Книги по разным темам Pages:     | 1 |   ...   | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |   ...   | 85 |

Однако, лизофосфолипиды являются лишь промежуточным продуктом реакции и это выражение не отражает всех стадий гидролиза. К тому же, превращение лизофосфолипидов в глицеро-фосфо соединения происходит быстрее, чем гидролиз фосфотидилхолина до лизофосфолипидов. Для получения точных данных нами разработан метод измерения степени гидролиза, заключающийся в наблюдении за содержанием фосфотидилхолинов и лизофосфолипидов во времени методом ТСХ (или ВЭЖХ) и уровня глицеро-фосфо соединений, определяемого при анализе общего фосфата в супернатанте после экстракции липидов. В этом случае степень гидролиза выражается как отношение суммы концетраций фосфотидилхолинов, лизофосфолипидов и глицеро-фосфо соединений к первоначальной концетрации фосфотидилхолинов, что является более верным отражением степени гидролиза.

Влияние азотного голодания на эффективность функционирования фотосинтетического аппарата водорослей Chlamydomonas reinhardtii Толмачева Александра Викторовна (Москва, aleksandratolmachova@gmail.com) Азот является одним из основных элементов минерального питания фитопланктона.

Азотное голодание может привести к прекращению роста и гибели отдельных популяций фитопланктона. Предполагается, что на определенных стадиях роста снижение эффективности функционирования фотосинтетического аппарата водорослей (ФСА) связано именно с лимитированием по азоту.

Для доказательства этого утверждения было необходимо проследить динамику потребления азота на примере культуры водорослей Chlamydomonas reinhardtii и выяснить, на каком этапе роста водорослей возникает лимитирование по азоту. Определение влияния условий минерального питания на эффективность функционирования ФСА водорослей позволит контролировать и прогнозировать развитие фитопланктонного сообщества, что имеет важное прикладное значение для экологического мониторинга природных вод, процессов водоподготовки и водоочистки на производстве.

Эффективность функционирования ФСА с высокой точностью оценивается по флуоресценции хлорофилла. Разница между интенсивностями флуоресценции хлорофилла при переходе ФСА из активного состояния в неактивное называется переменной флуоресценцией Fv хлорофилла в клетках. Величина Fv соответствует той части энергии света, которая используется в фотосинтезе открытыми реакционными центрами фотосистемы 2, то есть может характеризовать активность первичных стадий фотосинтеза.

На практике оценивают отношение переменной флуоресценции к максимальной флуоресценции. Эта безразмерная энергетическая характеристика эффективности фотосинтеза, аналогичная коэффициенту полезного действия, является универсальной и не зависит от видовой специфики организма.

Содержание азота в аммонийной форме определяется индофенольным фотометрическим методом. В щелочной среде аммиак при взаимодействии с фенолом в присутствии окислителя - гипохлорита натрия - образует продукт синего цвета, называемый линдофенольная синь.

Анализ содержания аммонийного азота производился в культуральной среде водорослей Ch.reinhardtii. Трудности определения были связаны с влиянием химических свойств компонента питательной среды Taps триса на реакцию образования линдофенольной сини, которое в настоящее время не изучено. Исследования показали, что азот, входящий в аминогруппу триса, участвует в реакции образования линдофенольной сини, но его буферные свойства подавляют реакцию, что привело к плохо воспроизводимым результатам анализа. Поэтому для последующего определения содержания азота в среде была использована питательная среда УHigh-saltФ, не содержащая трис.

Динамика потребления азота в культуральной среде УHigh-saltФ показала, что культура водорослей Ch.reinhardtii по мере роста не испытывает азотного голодания, что подтверждается высокой эффективностью функционирования ФСА. Следовательно, необходимо многократно снизить исходное количество азота в среде и продолжить исследования, чтобы установить зависимость между обеспеченностью азотом в культуральной среде и эффективностью функционирования ФСА водорослей.

Исследование конформации примембранного гемоглобина с помощью спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния Хабатова Венера Владимировна (Москва, venera_khabatova@mail.ru) Свойства плазматической мембраны и мембранных белков в эритроцитах меняются на ранних стадиях сердечно-сосудистых заболеваний. Данные модификации влияют на конформацию примембранного гемоглобина, связанного с трансмембранным белком.

Поэтому примембранный гемоглобин может использоваться в качестве маркера патологий эритроцитов.

