Geum.ru

Тезисы докладов

Вид материалаТезисы

Содержание


Экспериментальное и клиническое исследование немоторных симптомов паркинсонизма в модели доклинической стадии у животных и при б
Механизмы радиорезистентности терминально
Подобный материал:
1   ...   70   71   72   73   74   75   76   77   ...   96

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ И КЛИНИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НЕМОТОРНЫХ СИМПТОМОВ ПАРКИНСОНИЗМА В МОДЕЛИ ДОКЛИНИЧЕСКОЙ СТАДИИ У ЖИВОТНЫХ И ПРИ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА У ЧЕЛОВЕКА

Ю.Ф.Пастухов1), И.В.Екимова1), К.А.Худик 1), В.В.Чернышев1), К.В.Лапшина1), И.В.Романова1), В.В.Коржова1), И.В.Гужова2)



1)Учреждение Российской Академии наук Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург;

2)Учреждение Российской Академии наук Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург


«Ахиллесовой пятой» болезни Паркинсона (БП) является поздняя постановка диагноза – в клинической стадии, при манифестации моторных симптомов, когда гибель дофамин-ергических (ДА) нейронов черной субстанции (ЧС) достигает 50-60 % и полное излечение уже невозможно. Прогресс в лечении БП связывается с определением ранних немоторных симптомов в моделях доклинической стадии у животных [Угрюмов, 2010]. Нами создана такая модель у крыс на основе снижения функции убиквитин-протеасомной системы (УПС), которое приводит к накоплению токсичных белков и дегенерации клеток, в т.ч. ДА нейронов ЧС, что рассматривается как ключевой механизм старения и развития БП [Mc Naught et al., 2010 и др.]. При изучении модели высказана гипотеза: увеличение общего времени быстрого сна является ранним немоторным маркером БП, отражающим сохранение компенсаторных резервов ДА [Пастухов и др., 2010]. Для обоснования гипотезы необходимо выяснить, сохраняются ли этот маркер и защитный потенциал шаперона Hsp70i при переходе в клиническую стадию. Для решения задач проекта сопоставлены иммуногистохимические, поведенческие и электрофизиологические показатели через 7 и 14 сут после двукратных (с интервалом 7 сут) микроинъекций в ЧС ингибитора протеасом лактацистина в дозах 0.4 мкг (стадия 1 – доклиническая) и 4 мкг (стадия 2 – ранняя клиническая). Установлено, что в стадии 2 потеря ДА нейронов ЧС составляет в среднем 60 %, а их аксонов в стриатуме 70 %, что типично для клинических стадий БП; потеря нейронов в стадии 1 в 2.5 раза меньше. Нарушения моторного поведения ни по одному из тестов в стадии 1 не найдены, а в стадии 2 определены сокращение времени «зависания» в тестах «перекладина» и «перевернутая решетка» и тенденция к уменьшению длины шага. Увеличение времени быстрого сна обнаружено не только в стадии 1, но и в стадии 2. Общий уровень тирозингидроксилазы (ТГ), косвенного показателя компенсаторных резервов ДА, в ткани ЧС и дорзального стриатума в стадии 1 не изменяется, а в стадии 2 снижается. При пролонгировании стадии 2 на 7 дней уровни ТГ и везикулярного транспортера моноаминов уменьшаются, а общее время быстрого сна не изменяется. У пациентов в клинической стадии БП обнаружено уменьшение быстрого сна. Все это указывает на то, что наша гипотеза «работает» только в доклинической стадии. Отличается ли в стадиях 1 и 2 нейропротективный потенциал шаперонной системы, которую относят к 1-й линии защиты при стрессе, старении и нейродегенеративных процессах? Выяснено, что при ослаблении функции УПС в стадии 1 теряется около четверти, а в стадии 2 – более половины ДА-нейронов ЧС, содержащих главный шаперон Hsp70. В стадии 1 в большинстве оставшихся нейронов и в ткани ЧС уровень этого защитного фактора возрастает [Пастухов и др., 2011], а в стадии 2 – падает. Полученные данные подтверждают и дополняют нашу гипотезу: увеличение квоты быстрого сна является ранним немоторным маркером БП, отражающим сохранение компенсаторных и протективных резервов нигростриатной системы в доклинической стадии БП. Мы полагаем, что активация этих резервов путем применения природных и синтетических индукторов шаперонов и различных способов прекондиционирования может быть основой для разработки новой стратегии превентивной терапии с целью замедления или остановки нейродегенеративного процесса в доклинической стадии БП.


