Geum.ru

Тезисы докладов

Вид материалаТезисы

Содержание


Поиск белков, контролирующих амилоидогенез при болезни альцгеймера
S. cerevisiae
Подобный материал:
1   ...   68   69   70   71   72   73   74   75   ...   96

МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ АМИЛОИД-ДЕГРАДИРУЮЩЕГО ФЕРМЕНТА НЕПРИЛИЗИНА И РОЛЬ АМИЛОИДНОГО МЕТАБОЛИЗМА В ПАТОГЕНЕЗЕ КОГНИТИВНЫХ РАССТРОЙСТВ ПРИ МЯГКОМ КОГНИТИВНОМ СНИЖЕНИИ И РАЗВИТИИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА

И.А.Журавин1), Н.Н.Наливаева1,2), С.А.Плеснева1), Н.Л.Туманова1), Д.И.Багрова1), Д.С.Васильев1), Н.М.Дубровская1), Е.Г.Кочкина1), А.Ю.Морозова1), С.И.Гаврилова2), Г.Ш.Бурбаева2), И.С.Бокша2), Я.Б.Федорова2), Н.З.Макова3), Н.Д.Беляев3), A.J.Turner3)



1)Учреждение Российской академии наук Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова, РАН, Санкт-Петербург,

2)Учреждение Российской академии медицинских наук Научный центр психического здоровья РАМН, Москва, Россия,

3) Institute of Molecular and Cellular Biology, University of Leeds, U.K.


Целью проекта является изучения роли продуктов метаболизма предшественника амилоидного пептида (АРР) и изменения актив-ности ферментов катаболизма амилоидного пептида (Аβ) в функци-онировании нервных клеток и формировании памяти, а также изучение механизмов развития мягкого когнитивного снижения (mild cognitive impairment – MCI) и болезни Альцгеймера (БА).

В серии экспериментов по изучению роли изоформ АРР в экспрессии амилоид-деградирующей пептидазы неприлизина (НЕП) посредством С-концевого фрагмента АРР (AICD) в клетках разного происхождения показано, что повышение экспрессии НЕП наблюдается только в нейрональных клетках, экспрессирующих АРР695 и имеющих повышенное содержание транскрипционно активного AICD в ядерном аппарате. Повышенная экспрессия АРР695 также приводит к изменению уровня активности и содержания АХЭ, но не влияет на характер секреции этого фермента и экспрессию PRiMA.

Для восстановления сниженного (в среднем на 40 %) уровня активности НЕП, наблюдаемого после пренатальной гипоксии у взрослых крыс, проводили i.p. инъекции (200 мг/кг, ежедневно, 24 дня) ингибитора гистондеацетилаз вальпроата натрия (ВН) или i.c. инъекции антиоксиданта EGCG (2x10-3 M, 0.25 мкл /час, 28 дней). После введения ВН или EGCG крысам, перенесшим пренатальную гипоксию, активность НЕП увеличивалась и не отличалась от уровня, полученного у контрольных животных. При этом наблюдалось увеличение количества правильных побежек у крыс в радиальном лабиринте и восстановление их кратковременной памяти в тесте «распознавание новых объектов», а также повышение количества лабильных шипиков в коре мозга (после введения ВН) и в гиппокампе (после введения EGCG). Изучено также влияние пониженного содержания продукта протеолиза АРР (sAPPα) на поведение животных и пластичность нервной ткани после длительного введения взрослым интактным крысам специфического ингибитора α-секретазы TAPI-2 (0.5 10-3 M, 0.25 мкл /час, 14 дней) с помощью осмотических минипомп. У таких животных не обнаружено изменений в количестве лабильных синаптоподин-позитивных шипиков в кортикальных отделах мозга и в поведении по сравнению с контролем. Сделан вывод, что одной из причин нарушения функций мозга после пренатальной гипоксии является изменение уровня активности ферментов, участвующих в метаболизме Аβ, приводящее к уменьшению количества межклеточных контактов и, как следствие, к нарушению пластичности нейрональных систем мозга и ухудшению памяти. Выявленные нарушения можно компенсировать путем специфи-ческой эпигенетической и фармакологической регуляцией экспрессии амилоид-деградирующих ферментов.

