Биотехнология, биопрепараты (вакцины, сывортки, прививки и т.д.)

 БИОТЕХНОЛОГИЯ. БИОПРЕПАРАТЫ.

БИОТЕХНОЛОГИЯ - технология, т.е. способ получения продуктов

из биологических объектов или с применением биологических объек-

тов. (Спор - это наука или производство.)

В качестве биологических объектова чащеа всего используются

клетки (микроорганизмов, растительного или животного происхож-

дения). Преимущества:

1. клеткиа являются своего рода биофабриками белков, жиров,

углеводов, витаминов, нуклеиновых кислот, аминокислот, антибио-

тиков, гормонов, антител, ферментов, спиртов;

2. клетки чрезвычайно быстро воспроизводятся (бактерии -а за

20-60 мин., дрожжевые - за 1,5-2 часа, животная - 24 часа),

3. биосинтез сложных веществ, таких как белки, антибиотики,

нтигены, антитела аи др. значительно экономичнее и технологи-

чески доступнее, чем химический синтез. Для биосинтеза исполь-

зуются отходы сельскохозяйственной, рыбной продукции, пищевой

промышленности.

4. возможность проведения биотехнологического процесс в

промышленных масштабах.

 _Направления биотехнологии .:

- медицинская (фармацевтическая, иммунная)

- сельскохозяйственная (ветеринарная, растений)

- промышленная (пищевая, легкая промышленность, химическая,

энергетическая)

- экологическая (очистка, деградация).

 _История биотехнологии

( _исторические достижения .)

- Земледелие, животноводство - 10-11 тыс. лет назад.

- Селекция (интуитивная, например, пшеницы, домашних живот-

ных), затем научная.

- Биотехнология возникла примерно 5-6 тысяч лет назад, когда

люди научились выпекать хлеб, варить пиво, приготовлять сыр и

вино.

- В 19 веке Пастером была открыта природа брожения (начался

научный этап биотехнологии).

- Открытиеа многих микроорганизмов и способов их получения в

большом количестве (сформировалась техническая микробиология);

в настоящее время из 1 видов микроорганизмова используется

не более 100  5(см. ниже) 0. С 70-80-х годов ХХ века начали полу-

чать штаммы-суперпродуценты.

- Искусственное оплодотворение в животноводстве, искусствен-

ное опыление в растеневодстве. Трансплантация эмбрионов (в жи-

вотноводстве). Разработка технологии искусственного оплодотво-

рения человека.

- Биодобавки в медицине, животноводстве, растеневодстве.

- Трансплантация органов. Переливание крови. Позднее созда-

ние искусственных органов (искусственная почка...).

- Выделение ферментов, использование иммобилизованныха фер-

ментов в молочном деле и пр.

- Разработка получения МАТ (моноклональных антител) гибридом

(Келлер и Мильштейн, 1975; Нобелевские лауреаты)

- Разработк и применение биосенсоров - технических средств

детектирования веществ (с помощью антител, ферментов, рецепто-

ров...). же созданы биосенсоры более 100 веществ. /1990г./

 _- Развитие генной инженерии .. Технология включения гена (ин-

сулина и пр.) Е.coli.

-- Использование микроорганизмов (бактерий, дрожжей, виру-

сов)а кака реципиентова чужеродного генетического материала для

получение БАВ. Например, получены  2рекомбинантные 0 штаммы Е.с.,

продуцирующие интерфероны, инсулин, гормон роста; В.subtilis, -

вырабатывающие интерферон, инсулин; дрожжи - продуценты ИЛ, ре-

комбинантные вирусы осповакцины, синтезирующие антиген гепатита

В. Производство лекарственных форма (интерлейкины, интерферон,

тканевый активатор плазминогена, фактор V, эритропоэтин, ре-

лаксин, использующийся для расслабления шейкиа матки, гормон

роста, фактора рост эпидермиса колониестимулирующие факторы,

МАТ).  В клиниках сегодня (1988г.) проходит испытания около 150

 4биотехнологических лекарств. 0

- Разработк способов переноса генов (впрыскивание в яйцек-

летку, электроток, вирусами, плазмидами). Некоторые методы пе-

реноса дают в результате не трансгенных животных, а  2химер 0. Для

этого в эмбрион животного вводята группу эмбриональныха клеток

другого вида. Получаемое потомство построено из "мозаики" кле-

ток, часть которых несет гены одного из родителей, часть -

другого.  Так, широко известная сегодня "ковца" (химера козы и

 4овцы), выведенная в Кембридже (Англия), является такой химерой.

 От козы она наследовала рога, от овцы - лохматую шкуру. 0

- В клетки молочных желез овец введены гены фактор IХа ССК

(лечение гемофилии В), другима - альбумин (используется после

хирургических операций).

- В 1982г. Ричарду Палмитеру и Ральфу Бринстеру далось пе-

ресадить гена гормон роста крысы мышке. В итоге трансгенная

мышь была в 1,5 раза большего размера, чем обычные.

- Разработка автоматизированных синтезаторов гена. Получение

рекомбинантных ДНК. Разработка технологии репарации ДНК. С по-

мощью ферментов рестрикции (их обнаружено более 400) разрезается

кольцевая плазмида, вставляется новый часток ДНК.

- Генноинженерные микробы (например, "форсбан", защищающий

растения от заморозков), семена и пр.  Рекомбинантные организмы

 4попадаюта в окружающую среду (известно более 20 случаев). Нега-

 4тивные последствия не обнаружены. 0

- Разработан способ силения естественной способности бакуло-

вирусов поражать насекомых-вредителей, введя в них гены ДНК, ко-

дирующие яды. Если в вирусы встроить гены белков человека, то в

организме хозяина (насекомого) они будут силенно продуцировать

данные белки.

- Клонирование.

- Технология гибридизации фрагментов ДНК и РНК, на основе ко-

торой разработаны различные методы ( ПЦР =а полимеразная цепная

реакция /Мюллис,1983/, лигазная цепная реакция, Q-бета-система и

др.).

- Созданная технология получения гомозиготных "knockout"-мы-

шей с отсутствиема ва иха геноме теха илиа иныха генова /Koller

B.H.,1992/.

 _Использование микроорганизмов

- иза грибов для получения антибиотиков используются актино-

мицеты (род Streptomyces), Penicillium chrysogenum, Clphalospo-

rum acremonium, Streptomyces spp и др.

- дрожжи (в хлебопечении, пивоварении, виноделии, получении

соков, кормового белка, питательный сред для выращивания бакте-

рий и культур животных клеток);а Из 500 известных видов дрожжей

используется только несколько;

- род Acetobacter для превращения этанола в уксусную кислоту

и ксусной кислоты в газ;

- род Bacillus - для получения ферментов (В.subtilis)

-- средства защиты растений (В.thuringiensis);

- род клостридий - для сбраживания сахаров в ацетон, бутанол;

- молочно-кислые бактерии (lactobacillus,Leuconostoc,Strep-

tococcus);

- псевдомонады для получения витамина В 412 0;

- коринебактерии glutamicum для получения аминокислот и др.

 БИОПРЕПАРАТЫ

 Классификация

I.  Биопрепараты, использующиеся in vivo

1. АГ-ые (вакцины /ва т.ч. анатоксины/, аллергены, лизаты

микробов для кожных проб), создающие активный иммунитет. Специ-

фические АТ и Тк появляются в кровотоке примерно через неделю у

здорового человека (у лиц с ИД - позже).

2. АТ-содержащие (антисыворотки, гамма-глобулины, МАТ, им-

мунное молоко), создающие за счет готовых АТ пассивный иммуни-

тет. Однако "примеси" данных биопрепаратов и ксеногенные (лоша-

диные и пр.) АТ запускают активный "вредоносный" иммунитет. По-

этому использование желательно в течение 1 недели после первой

инъекции (до появления вторичных АТ и избежания ИК-ых осложне-

ний, васкулитов). Антисыворотки вводят только по жизненным по-

казаниям.

3. Иммунокорректоры

- животного происхождения (цитомедины, интерлейкины, интер-

фероны, факторы роста, гормоны /глюкокортикоиды и др./)

- растительного происхождения (аллергены, лектины)

- микробного происхождения (БЦЖ, продигиозан, антибиотики)

- химические иммунокорректоры

4. Бактериофаги.

Бактериофаги относятся к эффективным препаратам антимикробно-

го действия, обладающима строгой специфичностью и не вызывающим

развития дисбактериозов, как это имеет место при использовании

нтибиотиков.

II.  Биопрепараты, использующиеся in vitro

- Диагностикумы (для РНГА) антигенов микробов (самиха клеток,

лизатов, или очищенных АГ-ов), использующиеся в серологических

реакциях. Иммунодиагностикумы - это часто взвесь известных би-

тыха микробов. Для инактивации используют высокую температуру,

химические вещества (формалин, спирт, ацетон, фенол), льтраз-

вук, льтрафиолетовые иа рентгеновские лучи. При выделении из

клеток различных АГ используюта методы разрушения, экстракции,

обработку ферментами и различными детергентами, центрифугирова-

ние. /2551к/

- Антигены, в т.ч. анатоксины /токсины/ для проведения РП,

РН (для постановки контроля в серологии).

- Диагностические антисыворотки. Для даления из антисыворо-

ток группоспецифических антител в сыворотку последовательно до-

бавляют микроорганизмы, в состав которых входят групповые анти-

гены (метод Кастеллани). Таким образом получают адсорбированные

сыворотки, которые содержат антитела к определенному виду микро-

бов. /2551к/

- МАТ (мышиные) для ИФА, иммуноблоттинга, ИФМ и пр. сероло-

гических реакций.

АЛЛЕРГЕНЫ

Известно более 200 тысяч аллергенов.

Аллергией страдает 20% населения земного шара.

I. ЭДоЛЛЕРГЕНЫ

- тепловые --- тепловая аллергия (на перегрев),

- ожоговые белки ("аллергия на УФ"),

- холодовыеа эндоллергены (измененная конформация белков на

холоду) --- холодовая аллергия,

- появляющиеся новые антигенные детерминанты при физнагрузке

("аллергия на физнагрузку")

- появляющиеся новыеа антигенные детерминанты при стрессе

("аллергия на стресс")

II. ЭЗоЛЛЕРГЕНЫ

 31) Растительного происхождения

Официально зарегистрировано 600а (598)а видов аллергических

растений.

 Поллинозы на пыльцу 0. Количество пыльцы в воздухе max ранним

вечером и min утром, поэтому период активной деятельности надо

перенести на утренние часы.

Пыльца деревьев:а ива, ольха, тополь, лещина, береза, дуб,

клен, ясень, рябина, вяз, липа, ильм.

Пыльца хвойных деревьев:а сосна, лиственница, ель, пихта,

кедр.

Пыльца злаков:а овес, рожь, пшеница, пырей, рис, овсянница,

ежа, амброзия, тимофеевка, мятлик; загряз-

няющие зерно продукты животного, токсического, химического ха-

рактера (аллергия на пшеничную или овсяную муку).

Растения, вызывающие фитодерматозы: крапива, середка тополя,

волчье лыко, одуванчик, марь, паслен, лебеда, полынь. /7538/91/

Аллергены цитрусовых - какие-то белковые компоненты кожуры

мандарин, лимонов, апельсин.

Лук, клубника, малина, земляника, соя...

Чай, кофе, шоколад.

Ваниль, горчица, гвоздика, миндаль, корица, мускатный орех,

чеснок, сельдерей, перец.

 32) Животного происхождения

- кожный эпителий животных (перья и пух птиц, "шерсть"а жи-

вотных --- пуховые и шерстяные изделия)

- корм для аквариумных рыбок (сухие рачки и дафнии)

- экстракт тараканов

- морские продукты, особенно богатые иодом

- мед, яйца, рыба и икра, свинина, куриное мясо,

- молоко (альфа-лактальбумин, казеин) - 7% аллергий у детей;

У кипяченого молока аллергические свойства резко падают (меня-

ется структура белков). Молоко заменяют кефиром, творогом и пр.

Сыр.

- яды насекомых

- препараты крови, лечебные сыворотки.

 33) 1  3микробного происхождения

- Некоторые АГ пневмококков, стафилококков, стрептококков,

- АГ дрожжей /аллергия на хлеб/,

- АГ спор плесневых грибов - ГП (М. более 40 кД),

- АГ паразитов

- АГ вакцин

- Антибиотики

 34) химического происхождения

- краски, лаки, моющие средства, косметика (только 20% кос-

метических средств безопасны в отношении аллергии /1652к/),

- лекарственные препараты (сульфаниламиды, новокаин, дикаин

и др. анальгетики, анестетики /аспирин, анальгин/), [анальгети-

ки - блокируют болевую чувствительность; анестетики - подавляют

любой вид чувствительности]

- отходы химического производств /профессиональные болез-

ни/,

- рентгеноконтрастные вещества

- дезинфецирующие средства и пр.

[5) физического происхождения (см. эндоллергены).]

6) Промышленная, бытовая и библиотечная  3пыль 0.

- клещ домашней пыли

Проба на аллергены: за рубежом накладывают манжету на предп-

лечье са 40 ячейками, в каждой их которых один из основных ал-

лергенов. Через 1-2 сут оценивается зон покраснения и соот-

ветствующая ячейка. (У пожилых лиц пробы чаще отрицательные.)

.

 АНТИТЕЛО-СОДЕРЖАЩИЕ БИОПРЕПАРАТЫ

(вызывают пассивный иммунитет)

АТ-содержащие биопрепараты включают антимикробные или анти-

токсические АТ и используются для лечения или диагностики. Ан-

тисыворотки используют по жизненным показаниям с целью экстрен-

ной серопрофилактики (при непосредственной грозе заболевания).

1) Кровь, плазма (переливание). Сыворотки.  _Антисыворотки ..

2)  _Гамма-глобулины . (общие, направленного действия, получае-

мые либо после иммунизации, либо от лица, недавно перенесшего

заболевание).

3)  _МАТ . (пока только мышиные, человеческие гибридомы в насто-

ящее время отсутствуют).

 14) Иммунное молоко. Сочетание парентеральной и диалетической

 1иммунизации позволило получить  _иммунное молоко ., содержащее ан-

 1титела к вибрионам холеры и токсину, ЭПКП, протеям, шигеллам

 Зонне. В настоящее время наметились 2 тенденции ва технологии

 1изготовления препаратов иммунного молока - получение  _лактосыво-

 _ 1роток или лактоглобулинов .. Лактосыворотка, в отличие от лактог-

 1лобулина, обладает большей буферной емкостью, содержит ингиби-

 1торы трипсина и химотрипсина, что в известной степени обеспечи-

 1ваета стойчивость белков коровьего молока к действию ферментов

 ЖКТ. Кроме того, некоторые белки лактосыворотки (лактоперокси-

 1даза, лактоферрин, лизоцим и др.) оказывают неспецифическое ан-

 1тимикробное действие и способы потенцировать защитныйа эффект

 1специфических антител. /2114к/87/ - (ПОВТОР материала по ОКИ)

 _Получение антисыворотки из молока

 Молозиво центрифугируюта при 2 об./мин. 2 часа при 4 50 С,

 4липидный слой отделяют (обезжиривание). Казеин осаждают титро-

 4ванием Н уксусной кислотой до рН 4,6 с последующим центрифуги-

 4рованием в тех же словиях. Используют надосадок, который диа-

 4лизируют в 0,0М растворе фосфатного буфера с рН 7,0. Для выде-

 4ления очищенной фракции Ig Aа можно использовать ионообменную

 4хроматографию (ИОХ) на ДЭАЭ-целлюлозе. /6737/ 0

5) Антиидиотипические АТ используюта для запуск активного

иммунитета, поэтому называют антиидиотипическими вакцинами  4(см.

 4материал по вакцинам) 0

 _ Получение  0 АТ .-содержащих препаратов

I. От иммунизированных животных

II. Из крови иммунных лиц (недавно выздоровевших)

 _Иммунизация животных

┌────────────────────┴─────────────────────┐

селезенка мыши Кровь

│ │

выделение Ретракция сгустка

ПК, синтезирующих (40 минут, 37 5о С)

искомые АТ │

│ Сыворотка

ПК+ (В-лимфоцит, (=антисыворотка)

инфицированный ВЭБ │

--- лимфомная клетка) (Высаливание,

+ ПЭГ спиртовое осаждение,

│ адсорбция)

Гибридома --- активация │

│ клеток Гамма-фракция

МАТ │ иммуноглобулинов

ИФ, ФНО, ИЛ │

в питательной Аффинная хроматосреде графия (сорбция

│ на комплекс "АГ│ носитель"

Реакция н │

"примеси" Моновалентные АТ

 31. Иммунизация

Первая иммунизация вызывает первичный ИО; вторая и последую-

щие --- вторичный ИО. Многократную иммунизацию называюта гипе-

риммунизацией (--- гипериммунная сыворотка).

Способы иммунизации животных:

 2- в/кож. 0 (объем до 100 мкл) --- региональные ЛУ

 2- п/кож. 0а (объем 1-30 мкл). При данном способе иммунизации

нтиген распространяется медленно, т.к. подкожная клетчатка не

имеет развитых лимфатических протоков.

 2- в/мыш. 0а (0,5-8мла соответственно для мышей-кроликов) в об-

ласть бедра; птицам в грудную мышцу.

 2- в/бр. 0 (2-30мл соответственно для мышей-кроликов); при этом

животное опускается головой вниз;

 2- в/в 0 (1-10мл);а если в боковую вену хвоста, то хвост предва-

рительно опускается в стакан с горячей водой -55 5о С;

 2- интраназально 0а (по капляма от 0,03 до 1 мл соответственно

для мышей-кроликов);

 2- оральное введение 0 (0,3-5 мл): антиген смешивают с кормом и

скармливают или в виде питья, можно через зонд --- ва желудок.