В нашем исследовании изучается конформация примембранного гемоглобина с помощью спектрскопии гигантского комбинационного рассеяния (ГКР) с использованием наночастиц серебра. Данные наночастицы адсорбируются на мембране эритроцита и усиливают КР сигнал от молекул примембранного гемоглобина. На поверхности наночастиц (НЧ) благородных металлов существует локальный поверхностный плазмонный резонанс, благодаря которому происходит усиление комбинационного рассеяния молекул, находящихся на расстоянии не более 15-20 нм от поверхности НЧ. Толщина мембраны клетки составляет около 10 нм. Оставшиеся 10 нм примембранной области содержит фракцию примембранного гемоглобина. Таким образом, ГКР обеспечивает получение информации о конформации примембранного гемоглобина в эритроцитах.

Целью нашего исследования является подбор оптимальных экспериментальных условий для максимального усиления КР сигнала от эритроцитов. Задачами нашего исследования являются: 1) найти экпериментальные условия для усиления КР сигнала от примембранного гемоглобина в эритроцитах, используя коллоиды серебряных наночастиц и две длины волны лазерного излучения (473 и 532 нм), 2) получить коллоиды серебряных наночастиц разного размера, 3) изучить ГКР сигнал эритроциов, зависящий от размера наночастиц серебра, 4) исследовать влияние серебряных наночастиц разного размера на морфологию эритроцитов.

В результате исследования мы подобрали экспериментальные условия для усиления КР сигнала от примембранного гемоглобина в эритроцитах с использованием серебряных наночастиц и двух длин волн лазерного излучения (473 и 532 нм). Также мы выяснили, что интенсивность ГКР спектров возрастает с уменьшением размеров наночастиц.

Автор выражает искреннюю благодарность научным руководителям Браже Н.А. и Максимову Г.В., а также сотрудникам лаборатории Паршину Е.Ю., Браже А.Р. и Юсиповича А.И. за помощь, советы и поддержку, оказанные в ходе выполения данной работы.

Микрохирургия преимплантационных эмбрионов при помощи системы лазерный скальпель - лазерный пинцет Храмова Ю.В., Сергеев С.А., Ракитянский М.М. (Москва, yul.khramova@gmail.com) Микрохирургия является важной частью работы с преимплантационными эмбрионами и применяется как в эксперименте, так и в клинической практике. Микрохирургические операции производят на эмбрионах на стадиях от зиготы (0,5сут. развития) до бластоцисты (3,5сут.). В клиниках ВРТ для проведения преимплантационной генетической диагностики производят биопсию редукционного тельца (РТ) или бластомера, разрезают zona pellucida (ZP) эмбриона при проведении вспомогательного хэтчинга. В экспериментальной эмбриологии при помощи микрохирургических методов вводят генетические конструкции в пронуклеус зиготы и генномодифицированные клетки в полость бластоцисты для получения трансгенных животных. В клиниках и лабораториях для осуществления всех этих процедур используют микроманипуляторы. Так, например, при биопсии эмбриона двумя стеклянными иглами механически разрушают участок ZP и через полученное отверстие с помощью иглы для биопсии изымают бластомер или РТ. В последние годы разрабатываются методы лазерной микрохирургии эмбрионов.

Нами была разработана методика проведения микрохирургических операций на преимплантационных эмбрионах мыши с помощью лазерного пинцета (ЛП) и лазерного скальпеля (ЛС). Мы использовали установку на основе фемтосекундного хромфорстеритового лазера с длиной волны 620нм, импульсной мощностью 1-15мВт, длительностью импульсов 100фс и инвертированного микроскопа с эпи-положением лазерного луча, разработанную в отделе лазерной плазмы Объединенного института высоких температур РАН. Эмбрионы мыши 1,5-2,5сут. помещали в микрокаплю среды для манипуляций, покрывали минеральным маслом, для получения отверстия в ZP производили серию выстрелов в режиме ЛС и с помощью ЛП (длина волны лазерного излучения 1060нм) извлекали РТ. Для осуществления слияния бластомеров на стадии двух клеток также производили одиночные выстрелы в режиме ЛС. Были подобраны параметры установки, при которых в наибольшем проценте случаев достигали слияния бластомеров.

Так, если выстрел производили точно по линии контакта бластомеров при наведенном фокусе, то в не зависимости от энергии удара происходила гибель эмбриона в 90% случаев.

В то же время, если выстрелы проводили при не наведенном фокусе, в 45% случаев происходило успешное слияние. Для визуализации процесса слияния мембраны эмбрионы окрашивали флуоресцентным красителем FM4-64 (F34653, Invitrogen) при +4С и фиксировали 4% р-ром параформальдегида в ФБС, готовили тотальные препараты, которые изучали при помощи конфокального микроскопа (Axiovert 200M 510Meta, Zeiss, Германия).

