Книги по разным темам Pages:     | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | ЗООБИОТЕХНОЛОГИЯ О.В. Мосин Зообиотехнология является ветвью биотехнологии.

Принципиальное отличие ее от микробной биотехнологии и фитобиотехнологии состоит в том, что объектами зообиотехнологии являются клетки животных и человека.

Как известно из биологии наипростейшими животными существами клеточной организации являются протозоиные организмы, или Protozoa (от греч. protosЧпервый, zoonЧ животное, живое существо), составляющие самостоятельный отдел в царстве Animalia (таблица 1).

Т а б л и ц а 1. Представители царства Animalia №№ Отдел Типы или классы п/п 1 Protozoa Типы: Acanthariae Ч акантарии, Ascetospora Ч (простейшие) -асцето споровые, Ciliophora реснитчатые, Cnidosporida Ч книдоспоридевые, Mastigophora Ч жгутиконосцы, Microsporida Ч микроспоридевые, Opalinidomorpha - Ч опалинидоформные, Sarcodina -ложноножки, Sporozoa Ч споровики.

2 Клас Parazoa (губки) сы: Calcarea известковые губки, Demospongiae Ч обыкновенные губки, Hexactinellida Ч кремниевые шестилучевые губки.

3 Metazoa Annelida Ч Х кольчатые черви, Arthropoda Ч (многоклеточные членистоногие, Chordata Ч хордовые, Coelenterata Ч гетеротрофные Х кишечнополостные, Echinodermata Ч иглокожие, животные) Mollusca Ч моллюски, или мягкотелые, Nematoda Ч круглые черви, Platyhelminthes Ч плоские черви.

Из 65 тысяч видов Protozoa в мире 55 тысяч являются свободно живущими в природе, а 10 тысяч ведут паразитический образ жизни.

Среди выделяемых ныне 9 типов простейших организмов жгутиковым отводят место пограничных существ, являющихся ближайшими предками многоклеточных животных и растений и образующих связующее звено между ними.

Поддержание Protozoa в культуре - дело достаточно сложное, однако многие виды удается выращивать на относительно простых средах или на более сложных, рекомендованных для культивирования клеток и тканей животных. Для некоторых протозойных видов целесообразно добавлять в среды споровые бактерии (Вас. subtills) и/или дрожжи (Saccharomyces cerevisiae и др.). Это обусловлено их фагоцитарной активностью.

С биотехнологических позиций попеременный интерес был проявлен к препаратам круцину (Н. Г. Клюева, Г. И.

Роскин) и его аналогу Ч трипанозе (Ж. Кудер, Ж. Мишель-Брэн и др.) получаемым с помощью Trypanosoma (Schizotrypanum) cruzi, астазилиду (Н. Н. Сухарева-Немакова) Ч полу синтетическому продукту, включающему комплекс эфиров сахарозы и жирных кислот, выделенных из жгутиконосца Astasia longa, полисахаридам. В доклинических и клинических испытаниях они проявляли больший или меньший противоопухолевый эффект. Однако из-за нестабильности клинических результатов, неосвоенности крупномасштабного культивирования Protozoa и некоторых других причин зообиотехнология в этой области мало продвинулась вперед.

Из всех других представителей царства животных наибольший интерес представляют хордовые. Их подразделяют на два подтипа Ч бесчерепные (Protochordata, или Acrania) и черепные, или позвоночные (Craniata, или Vertebrata). Всех черепных объединяют в следующие классы: Cyclostomata (круглоротые), Pisces (рыбы), Amphibia (земноводные), Reptilia (пресмыкающиеся), Aves (птицы) и Mammalia (млекопитающие).

Значимость представителей царства животных в зообиотехнологии далеко неравноценная. Это связано с теми обстоятельствами, что во многих случаях еще не разработаны способы культивирования клеток не только в производственных, но и в лабораторных условиях, или, как говорят, "еще не дошли руки" до конкретных биообъектов животного происхождения, хотя техника однослойной культуры клеток впервые разработана еще в 1950 г. Ф. К.

Роббинсом и Дж. Ф. Эндерсом.

В настоящее время в промышленном масштабе освоено культивирование лимфобластов человека, продуцирующие интерферон, клетки-гибридомы, образующие моноклональные антитела; монослойные клеточные культуры различных тканей, использующиеся, например, для репродукции вирусов и т. д. Даже из этих немногочисленных примеров можно заключить, что первостепенной задачей для зообиотехнологических процессов является получение клеток и клеточных культур.

Способы выращивания клеток животных. Как известно, любые клетки животного организма происходят из оплодотворенной яйцеклетки, которая со временем развивается и дифференцируется (рис. 1).

Зародышевый диск включает эктодерму, эндодерму и мезодерму, из которых впоследствии образуются все ткани будущего организма. Но как только какую-либо ткань перевести в кулътуру, то наступает дедифференциация клеток и различить их становится делом трудным или невозможным. Например, для исследования в области онкологии важны культуры раковых клеток, о которых имеются сообщения в научной литературе. Такие клетки получены от больных раком легкого и щитовидной железы.