/7143/89/1

-  2per rectum 0

 Пример:

 Один объем антигена смешивают с 3 объемами полного адъюванта

 Фрейнда и тщательно перемешивают. Полученнуюа эмульсию вводят

 5внутрикожно по 0,1мл в 10 точек спины, расположенных по 5 в ряд

 5на расстоянии 2 см по обе стороны от позвоночника. Общая доза

 5иммуногена равна 10-100 мкг на кролика. Иммунизируют 6 кроликов

 5массой по 2 кг. Через 8-10 недель проводят пробное кровопуска-

 5ние. Приа удовлетворительном качестве антисыворотки последова-

 5тельно проводят до 3 кровопусканий, после чего кроликама дают

 5отдохнуть в течение 1 месяца и затем делают следующие кровопус-

 5кания. При неудовлетворительном качестве антисыворотки проводят

 5вторичную иммунизацию, используя половинную дозу иммуногена в

 5неполном адъюванте Фрейнда. Иммунизируют подкожно в складку ко-

 5жи на шее. Через 10 суток делают пробное кровопускание и опре-

 5деляют качество антисыворотки. При неудовлетворительном качест-

 5ве индивидуальной антисыворотки иммунизируют новую группу кро-

 5ликов или животных другого вида. /6817/84/ 0

 32. Получение крови и сыворотки

У животных или иммунизированного человека берут кровь в пус-

тые пробирки, после ее свертывания откручивают на центрифуге,

получается т.н. антисыворотка, из которой можно выделить гам-

ма-глобулиновую фракцию.

Противоэнцефалитный иммуноглобулин получали из сывороток лю-

дей, проживающих в местах распространения данного заболевания,

содержащих достаточно высокий ровень специфических противови-

русных антител. /1430к/

 32.  О 3чистка 0 ( 3фракционирование 0) и тестирование

- Осаждение

-- высаливаниема (осаждение сульфатом натрия или сульфатом

аммония)

-- осаждение спиртом

-- полиэтиленгликолем (ПЭГ)

-- каприловой кислотой

- ферментирование

- диализ

- адсорбция

-- аффинной хроматографией

-- выделение на белок А-сефарозе (FcR золотистого стафилококка)

Силу антитоксических сывороток измеряют в международных еди-

ницах (МЕ) по способности нейтрализовать определенную дозу ток-

сина.

 _Антисыворотки

- Лечебные (используется только по

- Профилактические жизненным показаниям)

- Диагностические

По специфичности различают

- моновалентную антисыворотку

- поливалентную антисыворотку

- антицельную антисыворотку (против всех сывороточных белкова 36)

 _Недостатки антисывороток .:

- Выделенная из крови сыворотка, сколько бы ее не очищали и

ни концентрировали, содержит набор различных антител. Поэтому

ее называют поликлональной. Лишь  _небольшая часть антител . нап-

равлена  _против специфичных антигенных детерминант ..

- Иммуноглобулины антисывороток же с открытыми глеводными

компонентами, поэтому  _быстрее выводятся из организма ..

- глеводные компоненты, переплетаясь между собой, приводят

к спонтанной  _агрегации белков . при длительном хранении, что спо-

собствует в кровотоке закупорке некоторого количеств капилля-

ров и активации системы комплемента по альтернативному пути.

- " _Примесные АТ ." дают многочисленные "перекрестные"а положи-

тельные реакции, которые приводят к ошибочным диагнозам по се-

родиагностике.

- " _Примесные АГ .". Иные белки сыворотки могут содержать раст-

воримые (сброшенные) антигены HLA, АВ, Rh, иные аллотипы анти-

тел и др., что иммунизирует реципиента.

- Ксеногенные (лошадиные) сыворотки при повторном введении в

организм могут вызывать  _аллергические реакции . на чужеродный бе-

лок. Поэтому необходима постановка  _внутрикожной пробы . са сыво-

роткой в разведении 1:100 в объеме 0,1 мл. Введение антитокси-

ческой лошадиной сыворотки допустимо лишь ва случае отсутствия

выраженной кожной реакции в течение 20-30 минут. /1430к/

- Еще один серьезный недостаток:а для получения антител каж-

дый раз необходимо  _заново иммунизировать . животных и очищать вы-

деленную сыворотку. Это стоит немалых денег.

 _Гамма-глобулины (преимущественно Ig G)

Содержание антител в препаратах иммуноглобулинов человека:

- АТ к токсинам (дифтерийному, столбнячному, пертуссигену)

- Титры агглютинирующих АТ к штаммам возбудителей располага-

ются в следующем порядке (по быванию)

-- P. aeruqinosa

-- S. sanguis,

а-- B. melaninogenicus,

-- B. bronchisrptica,

-- Veillonella,

-- E. coli.

Титры к E.c. очень низкие. /2384к/84/

Использование иммуноглобулинов

для пассивной иммунизации /7330/87/

────────────────────┬─────────────────────┬────────────────────

Пулированные │ Специфические │ Специфические

Ig человек │ Ig человек │ лошадиные Ig

────────────────────┴─────────────────────┴────────────────────

Гуморальный ИД Гепатит В Ботулинум токсин

Гепатит Бешенство Дифтерийный токсин

Корь Столбняк Змеиный яд

Ветряная осп Яд паука

Натуральная осп Black widow

(коровья оспа)

Rh изоиммунизация

pertussis

───────────────────────────────────────────────────────────────

 МАТ

 МАТ (моноклональные антитела) 0а -а АТ, полученные из одного

клона культуры плазматических клеток.

МАТ с запрограммированной специфичностью впервыеа получили

ргентинеца Ц.Мильштейн (C.Milstein) и мюнхенец Г.Келер (G.Koh-

ler) /Nature. - 1975. - V.256. - P.495-497/, за что в 1978 году

им была присвоена Нобелевскую премию. Они рассчитывали исполь-

зовать гибридомы лишь для изучения генетики антител, а резуль-

тат привел к подлинному буму.

К настоящему времени получены тысячи разнообразных МАТ, нес-

колько тысяч гибридом, в т.ч. на 600 вирусных антигенов.

 _Получение

 1а) В-лимфоциты + вирус Эпстайна-Барра --- клетки быстро пе-

 1рестаюта синтезировать Та --- формируются опухолемые лимфомные

 1клетки

 1б) В-лимфоциты селезенки иммунизированной АГ-ом мыши +а мие-

 1ломная лимфоцитарная клетка + ПЭГ (полиэтиленгликоль) --- слия-

 1ние клеток (одной на миллион) --- далее размножается лишь гибрид

 1- гибридома (неограниченное размножение).

В основу метода положен давно известный принцип гибридизации

(слияния) соматических (неполовых) клеток с последующим выделе-

нием и культивированием необходимого гибридного клона. Для сли-

яния используют клетки двух видов. Первые - плазмоцитомы (опу-

холевые плазмоциты) из линий, культивируемыха ва искусственных

условиях, in vitro. Как и все злокачественные клетки они интен-

сивно размножаются без всякого внешнего стимула. Другие клетки

-а иммунные лимфоциты. Они несут в себе способность синтезиро-

вать и выделять необходимые антитела. Однако ва пробирке эти

клетки существуют лишь несколько дней.

Образовавшийся при слиянииа двуха клетока гибрида наследует

признаки обоих "родителей".

 Получение гибридом включает 6 основных этапов.

1. Иммунизация, многократное введение мышам или крысам анти-

гена, против которого необходимо получать антитела.

2. Слияние иммунных лимфоцитов селезенки животного с его же

опухолевыми клетками. Для соединения клеток используют обычно

полиэтиленгликоль, разрушающий поверхностные мембраны и спо-

собствующий соединению клеток.

3. Отбор гибридов. Клетки культивируют в среде, содержащей

гипоксантин. Плазмоциты погибают из-за отсутствия фермента, его

разрушающего, а лимфоциты - просто потому, что не умеюта долго

поддерживать свое существование вне организма.

4. Скрининг, то есть отбор тех гибридных клеток, которые вы-

рабатывают 3  0антитела против антигена, использоваого для имму-

низации. Антиген прикрепляют к какому-либо носителю, например,

к пластиковым шарикам или пленке. Такой иммобилизованный анти-

ген обрабатывают культуральной жидкостью, в которой растут гиб-

ридомы, затем наносят меченые антител протива мышиныха или

крысиных гибридомных антител (их метят радиоктивными, флуорес-

центными или ферментными метками). Иными 3  0словами, проводят ана-

лиза культуральнойа жидкости на присутствие антител к искомому

нтигену. Если гибридомы производят антитела, то они осядут на

нтигене, к тем, в свою очередь, прикрепятся меченые антите-

ла. В результате метка соединится с антигеном на носителе и за-

фиксируется.

5. Клонирование. Для этой цели несколько гибридных клеток

переносят на питательную среду таким образом, чтобы они росли

на достаточнома расстоянии друг от друга. Через несколько дней

вокруг каждой образуется колония дочерних клеток. Это и есть

гибридома. Клетки колонии снов разводят и помещают на пита-

тельную среду, чтобы строить новые колонии. Клонирование пов-

торяют 3-4 раза, после чего получается стойчивая и продуктив-

ная линия клеток.

6. Повторный скрининг и получение специфических моноклональ-

ных антител. Эти антитела можно выделить из питательной среды в

искусственных условиях или непосредственно из животных, приви-

тых гибридомными клетками (как и многие злокачественныеа опухо-

ли, гибридому можно прививать).

 _Недостатки МАТ:

1. Одна из проблем, связана с тем, что МАТ - продукты  _мыши-

 _ных . гибридом. В настоящее время разрабатываются способы получе-

ния человеческих МАТ.

2. Реакции лишь с одной антигенной детерминантой и отсутс-

твие перекрестных реакций с другими детерминантами на одной мо-

лекуле антигена. ( _Неполные АТ . не образуют ПИК, нельзя использо-

вать в РА /только Кумбса/, РП)

 43. Возможность непредсказуемых перекрестных реакций с поли-

 4функциональными антигенными детерминантами. Вследствие этого -

 4низкий аффинитет МАТ. 0

 _Преимущества МАТ:

1. Главная особенность МАТ -  _чрезвычайная моноспецифичность

(против одной антигенной детерминанты)а и бсолютная однород-

ность. По специфичности и чувствительности МАТ достигают значе-

ний, предельных для живой природы. Отсюда возможность использо-

вания для анализа антигенов не высокой степени чистоты.

2. Возможность многократного получения в течение длительного

времени (воспроизводимость).  _Неограниченное количество . получае-

мых антител.

3. МТа предполагается использовать  _в лечебных целях . в ка-

честве целенаправленных носителей, в состав которых будут вклю-

чены токсины (рицин и пр.) или другие фармакологически активные

препараты. Такие конъюгаты можно использовать ва химиотерапии

опухолей и при трансплантации органов и тканей (введением МАТ

против CD 4,8;а через 13 суток вырабатывались Та н введенные

МАТ). /6815,6816/

 _Достижения

- наборы для диагностики СПДа, гепатита, инфаркта и пр.;

- производство "центоксина" - МАТ, связывающих яды при сеп-

сисе;

- производство антиидиотипических антител, "аналогичных" ин-

сулину (регуляция рецепторного рата, замена инсулина);

- использование МАТ к интерлейкинам и другим цитомединам для

иммунокоррекции.

 МАТ

Основные дифференцирвочные антигены

(Номенклатура антигенов СВ от 1993г.)

/7070,94;7273/94,6504/90,7293/

───────────────────────────────────────────────────────────────

Г,МАТ а Распределение │ Функции

───────────────────────────────────────────────────────────────

CD1a,1b,1c Тимоциты, клетки Гомологичны HLA I класса

gp49,45,43 Лангерганса (=ДК), (3 варианта  7a 0-цепи)

= 7a 0-цепь часть В-лимфоцитова Маркер ранней фазы созревания.

 7b 0-цепь  7b 02-микроглобулин

 _CD2 . gp50 Т-клетки, ЕКК,  _Рецептора для ЭБ (эритоцитов барана)

с/с Ig тимоциты, Т-лимфоцитов (LFA-2)

большинство Принимает частие в неспецифической

тромбоцитов, активации ранних тимоцитова (до

на моноцитах /?/ появления антигенных рецепторов).

 _CD3 . 20кД Т-клетки Часть рецепторного комплекса для

с/с Ig-? зрелые антигенов.

 _(СD3+,CD56-) - маркер Т-лимфоцитов

 _CD4 . 59 кД  _Т-хелперы ., Взаимодействие с HLA II класса,

с/с Ig моноциты, ВИЧ-рецептор

(2/3 периферических (Гены относятся к суперсемейству

Т-лимфоцитов) генов иммуноглобулинов)

CD5а gp67 Т-,часть В-клеток ?

CD6а gp100 - " -,тимоциты ?

 _CD7 . gp40 Т-клетки,тимоциты Рецептор для иммуноглобулина М

Первый антиген протимоцитов

(Критерий диагностики острых

Т-клеточных лейкозов)

 _CD8 . 32/22  _Т-киллеры ., Взаимодействие с HLA I класса

с/с Ig  _Т-супрессоры . (рецептор HLA I)

(на 1/3 перифери- Гены внеклеточных 2 доменов

ческих лимфоцитов)а гомологичны генам дометов Ig.

CD9 gp 24 Моноциты,пре-В-клетки ?

тромбоциты

CD10а 100 Пре-В-клетки,грану- Нейтральная эндопептидаза.

лоциты, лимфоидные Антиген, выявляемый при острой

предшественники лимфоцитарной лейкемии

CD11а 180 Лейкоциты  7a 0-цепь LFA-1 (молекулы адгезии)

CD11b 155 ЕКК,миелоидные CR3-рецептор (для С3bi), Мо-1,

клетки, Т-subset 7 a М-цепь интегрина СD 11b/18,

моноциты,гранулоциты ICAM-1

CD11с 150 - " -, СR4, 7a Х-цепь интегрина СD 11с/18

часть В-лимфоцитов

СD13а 150 Моноциты,гранулоциты Аминопептидаза N

В присутствии МАТ к АГ происходит активация клеток

CD14 - " - Мо-2

CD16 50-65 Гранулоциты, ЕКК, Fc 7п 0R типа 3 (с низкой аффинностью)

Т-subset,макрофаги

СВw17 Гранулоциты, моно-а Лактозилцкрамид

циты, тробоциты

CD18 95 Лейкоциты  7b 0-субъединица (цепь) интегринов

CD11а,b,с/CD18 = ICAM

 _CD19 . 95  _В-лимфоциты . sIg M-ассоциированная молекула

 _(маркер В-лимфоцитов) .1

 _CD20 . 35  _В-лимфоциты . Антитела к CD20 вызывают пролиферацию клеток.

 _CD21 . 140 -"- СR2 (рецептор для С3d),рецептор

для вирус Эпштейна-Барра

CD23 7ф 0а 45 Активированные  _Fc 7e 0R . II (низкоффинный рецептор)

В-клетки

CD23 7и 0а 45 В-клетки,моноциты, эозинофилы,Т-subset

СD24 41/38 В-клетки, Костимуляция Т-хелперов-?

гранулоциты

 _CD25  . 55 Активированные Т- и Низко-аффинный _ IL-2-рецептор

В-клетки,макрофаги ( 7b 0-цепь)

CD29а 120 Многие типы клетока  7b 0-1-цепь интегринов, GPIIa

СВ31а 140 Тромбоциты,моноциты, GPIIa

гранулоциты,В-лимфоциты, (Т-лимфоциты)

 _CD34 . 105-120 Ранние предшествен- Рецептор L-селектина (СD62L).

ники гемопоэз  _Маркер миелоидных и лимфоцитар . _ных лейкозов.

