Полиморфизм гена эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) у детей с отягощенным семейным анамнезом по сердечно-сосудистой патологии
Дипломная работа - Медицина, физкультура, здравоохранение
Другие дипломы по предмету Медицина, физкультура, здравоохранение
p>
1)группа риска ССЗ из 101 ребенка и подростка в возрасте от 4-х до 17-ти лет из семей, имеющих наследственную отягощенность по сердечно-сосудистой патологии у родственников первой и второй степеней родства;
2)контрольная группа из 144 практически здоровых детей и подростков сопоставимого возраста, не имеющих наследственной отягощенности по ССЗ и связанных с ними осложнений.
Использованные материалы, реактивы и оборудование
При выполнении работы применялись следующие реактивы и ферменты: персульфат аммония, ЭДТА, протеиназа К (Helicon, Россия), ТЕМЕД, додецилсульфат натрия, трис-HCl (Serva, ФРГ), хлорид натрия, хлорид магния, сульфат аммония (Сибэнзим, Россия), буфер для ДНК-полимеразы (Сибэнзим, Россия), олигонуклеотидные праймеры (Литех, Россия), дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, агароза; и оборудование: программируемый термоциклер Biometra (США), центрифугу Beckman Великобритания), автоматический анализатор BioRad (Италия).
Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови
Для выделения ДНК из лимфоцитов периферической крови использовали модифицированный метод фенольно-хлороформной экстракции (Blin N., Stafford D.W. 1976).
В пластиковую пробирку, содержащую Na2ЭДТА (pH=8,0) в качестве антикоагулянта забирали кровь самотеком из локтевой вены в необходимом количестве. Кровь перемешивали в пробирке для предотвращения образования тромбов.
К 0.5 мл цельной крови, содержащей Na2ЭДТА (pH=8,0) в качестве антикоагулянта, добавляли 1 мл стерильной дистиллированной воды, перемешивали и центрифугировали 2 минуты при 10000 об/мин. Полученный осадок лейкоцитов еще дважды ресуспендировали и отмывали в 1 мл стерильной дистиллированной воды. Полученный осадок растворили в 0,2 мл буфера для протеиназы К (20 mM Tris-HCl; pH=8.0; 10 mM ЭДТА, 150,0 mM NaCl, 1% SDS). После этого добавляли протеиназу К до конечной концентрации 250 мг/мл в растворе. Смесь инкубировали в течение 16 часов при 560С. Экстракцию белков проводили, добавив равный объем смеси фенол: хлороформ: изоамиловый спирт в соотношении 25:24:1 и центрифугировали 10 минут при 10000 об/мин. Водную фазу отбирали в новую пробирку. К полученной водной фазе добавляли 2-2.5 объема охлажденного 96% этанола для осаждения ДНК. Полученный осадок ДНК промывали охлажденным 70% этанолом, просушивали на воздухе, и растворяли в 100 мкл стерильного ТЕ буфера (10 mM Tris-HCl; pH=8.0; 0,5 mM ЭДТА). Качество выделенной ДНК и ее приблизительную концентрацию оценивали с помощью электрофореза в 0.7% агарозном геле.
Полимеразно - цепная реакция (ПЦР)
Этот метод используется для преумножения необходимого фрагмента ДНК. Создается реакционный раствор, содержащий реакционный буфер, дезоксинуклеозидтрифосфаты, праймеры прямой и обратный (For и Rev), ДНК полимеразу и пробу выделенной ДНК в качестве матрицы. Праймер - это олигонуклеотид (18-25 нуклеотидов), необходимый для запуска полимеразной реакции. Необходимо наличие двух праймеров: по одному на каждую цепь. Для PCR берется ДНК полимераза бактерий, живущих в гейзерах и термальных источниках. Она устойчива к высокой температуре. PCR имеет три стадии:
) Денатурация. При 92-96 градусах цепи ДНК расходятся
) Отжиг праймеров на цепи ДНК. При определенной температуре, специально подобранной для каждой пары праймеров, праймеры садятся на цепи ДНК по принципу комплиментарности.
3) Элонгация. ДНК полимераза начинает синтез ДНК от праймера в направлении от 5 к 3 концу. Через определенное время происходит переход к первой фазе. При повторной денатурации вновь синтезированные цепи ДНК отходят от материнских. Через определенное количество циклов (порядка 30-35) реакция прерывается.
Проведение ПЦР для 4a4b полиморфизма гена эндотелиальной NO синтазы (eNOS)
a/4b полиморфизм обусловлен разным количеством 27-нуклеотидных повторов в четвертом интроне гена eNOS [22]. В норме их бывает четыре (4b-аллель), а при мутации - пять (4a-аллель).
Для ПЦР анализируемого участка гена eNOS были выбраны следующие праймеры:
- 5'-AGG CCC TAT GGT AGT GCC TTT-3'- 5'-TCT CTT AGT GCT GTG GTC AC-3'
циклов амплификации проводились в конечном объеме 20 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкг геномной ДНК, 250 пкмоль каждого праймера, 10мМ Tris-HCI pH 8.4, 1.2 mM, MgCI2, 50 mM KCI, 0,2 mМ каждого dNTP и одну единицу Taq-полимеразы (см. Таблицу 1). ПЦР включала: 45 сек - денатурация при 92 С, 45 сек - отжиг при 56 С и 45 сек - синтез при 72 С (см. Таблицу 2).
Для генотипирования eNOS, продукты ПЦР анализировались в 2% агарозном геле. При комбинации аллелей формируются три генотипа: 4a4a (393 п.н.) ; 4a4b(393 п.н, 420 п.н.); 4b4b (420 п.н.).
Электрофорез
Это метод разделения смеси веществ (белков, нуклеиновых кислот) на ее составляющие по массе в электрическом поле на носителе. В качестве носителя используют гель из агарозы. Концентрация агарозы в геле варьируется в зависимости от массы разделяемых фрагментов. В состав геля также входят вода и реакционный буфер. Расплав агарозы хранится в термостате при 60 градусах. Гель получается при заливке этого расплава на подложку, где он, при комнатной температуре, застывает В застывшем геле делаются лунки. Такой гель помещается в кювету между электродами. Сама кювета тоже заполнена буфером. Проба смешивается с краской и наносится в лунки геля. Затем в электрическом поле происходит разгонка пробы. Каждая фракция пробы с одинаковой массой формирует полосу. Эта полоса светится красным в ультрафиолете, за iет красителя. Определение массы этой фракции проводится относит