В 1986 г. в Японии впервые был получен в культуре штамм клеток рака желчного пузыря. Он был стабилен после 103 пассажей in vitro, сохранил прежнее число хромосом в пределах 76Ч101. Индуцируемый им опухолевый процесс и первичный рак желчного пузыря оказались тождественными по гистограмме. Подобный штамм оказался полезным при оценке противоопухолевых средств.

юбой штамм, представляющий определенную ценность для научно-практического использования, должен иметь следующие характеристики:

1) качество исходной ткани - нормальная или опухолевая (для опухолевой необходим показатель доброкачественности или злокачественности);

2) тип ткани Ч эмбриональная или зрелая;

3) принадлежность ткани Ч вид животного;

4) источник ткани Ч орган;

5) тип клетки (если известно);

6) наименование штамма (буквенное Ч не более букв и серия цифр нумерации);

7) номер клона, если штамм клонировался;

8) источник информации (ссылка на оригинальную публикацию).

Все способы выращивания клеток животных могут быть соотнесены либо к интактным (нетрансформированным с помощью вирусов), либо к вирусотрансформированным клеткам. Успех культивирования первых во многом обусловлен наличием и плотностью адгезинов, благодаря которым они проявляют эффект "заякоривания" на подлежащей поверхности стекла, металла или пластика. Однако такие клетки не растут в суспензионных культурах.

Вирусотрансформированные клетки животных, напротив, хорошо растут в виде суспензионных культур и хуже или совсем не растут в адгезированном состоянии.

Имеются такие штаммы животных клеток, которые могут расти и в прикрепленном состоянии, и в виде суспензии. Прикрепившиеся клетки размножаются, растут и развиваются до тех пор, пока не сольются в монослой, то есть плотность клеток выступает тормозным сигналом. Однако при смене питательной среды на новые порции наблюдается дальнейшее разрастание клеток в форме нескольких слившихся слоев. Подобного результата можно добиться при использовании других факторов воздействия на клеточные культуры (гормоны, ферменты, рН и т. д.). Тем не менее, на практике широко пользуются монослойными культурами.

Глубинное выращивание клеток в монослое. Рост клеток в виде монослоя зависит от адгезивных белков Ч фибронектинов (от лат. fibra Ч нить, nectere Ч связывать или соединять), обеспечивающих межклеточную адгезию, прикрепление клеток к подложке и направляющих их перемещения. В животном организме клетки, способные к перемещениям (особенно в период эмбрионального развития, при заживлении ран), и связанные с базальными мембранами, содержат на своей поверхности крупномолекулярные гликопротеиновые молекулы фибронектина, открытого в 1973 г. Р.О.

Хайнсом (Англия), К. Гамбергом и С.И. Хакомори (США) при изучении нормальных и опухолевых клеток. Фибронектин, полимеризуясь, образует длинные нити вокруг клетки, которые контактируют с клеточной мембраной и связываются с цитоскелетным белком-актином. Топология фибронектина в экстрацеллюлярном матриксе схематично представлена на рис. 2.

Молекула фибронектина состоит из двух субъединиц с ММ около 250 кДа, содержащих небольшие по размеру домены и соединенных на одном конце двумя SЧSмостиками. Размеры одной субъединицы 60Ч70x2Ч3 нм; на эту длину приходится от 2145 до 2445 остатков аминокислот.

Каждый домен отвечает за одну функцию фибронектина, например, за соединение с фибрином, другой домен Ч за прикрепление к пластику и т. д. (рис. 152).

Доказано, что фибронектин имеется у всех представителей царства Animalia, включая человека.

Амфотерный гликопротеинфибронектин в изолированном виде выраженно стимулирует адгезию, если добавлять его в питательную среду в концентрации порядка 1Ч5 мкг/мл.

Амфолит в данном случае выступает мостиком между отрицательно заряженной поверхностью животной клетки и субстратом, несущим отрицательный или положительный заряд. Свободная энергия поверхности твердого носителя может быть высокой (чистые поверхности стекол, металлов, металлических окислов) или низкой (поверхности из органических полимеров), хотя понятно, что при соответствующих обработках низкоэнергетические поверхности трансформируются Б высокоэнергетические. В качестве связующих мостиков можно применять ионы кальция или магния.

Наряду с плотностью заряда в прикрепляемости клеток большое значение имеют характеристики субстрата:

гидрофильность его поверхности (смачиваемость), протяженность и горизонтальность. Распластываем ость клеток на подложке будет выше, если число отрицательных зарядов оказывается не ниже 5 на площади 10 нм2. Адгезивные свойства более выражены для смачиваемых поверхностей в сравнении с гидрофобными, по протяженности они должны быть больше нормальной длины клеток; субстраты с искривленной поверхностью хуже гладких Ч растущие клетки распространяются в направлении наименьшей кривизны субстрата (здесь существен вклад цитоскелета. Если, например, прикрепление клеток к агар-агару принять за единицу, то к тефлону они прикрепляются в 5 раз лучше, к полиэтилену Ч- в 8 раз, к полипропилену Ч в 9 раз, к резине Ч в 12 раз, к алюминию Ч в 15 раз, к стеклу Ч в 16 раз, а к стали и полистирену Ч в 20 раз.