CD35а 220 Гранулоциты,моноци- CR1 (рецептор для С3в)

ты,эритроциты,ДК,

ТК,В-лимфоциты

CD41 120/133 Клетки тромбоцитар- GPIIb/a,GPIIb

ного ряда

CD44 200/220 Лейкоциты, Pgp-1,рецептор гиалуроновой

/180/190 эритроциты кислоты, HCAM

gp 80-95а головной мозг Рецептор хоминга /7293/

 _CD45 . 180-220 Лейкоциты Общий лейкоцитарный антиген

(Семейство родственных ГП на

лейкоцитах)

Клетки CD4+/СD45+ идентифицированы как  _индукторы супрессоров

CD49a 210 Тромбоциты VLA-1, ( 7a 01-цепь интегринов)

CD49b 160а Тромбоциты VLA-2, ( 7a 02-цепь интегринов),GPIa

CD49c 125 Тромбоциты VLA-3, ( 7a 03-цепь интегринов)

CD49d 150/ Моноциты,Т-лимфо- VLA-4, ( 7a 04-цепь интегринов),

80/70а циты, тимоциты, рецептор для фибронектина,

В-лимфоциты, рецептор VCAM (CD 106)

клетки Лангерганса

 _CD49е . 135/ Тромбоциты VLA-5, ( 7a 05-цепь интегринов),

125 рецептор фибронектина

CD49f 120/25 Тромбоциты VLA-6, ( 7a 06-цепь интегринов),

Т-лимфоциты рецептор ламинина, GPIc

CD50а 121 Лейкоциты ICAM-3

CD51/61 Тромбоциты Рецептор витронектина, 7 b 03-цепь

21-28 интегринов, GPa

CD54а 90 Многие типы клетока ICAM-1

CD55 - " - ФУР (DAF) - фактор, скоряющий

расщепление С3- и С5-конвертаз

комплемента

 _CD 56 ........ Маркер ЕКК (СD56+ CD3-)

CD58 40-65 LFA-3 Лейкоциты, лиганд CD2

CD62E 115 Эндотелиальные Е-селектин, ELAM-1, рецептор

клетки CD15s

CD62L 75-80а Предшественники L-селектин, LAM-1, LECAM-1

гемопоэза,лимфоциты,

моноциты,гранулоциты

CD62P 150 Активированные Р-селектин, PADGEM

тромбоциты, эндотелиальные клетки

СD64 75 Моноциты Рецептор Fc 7g 0 IgG типа I (Fc 7g 0RI)

CD71 Пролиферирующие Рецептор трансферрина

gp90-95 клетки, моноциты,

gp43/39 эритроидные предp69 шественники

СВ73а p69 Т- и В-клетки Экзо-5'-нуклеотидаза

CD74 В-лимфоциты, HLA II-ассоциированная инвариантная

gp41/35/33а моноциты цепь, LN2

CDw75а - Зрелые В-лимфоциты,  7a 0-2,6-сиалилтрансфраза, LN1

CD102а 60 Многие типы клетока ICAM-2, рецептор CD 11a/18

CD106 Эндотелиальные VCAM-1, рецептор CD 49d/29

100/110а клетки

CD107a 110 Тромбоциты LAMP-1

CD107b 120 - " - LAMP-2

СDw116 75-85 Миелоидные пред- Рецептор ГМ-КСФ

шественники,моноциты, макрофаги

 _CDw119  . 90 ЕКК,Т-, В-лимфоциты Рецептор 7 п 0-интерферона

 _CD120а  . 55 Т- и В-лимфоциты Рецептор для ФНО-55 кД

 _СD120b  . 75 Т- и В-лимфоциты Рецептор для ФНО-75 кД

 _CDw121a . 80 Т-лимфоциты Рецептор для IL-1 типа 1

(IL-1R1)

CDw121b 68 Т-лимфоциты,грану-а Рецептор для IL-1 типа 2

лоциты,предшест- (IL-1R2)

венники гемопоэза

 _СD122  . 75 Активированные Рецептор IL-2-75кД (IL-2Rb)

лимфоциты,моноциты,

часть покоящихся

Т-лимфоцитов

CDw124 140 Лимфоциты,моноциты, Рецептор IL-4 (IL-4R)

предшественники

гемопоэза

СD126 80 Т-лимфоциты, ктиви- Рецептор IL-6 (IL-6R)

рованные В-лимфоциты,

моноциты,тромбоциты,

гранулоциты

CDw127а 75 Т- и В-лимфоциты, Рецептор IL-7 (IL-7R)

макрофаги

CDw128 58/67 Гранулоциты Рецептор IL-8 (IL-8R)

CDw130 130 Рецептор IL-6 (IL-6R)

gp1300 sig

───────────────────────────────────────────────────────────────

Примание: LFA - лимфоцитарный функцио-ассоциированный АГ

ДК - дендритные клетки

КСФ - колониестимулирующий фактор

ФНО - фактор некроза опухолей

c/с Ig - cуперсемейство иммуноглобулинов

 ИММУНОПРОФИЛАКТИКА И ИММУНОТЕРАПИЯ

Иммунопрофилактику и иммунотерапию инфекционныха заболеваний

проводят с помощью

- вакцин, в т.ч. анатоксинов (препаратов индукции активного

противоинфекционного иммунитета за счета мобилизации механизмов

иммунологической памяти);

- иммунных сывороток и иммуноглобулинов - препаратов, содер-

жащих готовые специфические антитела, введение которых в орга-

низм приводита к немедленному приобретению пассивного гумораль-

ного иммунитета, /1430к/

- иммунокорригирующих средств (интерлейкинов, факторов рос-

та, интерферонов, цитокинов).

 Анатоксины

Анатоксины - препараты, содержащие инактивированный токсин,

вырабатываемый микробом. (Токсины - экзо- и эндо /ЛПС Г-/). Эти

препараты обеспечивают выработку иммунитета к токсину соответс-

твующего возбудителя. Используются вместе с адъювантом.

 _Примеры

- Дифтерийный (АД)

- Столбнячный (АС)

- Сексанатоксин, тетрнатоксин (токсины возбудителей газо-

вой гангрены)

- Стафилококковый

- Комбинированные препараты

-- дифтерийно-столбнячный (АДС)

-- коклюшно-дифтерийно-столбнячный (АКДС)

 _Приготовление . (выделение + адъювант)

- Токсины получают путем фильтрования жидкой питательной сре-

ды или исследуемого материала. где размножались токсигенные бак-

терии. Анатоксны получаюта путема обработки токсинов формалином

(0,3%а раствор /0,4%/) при температуре 37 5о 0 /39 5о 0/а ва течение 30

дней. При этом токсин теряет токсические свойства, но сохраняет

нтигенные.

-  Эндотоксины Е.coli (О:В4) выделяли 3 методами

( 4безводным фенолом 0, 4а охлажденным бутанолом 0, 4а и их смесью. 0  Гель-

 4фильтрация. 0) 4 /7661/79/

 Адъюванты 0 (adjuvans помогающий, поддерживающих) - компонент

иммунизируемого препарата, необходимый

1) для более длительного сохранения в организме в месте введения;

2) для повышения иммуногенности, допустим, гаптена (полиионы)

3) Адъюванта можета быть с иммуностимулятором (БЦЖ, тималином,

ГМ-КСФ /2648к/, HLA 4II  0/при иммунизации комплексом АГ са HLA

II класса антигенность значительно повышается/ и др.); тогда

он называется полным. Например, адъювант Фрейнда (неполный =

минеральное масло + эмульгатор; полный = минеральное масло +

БЦЖ).

 Виды адъювантов

1.  _Минеральные сорбенты и масла

- Al(OH) 43 0 - гидрооксид (гидрат окиси) алюминия, который полиме-а ризует АГ. Следует учитывать, что алюминий вызывает слабобумие.

- фосфат алюминия

- алюминиево-калиевые квасцы

- масляные адъюванты (оказывают побочное действие) /2112к/

Адсорбированные препараты, т.е. осажденные н коллоидных

субстратах (гидрат окиси алюминия, афосфат алюминия), са одной

стороны, с повышенной иммунологической эффективностью благодаря

созданию в организме "депо" в месте инъекции, с другой сторо-

ны, са силеннойа иммунологическая реактивность организма (адъ-

ювантное действие сорбента. (Л  Т.А. 0)

2. Микробного происхождения.

- Целыеа  _бактериальные клетки .

-- вакцина БЦЖ,

-- Bordetella pertussis,

-- Сor.parvum-?х

- извлеченные из микробов химические вещества

-- ЛПС, липид А ЛПС-да или эндотоксина E.coliа /7958/,

-- Па /1338к-с.253/,

-- Пептидоглюкан клебсиелл. /2295к/

-- Холерный токсин в микродозах (в мукозальных вакцинах).

Используют субъединицу Ва молекулы холерного токсина,

обеспечивающего рецепцию холерного токсина на клетках.

Токсин обладает иммуномодулирующей активностью: активируются Тх2а в слизистой кишечника, силивается синтез

sIg A и Ig E. /2295к/ Холерный токсина используется в

качестве носителя для доставки различных антигенов (он

очень стойчив к действию ферментов слизистых оболочек,

также к лимфоцитам). /2631к/99/

3.  _Полиионы . (полинуклеотиды, полианионы) или смесь тих ве-

ществ. /7143/89/ Это неприродные полиэлектролиты с М. от 10 до

100 кД. Полиионы стимулируют иммунный ответ в 30 и более раз.

/2380к/ Полиэлектролиты (замещают функцию Тх-ов):а комплекс АГ+

полиэлектролит превращает АГ в Т-независимый. ─── Новое поколе-

ние вакцин (против чумы и брюшного тифа). /2318к/

- Полиакриловая кислот (ПАК)

- Сополимера 4-винилпиридин иа 4-винил-N-этилпиридинийбромида

(МЕ-3);

- сополимер акридиловой кислоты и N-винилпирролидона (NА-5),

- полиамин. /2318к/

4. Использовании  _липосом . в качестве адъювант не аполучило

практического применения. /2295к/

Липосомы - фосфолипидные микроскопические пузырьки. Липосомы

способны адсорбироваться н клетках и их содержимое поступает

внутрь клетки. Липосомы могут захватываться фагоцитами. Гидро-

фобные Га можно вводить в состав фосфолипидов, гидрофильные -

как внутреннее содержимое липосом. В экспериментах "липосомные"

вакцины вызывали тысячекратное силениеа иммунного ответа.

/1430к/

5.  _Другие . соединения.

- декстран (стрептококков, вейлонелл ротовой полости) стимулирует гуморальный иммунитет;

- метилцеллюлоза

- ПАВ (поверхностно-активные вещества)

 4-- бромид диметилдиоктадециламмония (ГЗТ, ингибирует компле 4мент)

 4-- многотомные спирты (L101, L121) --- инактивируют компле 4мент) /2403к/

- тапиока

- мурамилдипептиды

- sodium alginate /7330/87/

 ВАКЦИНЫ

- АГ-содержащие препараты микробов или их продуктов

(направлены на формирование активного иммунитета)

В последнейа трети ХХ века получила всеобщее признание точка

зрения, согласно которой вакцинация является однима иза методов

борьбы за активное долголетие как в развивающихся, так и в эко-

номически развитых странах. Целенаправленная вакцинация, прово-

димая в мире в течение многих лет, обеспечила существенное сни-

жение заболеваемости корью, полиомиелитом, столбняком, коклю-

шем. /2318к/97/

 _Вакцины применяются

1) для профилактики заболеваний

-- плановая вакцинация детского населения

-- вакцинация определенного контингент ва определенных

районах /например, вакцины против зоонтропонозных инфекций, клещевого энцефалита/),

-- вакцинация в определенное время (по эпидемическим показаниям (гриппозная вакцина),

 При гриппе, как и при любой другой инфекции, можно эффективно

 5воздействовать на эпидемический процесс только после того, как

 5адекватной иммунизациейа будет охвачено не менее 80-90%а всего

 5населения. Однако это словие еще никогда не было выполнено. 0

2) для лечения хронических заболеваний или течений (напри-

мер, поражениях аденовирусами, вирусом герпеса). /2295к/а Это

направление значительно более ограничено. С этой целью исполь-

зуют чаще битые вакцины (стафилококковую, гонококковую).

В России также накоплен большой положительный опыт борьбы с

распространенными инфекционными заболеваниями. Однако в послед-

нее время существенно  _снижаются объемы иа эффективность вакци-

 _нопрофилактики ., проводимой в нашей стране. Это обусловлено ря-

дом обстоятельств:

- снижается процент лиц, подвергающихся вакцинопрофилактике,

что связано с увеличением частоты случаева противопоказаний к

вакцинации (ИД, аллергические заболевания),

- применяемые в настоящее время вакцинирующие средства отно-

сятся к препаратам старого поколения и не обеспечивают стойкий

иммунитет у лиц, прошедших вакцинацию. /2318к/97/

- Применение вакцин малоэффективно на фоне ИД-ых состояний.

/2318к/97/

- Политико-экономическая ситуация в России.

 История

Название "вакцины"а было дано Л.Пастерома всем прививочным

препаратам, полученным из микробов и их продуктов (от лат. vac-

ca -а корова). Э.Дженнерома была получена первая живая вакцина,

содержащая вирус коровьей оспы, идентичный по антигенным свойс-

твама вирусуа натуральной оспы человека, но маловирулентный для

человека. Это был первый природныха вакцинныйа штамм. Л.Пастер

разработала принципы направленного получения вакцинных штаммов -

селекцию мутантов с пониженной вирулентностью  4путема культивиро-

 4вания их в определенных словиях или пассирования через организм

 4устойчивых к данной инфекции животных. 0 /1430к/

 Получение вакцин

Из стратегийа разработки инактивированных вакцин заслуживают

внимания следующие. /2631к/99 и др./

1) Получение микробов методом селекции, пассирования. (Выра-

щивание микробов, очистка.)

- Использование целых микробов

 Вирусные вакцины на

 4- курином эмбрионе

 4- фибробластах

 4- культуре клеток опухоли

 4- культуре клеток почек.

- Использование инактивированных микробов (как правило, хи-

мическими веществами). /2631к/99/

- Выявлениеа из дивергентных линий возбудителя, возникших в

естественных условиях (например, вирус коровьей оспы для приви-

вок против натуральной оспы). (Л  Т.А. 0)

2) Получение in vitro псевдочастиц, не способных к реплика-

ции. /2631к/99/

3) Создание вакцин на основе секретируемыха антигенов, кап-

сульных полисахаридов, полисахаридов, конъюгированных с белка-

ми, также субъединиц микробов и белковых оболочек. /2631к/99/

- Получение рибосомальной фракции микробов --- рибосомальные

вакцины.

4) Применение антигенов, синтезированныха рекомбинантными

микробами и синтезированных антигенов с В- и Т-эпитопами./2631к/

 4- Генно-инженерные вакцины.

-  Самосборк VP2-белк парвовируса свиней (псевдочастицы).

 Данные псевдочастицы используются для доставкиа ва цитоплазму

 4клеток эпитопы, чужеродные цитотоксическим Т-лимфоцитам (ЦТЛ).

 Это свойство хотят использовать для получения вакцин.

 4/2632к/99/ 0

 45) Получение ДНК-вакцин. /2631к/99/

6) Применение в качестве АГ химически и генетически инакти-

вированных токсинов ( _анатоксинов .). /2631к/99/

7) Использование в качестве антигенов антиидиотипических ан-

тител. /2631к/99/

 _Общие требования к вакцинам

1. Высокая иммуногенность (либо иммуностимулирующее, либо

десенсибилизирующее действие). В идеале иммунитет, создаваемый

вакцинами, должен приближаться к иммунитету, формирующемуся

после инфекционного процесса, поскольку последний является наи-

более напряженным и полноценным. /2299к/90/

2. Ареактивность (отсутствие выраженных побочных реакций).

3. Безвредность и минимальноеа сенсибилизирующее действие.

/1430к/

До настоящего времени далеко не все вакцинные препараты от-

вечают этим требованиям. /1430к/

 Введение вакцин 0 (иммунизация)

- подкожно (вакцины против кори, АДС-анатоксин),

- накожно (оспенная вакцина),

- внутрикожно (БЦЖ),

- внутримышечно (вакцина АКДС),

- перорально (вакцина против полиомиелита). (Л  Т.А. 0)

 Мукозальные вакцины 0 - вакцины, вводимые не парентерально, а

через рот, аэрозольно, в инстилляциях (впрыскивание в мочевой

пузырь, влагалище и пр.) Вакцины (с адъювантом) выпускаются в

капсулаха или микрокаплях. Вакцины вызывают синтез sIg A в ки-

шечнике;а в кровотоке появляются антитела классов Ig G и Igа A.

/2295к/97/

 Иммунизация некоторыми препаратами через рот вызывала синтез

 5Ig A и sIg A-антител не только в пейеровых бляшкаха или стенке

 5кишечника, но иа ва отдаленных органах - на слизистой бронхов,

 5мочеполового тракта. Т.о., слизистые оболочки действовали как

 5единая система, в пределах которой, по-видимому, происходило

 5распространение активированных лимфоцитов и соответствующих ин-

 5терлейкинов. /2295к/97/

 Индукция синтеза Ig A, характерная для мукозального иммуни-

 5тета, связана с активацией Тh2 (Т-хелперов второго типа), про-

 5дукцией ИЛ-4,5,6 и 10. Активность Тх2 связана и са включением-

 5синтеза Igа E, но введение вакцин через рот обычно не вызывает

 5развития аллергических состояний. /2295к/97/

 В слизистыха кишечника и бронхов находятся клетки-супрессоры

 5различной природы. В частности, они могут презентировать анти-

 5гены, но не образовывать медиаторов, необходимых для размноже-

 5ния и дифференцировки лимфоцитов. Состояние, когд лимфоциты

 5получают лишь "первый сигнал", но не последующие, может привес-

 5ти к толерантности. Данный механизм необходим, очевидно, для

 5того, чтобы защитить слизистые от постоянного воспаления, свя-

 5занного с действием ИЛ-1 и ФНО. Все же такойа типа воспаления

 5наблюдается, например, при хроническом рините. /2295к/97/

 В связи с возможностью развития иммунологической толерант-

 5ности ва слизистой оболочке кишечника появилось новое направле-

 5ние - оральная десенсибилизация при аллергии, вызванной одним,

 5известным веществом. /2295к/97-14,39/ Возможная индукция толе-

 5рантности заставляет использовать при создании мукозальных вак-

 5цин те или иные 0  5адъюванты. /2295к/97/

Варианты мукозальных вакцин

1. рекомбинантным (см. ныше) с бактериальным вектором.

2. липосомные и микрокапсулы (скорость деградации до 2а не-

дель). Использовании липосома в качестве адъюванта не получило

практического применения. /2295к/

3. "Корпускулярные" вакцины, например, адсорбированныха на

эритроцитах цыплят живой вирус гриппа (оральное использование).

/2295к/

ВИДЫ ВАКЦИН

Для профилактики инфекционных заболеваний применяюта следую-

щие типы вакцин.

