Физиолого-биохимическая характеристика вида Pseudomonas corrugata
Курсовой проект - Сельское хозяйство
Другие курсовые по предмету Сельское хозяйство
Также липодепсипептиды, кислотная часть представлена 3-гидроксидеканоатом у кормицина А, и цис-3-гидрокси-5-додеценоатом у кормицина Б (рис 10). Проявляют сходную с кормицином бактерицидную активность и повреждают листья табака (Scaloni et al., 1998).
Рисунок 10. Структурная формула корпептина А (Scaloni et al., 1998).
2. Материалы и методы
2.1 Объекты исследования
В данной работе использовались штаммы, представленные в таблице 5.
Таблица 5
Использованные в исследовании штаммы
ШтаммИсточник выделения10864Новая Зеландия, 19909849Новая Зеландия, 1991DSM 7228Германия, июль 2002DAR 61730Австралия, февраль 198937.1ЧУП "Озерицкий-Агро", Смолевичского района, Минской области, 23.04.20093мКСУП "Светлогорская овощная фабрика", Светлогорского района, Гомельской области, апрель 20073.2УКАП фирма "Днепр", Могилёвского района, Могилёвской области, 11.04.2008JMB 9069Институт микробиологии и вирусологии им.Д.К. Заболотного НАН Украины
2.2 Среды и растворы
1. Плотная питательная среда:
агар-агар - 15 г
питательный бульон - до 1000 мл
. Буфер для ПЦР (pH 8,8):
Трис-HCl - 650 ммоль
(NH4) 2SO4 - 166 ммоль
МgCl2 - Твин 20
H2O - До 10 мл
. Загрузочный буфер (pH 7,6):
Трис-HCl - 10 ммоль
бромфенол синий - 30 мл
ксилен цианола - 30 мл
глицерин - 0,6 мл
ЭДТА - 60 ммоль2O - до 1 мл
. TAE-буфер (pH 8,0):
трис-основание - 4,84 г
уксусная кислота (ледяная) - 1,142 мл
.5М ЭДТАNa2 (pH 8,0) - 0,2 мл
этидия бромид (10 мг/мл) - 50 мкл2O дистиллированная - до 1000 мл
. Агароза (0,8%):
агароза - 0,8 г
ТАЕ буфер (pH 8,0) - до 100 мл
2.3 Методы исследования
1. Амплификация ДНК.
1) Ночные культуры исследуемых штаммов с 1,5% агаризированной среды наконечником дозатора вносили в пробирки Эппендорф с 50 мкл дистиллированной стерильной воды и встряхивали. Количество клеток оценивали визуально по степени мутности суспензии.
) В пробирку Эппендорф добавляли реактивы.
Таблица 6
Реактивы для ПЦР
Порядок внесенияРеактивВносимый объём1Вода дистиллированная стерильная100 мкл210х буфер18 мкл3Смесь праймеров PC 1/1 и PC 1/2,2 пмоль/мкл, и PC 5/1 и PC 5/2, пмоль/мкл18 мкл4Смесь нуклеотидов18мкл5Taq-полимераза1 ед.
Общий объём смеси - 172 мкл.
) Полученную смесь реактивов разливали по 19 мкл в девять пронумерованных пробирок Эппендорф, стоящих на льду. В первые восемь пробирок вносили по 1 мкл соответствующих клеточных суспензий. Девятую пробирку оставляли без матрицы, в качестве негативного контроля.
) Девять образцов амплифицировали по следующей программе:
. один цикл:
94C 5 мин;
.27 циклов:
94C 30 сек,
62C 30 сек,
72C 1 мин;
. один цикл:
72C 3 мин;
. Охлаждение до 4C.
Пробы хранились замороженными.
2. Электрофорез ДНК в агарозном геле.
1) Агарозный гель плавили на водяной бане.
) В электрофорезный аппарат устанавливали планшетку для лунок, заливали раствором агарозы. После застывания агарозы гребёнку доставали. Планшетку с готовыми лунками заливали буфером ТАЕ.
) К размороженным амплифицированным пробам добавляли 4 мкл 6-кратного загрузочного буфера. Вносили препараты в лунки.
) В десятую лунку добавляли ДНК-маркер, для определения размеров фрагментов.
) Электрофорез проводили при напряжении 100В.
) Гель извлекали из аппарата и визуализировали в ультрафиолетовом свете.
3. Результаты исследований и их обсуждение
Целью данного исследования была оценка возможности использования видоспецифичных праймеров для диагностики Ps. corrugata как возбудителя некроза сердцевины томата. Использовались праймеры, разработанные методом ПЦР со случайной амплификацией полиморфной ДНК. Образцы были подвергнуты амплификации и электрофорезу.
Исследовались как выделенные из заражённых растений (37.1, 3м и 3.2), так и коллекционные.
Результаты электрофореза представлены на рисунке 11.
Рисунок 11. Результаты электрофореза ДНК.1 - 10864; 2 - 9849; 3-DSM 7228; 4 - DAR 61730; 5 - 37.1; 6 - 3м; 7 - 3.2; 8 - JMB 9069; 9 - негативный контроль; 10 - ДНК-маркер.
Ожидаемый продукт 1100 п. н. был получен из препаратов штаммов 10864, 9849, DSM 7228, 37.1, 3м.
Штамм 3.2 предварительно определён как Ps. corrugate, однако точная видовая принадлежность не установлена.
Коллекционные штаммы DAR 61730 и JMB 9069 характерного продукта не дали по неизвестным причинам.
Выводы
. Амплификацию с праймерами PC 1/1, PC 1/2 и PC 5/1, PC 5/2 можно использовать для видового определения бактерий Ps. corrugata.
2. Использованный тест не универсален, т.к. не все изучаемые штаммы дали характерный для Ps. corrugata продукт амплификации.
Список литературы
1.И.А. Прищепа, В.В. Вабищевич. Основные бактериальные болезни огурца и томата защищенного грунта. - Несвиж: Несвиж. укрупн. тип., 2008. - 52 с.
2.Anzai Y., Kim H.,Park J., Wakabayashi H. and Oyaizu H. Phylogenetic affiliation of the pseudomonads based on 16S rRNA sequence // Int J Syst Evol Microbiol. - 2000. - 50. p.1563-1589.
.Bella P., Greco S., Polizzi G., Cirvilleri G. and Catara V. Soil ?tness and thermal sensitivity of Pseudomonas corrugata strains // Acta Hortic. (ISHS). - 2003. - 614. p.831-836.
.Basim H., Basim E., Yilmaz S. and Ilkucan M. First report of pith necrosis of tomato caused by Pseudomonas mediterranea in Turkey // Plant Pathology. - 2005. - 54, p.240.
.Catara V., Gardan L. and Lopez M. M. Phenotypic heterogenety of Pseudomonas corrugata strains from southern Italy // Journal of Applied Microbiology - 1997. - 83. p.576-586.
.Catara V., Arnold D., Cirvilleri G. and Vivian A. Speci?c oligonucleotide primers for the rapid identi?cation and detection of the agent of tomato pith necrosis, Pseudomonas corrugata, by PCR ampli?cation: evidence for two distinct genomic groups // European Journal of Plant Pathology. - 2000. - 106. p.753-762.
.Catara V., Sutra L., Morineau A., Achouak W., Christen R. and Gardan L. Phenotypic and genomic evidence for the revision of Pseudomonas corrugata and proposal of Pseudomonas mediterr