В 1993 г. на рынок поступил пронектин F Ч продукт белковой инженерии, созданный в Великобритании. Он напоминает ранее названный фибронектин, но пронектин F включает 13 мест связывания на молекулу (в сравнении с нормальным комплементом). Его потенциал к клеточной адгезии в 13 раз выше потенциала фибронектина, полученного от млекопитающих. Пронектин F рекомендуют для выращивания клеток в бессыворочных средах.

Крупномасштабное культивирование животных клеток в монослое нацелено на получение наибольшей концентрации клеток в наименьшем объеме газовой фазы. Выбор клеток не столь велик, но некоторые из них вполне адаптированы к условиям выращивания in vitro. В 1964 г. впервые были получены линии соединительнотканных клеток Ч фибробластов ВНК 21 от сирийского хомяка. Эти клетки пассируются неограниченно долго и первоначально использовались для репродукции вируса ящура для приготовления соответствующих вакцин. Следует иметь в виду, что нормальные диплоидные клетки человека, например, линии WI-38, могут делиться ограниченное число раз (50 10) и проявляют феномен старения (см. раздел 3.2.4.}. В то же время такие клетки, как HeLa, выделенные из раковой опухоли шейки матки человека, оказались бессмертными при пассировании.

При доступности донорской ткани используют клетки почек кроликов, обезьян, собак (линия МДСР), 10Ч14-дневных куриных эмбрионов, клетки из миндалин, амниона, легких эмбриона человека 12Ч16-недельного возраста, клетки эпидермиса взрослого человека, мышиные фибробласты (линия LS), диплоидные фибробласты человека (линия MRC-5) и другие.

Выбранные клетки выращивают в строго асептичных условиях в специальном оборудовании при медленном вращении роллерной системы или покачивании для смывания большей площади культуралъной среды. Клетки то погружаются в жидкую фазу, то в газообразную. При этом с избытком обеспечиваются их дыхательные потребности в кислороде.

Во время цикла культивирования клеток должны учитываться разные параметры. Одни из них относятся к числу константных, другие Ч к числу вариабельных.

Константными являются качество материала, форма и объем культиватора, вариабельными Ч скорость вращения или покачивания, качество и объем среды, тип клеток и размер (величина) посевного материала, рН и температура среды, снабжение кислородом и содержание СО2 в культиваторе, окислительно-восстановительный потенциал и концентрация основных источников питания. Первые три вариабельных показателя можно поддерживать постоянными, переводя их в разряд константных.

Естественно ожидать, что среды для клеток животных должны отличаться от сред, используемых, например, для прокариот. На начальных этапах развития зообиотехнологии обязательным было добавление сывороток к средам, применяемым в лабораторных и производственных условиях.

Сыворотки обеспечивали клетки необходимыми гормонами (глюкокортикоиды, инсулин, половые гормоны, простагландины и др.). ростовыми факторами (эпидермальным, фибробластным, Т-клеточным, тромбоцитарным, опухоленекротическим и др.), факторами адгезии (коллаген, фибронектин, ламинин), белками (альбумин, трансферрин, фетуин), микроэлементами и липидами, для выживания in vitro. Обычно для этого используют фетальную бычью сыворотку (ФБС). Высоким качеством отличаются сыворотки, рекомендуемые фирмой Sigma (США). Некоторые из них по качеству (для отдельных линий клеток) превосходят ФБС, например, сыворотка крови новорожденных телят в возрасте до 10 дней и менее, сыворотка от телят возраста менее 10-месячного, лошадиная сыворотка от жеребцов, кастрированных за год до взятия крови.

Вместо натуральных сывороток фирма IBF biotechnics (Германия) предлагает высококачественные заменители, в частности, ultroser G Ч для иммобилизованных клеток. Эта среда содержит мало белка, благодаря чему упрощается очистка биопродукта и достигается стабильность компонентного состава.

Оптимальные показатели рН и температуры зависят от происхождения и качества клеточных линий. Так, для клеток млекопитающих концентрацию водородных ионов поддерживают в пределах рН от 7,2 до 7,4, а температуру Ч в пределах +36 -37,5 С.

Поддержание рН осуществляют обычно за счет буферных систем (СО2ЧNaHCO3), трис- и др.] а температуру Ч с помощью терморегуляторов.

Контроль за развитием клеток проводят с помощью прямых (подсчет) и непрямых методов (по мутности, по подсчету ядер, по определению общего белка).

Посевной материал (инокулят, от лат. inoculatio Ч прививание) заметно сказывается на скорости роста клеток в монослойной культуре. В случае применения первичных клеток необходимо иметь их в более высокой плотности на см2 внутренней (рабочей) поверхности культиватора.

Pages:     | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |    Книги по разным темам