В совместных исследованиях с клиницистами охарактеризованы фазы доклинического снижения когнитивных функций и показаны возможности восстановления утраченных функций на стадии MCI. Выявлены биомаркеры, позволяющие идентифицировать это состояние. В частности, показано, что в плазме крови пациентов с диагностированным MCI активность НЕП (4,74±0,03 мкмоль/мин/мг) выше, чем у пациентов с БА (3,98±0,02), но ниже активности этого фермента у пациентов без нарушений внимания и памяти. Таким образом, данный показатель, наряду с изученными ранее, можно использовать для выявления начальных стадий развития заболевания.


ПОИСК БЕЛКОВ, КОНТРОЛИРУЮЩИХ АМИЛОИДОГЕНЕЗ ПРИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА

С.Г.Инге-Вечтомов, А.А.Рубель, Т.А.Рыжова, А.П.Галкин



Санкт-Петербургский филиал Института общей генетики РАН

им. Н.И.Вавилова


БА связана с накоплением в межклеточном пространстве головного мозга нейротоксичных олигомеров амилоидного пептида β (Aβ). Недавно были опубликованы данные, согласно которым белок PrP (Prion Protein), заякоренный на мембране нейронов, является рецептором для патогенных олигомеров Aβ. Таким образом, белок PrP, конформационные изменения которого вызывают прионные заболевания, в нормальной клеточной изоформе может быть вовлечён в патогенез болезни Альцгеймера. Более того, было показано, что олигомеры Aβ индуцируют болезнетворную агрегацию PrP, также как прионные полимеры PrP инкорпорируют пептид Aβ и способствуют его агрегации. Известно, что за взаимодействие олигомеров Aβ с мономерами PrP отвечают два коротких эпитопа – PrP(23-27 аа) и PrP(95-110 аа). При делеции одного из этих эпитопов взаимодействия не происходит. Какие последовательности отвечают за взаимодействие полимеров PrP с пептидом Aβ, остаётся неизвестным.

Мы исследовали этот вопрос, используя в качестве модельного объекта дрожжи S. cerevisiae. Были сконструированы химерные гены, в которых последовательности PrP мыши и пептида Aβ человека слиты с последовательностями, кодирующими циановый (CFP) и жёлтый (YFP) флуоресцентные белки, соответственно. На первом этапе исследований мы показали, что химерные белки PrP(23-231)-CFP и Aβ-YFP формируют в дрожжевой клетке амилоидные агрегаты, сходные по ряду характеристик с агрегатами PrP и Aβ в мозге больных млекопитающих. Было установлено, что большая доля белка PrP(23-231)-CFP в дрожжах представлена в виде высокомолекулярных агрегатов, тогда как Aβ-YFP распределяется между растворимой и нерастворимой фракциями примерно поровну. С помощью флуоресцентной конфокальной микроскопии мы показали, что химерные белки PrP(23-231)-CFP и Aβ-YFP образуют в цитоплазме дрожжевой клетки цитологически видимые агрегаты, которые не колокализуются с клеточными компартментами. При ко-экспрессии этих белков агрегаты белка PrP(23-231)-CFP в 100 % случаях колокализуются с Aβ-YFP. При помощи метода FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) мы показали, что колокализация агрегатов PrP(23-321)-CFP с белком и Aβ-YFP обусловлена их физическим взаимодействием.

Для выявления последовательностей, ответственных за это взаимодействие, был проведён сравнительный анализ колокали-зации Aβ-YFP с агрегатами укороченных вариантов белка PrP (PrP(90-231)-CFP и PrP(110-231)-CFP). Колокализация агрегатов PrP(110-231)-CFP с Aβ-YFP отмечается лишь 55 ± 3 % случаев. Такое нерегулярное взаимодействие может быть обусловлено неспецифическим связыванием агрегатов PrP(110-231)-CFP и Aβ-YFP за счёт случайного залипания β-структур. Вместе с тем агрегаты белка PrP(90-231)-CFP, также как и агрегаты PrP(23-231)-CFP, в 100 % случаях колокализуются с Aβ-YFP. Таким образом, специфическое взаимодействие амилоидных полимеров PrP с пептидом Aβ опосредовано короткой последовательностью PrP с 90-й по 109-ю аминокислоту. На основании полученных данных можно заключить, что последовательность PrP(23-27), которая необходима для связывания мономерного PrP c олигомерами Aβ, не важна для связывания амилоидных полимеров PrP с пептидом Aβ.