──────────────────┬────────────────────────────────────────────

Группа вакцин │ Примеры

по способу │ Бактерийные вакцины 0 │  Вирусные вакцины

получения │и простейших │

──────────────────┼─────────────────────────┼──────────────────

Живые │-туберкулезная (БЦЖ=BCG -│- коревая,

(аттенуированные) │ Bacille Calmette-Guerin)│- паротитная,

вакцины │-чумная │- гриппозная,

│-сибиреязвенная (СИа -а │- полиомиелитная

а│ взвесь живых спор) вакцины Сейбина

│-туляремийная (вакцин │- против краснухи

│ Гайского-Эльберта) │- антирабическая

│-бруцеллезная вакцина

│-холерная │- аденовирусная

──────────────────┼─────────────────────────┼──────────────────

Инактивированные │-коклюшная, │- гриппозная

(или убитые), │-брюшнотифозная, │- против клещевого

корпускулярные │-холерная энцефалита

│-лептоспирозная │- полиомиелитная

│-гонококковая вакцина Солка

│-бруцеллезная │- против краснухи

│- Лизаты /?/, например, │

│ при актиномикозе │

│ │

──────────────────┼─────────────────────────┼──────────────────

Химическая │-сыпнотифозная │- гриппозная (НА

(субъединичная) │-холерная (холеро- и NА)

│ ген + О-антиген │

│ /ЛПС/) │

│-менингококковая (ПС А и │

│ С) │

│-брюшнотифозная │

──────────────────┼─────────────────────────┼──────────────────

Синтетические │Полипептиды бакте- │Полипептиды виру-

вакцины │рий, их токсинов │сов, вакцина против

│(вакцина против │вируса гепатита В)

│дифтерийного токси- │

│на, стрептококков) │

──────────────────┼─────────────────────────┼──────────────────

Генноинженерные │-АГ стрептококков, Г нуклеокапсида

(рекомбинантные)а │-липопротеин Pseu- │- ВГА (вируса гепа-,

вакцины │domonas aeruginosa, тита А)

│-фимбрии кишечной │- ВГВ (HBsAg)

│ палочки, │- вируса Dengue 4

│-ЛПС Vibrio choleraе │- белки вируса

│-О-антигены шигелл бешенства

│ S.sonnei,S.flexneri │- Белки вирусов RSV

│-АГ возбудителей HIV (ВИЧ)

│ столбняка, │

│-АГ туляремийных │

│ бактерий, │

│-белки Brucella │

│ abortus, │

│-мембранный белок │

│ Bordetella pertus- │

│ sis (коклюш), │

│-АГ простейших │

│ (Р.berghei, │

│ P.yoelii), │

──────────────────┼─────────────────────────┼──────────────────

нтиидиотипическиеналоги анатоксинов │

вакцины │ │

──────────────────┼─────────────────────────┼──────────────────

натоксины │-Противодифтерийная, │

│-противостолбнячная (АДС)│

│-Холероген-анатоксин │

│ │

──────────────────┴─────────────────────────┴──────────────────

 Ассоциированные вакцины 0 ( 2поливакцины 0 - ВП)

Для одновременной выработки иммунитета против нескольких ин-

фекций с целью сокращения числа прививок в последние годы при-

меняют так называемые ассоциированные вакцины, в состав которых

входит несколько моновакцин. (Л  Т.А. 0)

- Примером ассоциированных вакцин, использующихся в настоя-

щее время, в настоящее время для иммунизации детей являются ши-

роко применяемая во всем мире АКДС-вакцина, а также паратит-

но-коревая и краснушно-паротитно-коревая вакцины, применяемые в

ряде зарубежных стран. (Л  Т.А. 0)

- Например, ВП-4 (вакцина без адъюванта, разработанная Инс-

титутом вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова, Москва) содержит

растворимые Га St.aureus, Kl.pneumoniae, Proteusа vulgaris,

E.coli. Используется для лечения хронических инфекционных забо-

леваний дыхательной системы (в т.ч. микробно-обусловленной аст-

мы). /2295к/

- Бронхомунал (ВП) /используется перорально/. /2295к/

- Вакцина бронховакс содержит антигены Diplococcus oneumoni-

ae, Haemoph. influenzae, Neisseriaа catarralis, St.aureus,

Str.pyogenes, Str.viridans. /2295к/

 Аутовакцины 0, полученные из микробной культуры больного (нап-

ример, при хронических стафилококковых инфекциях, гонорее и др.)

{Быстро эволюционирующие микробы - вирусы гепатитов, ВИЧ, грип-

па; меняющие АГ + гонококки, боррелии.]

 ДНК-вакцины 0 (плазмидные) стимулируют клеточный иммунитета (но

не гуморальный).  При введении некоторых ДНК-вакцин в организм не

 4экспрессировался закодированный в ДНК белок и не синтезировались

 АТ. Одновременно с этим имела место индукция весьма выраженного

 4клеточного иммунитета. /2579к/99/ 0

Классификация вакцин по способам получения

 _ Живые (аттенуированные = ослабленные) вакцины

1) Жизнеспособные микробы, несущие "свои" АГ

2) - " -, несущие АГ другого вида микроба ("химеры"), соз-

данные генноинженерным путем (векторы).  5- см. ниже

Живые аттенуированные препараты вызывают вакцинальный про-

цесс, идентичных инфекционному, иногда с некоторыми клинически-

ми проявлениями. (Л  Т.А. 0)

В соответствии с требованиями ВОЗ  _живая вакцина . должна быть

- непатогенной (специфически безопасной) для человека,

- стабильной,

- защищать от пенетрации и размножения в клеткаха кишечника,

- создавать защиту от заражения вирулентным штаммом,

- нести один или более маркеров для идентификации вакцинного

штамм средиа дикиха культура в организме хозяина и окружающей

среде. /1365к/

 _Достоинства живых вакцин

- Создают напряженный иммунитет, сходный с инфекционным.

- Достаточно однократной вакцинации, так как вакцинный штамм

может размножаться и персистировать в организме.

- Для иммунизации необходимы гораздо меньшие количества жи-

вой вакцины. /1633к/

 _Недостатки живых вакцин

- Антирабическая вакцина иногда вызывает энцефалит (мозговые

Г).

- Применениеа живых вакцин опасно для людей (особенно детей)

с врожденными или приобретенными ИД=ми состояниями, на фоне ко-

торых возбудители с пониженной вирулентностью могут вызвать тя-

желую генерализованную инфекцию (например, паралитический поли-

омиелит при агаммаглобулинемии).

- Сохраняется вероятность обратной мутации и приобретения

вирулентных свойств.

Противопоказание к применениюа - первичное иммунодефицитное

состояние, иммуносупрессия, злокачественные новообразования,

беременность.

 Убитые вакцины

готовят из микроорганизмов, обладающих максимально выражен-

ной иммуногенностью, инактивированных прогреванием, Ф-лучами,

химическими веществами (формалином, фенолом, спиртом и др.) в

условиях, включающих денатурацию АГ-ов. /1430к/

 _Недостатки

- Меньшая иммуногенность

- Необходимость повторного введения

- Использование адъювантов

- Аттенуированных или битый возбудитель -а это множество

различных антигенных детерминант, из которых "протективностью",

т.е. способностью индуцировать защитныйа иммунитет, обладают

очень немногие. Необходима очистка от токсичных, индифферентных

и аллергизирующих компонентов.

 _ Цельновирусные вакцины

 Цельновирусные вакцины содержат помимо нужных НА и N также

 4липиды, повинные в пирогенных, токсических и реактогенных эф-

 4фектах при проведении прививок. Наличие липидова не позволяет

 4увеличивать дозировку антигенов, т.к. немедленно худшается пе-

 4реносимость прививки.

 Субъединичные вакцины

Состоят из фракций цельных битых микробов (ЛПС, токсинов и

др.).

 _Достоинства

- наименее реактогенны

- моновалентны

-  Аллерговакцины 0 - конъюгат аллергена и полиэлектролита (по-

лиоксидония)а снижает аллергенную активность, что способствует

индукции "блокирующих" Ig G-антител. /2327к/97/

 _Недостатки

- наименее иммуногенны; используются с адъювантами

- необходимость дробного введения. /1430к/

Более иммуногенными следует считать вакцины субъединчиные из

белков микроорганизмов, полученных с помощью генной инженерии и

синтетические пептидные вакцины. (Л  Т.А. 0)

-  Рибосомальные вакцины

Рибосомальная вакцин -а рибосомальная фракция микробов,

включающая антигены. Препарат рибомунил (мукозальная вакцина)

включаета рибосомальную фракцию из культур Klebsiella pneumoni-

ae, Diplococcus pneumoniae, Str. pyogenes, Haemophilus influen-

zae. /2295к/

Рибосомальная вакцина - микробная вакцина;а у одних микробов

(шигелл)а основную иммуностимулирующую (антигенную) роль играют

белковые компоненты, у других микробов - РНК.

30 лет назад открыли иммуностимулирующие свойств рибосо-

мальной вакцины - рибосомы выступают в качестве адъювантов.

Это естественная комплексная (случайный комплекса са другими

мембранными структурами, на которых есть АГ) вакцина.

 Генноинженерные (рекомбинантные) 0  2вакцины

созданы на основе картирования геномов микробов. Гены, контро-

лирующие нужные антигенные детерминанты, переносят в геном дру-

гиха микробова и клонируют в них, добиваясь экспрессии генов в

новых словиях. /1430к/

Рекомбинантные вакцины - микроносители + белковый антигена +

дъювант (холерный токсин и пр.). В качестве векторов в живых

рекомбинантных вакцинах используются малопатогенныеа сальмонел-

лы, аденовирусы, полиовирусы, вирус Vaccinia. Такие вакцины вы-

зывали развитие как местного, так и системного иммунитета, ха-

рактеристик которого зависел ота использованного вектора

(Табл.). /2295к/

- Например, вирус Vaccinia c протективным белкома Gа вируса

бешенства размножается в кишечнике и вызывает местный и систем-

ный иммунный ответ;а аденовирус c протективным белком G вируса

бешенства лучше размножается в легкиха (аэрозольное введение).

/2295к/

- Малопатогенную Salmonella typhimurium используют в качест-

ве бактериального вектор кака носителя поверхностного белка

лейшманий (gp63), а также белка С тетанотоксина. /2295к/

Рекомбинантные оральные вакцины /2295к/

───────────────┬───────────────────────────────────────────────

Векторы │ Антигены

───────────────┼───────────────────────────────────────────────

S.typhi │Поверхностный белок Str.mutans

│

S.dublin │Липопротеин Pseudomonas aeruginosa

│Фимбрии кишечной палочки

│ЛПС Vibrio cholerae

│

S.typhi │О-антигены шигелл (S.sonnei, S.flexneri)

│

S.typhimuriumа нтигены возбудителей столбняка,

│туляремии,

│белки Brucella abortus,

│Str.major,

│M-белок Str.pyogenes,

│мембранный белок Bordetella pertussis,

│простейших (Р.berghei, P.yoelii),

│вирусов нуклеокапсида

│- ВГА,

│- ВГВ,

│- вируса woodcbuek hepaitis,

│поверхностный антиген вируса Dengue 4.

│

Adenovirus │Белки вируса бешенства

accinia virus │Белки вируса бешенства, RSV, HIV, HBsAg

Polio virus │Белки вируса HIV

Е.с. │

───────────────┴───────────────────────────────────────────────

 Химические (синтетические) вакцины

представляют собой искусственно синтезированные короткие пепти-

ды, имитирующие небольшие структуры оболочки вирусов, бактери-

льныха структур (т.е. они моделируют природные аналоги, но в

отличие от них не содержат "баластного материала", который не

существенен для создания иммунитета, лишь загрязняет матери-

л. (Л  Т.А. 0)

Можно использовать комплекса выделенных в чистом виде анти-

генных детерминант (эпитопов), конъюгировать с носителем (поли-

электролитом, абелком и ввести подобную искусственную вакцину в

организм. /1430к/

 Антиидиотипические вакцины

- вакцины на основе антиидиотипических антител, которые яв-

ляются "внутренним образом" АГ и тем самыма могута вводиться в

организм вместо АГ патогенных микробов. Показано, что антитела

против антитоксического Ig могут иммунизировать подобно анаток-

сину. (Л  Т.А. 0)

 Виды побочного действия вакцин

 Недостатки

Вакцинация - одно из крупнейших достижений биологии. Однако

техника вакцинации до сих пор несовершенна. Самое гласное - не-

возможно гарантировать абсолютную безопасность вакцины.

1.  _ Фармакологическое действие вакцин

Вакцины могут влиять на работу сердца, легких, почек, эндок-

ринной, нервной систем и пр. ЛПС коклюшного ЛПС может вызвать

лихорадку, судорожный синдром, энцефалопатию. /2259к/95/

Вакцины вызывают образование различных медиаторов. Например,

ИФ вызывает лихорадку, гранулоцитопению и токсические явления в

ЦНС, ИЛ-1 является одним из факторов воспаления. /2259к/95/

2.  _ Поствакцинальный инфекционный процесс, вызванный

-  _ 1остаточной вирулентностью вакционного штамма;

Например, лимфадениты и остеомиелиты после введения БЦЖ.

Вакцино-ассоциированный полиомиелит, корь. /2259к/95/

-  _ 1реверсией патогенных свойств вакцинного штамма

3.  _ Туморогенное действие

Используемые для биотехнологииа (получения рекомбинантных

вакцин, препаратов)а материалы могут быть контаминированы раз-

личными вирусами и микоплазмами. Для контроля препаратов приме-

няются современные методы молекулярного анализ (определение

содержания ДНК, аминокислотной и нуклеоидной последовательнос-

ти, методы молекулярной гибридизации с применение цепной поли-

меразной реакции и др.). /2259к/95/

Присутствие ва препаратаха гетерологичной ДНК в большой кон-

центрации представляет онкогенную опасность, так как ДНК может

вызывать инактивацию супрессорных онкогенов или активацию про-

тоонкогенов после ее интеграции с клеточным геномом. По требо-

ваниям ВОЗ, содержаниеа гетерологичной ДНК в 1 дозе вакцины не

должно превышать 100 пг, для препаратов ИФ и МАТ, вводимых

людям многократно, оно станавливается в каждой стране нацио-

нальным контрольным органом. /2259к/95/

4.  _ Индукция образования антител к непротективныма антигенам

 _ 1вакцин

Число антигенных детерминант в одной вакцине может достигать

нескольких десятков. Лишь небольшая часть этиха детерминант

обеспечивает развитие антиинфекционного иммунитета. Остальные

нтигены вызывают продукцию АТ-свидетелей, не играющих сущест-

венной роли в становлении иммунитета. Такую бесполезную работу

ИС выполняет при введении многокомпонентных вакцин, рассчитан-

ныха преимущественно н создание клеточного иммунитета.

/2259к/95/

5.  _ 1иммуномодулирующее действие вакцин . 0:

-  _ 1действие антигенов вакцин

Многие возбудители (БЦЖ. коринебактерии parvum, B.pertussis,

Nocardia, L.monocytogenes) и бактерийные препараты (пептидогли-

каны, ЛПС, белок А и др.) обладают ярко выраженныма неспецифи-

ческим иммуномодулирующими свойствами, влияющими на развитие ИО

к другим АГ. Например, В.pertussis влияет к опустошению ти-

мус-зависимых зон лимфоидной ткани. Этот возбудитель усиливает

ктивность макрофагов, Т-хелперов и Т-эффекторова и подавляет

ктивность Т-супрессоров. /2259к/95/

-  _ 1действие сорбента, носителей и др.;

-  _ 1действие цитокинов, присутствующих в вакцинах

Многие цитокины, например, ИЛ-1, ИЛ-6, гранулоцитарный и

гранулоцитарно-макрофагальный КФа (ГМ-КСФ), могут присутство-

вать ва полиомиелитной, антирабической, коревой, паротитной,

краснушной вакцинах. Такие цитокины, как ИЛ-1, ФНО, могут при-

сутствовать в МАТ. /2259к/95/

6.  _ Индукция аутоиммунных состояний

а) При наличии перекрестных АГ у микробов (с АГ человека)

Например, перекрестные АГ между полисахаридом менингококко-

вой В-вакцины и гликопротеином клеточных мембран млекопитающих.

/2259к/95/

б) При наличии перекрестных АГ примесей и АГ человека.

Примеры для сравнения:

- вирус (вакцина), выращенный на культуре клеток почек чело-

века и хомяка,

- вирус (вакцина), выращенный на культуре клеток фиброблас-

тов,

- вирус (вакцина), выращенный на культуре опухолевых клеток

- др.

7.  _ Аллергия . 0:

-  _ 1к антигенам вакцин

Столбнячный анатоксин способен вызывать атопию (одни компо-

ненты - атопию, другие - ГЗТ).

-  _ 1к примесям и добавкам

Большинство вакцин содержат различные примеси и добавки: ге-

терологичный белок, консерванты, ростковые факторы, стабилиза-

торы, сорбенты и др. Они могут быть причиной побочных реакций,

прежде всего аллергических осложнений. /2259к/95/

Значительную опасность представлет примесь чужеродного белка

(яичный альбумин, БСА и др.) в вакцине. Такой белок входита в

состав большинства вирусных вакцин. По требованию ВОЗ, гриппоз-

ная вакцина должна содержать овальбумина не болееа 5а мкг/доза,

/2259к/95/ Пример для сравнения: вирус, выращенный на курином и

гусином эмбрионе. Кильковый бульон (МПБ).