Для получения отверстия в ZP, достаточного для извлечения РТ и/или бластомера в среднем давали 10 импульсов (эффективность - 97%), а затем с помощью ЛП извлекали клетки.

Эффективность биопсии при извлечении РТ - 50%.

Таким образом, проведение микроопераций при помощи системы лазерный скальпель - лазерный пинцет, представляется перспективной технологией для микрохирургии эмбрионов.

Изучение структуры С-терминального домена CAP-комплекса дрожжей по данным электронной микроскопии Шаров Григорий Германович (Москва, sharov.grigory@gmail.com) Процессы сборки и разборки актиновых филаментов, а также направление и скорость роста регулируются не только концентрацией мономерного актина в определенных частях клетки, но и большим комплексом актин-связывающих белков (АСБ). В настоящее время известно более 160 АСБ. Большинство из них взаимодействует с фибриллярным F-актином и только некоторые с мономерным G-актином (в том числе CAP).

Белок CAP обнаружен в большинстве эукариотических клеток. Он представляет собой молекулярную машину - высокомолекулярный комплекс с актином, имеющий множество сайтов связывания с другими АСБ. Участвуя в процессе обновления актиновых филаментов, N- и C-фрагменты комплекса работают последовательно, освобождая молекулы актина и кофилина. Получение пространственной структуры этого комплекса и объяснение механизма его работы является необходимой задачей для понимания функционирования актинового цитоскелета.

Для мономера CAP известны кристаллические структуры отдельных доменов: N- (1S0P) и С-концов (1K4Z), но нет данных о пространственной структуре. Результаты аналитического ультрацентрифугирования позволяют предположить, что комплекс является гексамером с молекулярной массой около 600кДа из 12 молекул САР и актина в соотношении 1:1.

Целью данной работы является получение 3D реконструкции С-концевого фрагмента САР. Известно, что именно он ответственен за связывание мономерного актина.

С-САР домен представлен бета-спиральными участками. Известная кристаллическая структура фрагмента представляет собой димер, каждый мономер которого включает правозакрученных бета-спиралей, окруженных антипараллельными бета-слоями.

Для изучения методом электронной микроскопии структуры С-САР (в комплексе с актином), полноразмерный комплекс САР с мономерным актином выделяли из дрожжей и наносили на сетки с углеродной подложкой. Негативно окрашенные сетки исследовали на микроскопе Philips CM12 в условиях низкой дозы (120кВ, увеличение 60000). Отбор удачных изображений отдельных молекул С-САР для последующего построения 3D структуры проводился вручную с помощью программы Signature. На основе этих изображений после коррекции частотно-контрастной характеристики с помощью программы IMAGIC была получена объёмная структура С-концевого домена САР. 3D структура С-САР имеет форму подковы с линейными размерами 129нм. Для интерпретации результатов проводили докинг кристаллических структур С-концевого домена САР и мономерного актина в полученную электронную плотность. Было показано, что 3D структура может вместить два мономера С-концевого домена, каждый из которых связан с одной молекулой актина. Молекулярная масса димерного комплекса С-САР с учетом двух молекул актина составляет около 150кДа, что соответствует рассчитанной массе 3D реконструкции.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что в полноразмерном комплексе САР с актином С-концевые домены организованы в димеры, стабилизированные N-концевыми двойными спиралями.

Работа поддержана грантами CRDF (№2918) и РФФИ (№08-04-91125).

Разработка детоксикационных и антибактериальных препаратов на основе лишайникового сырья Шеин Алексей Анатольевич (Якутск, bg98saa@yandex.ru) Разработка и внедрение препаратов на основе уникального природного северного биосырья - слоевищ лишайников из родов цетрарии (Cetraria) и кладонии (Cladonia) относится к важнейшим фундаментальным и прикладным аспектам медицины. Различные варианты предэкстракционной подготовки лишайникового сырья позволяют получать препараты с различным физиологическим действием на организм человека.

Первое направление - разработка препарата детоксикационного действия УЯГЕЛЬФ.

Исследования связаны с применением технологии экстракции антиоксидантов (флавоноидов, ароматических кислот и пигментов, полиненасыщенных жирных кислот, хинонов), природных антибиотиков из смеси тканей лишайников кладины и цетрарии (ягель) в среде сверхкритического диоксида углерода. В сверхкритическом состоянии диоксид углерода способен активировать воду, проникать вместе с ней в нанонопоры амино-полисахаридов, где происходит гидролиз -гликозидных связей и образуются амино-олигосахариды, обладающие детоксикационным действием по отношению к катионам тяжелых металлов и карбонильным соединениям (альдегидам и кетонам).

Pages:     | 1 |   ...   | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |   ...   | 85 |    Книги по разным темам