Выделение чистых культур целлюлозолитических микроорганизмов из короедов
Информация - Биология
Другие материалы по предмету Биология
?фференциации микробных клеток, основанный на различии в химическом составе клеточных оболочек. Сущность его в том, что в клетках одних видов микроорганизмов образуется нерастворимое в спирте соединение йода с основным красителем, у других видов это соединение временно появляется временно и после обработки спиртом растворяется. Микробы первой группы называются грамположительными, второй - грамотрицательными.
Техника окраски по Граму. На хорошо обезжиренное стекло наносят три тонких мазка разных культур микроорганизмов (два из них - контрольные с заведомо известным отношением к окраске по Граму). Мазки высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и окрашивают в течение 1мин феноловым раствором генциана фиолетового (или кристаллического фиолетового), держа стекло в несколько наклоненном положении. Препарат, не промывая водой, обрабатывают, непрерывно покачивая ,96% -ным спиртом в течение 15-20 с. Время обесцвечивания очень существенно, при превышении указанного срока обесцвечиваются и грамположительные клетки, при недостаточном сроке обработки препарат окажется перекрашенным.
Промыв препарат водой, его окрашивают фуксином Пфейфера в течение 1мин. После этой обработки грамположительные микроорганизмы окрашиваются в темно - фиолетовый цвет, грамотрицательные имеют только цвет дополнительной окраски.
Выделение каталазы. Проводят на предметном стекле в капле 5% перекиси водорода. Стерильной бактериологической петлей вносят исследуемую культуру и тщательно перемешивают. При наличии каталазы происходит разложение перекиси водорода с выделением пузырьков кислорода.
Проба на аммиак. Выделяющийся в атмосферу аммиак окрашивает подвешенную влажную красную лакмусовую бумагу в синий цвет. Накопления аммиака в среде устанавливают при помощи реактива Несслера. На предметное стекло наносят каплю исследуемой культуральной жидкости и вносят каплю реактива Несслера. При большом количестве аммиака образуется коричневый или буроватый осадок, при небольшом - появляется оранжевая или желтая окраска.
Проба на сероводород. Полоску фильтров бумаги пропитывают раствором уксуснокислого свинца, высушивают и помещают в пробирку, укрепив ватной пробкой. В присутствии сероводорода полоска бумаги через несколько дней чернеет. Образование на поверхности почерневшей бумаги серебристого налета свидетельствуют о выделении и других соединений среды (меркаптанов). При введении в состав питательной среды лимоннокислого или виннокислого железа выделение сероводорода ведет к почернению всей среды. Поверхностный посев. Перед посевом поверхностным способом разливают расплавленную агаризованную питательную среду в ряд стерильных чашек Петри по 15 - 20 мл в каждую. Чашки оставляют на горизонтальной поверхности, пока среда не застынет. Поверхность агаризованных сред перед посевом рекомендуется подсушить для удаления конденсационной воды, например, поместив чашки в термостат на 2-3 суток крышками вниз. В чашку Петри с подсушенной средой вносят точно измеренный объем (0,05 или 0,1 мл) соответствующего разведения и распределяют его стеклянным шпателем по поверхности среды. Высевы на плотную поверхность проводят, как правило, из трех последних разведений, причем из каждого делают 2 - 4 параллельных высева. Посевы можно делать одной пипеткой, но при этом начинать следует обязательно с большего разведения. Для каждого разведения используют новый стерильный шпателем. После посева чашки Петри помещают в термостат крышками вниз. Среды Гисса (Пестрый ряд). Гисс - разновидность дифференциальных сред, предназначенных для изучения сахаролитических свойств микроорганизмов. Состав: пептонная вода или бульон, углевод (сахар или многоатомный спирт), индикатор рН. В пробирки с глюкозой помещают "поплавок", что позволяет определить глубину расщепления: - кислота, КГ - кислота и газ. В качестве основы может использоваться полужидкий агар.
Среда Гетчинсона (г/л): NaNO3 - 2,5; FeCl3 - 0,01; K2HPO4 - 1; MgSO4*7H2O - 0,3; NaCl - 0,1; CaCl2 - 0,1; pH среды доводят до 7,2, добавлением 20% - го раствора Na2CO3; дистиллированная вода; МПА.
.2 Ход работы
Субстрат: КОРОЕД.
1.Исследуемые короеды растираем в ступке пестиком со стерильным песком, затем добавляем дистиллированной воды, размешиваем до образования однородной массы. И делаем посев на жидкую среду Гетчинсона в три колбы на 250 мл. Питательной средой является фильтровальная бумага, сложенная в форме конуса. Опускаем бумагу в колбу конусом вниз. Далее ставим в термостат при 37 0С .
2.После того как начнется разложение фильтровальной бумаги микроскопируем, для того чтобы определить какие выросли микроорганизмы.
.Чтобы выделить чистую культуру микроорганизмов, делаем пересев на плотную среду Гетчинсона с МПА с помощью поверхностного посева из накопительной культуры. В качестве питательной среды - полоски фильтровальной бумаги. Затем ставим в термостат при 37 0С.
.О получении чистой культуры судят по выявлению характерных признаков развития выделяемых микроорганизмов. Помимо визуального наблюдения накопительную культуру микроскопируют и выявляют присутствие желаемых форм, или продуктов метаболизма, образование которых свойственно выделяемым микроорганизмам.
.Выявление каталазы. Проводят на предметном стекле в капле 5% перекиси водорода. Стерильной бактериологической петлей вносят исследуемую культуру и тщательно перемешивают. При наличии каталазы происходит разложение перекиси водорода с выделе?/p>