Ранее в некоторые вакцины добавлялиа стрептомицин, который

вызывал тяжелые аллергические реакции вплоть до анафилактичес-

кого шока. В настоящее время используются антибиотики со слабы-

ми аллергенными свойствами. /2259к/95/

В качестве инактиваторов и консервантов вакцин применяют фе-

нол, формальдегида и мертиолят. Побочные реакции на мертиолят

возникают редко. /2259к/95/

-  _ 1к экзоллергенам, не связанным с вакциной

Вирус гриппа А силивает выделение гистамина н аллергена у

больных аллергией. /2259к/95/

8.  _ Индукция иммунодефицитных состояний

Микробные АГ способны активировать клетки-супрессоры, вызы-

вать выделение супрессорных факторов из этиха клеток, секрецию

Pg E 42 0 из макрофагов и т.п. /2259к/95/

9.  _ Психогенное действие вакцин

Ярко выраженные психоэмоциональные свойства прививаемого мо-

гут силивать местные и общие реакции вплоть до обморок при

инъекции вакцины. /2259к/95/

 Календарь прививок

Для достижения желаемого иммунитета при проведении активной

иммунизации большое значение имеют реакции инокулирования анти-

гена, т.е. наличие определенных интервалов между его введением.

Соблюдение этого правила важно с 2 точек зрения:

- организм человека, находящийся в процессе иммуногенез в

результате введения прививочного антигена, в течение определен-

ного времени не способен ответить на новое наслаиваемое анти-

генное раздражение развитием иммунитета (отрицательная фаза им-

мунитета)а (Л  Т.А. 0);

- вакцинация организма, находящегося еще в начальной фазе

иммунологической перестройки, под влиянием предшествующей вак-

цинации может вызывать повышенные реакции и осложнения.(Л  Т.А. 0)

Активная иммунизация не обуславливает у всех прививаемых де-

тей одинаковую степень невосприимчивости. Существуют группы де-

тей, которые не способны к выработке антител. Поэтому очень

важным является использование для иммунизации оптимального мо-

мента для ребенка в целях получения высокого иммуностимулирую-

щего эффекта. (Л  Т.А. 0)

Поскольку активная иммунизация вызывает выработку иммунитета

лишь после определенного периода...

В соответствии с принятым календарем профилактических приви-

вок вакцинация детского населения проводится в 2 направлениях:

- массовая вакцинация и

- вакцинация отдельных групп (по специальным показаниям). (Л

 Т.А. 0)

К первой относятся профилактические прививки против туберку-

леза, полиомиелита, коклюша, дифтерии, столбняка, кори, пароти-

та, гриппа;а ко второй - против брюшного тифа, холеры, туляре-

мии, бруцеллеза, сибирской язвы, лептоспироза, чумы, лихорадки

Ку, клещевого энцефалита. (Л  Т.А. 0)

Утверждено приказом

N 375

от 18.12.1997г.

Календарь профилактических прививок

детям и подросткам

──────────┬───────┬───────────────────────┬────────────────────

Вид вакци-│ Сроки Сроки ревакцинации │ Примечание

нации │ вакци-├──────┬──────┬─────┬───┤

│ нации 1а а 2а 3а │ 4 │

──────────┼───────┼──────┼──────┼─────┼───┼────────────────────

Вакцин │ 1 сут.│1-ый │5-6 │ │- Первая схема

против │(ново- │месяц │месяц │ │

гепатита В│рожден-│ │ │ а │

│ным) │ │ │ а │

│ │ │ │ а │

- " - │4-5 │5-6 │12-13 │ │- Вторая схема

│месяца │месяц │месяц │ а │

│ │ │ │ а │

Против │ 4-7 │ 6-7а │14-15 │ а │Вакцинацию и ревак-

туберкуле-│дней │ лета │лет │ а │цинацию проводят

за (БЦЖ │ │ (1 │(8-9а │ а │однократно. (противо-

или БЦЖ-М)│ │класс)│класс)│ а │показания - вес ре│ │ │ │ а │бенка менее 2 кг,

│ │ │ │ а │келлоидных рубец пос│ │ │ │ а │ле предыдущей дозы)

│ │ │ │ а │

Против │3 мес. │18 мес│2 года│6 лет│ 11│Вакцинация может про-

коклюша, │4 мес. │(через│мес. │(АДС-│лет│водиться одновременно

дифтерии и│5 мес. │12-18 │(ОПВ) │М, │(АД│с вакцинацией против

столбняка │ │мес. │ │ОПВ) │-М)│полиомиелита.

(АКДС),ОПВ│ │после │ │ │16,│Далее - 16-17 лет

-оральная │ │закон-│ │ │26,│(АДС-М), взрослые

полиомие- │ │ченной│ │ │36,│(АДС-М или АД-М)

литная │ │вакци-│ │ │46,│однократно каждые 10

вакцин │ │нации)│ │ │лет│лет.

│ │ │ │ а │Противопоказание │ │ │ │ а │прогрессирующие забо│ │ │ │ а │левания нервной сис│ │ │ │ а │темы, афебрильные

│ │ │ │ а │судороги в анамнезе

│ │ │ │ а │(вместо АКДС вводят

│ │ │ │ а ДС)

│ │ │ │ а │

Вакцин │12-15а │6 лет │ │ │Противопоказания:

против │месяцев│ │ │ а │тяжелые реакции на

кори, │ │ │ │ а миногликозиды,

паротита и│ │ │ │ а нафилактические

краснухи │ │ │ │ а │реакции на яичный

│ │ │ │ а │белок.

──────────┴───────┴──────┴──────┴─────┴───┴───────────────────

Примечания:

- Ревакцинация вакциной БЦЖ проводится неинфицированным ту-

беркулезом детям.

- Вакцинация против кори, эпидемического паротита и краснухи

проводится моновакцинами или тривакцинами (корь, краснуха, эпи-

демический паротит)

- Для проведения последующих прививок минимальный интервал -

4 недели.

 _Противопоказания .:

- Сильная реакция или осложнение на предыдущую дозу (наличие

температуры выше 40 5о С, отек, гиперемия больше 8 см в диаметре в

месте введения вакцины, реакция анафилактического шока).

- Первичное иммунодефицитное состояние, иммуносупрессия,

злокачественные новообразования, беременность (для всеха живых

вакцин).

 Календарь прививок в эндемичных, зоотипичных районах

 2и по эпидемическим показаниям

──────────┬───────────┬────────────┬────────────────────────────

Вид вакци-│Сроки │Сроки │ Примечание

нации │вакцинации │ревакцинации│

──────────┼───────────┼────────────┼────────────────────────────

Против │С 2 лет │ │

чумы │ │ │

│ │ │

Против │С 7 лет │Через каждые│

туляремии │ │5 лет │

│ │ │

Против │С 18 лет │Через 1 год │

бруцеллеза│ │ │

/?/ │ │ │

│ │ │

Против │? │Через 1 год │Только профессиональным

сибирской │ │ │контингентам

язвы │ │ │

│ │ │

Против │С 7 лет │ │

лептоспи- │ │ │

роз │ │ │

│ │ │

Против │С 14 лет │ │

лихорадки │ │ │

Ку │ │ │

│ │ │

Против │С 4 лет │Ежегодно на │

клещевого │ │протяжении │

энцефалита│ │3 лет │

│ │ │

Против │С 7 лет │Через 2 года│

брюшного │ │ │

тиф │ │ │

│ │ │

Против │С 3 лет │ │Лицам, относящимся к

грипп │ │ │группе повышенного риска

│ │ │

Против │С 9 месяцев│ │Лицам, выезжающим в

желтой │ │ │зарубежные страны,

лихорадки │ │ │эндемичные по этой

│ │ │инфекции

│ │ │

──────────┴───────────┴────────────┴────────────────────────────

 ИММУНОКОРРЕКТОРЫ

 Иммунопрофилактика (иммуностимуляция) 2  0- профилактика у имму-

нокомпрометированных индивидов (например, до сезонного подъема

заболеваемости) са использованиема витаминов, микроэлементов,

даптогенова иа препаратов, нормализующиха обменныеа процессы.

/1652к/

 Иммунокоррекция (иммунореабилитация) 2  0- это в известной мере

иммуностимуляция или иммуносупрессия у людей без видимого про-

явления патологии и у больных, c возможностью регулирования

этих процессов или при помощи дозировки препаратов или и комби-

наций. /1652к/

35% больных нуждаются в иммунокоррекции. Правильная оценка

состояния иммуной системы необходима для грамотной иммуномоду-

ляции и иммунопрофилактики больных.

Иммунокорректоры: метилурацил, пентоксил, левамизол, аскору-

тин, препараты кальция в возрастных дозировках. /1629к/

 Иммунотерапия 0 -а терапевтические мероприятия у лиц с опреде-

леой патологией с использованием препаратов крови, аутовак-

цин, различных аллергенов, аллергоидов и др. /1652к/

 Иммуномодуляция 0 - термин, отражающий работы по исследованию

препаратов са разнонаправленным эффектом в зависимости от доз и

схем. /1652к/

Проблема в отсутствии строго селективныха иммуномодуляторов

(повсеместно используют препараты общего действия), практически

полном отсутствии для клинического использования иммуномодуля-

торов селективного действия на отдельные звенья иммунной систе-

мы, на конкретные популяции и субпопуляции лимфоидных клеток. А

в отношении влияния на специфические клоны лимфоцитов практи-

чески нет даже научных разработок. /2157к/97/

Т.о., ва современныха клиническиха словияха речь может идти

лишь о "грубом" выявлении иммунологических нарушений и о назна-

чении больныма более илиа менее профильных иммунокорригирующих

препаратов общего действия. /2157к/97/

 _По происхождению . (действия на разные звенья ИС):

1. Биологические (растительные экстракты;а препараты, выде-

ленные из организма человека, крупного рогатого скот /крс/,

морских животных;а препараты из крови и их других биологических

жидкостей),

- иммуноглобулины (крови, молока женщин и сельскохозяйствен-

ных животных: чагоин, лактоглобулин и др.)

2. Микробные (выделенные из микроорганизмов: вакцины и пр.),

- колибактерин, бифидумбактерин,

- пирогенал, продигиозан, сальмозан,

- биоцил, иском, кукумариозид и др.

3. Синтетические (синтезированные искусственно). /1652к/...

 _По природе . ("избирательность" действия препаратов):

1) полисахариды

2) вакцины (BCG, ССВ, MRV, полиомиелитная вакцина...),

3) препараты НК, синтетические полинуклеотиды,

4) производные имидазола,

5) ИФ, тимозин,

6) гормональные средства

7) витамины

8) средства нейромедиаторного действия. /1652к/

Ни один препарат не оказываета избирательного действия на

клетки, участвующие в иммунном ответе. /1652к/

Иммуномодулирующие свойств присущиа и биогенным аминам.

Большие гранулярные лимфоциты способны депонировать и высвобож-

дать биогенные амины. Макрофаги могут способствовать депониро-

ванию гистамин и серотонина в лимфоцитах из окружающей среды.

/1674к/

 _По механизму действия:

1. препараты, действующие на клеточную кооперацию (преиму-

щественно на Т- или В-систему): Т-активин, миелопид, левамизол,

диуцифон и др.

2. препараты, действующие на иммуно-нейроэндокринную регуля-

цию (медиаторы, нейропептиды, гормоны, цитокины): лейцин-энке-

фалин, субстанция Р, нейротензин и др.

3. препараты экстра (транс) иммунного типа действия (адапто-

гены, витамины, микроэлементы, коферменты, препараты, влияющие

на восполнение пластических и энергетических ресурсов):

- элеутерококк, женьшень, экстракт левзеи (адаптогены)

- рибоксин, оротат калия, линетол, штарк-протеин, политабс,

изопринозин,

- ндевит, декамевит, токоферол, кобаламид и др.

4. препараты с неизвестным механизмом действия:

- димиколат, проксанола 268, бонафтон, АД 202-718 и др.

/1652к/

Можно выделить группу "ретропрепаратов", имеющих длительную

историю использования в практике без чета их иммуномодулирую-

щих свойств (аспирин, теофиллин, кофеин, фенамин и др.). /1652к/

.

 ОЦЕНКА ИММУННОГО СТАТУСА ОРГАНИЗМА

До исследования собственных компонентов иммунной системы сле-

дует оценить фагоцитарную и комплементарную активность.

АГ

│

Фагоцитоз (АПК)

│

HLA 4II 0 │ HLA 4I+II

┌──────Тх/Тs──────  ИО 0 ─────Тх/Тs───────┐

АТ Тк

 Гуморальный Клеточный

 3иммунитет иммунитет

│ │

 4┌────── ИК 4──────┐ 0 клетка-мишень (КМ)

│ Активация комплемент │

│ (ИК-С1q, ИК-С3в) Лизис

│ │ │

Фагоцитоз Фагоцитоз через Фагоцитоз

через FcR комплементарные мертвой

рецепторы клетки

\/

 _При фагоцитарной недостаточности . преципитаты ИК-ов,

деструктированные клетки активируют свертывающую систему

и при истощении (общем или локальном) антикогулянтов

развивается тромбофилия ( _склонность к тромбозам .)

Т.о. основной фактор, определяющий элиминацию из организма

чужеродных и собственных неполноценных субстанцийа -а фагоцитоз

(полноценный завершенный эндоцитоз). Поэтому оценкуа иммунного

статуса следуета начинать с лейкоцитарной формулы, общего коли-

чества лейкоцитов,  _оценки фагоцитарной активности . (степени за-

вершенности по НТС-тесту) и как отражение гуморального иммуните-

та (степень растворения ПИК и тилизации из кровотока ИК) -а ак-

тивность  _системы комплемента .. Стимулировать иммунную систему

(использовать иммуностимуляторы) при недостаточности по системе

комплемента нельзя, так как лишние ИК (при избытке АТ) не будут

элиминироваться из кровотока. [Физиологический механизма данной

регуляции -а фрагменты С3а регулируюта созревание В-лимфоцитов,

т.е. при недостатке С3 синтез АТ "прекращается", так как тили-

зации ИК не будет.]

ОЦЕНКА ФАКТОРОВ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЗАЩИТЫ ОРГАНИЗМА

- Определение абсолютного (камера Горяева) и относительного

(мазок) числа нейтрофилов и моноцитов.

- Определение фагоцитарной активности;

-- оценка функциональной активности макрофагов (хемотаксиса, стадий фагоцитоза и его завершенности, внутриклеточной

инактивация Staphylococcus aureus, тест кожного окна),

- Определение общей гемолитической активности комплемента.

Количественное определениеа компонентова комплемент С3,

С6-С8, субкомпонента С1q.

- Количественное определение ЕКК,определение активности ЕКК.

- Тест торможения миграции лейкоцитов н ФГ или цитокины

ктивированных определенным антигеном лимфоцитов.

ОЦЕНКА ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ

Фагоцитозом называется поглощение клетками микробов или чу-

жеродных частиц. Снижение числа нейтрофилов ниже 25%а от нормы

опасно для жизни. /2269к/

┌─после комплементарного лизиса ─── АПК, КПК ── АТ

Фагоцитоз ┼─после "работы" антител (ИК) ─── ровень АТ

└─комплексов с фибронектином, альфа-2-макроглобулином, С-РБ, лектинами и пр.

Для изучения поглощения используюта бактериальные клетки

(St.aureus или E.coli), дрожжи, латексные частицы. Более интен-

сивно фагоциты поглощают чистицы, обработанные сывороткой, со-

держащей опсонины (Ig G, комплемента, фибронектин, СРБ и др.).

/2291к/

При определении фагоцитарной активности определяют следующие

 2показатели:

- фагоцитарный показатель - процент фагоцитирующих нейтрофилов к общему количеству нейтрофилов;

- фагоцитарный индекс - среднее число микробных тел, захваченных каждой клеткой;

- опсонический индекс

- переваривающая способность -а постепенное меньшение ( в

течение 50-60 минут) интенсивности окрашивания фагоцитированных

микробов вплоть до их полного обесцвечивания;

- завершенность фагоцитоз - отношение лейкоцитов с завер-

шенным фагоцитозом к общему числу лейкоцитов с фагоцитированны-

ми микробами, выраженное в процентах. /272-53/

 _ Методики . 1:

Фагоцитарную активность можно определять в условиях in vitro

и в словиях in vivo.

I. In vitro.

- Методы оценки экспрессии С3- и Fс-рецепторов по тесту РОК;

- Радиометрические методы изучения стадии захвата.

- Теста восстановления нитросинего тетразолия. По реакции

восстановления нитросинего тетразолия судят об стимуляцииа гек-

созомонофосфатного шунта. /1583-4/

II. In vivo.

Белым мышам вводят в/бр. 2мл стерильного МПБ, чем вызывают-

локальный лейкоцитоз. Через 4 часа в/бр. вводят 1мла 2млрд-ой

культуры Staphylococcusа albus. Через 10-15 минут из перитоне-

льной жидкости готовят мазки (можно из осадка послеа центрифу-

гирования), окрашивают метиленовым синим.

 Незавершенный фагоцитоз 0 (наблюдается при поглощении туберку-

лезных палочек, возбудителей лепры, лейшманиоза, гонореи, ме-

нингококков, вирусов, риккетсий) :

Рис. "Незавершенный фагоцитоз гонококков (мазок in vivo)"

Показатель завершенности фагоцитоза (ПЗФ) - процентное отно-

шение мерщвленныха и всех поглощенных микробов (примерно равно

0,80). Выделяют 5 степеней завершенности фагоцитоза (ЗФ):

- высокая ЗФ (1,0-0,82);

- средняя (0,81-0,45);

- слабая (0,44-0,32);

- очень слабая (0,31-0,29)

- ЗФ отсутствует (0,28-0,25)

 Фагоцитарная активность

(фагоцитоз стафилококка)

Реакцию осуществляли по методу Н.В.Васильев и совт.

