанном заражении клеток Echerichia coli мутантами hR и Hr. В потомстве фагов, освобожденном при лизисе клеток, были обнаружены частицы дикого типа (Т2 НR)I и двойного мутанта. Появление таких рекомбинантных генотипов говорило о том, что при размножении фаговых частиц двух генотипов в одной бактерии происходит в той или иной форме гибридизации.
Для генетика возможно при обнаружении рекомбинантов количественно оценить частоту, с которой они появляются.
Рассмотрим скрещивание у фага Т4 между тройным мутантом (m r tu) и фагом дикого типа (M R Tu). В потомстве от смешанного заражения такими фагами наблюдались частицы восьми генотипов - следовательно, все рассматриваемые гены рекомбинируют. Если бы они рекомбинировали свободно, то все восемь классов в потомстве появились бы с равной численностью. В действительности же резко преобладают родительские типы (m r tu и M R Tu). Так, в одном опыте среди 10342 колоний было найдено родительских генотипов: m r tu - 3467, M R Tu - 3729; рекомбинантных: m R Tu - 520, M r tu - 474, m r Tu - 853, M R tu - 965, m R tu - 162, M r Tu - 172. Помимо преобладания родительских генотипов в потомстве, обращает на себя внимание и приблизительное равенство численностей взаимодополняющих рекомбинантных классов (например, m R Tu и M r tu), т.е. картина расщепления выглядит также, как картина расщепления в мейозе тригетерозиготы по специальным генам у любого высшего организма. Если это так, то можно по законам расщепления вычислить частоту встречаемости рекомбинантов.
Определим частоту рекомбинации для пары генов m и r, т.е. отношение числа рекомбинантов по этим генам к общему числу потомков:
(520+474+162+172) / 10342 =0,129
для пары r и tu частота рекомбинации будет равна 0,208, а для пары m и tu - 0,271. из этих результатов следует, что все три гена iеплены и могут быть линейно расположены в порядке m-r-tu. Понятно, что найденная частота рекомбинации пары m и tu занижена, так как при ее определении не были учтены двойные обмены (генотипы m R tu и M r Tu).
Итак, генетический анализ рекомбинации у фагов может проводиться также, как и в генетике высших организмов. Анализ разнообразных скрещиваний у фага T4 показал, что все изученные гены фага могут быть расположены в линейном порядке в од