МЕХАНИЗМЫ РАДИОРЕЗИСТЕНТНОСТИ ТЕРМИНАЛЬНО ДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫХ КЛЕТОК СЕТЧАТКИ ГЛАЗА И ВОЗМОЖНАЯ РОЛЬ МЮЛЛЕРОВЫХ КЛЕТОК В РЕГЕНЕРАЦИИ СЕТЧАТКИ

В.А.Тронов1,2, Ю.В.Виноградова2, М.Ю.Логинова3, В.А.Поплинская4, М.А.Островский2,3



1 Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, Москва,

2 Объединенный институт ядерных исследований, Дубна,

3 Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва,

4 Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова, Москва


Основу зрелой сетчатки млекопитающих составляют терминально дифференцированные клетки, утратившие свой регенеративный потенциал. Для них апоптоз представляется угрожающим существованию органа в целом. Вместе с тем в эмбриогенезе глаза апоптоз играет важную роль: по мере дифференцировки клеточных элементов сетчатки частота апоптоза снижается, и зрелая сетчатка приобретает высокую устойчивость к генотоксическому стрессу и связанному с ним апоптозу. Пострадиационная ретинопатия и когнитивные расстройства часто бывают нежелательными побочными эффектами радиотерапии при высоких кумулятивных дозах. Так, при радиотерапии опухолей носоглотки и глаза суммарная доза облучения превышает 50 Гр. При протонной радиотерапии меланомы глаза кумулятивная доза фракционированного облучения составляет 54–75 Гр. Цитотоксическая химиотерапия также вызывает офтальмо-логические осложнения в виде обратимых и необратимых острых и хронических глазных заболеваний.

Наследственная или вызванная внешним воздействием дегенерация сетчатки начинается с гибели фоторецепторов. Хотя доминирующей формой гибели фоторецепторов признается апоптоз, тем не менее связь повреждения ДНК с гибелью постмитотических клеток сетчатки на сегодняшний день не исследована.

Целью нашей работы было исследование связи повреждения и репарации ДНК с дегенеративными изменениями в сетчатке после воздействия на мышей ионизирующей радиации (гамма-, протонного излучений) и генотоксического агента метилнитро-зомочевины (МНМ). Гамма-излучение вызывает главным образом однонитевые разрывы ДНК, равномерно распределенные по всему геному. Протоны же более эффективны в индукции двунитевых разрывов, локализующихся в области трека частицы. Двунитевые разрывы являются летальным повреждением из-за их высокой эффективности в индукции апоптоза в делящихся клетках. Метилирующий агент метилнитрозомочевина вызывает в ДНК безразрывные дефекты – метилированные основания, апуриновые и апиримидиновые (АП) сайты Показано, что МНМ вызывает апоптоз фоторецепторов после однократного в/б введения животным в дозе >60 мг/кг. В нашей работе МНМ используется как позитивный контроль на апоптоз в сетчатке, а, кроме того, три используемых агента охватывают основные типы повреждений ДНК и механизмы их репарации.

Оценивали морфологические изменения ткани, повреждение и репарацию ДНК в сетчатке, экспрессию 5 белков, участвующих в апоптозe, P53, АТМ, PARP, FasR и каспазы 3. Все измерения осуществлялись in vivo. Облучение в дозе 14 Гр равнотоксично по индукции однонитевых разрывов ДНК для гамма-излучения и протонов. Но протоны в 2 раза более эффективны в индукции двунитевых разрывов ДНК. Разрывы ДНК в сетчатке репарировались в течение ≤10 ч. Облучение увеличивало экспрессию P53 и АТМ. Однако в течение 7 дней после облучения не обнаруживались признаки клеточной гибели в сетчатке. После облучения протонами в дозе 25 Гр отмечались нарастающие во времени деструктивные изменения в сетчатке, затрагивающие главным образом фоторецепторный слой. Изменения сопро-вождались увеличением экспрессии проапоптотических белков. Однократное введение мышам МНМ в дозе 70 мг/кг увеличивало уровень белков P53, PARP, FasR, каспазы-3 и сопровождалось деструктивными изменениями в сетчатке с признаками апоптоза фоторецепторов. Как и в случае с облучением, снижение дозы МНМ в два раза полностью отменяло цитотоксический эффект агента. В ДНК сетчатки обнаружен высокий уровень спонтанных повреждений в виде АП-сайтов. Полученные результаты свидетельствуют о генотоксическом пороге инициации гибели клеток сетчатки. Предполагается участие топоизомеразы 2 в реализации повреждений ДНК в цитотоксический эффект.

Пролиферативный маркер BrUdR был успешно применен в нашем исследовании реакции мюллеровых клеток на супермутаген метилнитрозомочевину. Считается, что на химический стресс Мюллеровые клетки отвечают реакцией реактивным глиозисом, включающем в себя гипертрофию клеток, миграцию и пролиферацию. Вследствие пролиферации возможно включение пролифиративного маркера BrUdR в Мюллеровы клетки и определение внутриклеточных параметров.

После нанесения химического стресса спустя 24 ч наблюдается увеличение численности и физических размеров Мюллеровых клеток, а также их миграция, достигающая фоторецепторов. В ходе исследования две особенности сетчатки обнаружены нами впервые. Значительная спонтанная поврежденность ДНК (в виде апуриновых и апиримидиновых сайтов). Вторая особенность – высокий гентотоксический порог сетчатки для достижения заметного цитотоксического эффекта in vivo. Это объединяет наши экспериментальные данные в одну цельную картину генотоксического порога, высокий спонтанный уровень поврежденности ДНК в сетчатке, активацию в ответ на геностресс Мюллеровых клеток. В последние дни нами проведены исследования ЭРГ сетчатки в ответ на введение МНМ, подтверждающие гипотезу о генотоксическом пороге сетчатки.