(1972). Для постановки реакции в лунки иммунологического план-

шета вносили по 15 мкл гепарина в концентрации 10 ед/мл, 50 мкл

цельной крови, взятой с пальца натощак, и добавляли 25 мкл 2 х

10 59 0 микробных тел/мл суточной агаровой культуры Staphylococcus

aureus разведенных на 0,1 М фосфатном буфере рН 7,2. В опытные

лунки вводили по 10 мкл расстворова изучаемыха полипептидов, в

контрольные - 10 мкл фосфатного буфера. Лейкоцитарно-микробную

взвесь перемешивали и инкубировали при температуре 3С ва тече-

ние 30 минут, повторно встряхивая каждые 5 минут. После инкуба-

ции взвесь ресуспендировали, готовили мазки, фиксировали 10 ми-

нут метанолом и окрашивали по Романовскому-Гимза.

Готовые препараты микроскопировали с использованием масляной

иммерсии и вели подсчет в 200 нейтрофилах. Поглотительную спо-

собность фагоцитов оценивали по следующим показателям:

1) фагоцитарный показатель - процент фагоцитировавших кле-

ток из числа сосчитанных нейтрофилов;

2) фагоцитарный индекс - среднее число микробов, поглощен-

ных одним активным нейтрофилом.

Для оценкиа переваривающей функции нейтрофилов определяли

показатель завершенности фагоцитоза (ПЗФ) по формуле:

общее количество переваренных микробов

ПФа =а -------------------------------------- х 100 %.

общее количество поглощенных микробов

Чувствительным методома оценки функциональной активности фа-

гоцитов является метода определения хемилюминесценции крови.

/7062/

- Приготовить кровяно-микробную взвесь (0,05мл 2%а цитрата

натрия, 0,1мл крови и 0,05мл 2 млрд-ой взвеси микробов - микро-

кокков);

- для определения опсонического индекса в опытную пробу до-

полнительно добавляетя антисыворотк к микробам или сыворотка

больного для определения функциональнойа активности антитела к

микробам;

- выдержать в термостате 30 мин. при 37 50 С.

- приготовить мазок из кровяно-микробной взвеси;

- высушить мазок, окрасить по методу Филлипсон:а краситель

Романовского развести этиловым спиртом 1:3. На высушенный пре-

парат наносята 5 капель красителя и выдерживают 5 минут (однов-

ременная фиксация и окраска). Не сливая краску, добавляют во-

допроводную воду, 5 капель на 5 минут. Промывают водой, высуши-

вают, микроскопируют с иммерсией.

- В мазке определяют

а) фагоцитарный показатель - процент фагоцитирующих лейкоцитов (среди полиморфоядерных лейкоцитов). Подсчитывают

100 гранулоцитов и, например, если 35 из них водержат

микробы, то фагоцитарный индекс равен 35%.

б) фагоцитарное число или индекс (количество микроорганизмов, поглощенных одним нейтрофилом); считают суммарное

количество микроорганизмов, например, 567 во всех фагоцитирующих гранулоцитах /80/ и делят н число фагоцитов. Частное ота деления (567:80=7) отражает сруднюю

поглотительную способность одного фагоцита.

в) определяют опсоно-фагоцитарный индекс (ОФИ). Для этого

либо рассчитывают частное от деления Ча (фагоцитарного

числа) больного н Ча здорового донора (при этом ОФИ

должен быть больше единицы; либо ОФИ определяют эмпирическим методом, с помощью которого анализируют состояние 25 нейтрофилов по следующей схеме:

──────────────────────────────────────────────────────────────

Количество микро-│Оценка фагоцитоза│Количество нейт- ОФИ

бов, фагоцитиро- │ │рофилов с данной │

ванный одним │ │степенью фагоци- │

гранулоцитом │ │тарной активности│

──────────────────────────────────────────────────────────────

0 0 2 0х2=0

от 1 до 20 +а (один) 5 1х5=5

от 20 до 40 ++а (два) 10 2х10=20

от 40 и более +++ (три) 8 3х8+24

Итого:а ОФИ=49

Максимальное значение ОФИ - 75, т.е. во всех 25 нейтрофилах

фагоцитировано от 40 и более микробов. У здоровых людей ОФИ ра-

вен 10.

ОИа от 10 до 24 - слабо положительный (+);

от 25 до 49 - ясно выраженная реакция (++);

от 50 до 75 - резко положительная реакция (+++).

Полученые результаты внести в протокол.

Фагоцитарный показатель у здорового человека - 70-84%.

Фагоцитарное число у здорового человека - 4-?.

Фагоцитарное число после обработки микробов антителами (им-

мунной сывороткой) или комплементом Опсонический индекс - больше 1.

Фагоцитоз культуры стафилококка или микрококков в отсутствие

нтител идет плохо, при наличии антител в сыворотке или плазме

фагоцитоз ускоряется, при добавлении комплемента или активации

комплемента ва кровиа исследуемого фагоцитоз резко ускоряется,

т.к. происходит как через Fc-, так и через С3в-рецепторы.

 Оценка степени перекисного и радикального окисления

 2по НСТ-тесту 0 (NBT-тест)

 Тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест)

Тест бессубстратного восстановления нитросинего тетразолия

основан на способности фагоцитов тилизировать кислород с обра-

зованием высокореактогенныха свободных радикалов. НСТ является

индикатором респираторного взрыва (показывает готовность нейт-

рофилов к завершенности фагоцитоза). Низкая реактивность нейт-

рофилов в динамике заболевания можета служить неблагоприятным

прогностическим признаком. /2737к/87/

Сущность метода заключается в образовании нерастворимыха ок-

рашенныха зерена формазана при восстановлении НСТ супероксидным

радикалом.

Метод высокоинформативен

- для оценки функциональной активности фагоцитов,

- прогнозирования тяжести заоблевания,

- контроля з эффективностью антибактериального лечения,

- дифференциальной диагностики вирусных и бактериальныха заболеваний и пр. /2291к/

- Получены доказательства высокого уровня корреляции между

образованием активных форм кислорода и киллингом.

Метод Н.Е.Виксмана, А.Н.Маянского (1979). Изучаемые образцы

вещества ва количестве 20 мкл вносили в лунки иммунологического

планшета, в контрольные лунки - 20 мкл среды 199. В каждую из

лунок вносили по 20 мкл цельной крови, взятой из пальца здоро-

вых людей пипеткой, предварительно промытой раствором гепарина

250 ед/мл и добавляли 20 мкл 0,15% суспензии нитросинего тетра-

золия (Reanal, Венгрия) на 0,1 М фосфатном буфернома растворе,

рН 7,2. Содержимое лунок осторожно перемешивали и инкубировали

при температуре 37 5о С в течение 30а минут, встряхивая планшеты

каждые 10 минут. После инкубации содержимое перемешивали, гото-

вили мазки и высушивали на воздухе. Готовые мазки фиксировали

метанолома 10а минут, высушивали и докрашивали 0,5%а раствором

сафранина.

В качествеа активаторов фагоцитов рекомендуется использовать

опсонизированный зимозана или активатор протеинкиназы С - фор-

болмиристат ацетат. /2291к/

Об интенсивности радикалообразования судят по количеству ди-

формазана, который откладывается в виде грубодисперсных темно-

синих гранул внутри или на поверхности активированного нейтро-

фила. /7062/

При микроскопии в каждом мазке подсчитывали 100а нейтрофи-

лов, среди которых определяли процент клеток, содержащих отло-

жения диформазановых гранул (НСТ-позитивные нейтрофилы). Далее

расчитывали индекс активации нейтрофилов (ИАН) по формуле:

А х 0а +а Б х 1а +а В х 2а +а Г х 3

ИНа = -----------------------------------,

100

где: А - количество клеток, не содержащих диформазановых отложений;

Б - количество клеток, в которых площадь отложений диформазана не превышает 1/3 площади ядра;

В - количество клеток, в которых названные отложения занимают от 1/3 до всей величины ядра;

Г - количество клеток с диформазановыми отложениями по площади превосходит площадь ядра.

НСТ-тест можета быть сделана беза дополнительной стимуляции

(спонтанный НСТ-тест) или после стимуляции нейтрофилов in vitro

(индуцированный НСТ-тест). /7062/

При патологии чаще ПОЛ растет. Поэтому если лечение выбрано

правильно, то процент активированных нейтрофилов быстро падает,

опережая динамику лейкоцитарных сдвигов, СОЭ и др. /7062/

Сниженные показатели НСТ-теста --- неблагоприятный исход

(сепсиса)

Повышенные показатели НСТ-теста --- опасность развития гнойных осложнений после операции.

Нормальные показатели НСТ-теста --- спешная терапия. /1365к/

[Преципитат с НСТ может образовывать гепарин. /1575к/90/]

На стекла с прилипшими клетками капают 5а капель (0,14а мл)

1,03% раствора нитросинего тетразолия (17мг на 14 мл).

(Pack B.I. и совт. // Lancet. - 1968. - V.2. - P.532):

0,2% раствор НСТ (0,1 мл на 0,1 мл взвеси лейкоцитов, выде-

ленных из гепаринизированной крови). Пробирку со смесью помеща-

ли в термостат (37 5о С) на 25 минут, затем выдерживали при ком-

натной температуре 15 минут, после чего готовили мазки, фикси-

ровали в метаноле и окрашивали гематоксилином. В мазках подсчи-

тывали % гранулоцитов, включающих красители.

 Лизосомально-катионный тест (ЛКТ)

Растворами исследуемых полипептидов по 50 мкл заполняли лун-

ки иммунологического планшета, ва которые вносили по 20 мкл

цельной крови здоровыха доноров, взятой со скарифицированной

ранки пальца руки при помощи пипетки, предварительно промытой

раствором гепарина 250 ед/мл. Полученную взвесь клетока крови

инкубировали 1 час при температуре 3С. После инкубации готови-

ли мазки, сушили на воздухе при комнатной температуре и окраши-

вали по методу В.Е.Пигаревского и совт. (1981) в 0,1 % забуфе-

ренном спиртовом растворе зеленого прочного с рН 8,2 ва течение

20 минут. Дополнительную окраску мазков проводили 0,25% водным

раствором азура А. Окрашенные препараты промывали дистиллиро-

ванной водой, высушивали на воздухе и микроскопировали с ис-

пользованием масляной иммерсии.

При исследовании просматривали 100 гранулоцитов. Внутрик-

леточное содержание катионных белков крови оценивали полуколи-

чественно по величинеа среднего цитохимического коэффициента

(СЦК), вычисляемого по формуле:

3 +а 2ба +а 1,5ва +а 1га +а 0,5да +а 0а

СКа =а -----------------------------------------,

100

где: а-е - количество однотипных клеток с определенной степенью

окрашиваемости цитоплазмы зеленым прочным, цифры

показывают степень выраженности окраски;

0 - отсутствие окраски;

0,5 - наличие в цитоплазме единичных окрашенных гранул;

1 - половина цитоплазмы заполнена светлоокрашенными гранулами;

1,5 - цитоплазма равномерно заполнена гранулами, окрашенными в светло-зеленый цвет;

2 - цитоплазма содержит 1/3 часть своей площади темнозеленых гранул;

3 - цитоплазма содержит 2/3 части своей площади темнозеленых гранул.

 Определение хемотаксической активности лейкоцитов

Недостаточный хемотаксиса сдерживаета мобилизацию фагоцитов,

способствуя опережающему размножению бактерий. Снижение мигра-

ционной активности нейтрофилов в 2 раза сопровождается затяжным

торпидным течением пневмонии более чем у 50% детей. /7062/

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕЙ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ

СИСТЕМЫ КОМПЛЕМЕНТА

 _Изотонический вероналовый буфер (VBS) ..

1 л раствора содержит 5,095 г веронала и 41,5 г NaCl, рН до-

водится до 7,40 1 М раствором NaOH. Перед работой буфер разбав-

ляют в 5 раз.

 _Изотонический вероналовый буфер, содержащий ионы Са 52+ 0 и Mg 52+

 _(VBS 52+ 0) ..

2 л раствора содержит 5,75 г веронала, 3,0 г мединала, 85,0

га NaCl, 5а мла 1 М MgCl 42 0 и 1,5 мл 1 М ССl 42 0, рН доводится до

7,40. Перед работой буфер разбавляют в 5 раз.

 _Изотонический вероналовый буфер, содержащий ионы Mg 52+ 0 и ЭГТА

 _(VBS, .  _Mg 52+ 0-ЭГТА) ..

К 850а мл изотонического вероналового буфера (VBS), разбав-

ленного в 5 раз, добавляется 100 мл 0,1 М раствора ЭГТА, рН 7,4

и 50 мл 0,1 М раствора MgCl 42 0, рН доводится до 7,40.

 _Изотонический фосфатный буфер (РВS)

0,85% раствора NaCl, содержащий 2%а по объему 0,2 М нат-

рий-фосфатного буфера, рН 7,20.

 _Изотонический трис-буфера c ЭДТ (TBSE) ..

Содержит 5 мМ трис, 0,15 М NaCl, 10 мМ ЭДТА 5. 0Na 42 0, рН 7,2 (до-

водится 0,01 М NaOH).

 _Раствор Олсвера ..

В 750 мл дистиллированной воды растворяли 8,0 г цитрата нат-

рия (дигидрата натриевой соли), 4,2 г NaCl и 20,0а га глюкозы,

добавляли 4а ~ 05,5а мла 10%а лимонной кислоты до рН 6,1 и доводили

объем раствора до 1 л. Для взятия крови раствор Олсвера стери-

лизовали.

Другие буферные растворы готовили по общеизвестныма методи-

кам.

 _Приготовление стандартных взвесей эритроцитов

Эритроциты барана. Кровь барана из яремной вены отбирали с

соблюдением асептических словий ва равныйа объема стерильного

раствор Олсвера со стеклянными шариками, перемешивали и сте-

рильно разливали по пробиркам. Оставляли на 3-7 суток при 4 5о С

для стабилизации клеток. Стерильно отобранные эритроциты можно

хранить около 2 месяцев при 4 5о С.

 _Приготовление стандартной взвеси бараньих эритроцитов ..

Осадок эритроцитов трижды промывали 10-20-кратным объемом VBS 52+

с последующим центрифугированием (1 g) в течениеа 5-10а мин.

Отмытые эритроциты суспендировали в VBS 52+ 0 таким образом, чтобы

после 15-кратного разбавления водой суспензия обладала поглоще-

нием при 541 нм равным 0,7, что соответствует концентрации кле-

ток в суспензии 1 5. 010 59 0 клеток/мл. Для стандартизации пользова-

лись формулой V 4k 0 = V 4o 5. 0A 4541 0/0,7, где V 4k 0 - конечный объем суспен-

зии, V 4o 0 - начальный объем с концентрацией, определяемой по ве-

личине А 4541 0. Стандартизированные эритроциты хранили при 4 5о С и

использовали в работе в течение нескольких суток.

 _Приготовление сенсибилизированных эритроцитов (ЕА) ..

К взвесиа эритроцитова (стандартизированныха до 1х10 59 0а кле-

ток/мл) прибавляли равный объем гемолитической сыворотки, раз-

бавленной VBS 52+ 0 в отношении 1:400, тщательно перемешивали и ин-

кубировали 30 мин при 37 5о С, периодически перемешивая. После за-

вершения инкубации взвесь эритроцитов доводили до концентрации

1,5 5. 010 58 0 клеток/мл, добавляя VBS 52+ 0 таким образом, чтобы 0,2 мл

суспензии е в смеси с 2,8 мл Н 42 0о давали 1,0а ед. оптической

плотности при 412 нм. Стандартизированную взвесь е хранили при

4 5о С и использовали в работе в течение одного дня.

Эритроциты кролика получали, отбирая кровь из шной вены жи-

вотного в стерильный раствор Олсвера, который постоянно переме-

шивали со стеклянными бусами. Эритроциты хранили в этом раство-

ре при 4 5о 0 до 1,5-2 месяцев. Для стандартизации эритроциты отмы-

вали трижды раствором VBS с последующим центрифугированием при

1-1500g в течение 5 мин, дважды - раствором VBS, Mg 52+ 0-ЭГТА и

в последнем буфере приготовляли стандартную суспензию таким об-

разом, чтобы при 15-кратном разбавлении дистиллированной водой

(0,2а мла суспензии и 2,8 мл Н 42 О) она имела поглощение 1,0 при

412 нм. Стандартную взвесь эритроцитов кролика использовали в

работе в течение одного дня.

Эритроциты барана и кролика более стабильны (менее подверже-

ны спонтанному лизису), если буферы, используемые для стандар-

тизации, содержат 0,1% человеческого сывороточного альбумина.

 _Инактивация комплемента ..

Для проведения серологическиха реакцийа систему комплемнта

часто инактивируют при 56 5о 0 30 минут. При этом теряют активность

С2,С4,фактор В, в результате чего прерывается активация как

КПК, так и АПК.

 Определение общей гемолитической активности

 2системы комплемента 0

Предложено несколько методов определения уровня комплемента.

 _Классический путь активации системы комплемента . (КПК)а опре-

деляли по методу P.G.Adrian (1983) и S.Tanaka et al. (1986).

Для постановки реакции использовали суспензию эритроцитов бара-

на в концентрации 109 клеток/мл, предварительно сенсибилизиро-

ванных антисывороткой к ним. К 280 мкл веронал-мединалового бу-

фера (рН 7,4), содержащего 5 мМ MgCl2 и 0,75 мМ CaCl2, добавля-

ли 20 мкл рабочей концентрации сыворотки здоровых доноров, раз-

бавленной в том же буфере. Рабочая концентрация сыворотки под-

биралась таким образом, чтобы лизировалось 50-60 % эритроцитов

за 20 минут. В систему вносили 20 мкл раствора исследуемого по-

липептида (контроль- 20 мкл веронал-мединалового буфера). Пробы

инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре, пос-

ле чего вносили 200 мкл суспензии эритроцитов барана, сенсиби-

лизированныха антителами. Смесь встряхивали и инкубировали 20

минут при температуре 3С в водяной бане. По истечении времени

реакцию гемолиз останавливали погружением пробирок в ледяную

баню и разведением системы охлажденным забуференныма физиологи-

ческим раствором (2,5 мл буфера). Эритроциты осаждали при 3

об/мин в течение 5 минут. Степень лизиса эритроцитов определяли

спектрофотометрически по оптической плотности супернатанта при

длине волны 412 нм против пробы, не содержащей сыворотку.

Для определения  _альтернативного пути активации . системы комп-

лемента /АПК/ (Козлов Л.В., Соляков Л.С., 1982;а Tanaka S. et

al., 1986) к 280 мкл веронал-мединалового буфера (рН 7,4), со-

держащего 5 мМ MgCl2 и 10 мМ этиленгликоль-тетрауксусной кисло-

ты добавляли рабочую дозу сыворотки здоровых доноров (20 мкл) и

20 мкл исследуемого полипептида. Смесь инкубировали при комнат-

ной температуре 20 минут, затем добавляли 200 мкл суспензии

эритроцитов кролика в буфере (1,5х10 58 _ 0  .клеток/мл). Смесь встря-

хивали и помещали в водяную баню при температуре 3С на 20 ми-

нут. Реакцию гемолиза останавливали добавлением 2,5 мла охлаж-

денного до С забуференного физиологического раствора, а затем

содержимое пробирок центрифугировали при 3 об/мин ва течение

5 минут. Степень лизиса эритроцитов определяли на спектрофото-

метре при длине волны 412 нм против пробы, не содержащей сыво-

ротку.

Гемолитический метод титрования комплемента

 2по 50%а или 0  2100%-му гемолизу

Титром комплемента является наменьшее количество исследуемой

ктивности сыворотки, способствующее полному гемолизу добавлен-

ного количеств (0,5-1 мл) сенсибилизированных эритроцитов.

Для титрования комплемента по 100%-му гемолизу активную исс-

ледуемую сыворотку, разведенную в 10 раз, разливают в 11 проби-

рок в количестве 0,1;а 0,2;а 0,3;а 0,4... 1; 1,1 мл. Сыворотку

доводили физиологическим раствором до 1,5 мл, после чего в каж-

дую пробирку добавляют 1 мл гемолитической системы (1,5% взвесь

эритроцитов барана, обработанных антителами ва конечнома титре

1:3). чет результатов производили после 45-минутного инкубиро-

вания взвеси в термостате при 37 50 С.

Для расчет берут пробирку, в которой получен полный гемо-

лиз. Например, полный гемолиз произошел в пробирке N 4 с дозой

ктивной сыворотки 0,4мл; следовательно, титр комплемента равен

0,04.

СН 450 0 -а минимальноеа количество сыворотки, которое вызывает

лизис 50% сенсибилизированных бараньих эритроцитов, находящихся

в 0,5мл стандартной суспензии при 37 50 С в течение 30 минут.

 Количественное определение уровня комплемента

 1ва весовых 3  1единицах

Среди больных с бактериальными инфекциями (пневмония, сеп-

сис) опсонический резерв альтернативного пути активации компле-

мента нередко в 5-10 раз ниже нормы. /7062/ Классический путь

более устойчива к нарушениям внутренней среды и менее пригоден

для их регистрации. /7062/ При падении активности АПК до 30% от

среднего ровня взрослых септические проявления пиогенного про-

цесса отмечали у 80% больных. /7062/

 Приготовление реагентов 0 для определения

ктивности отдельных компонентов комплемента

 _Сыворотка человека. . Донорскуюа кровь отбирали в сухую сте-

рильную посуду и оставляли на 2 суток при 4 5о С. После этого сы-

воротку крови сливали декантацией и центрифугировали в течение

20 мин при 3g. Супернатант разливали по пробиркам и хранили

при -70 5о С.

 _Приготовление реагента R2 для определения гемолитической ак-

 _тивности компонента С2 .. Сыворотку разливали в тонкостенные про-

бирки по 3 мл и инкубировали ва водянома термостате при 50 5о С

(внутри пробирок). Отбирали пробы через каждые 10 мин, опреде-

ляя активность компонентов С1, С1q, С4 и контроль на гемолиз по

методике определения С2, используя в качестве R2 отобранную

пробу. В качестве R2 выбирали сыворотку, инкубированную в тече-

ние такого времени, при котором сохраняется активность компо-

нентов С1 и С4 при достаточно низком контроле. R2 хранили при

-70 5о С в течение года.

 _Приготовление реагента R4 для определения гемолитической ак-

 _тивности компонент С4 .. К 1 мл комплемента морской свинки до-

бавляли 0,25 мл 0,075 М раствора гидразингидрата, смесь инкуби-

ровали 1,5 ч при 20 5о 0 и нейтрализовали добавлением 0,25 мл 0,15

М HCl, после чего диализовали против РВS в течение 18а ча при

4 5о С. Реагента хранили при -70 5о С и использовали в качестве R4

после предварительного разбавления VBS 52+ 0 в соотношении 1:3.

 _Приготовление реагента R3 для определения гемолитической ак-

 _тивности компонента С3 .. К 10 мл охлажденной до 4 5о С свежей сыво-

ротки приа непрерывнома перемешивании медленно приливали 10 мл

охлажденного насыщенного при 4 5о С раствора КВr. Смесь инкубиро-

вали 18 ч при 4 5о С, затем диализовали в течение 18 ч против PBS.

Реагент хранили при -70 5о С. В качестве R3 использовали реагент,

разбавленный VBS 52+ 0 в соотношении 2:3.

 _Приготовление реагент R3 . 5oxy _ 0 для определения гемолитической

 _активности компонента ..

Реагент R3 5oxy 0а готовилиа окислением компонента С2 в реагенте

R3. Реагент R3 готовили как описано выше. Окисляющийа раствор

готовили растворениема 8,3а г KI и 0,25 г I 42 0 в 4 мл фосфатного

буфера, рН 6, ионная сила 0,1 (105 мл 1 М NaH 42 0PO 44 0 + 35 мл 0,5 M

Na 42 0HPO 44 0а + H 42 0O до 1,5 л), затем доводили объём до 10 мл тем же

буфером. Хранили в темной склянке при 4 5о 0а ва течение недели.

Окисляющий раствор (10 мкл) добавляли к 2 мл реагента R3 инку-

бировали 5 мин при 4 5о 0 и нейтрализовали избыток иода добавлением

1а мга глюкозы на 1 мл пробы. Реагент R3 5oxy 0 хранили при -70 5о 0 и

использовали в качестве реагента R3 5oxy 0а после предварительного

разбавления VBS 52+ 0 в соотношении 1:3.

 _Приготовление реагента R1q с помощью IgG-стекла ..

К 10 мл сыворотки крови человека добавляли 37,2 мг ЭДТА 5. 0Na 42 0,

осторожно перемешивали на магнитной мешалке до растворения соли

(конечная концентрация 10 мМ) и доводили 0,15 М NОН до рН 7,2.

Подготовленную такима образома сыворотку наносили на колонку с

IgG-стеклом (9,5х2 см), равновешенную TBSE, со скоростьюа 15

мл/ч. Колонку промывали 50 мл TBSE со скоростью 35 мл/ч. Фрак-

ции несвязавшегося на колонке белка (50 мл) не проявляли актив-

ности С1q. Фракции несвязавшегося белка с максимальным поглоще-

нием при 280 нм объединяли (18 мл), добавляли раствор, содержа-

щий 0,3 М CaCl 42 0, 1 M MgCl 42 0, pH 7,4, из расчета 15 мкл раствора

на 1 мл фракции, доводили до рН 7,4, диализовали в течение ночи

против VBS 52+ 0, разливали небольшими аликвотами по пробиркам, за-

мораживали и хранили при -70 5о С. Использовали в качестве реаген-

та R1q, после размораживания непосредственно перед титрованием

С1q.

 _Получение реагента R1 с помощью IgG-стекла.

5 мла охлажденной сыворотки приа 4 5о 0а наносили на колонку с

IgG-стеклом (9,5 х 2 см), равновешенную VBS pH 7,4, содержащим

0,001 М ССl 42 0, со скоростью 8 мл/ч. Фракции несвязавшегося бел-

ка собирали по 2 мл и определяли остаточнуюа активность С1qа и

С1r 42 0s 42 0, фракции с максимальным поглощением при 280 нм объединя-

ли (10мл), диализовали против VBS 52+ 0 в течение ночи, разливали

небольшими аликвотами по пробиркам, замораживали и хранили при

-70 5о 0. Колонку IgG-стекло-С1 использовали в дальнейшем для выде-

ления С1q, C1r и C1s.

 Гемолитические методы определения активности

 1компонентов и факторов комплемента

 _Определение гемолитической активности компонентов С2 и С4 .. К

0,2 мл стандартизованной суспензии е в VBS 52+ 0 добавляли 0,05 мл

реагент (R4 аилиа R2а в соответствующем разведении) и 0,25 мл

тестируемой пробы. Смесь инкубировали 30 мин при 37 5о 0, добавляли

2,5а мла 0,15а Ма NaCl и центрифугировали при 1500g в течение 5

мин. Степень гемолиза определяли по А 4412 0, измеренному против

буфера. Кроме того, ставили контроли на спонтанный лизис (0,2

мл е и 0,3 мл буфера), также контроль на полный лизис эрит-

роцитов (0,2 мл е и 2,8 мл Н 42 О). Измеренную величину гемолиза

выражали в виде Z (количество эффективных молекул), которую оп-

ределяли по формуле:

Z = ln  _К П.Л. 5_ 0 К 4R

К П.Л. 0- А 4412 0,

где К 4R 0а -а контроль реагента (буфер вместо тестируемой пробы),

К П.Л. 0 - контроль на полный лизис эритроцитов, А 4412 0 - измеренное

значение тестируемой пробы.

 _Определение гемолитической активности компонентов С3 .. К 0,2

мл ЕАС14 (приготовление комплекса описано ниже) добавляли 0,05

мла реагента (R3 или R5 в соответствующем разведении), 0,25 мл

тестируемой пробы и смесь инкубировали приа 37 5о 0а ва течениеа 30

мин. После инкубации добавляли по 2,5 мл 0,15 М NaCl и центри-

фугировали при 5 мин при 1500g. Степень гемолиза определяли по

поглощению при 412 нм, измеренному против буфера. В качестве

контролей ставили контроль реагента (0,25 мл буфера вместо тес-

тируемой пробы), контроль на спонтанный лизис эритроцитов (0,2

мл ЕАС1 4 и 0,3 буфера) и контроль на полный лизиса эритроцитов

(0,2 мл ЕАС1 4 и 2,8 мл Н 42 О). Измеренные значения гемолиза вы-

ражали в виде Z аналогично определению активности компонентов

С2 и С4.

 _Приготовление комплекса ЕАС14 .. 10 мл ЕА (концентрация 1а х

10 59 0а клеток/мл)а инкубировали с 1,0 мл R2 при 37 5о 0 в течение 10

мин. Комплекс промывали VBS 52+ 0 до полного исчезновения фона (ли-

зированные эритроциты)а са последующима центрифугированием при

1500g в течение 5 мин. Отмытый комплекса стандартизировали до

концентрации 1,5 х 10 58 0 клеток/мл как описано для ЕА. Комплекс

ЕАС14 использовали в работе в течение одного дня.

 _Приготовление комплекс ЕАС1qа с ограниченным числом эффек-

 _тивных молекул С1q. . К 200 мкл суспензии Е (1,5а ха 10 58 0а кле-

ток/мл)а добавлялиа подобранное количество раствора С1q в общем

объеме 300 мкл. Инкубировали 30 мин при 37 5о С. Реакцию останав-

ливали охлаждениема и добавлением 700 мкл охлажденного VBS 52+ 0.

Комплекс промывали 1 раз VBS 52+ 0/HSA и количество гемолитических

эффективных молекул С1q определяли с помощью реагента R1q.

 _Получение комплекса ЕАС14 с ограниченным числома эффективных

 _молекул С4b. . К 10 мл суспензии е (1,5 х 10 58 0 клеток/мл) добав-

ляли 100 мкл реагента R2 и инкубировали 5 мин при 37 5о 0. Реакцию

останавливали охлаждением до 0 5о 0 в ледяной бане. Комплекс промы-

вали 3 раза VBS/HSA с центрифугированием иа стандартизовали по

 4412 0 при гемолизе. Количество гемолитических эффективных моле-

кул С4b определяли с помощью реагента R4.

 _Приготовление стабилизированной мембраносвязанной С3-конвер-

 _тазы ЕАС142 5oxy . 0. К 6 мл суспензии ЕАС14 (1,5 ха 10 58 0а клеток/мл)

добавляли при 0 5о 0 180 мкл реагента R3 5oxy 0, 30 мкл 0,1 М NiCl 42 0 и

инкубировали 5 мин при 37 5о 0, реакцию останавливали охлаждением

до 0 5о 0а ва ледяной бане. Добавляли 4 мл VBS, содержащего ЭДТА

(VBSE) и центрифугировали 5 мин при 1500g. Полученный комплекс

ЕАС142 5oxy 0а промывалиа 3а раза VBS 52+ 0 и стандартизовали при А 4412 0,

как описано выше.

 _Определение гемолитической активности С3-конвертазы. . К 0,2

мл суспензии ЕАС142 5oxy 0 (1,5 х 10 58 0 клеток/мл) добавляли 0,1а мл

сыворотки, разведенной 1:9 VBS, содержащего 0,05 М ЭДТА (VBSE).

Общий объём доводили до 0,5 мл VBSE и инкубировали 30а мина при

37 5о 0. Реакциюа останавливали добавлениема 2,5 мл 0,15 М NaCl и

центрифугировали 5 мин при 1500 g. Степень гемолиза определяли

в супернатанте при А 4412 0.

 _Выделение функционально активных субкомпонентов С1, первого

 _компонента комплемента, на аффинном сорбенте. .

20 мла сыворотки крови человек наносили н колонку с

IgG-стеклом (9,5 х 2 см), равновешенную 0,01 М трис-HCl-буфе-

ром с 0,15 М NaCl и 0,001 М ССl 42 0, рН 7,4, со скоростью 20 мл/ч

при 0 5о 0. После полного нанесения сыворотки протекание раствора

через колонку останавливали и колонку инкубировали с сывороткой

40 мин при 0 5о 0 для полного связывания комплекса С1. Колонку про-

мывали стартовым буфером со скоростью 20 мл/ч, собирая белковые

фракции (А 4280 0)а иа определяя в них остаточную активность С1q и

С1r 42 0s 42 0.

 _Получение С1r 42 . 0. Колонку c IgG-стеклома с сорбированным С1

нагревали при 30 5о 0 в течение 40 мин для активации С1. Затем про-

водили элюированиеа приа 0 5о 0стартовыма буферома со скоростью 20

мл/ч, собирая фракции по 3 мл. В белковых фракциях определяли

ктивность С1r и С1s.

 _Получение С1s. . После элюирования С1r стартовым буфером про-

водили элюирование С1s 0,05 М ЭДТА трис-НСl-буфере, содержащем

0,15 М NaCl, рН 7,4, со скоростью 20 мл/ч при 0 5о 0. Фракции, об-

ладающие активностью С1s (около 60 мл) объединяли и концентри-

ровали ультрафильтрацией до 5,5 мл. С1s хранили при 4 5о 0 с 0,01%

NaN 43 0 в течение года.

 _Получение С1q. . После элюирования С1s субкомпонент С1q элюи-

ровали с колонки с IgG-стеклом 0,02 М трис-НСl-буфером, содер-

жащим 1,0 М NaCl, 0,03 ЭДТА, рН 8,5 со скоростью 20 мл/ча при

0 5о 0. Фракции, содержащие активность С1q, объединяли и белок

осаждали сульфатом аммония при 33%а насыщения. Для дальнейшей

очистки осадока С1qа растворяли и фракционировали на колонке с

сефакрилом S-300, как описано в работе [48].

ОЦЕНКА ДРУГИХ ФАКТОРОВ НЕСПЕЦИФИЧЕКОЙ ЗАЩИТЫ

 Определение ферментативной активности

 2мурамидазы (лизоцима)

Записать метод определения лизоцим (ферментативной актив-

ности мурамидазы).

В опытную пробирку наливают 0,4мл 0,1М солевого фосфатного

буфера с рН 6,2, добавляют 0,1 мл исследуемой сыворотки крови.

К полученной смеси приливают 2 мла стандартизированной (Е=0,66

н ФЭК в кювете N 5 при светофильтре N 6) бактериальной взвеси

суточной культуры микрококка в фосфатном буфере. Пробы помещают

в термостата н 30 минут при температуре 37 50 С, затем замеряют

оптическую плотность на ФЭК в кювете N 2 c зеленыма светофиль-

тром.

 Мониторинг з концентрацией фибронектина

Слежение з уровнем фибронектина в плазме позволяет прогно-

зировать направленность патологического процесса. При снижении

концентрации фибронектин до 100 мкг/мл (при норме 300 мкг/мл)

практически у всех детей развивались тяжелые токсическиеа синд-

ромы. Для возмещения фибронектина в терапии токсических заболе-

ваний можно использовать криопреципитат (10-15 мл н инфузию).

Даже однократная введение оказывает положительный эффект у 65%

больных. /7062/

 Определение содержания серомукоида

(Mejbaum-Kkatzenellenbogen W.,1955)

К 0,2а мла сыворотки кровиа добавляют 0,2 мл 0,95%а водного

раствора NaCl и 0,9 мл 0,4М сульфосалициловой кислоты. В тече-

ние 30а минута смесь центрифугируют при 1500 об./мин. К 0,3 мл

надосадочной жидкости дабваляют 0,6 мл физраствора и 4 мла 0,1%

водного раствора танина, перемешвают и помещают на 30 минут в

кипящую водяную баню. Содержимое пробирки охлаждают и измеряют

оптическую плотность в кювете с длиной оптического пути 10 мм

на ФЭК при длине волны 590 нм против дистиллированной воды.

Содержание серомукоид в биологических жидкостях выражают в

единицах оптической плотности полученного раствора. В норме в

сыворотке крови содержание серомукоид составляета 0,11-0,13

единиц оптической плотности.

 Реакция кольцепреципитации

определения С-РБ

Треть капилляра заполняют антисывороткой и через этот же ко-

неч треть - исследуемой сывороткой. Капилляр покачивают 12-15

раз для смешивания ингредиантов и станавливают вертикально на

пластилиновый штатив. оставляют 24 часа при комнатной темпера-

туре. Помутнение на границе раздела свидетельствуета о наличии

СБа ва кровотоке (количество СРБ пропорционально интенсивности

деструктивных процессов в организме).

 Результат оценивают по высоте приципитат ва капилляре.

 Определение концентрации фибриногена

Гравиметрический метод. к 1 мл плазмы крови добавляют 0,05

мл суспензии тромбопластина (10 мг/мл) для быстрого и полного

образования сгустка, 0,1 мл 5% раствора хлорида кальция, пере-

мешивают. Через 7-15 минут инкубации при 37 5о Са образовавшийся

сгусток отжимали до полного даления сыворотки и взвешивали на

торсионных весах. Полученную величину множали н коэффициент

0,. Концентрацию выражали в г/л.

 ш1. 1г. ЗАПОЛНЯТЬ ТОЛЬКО В ЛЕКЦИИ ПО НЕСПЕЦ. ФАКТОРАМ

Содержание БОФ

─────────────────────┬───────────────┬─────────────────────────

│ В норме При остром воспалении

─────────────────────┼───────────────┼─────────────────────────

│

СРБ (усл. ед.) │70 нг/мл,т.е. │ 0,1 г/л

│почти нет │

- у новорожденных │100 нг/мл с │

│постепенным │

│возрастанием │

│ │

Фибриноген │2-4 г/л │

│3-4 г/л │ 6-10 г/л

Гаптоглобин (Нр) │170-300мг/л │

│(70-150 мг%);а │

│830-2700мг/л │

│0,1-0,04г%а │

│0,6-1,8 г/л │ 3-6 г/л

Преальбумин │300 7+ 020 мкг/мла │

Орозомукоид (Оm) │550-1400 мг/ла │

│= мкг/мл │

│0,6-0,9 г/л 1,5-3 г/л

нтитромбин- │210-300 мг/л │

С3-компонент │550-1200 мг/ла │

комплемент │1,3-1,7 г/л 2-3 г/л /2809к/

│100 мг% │

С1q-субкомпонент │100% │

комплемент │ │

Трансферрин │3030 7+ 0350 мкг/мл│

Церулоплазмин │260 7+ 030 мкг/мла │

│0,3-0,6 г/л 1-2 г/л

льфа-2-макроглобулин│2150 7+ 0150 мкг/мл│

│(500-2500 мг/л)│

льфа-1-антитрипсина │2200 7+ 0200 мкг/мл│

─────────────────────┼───────────────┼─────────────────────────

 4альфа-1-антипротеаз- │2,5-4,0 г/л │ 5-7 г/л

 4ный ингибитор /???/а │ │ -?

 Оценка ПОЛ

 Определение активности каталазы 0. Активность каталазы опреде-

ляли в гемолизатах крови на основе способности перекиси водоро-

да образовывать окрашенных комплекс с молибдатом аммония. Инку-

бационная смесь объемом 2 мл содержала 0,03% Н 42 О 42 0. Реакцию ини-

циировали внесением 0,1 мл гемолизата в разведении 1:1. Про-

должительность инкубации - 10 минут. Температура 25а градусов.

По окончанииа инкубации приливали 1 мл 4%а молибдата аммония и

измеряли поглощение при длине волны 410 нм. Для расчета актив-

ности фермента использовали коэффициент мольной экстинции цвет-

ного комплекса Н 42 О 42 0 и молибдата аммония - 10 52 0а М 5-1 0см 5-1 0. Актив-

ность каталазы выражали в ммолях Н 42 О 42 0 с 5-1 0л 5-1 0.

 Определение содержани МДА 0. МДА определяли в цельной крови по

цветной реакции с ТБК (Бородин Е.А., рчаков А.И.,1987). К 1 мл

образца добавляли 1 мл 30%а Ху иа центрифугировали при 3

об./мин. ва течение 10 минут. К надосадку приливали 1 мл 0,8%

ТБК и ставили на кипящую водяную баню на 15 минут. По окончанию

инкубации пробирки охлаждали, приливали 1 мл хлороформа и цент-

рифугировали при 3 об./мин. в течение 5 минут для даления

мутости. Верхнюю окраенную фазу осторожно переносили в кювету и

измеряли светопоглощение при 532 нм. При расчете содержания МДА

ва пробеа использовали коэффициент мольной экстинции 1,56х10 5-5

М 5-1 0см 5-1 0. Содержание МДА выражали в наномолях на 1 мл крови.

 Определение диеновых конъюгатов 0. 0,1 мл спиртового раствора

липидов вноили в кювету спектрофотометра СФ-16, в которой нахо-

дились 2,9 мл абсолютного спирта. Оптическую плотность измеряли

при длине волны 233 нм с ходом луча 10 мм. Для перерасчета ис-

пользовали коэффициетна мольной экстинции 2,2х10 5-5 0 М 5-1 0см 5-1

(Стальная И.Д.,1977). Величину диеновых конъюгатов выражали в

наномолях на 1 мл крови.

 Определение гидроперекисей липидов 0. Количество гидропереки-

сей липидов определяли на основе их способностиа окислять ионы

Fe 52+  0cа последующей реакцией на Fe 53+ 0 с тиоцианатом аммония (Ро-

манова Л.А., Стальная И.Д.,1977 ва модификацииа Е.А.Бородина).

Для расчет содержания гидроперекисей использовали коэффициент

мольной экстинции образующегося цветного комплекса Fe[Fe(CNS)] 46

при 490а нма 1,1х10 55  М 5-1 0см 5-1 0, в расчете на ион Fe 53+ 0 0,55х10 55

М 5-1 0см 5-1 0 (Бородин Е.А. и совт.,1992). Величину гидроперекисей

выражали в наномолях на мл крови.

 Определение окисляемости сыворотки крови 0. Окисляемость сыво-

ротки крови изучали по степени накопления МДА при индукции Fe 52+

скорбат-зависимого или НАДФН-зависимого ПЛа ва инкубационной

смеси объемома 1а мл, содержащей 12 мкМ Fe 52+ 0;а 0,8 мМ аскорбат

(или 1 мМ НАДФН);а 0,2 мМ пирофосфат натрия; 50 мМ трис-НСl бу-

фер, рН 7,4;а 0,1 мл сыворотки крови и выражали в наномолях МДА

мин 5-1 0мл 5-1 0 сыворотки крови.

 Определение антиокислительной  0(антиоксидантной)а  2активности

 2(Ао) крови 0. Ао сыворотки крови оценивали в словиях in vitro

по иха способностиа тормозить аскорбат (НАДФН)-зависимое ПОЛ в

суспензии микросом (М.А.Штарберг,1996) и выражали ва процентах.

Опытная инкубационная смесь объемом 1 мл содержала 0,8 мМ ас-

корбат (или 1 мМа НАДФН);а 0,2а мМа пирофосфата натрия;а 50а мМ

трис-НCl буфер, рН 7,4; 0,5 мг фосфолипида микросом, 0,1 мл сы-

воротки крови. ПОЛ инициировали внесением ионов 5  0Fe 52+ 0 в конечной

концентрации 12 мкМ. Контрольная проба аналогичного состава не

содержала сыворотки крови. Ао рассчитывали по формуле:

МДА 5  4контроль  0- МДА 4 опыт

Ао = ──────────────────────── 4─ 0 х 100%.

МДА 4 контроль

 Определение токсигенной зернистости нейтрофилов 0. Токсигенную

зернистость изучали с иммерсионной системой микроскопа в препа-

ратах крови, окрашенных по Паппенгейму, Нохту. В сравнении с

нейтрофильной зернистостью нормальныха лейкоцитова он более

крупная и интенсивнееа окрашивается. чет ведут суъектвино по

количеству гранул, их размерам и интенсивности окраски: (-) или

(+) (Ронин В.С., Старобинец Г.М.,1989).

 Парамецийный тест 0.

Сущность методы оценки токсичности биологических жидкостей с

парамецийным тестом (Пафомова Г.А. и совт. /1980/ с добавлени-

ем словий по Нифантьеву О.Е. и совт.а /1988/) заключается в

измерении времени жизнеспособности парамеций (инфузорий) - "па-

рамецийного времени" в присутствии токсического фактора, нахо-

дящегося в биологической жидкости. В качестве контроля опреде-

ляли время выживаемости инфузорий в присутствии плазмы или сы-

воротки крови здоровых людей. 0,01 мл исследуемой биологической

жидкости и столько же взвеси, содержащей от 8 до 10 парамеций,

тщательно перемешивали и под величением объектива в 25 раз оп-

ределяли время полной гибели парамеций. Образец исследовали 3

раза и использовали средние данные. С целью повышения точности

способа использовали 11-15-суточную культуру парамеций.

 _Проверка дефицита Se в организме .: кончики пальцев рук проте-

реть спиртом, затем 7,5% Н 42 О 42 0. Если кожа побелеет, то дефицит.

/со слов проф. М.А.Джулай/

 Определение бактерицидной активности

 2сыворотки (БАС)

(= комплемент, + лизоцим, + катионные белки)

В пробиркиа са 2,5 мл стерильного бульона Кольбака добавляют

по 0,5мл испытуемой сыворотки. Затем микропипеткой во все про-

бирки вносятпо 0,1а мл 24-часовой бульонной культуры кишечной

палочки. Содержимое пробирок тщательно перемешивают и отбирают

1,5а мла для нефелометрического измерения оптической плотности.

Смесь, оставшуюся в пробирках, помещают в термостат при 37 50 С на

3а часа.а (Расчет бактерицидной активности в процентах произво-

дится по ниже описанной формуле.) Таким образом, удается снять

2а показателя:а первый -а характеризующий исходную оптическую

плотность бульона с культурой и сывороткой сразуа после смеше-

ния, и второй - регистрирующий оптическую плотность той же сме-

си после 3-часовой инкубации смеси в термостате.

(Д опыта через 3 часа - Д опыта сразу) х 100

───────────────────────────────────────────── =

(Д контроля через 3 часа - Д контроля сразу)

(0,18 -0,163) х 100

= ──────────────────── = 7,8%

0,312 - 0,095

 Биологический метод - парамецийный тест

Сущность метода заключается в измерении времени жизнеспособ-

ности парамеций (инфузорий) -"парамецийного времени" в присутс-

твии токсического фактора, находящегося в биологической жидкос-

ти. В качестве контроля определяют время выживаемости инфузорий

в присутствии плазмы или сыворотки крови здоровых людей. 0,01

мл исследуемой биологической жидкости и столько же взвеси, со-

держащей ота 8а до 10 парамеций, тщательно перемешивают и под

увеличением объектива в 25 раз определяют время полной гибели

парамеций.Образец исследуюта 3а раза и расчитывают средние дан-

ные. С целью повышения точности способа используют 11-15 суточ-

ную культуру парамеций. время жизнеспособности парамеций при

добавлении к их культуре биологической жидкости здоровыха людей

составляет 25-30а минута (106,137,47-ЛИИ - лейкоцитарный индекс

интоксикации)

 Определение содержания МСМ в сыворотке крови, лимфе

(молекулы средней массы)

Принцип метод основан на осаждении белков исследуемой жид-

кости 10%а р-ром ТХУ с последующим центрифугированием при 3

об/мин в течении20 мин. и определением поглощения супернатанта,

в 10 раз разведенного дистиллированной водой, (при длине волны

280 нм)а против воды. Сдержание МСМ выражают в словных едини-

цах, соответствующих величине оптической плотности разведенного

супернатанта. Ва нормеа количество МСМ составляет 0,260,280 с-

ловных единиц (24, 102)

 Определение общей протеолитической активности 0

В кювету спектрофотометра вносили 0,03 мл цельной сыворотки

крови, 1,97 мл 0,0М трис НС1 буфера и 1,0 мл 1,5*10  5-3 М БАЭЭ в

этом буфере, перемешивали. Оптическую плотность измеряли в те-

чении 30 мин. через каждые 10 мин при длине волны 253 нм против

раствора не содержащего сыворотку крови. Протеолитическую ак-

тивность выражали в МЕ/мл. (100)

 Оценка активности катепсина D 0

Определение количества кислоторастворимых продуктов фермент-

ного гидрролиза гемоглобина (6). Инкубационная смесь содержала

0,5 мл сыворотки крови, 0,5 мл 0,М ацетатного буфера и 0,2 мл

0,3% раствора гемоглобина в ацетатном буфере. Продолжительность

инкубации60 мин. t=45 50 0 С. По окончании инкубации приливали 4 мл

3% Ху (трихлоруксусная кислота), замеряли при длине волны

280нм. Содержание катепсина Д выражается в словных единицах.

 Определение содержания альфа-1-АТ и альфа-2-МГ

Способ определения альфа-1-Та и альфа-2-МГ в плазме (сыво-

ротке) крови основан на различном механизме взаимодействия их с

трипсином при использовании в качестве субстрата БАЭЭ (N-бензо-

ил-L-аргинин этиловый спирт)1. Альфа-1-АТ образует са трипсином

комплекс, неспособный гидролизовать комплекс БАЭЭ. Поэтому его

ктивность оценивается по торможению БАЭЭ-эстеразной активности

трипсина сывороткой крови.

В кюветаха спектрофотометр готовили контрольную и опытную

пробы. Опытная проба содержала 1,9 мл 0,005 М триса НС1а буфера

(рн 8,0), 0,1 мл разведенной в 50 раз сыворотки крови и 0,1 мл

0,1% раствора трипсина. Контрольная проба содержала 2 мл 0,05 М

трис НС1 буфера (рн8,0) и 0,1мл 0,1% раствора трипсина. Инкуби-

ровали при t=25 50 0 5 мин и добавлялти по 1 мл 1,5мМ раствор БА-

ЭЭ. Быстро перемешивали и измеряли прирост оптической плотности

растворов при длине волны 253 нм против контроля.Отсчеты произ-

водили каждую минуту в течении 5 мин. При расчете активности

фермента использовали разность средних значений прироста актив-

ности за 1 мин. Активность альфа-1-АТ выражается в ИЕ/мл.

Альфа-2-МГ образует с трипсином комплекс, сохраняющий спо-

собность к гидролизуа БАЭа са сывороткойа крови и последующей

инактивацией несвязавшегося с альфа-2-МГ трипсина соевыма инги-

битором трипсина (86). В кювету спектрофотометра вносили 1,75мл

0,0М трис НС1 буфера, рн 8,0, 0,1 мл разведенной в 10 раз сы-

воротки крови и 0,0МЛ 0,1%а раствора трипсина.Инкубировали 5

мин при t=25 50 С, добавляли0,1 мл 0,3% раствора ингибитора из бо-

бов сои, перемешивали и инкубировали 5 мин. Затем добавляли 1

мл 1,5 мМ раствора БАЭЭ, пробу перемешивали и измеряли прирост

оптической плотности при длине волны 253 нм через 2 мин в тече-

нии 10 мин против контрольной пробы, содержащей только реактивы

(2мл 0,0М трис НС1 буфера, рн8,0 и 1 мл 1,5мМ раствора БАЭЭ)

расчета активности фермента использовали среднее значение при-

роста оптической плотности за 1 мин. Активность альфа-2-МГ вы-

ражали в ИЕ/мл сыворотки крови.

 Оценка фагоцитарной активности 0

 5(+ см. материал 1-2 лекции)

 Фагоцитарный индекс 0 - среднее количество частиц или микробов

в одном фагоците (норма 3-8).

 Фагоцитарное  0ч 1исло 0а - количество фагоцитов, частвующих в фагоцитозе (норма 60-80%).

 Оценка показателей через разные промежутки времени позволяет

 5оценить динамику фагоцитоза. В норме через 90 минут фагоцитар-

 5ный индекс должен быть ниже, чем через 45 и 60 минут, в связи в

 5перевариванием микробов. При нарушении переваривания он не ме-

 5няется. /2551к/

 _Переваривание микробов . можно оценивать путем посев лизатов

лейкоцитов н питательные среды и подсчета выросших колоний.

Метод предполагает использование в качестве объект фагоцитоза

живых микроорганизмов. После инкубирования с микробами фагоциты

осаждают центрифугированием, омывают и лизируют. Их лизаты вы-

севают на твердую питательную среду. Переваривающую активность

фагоцитов оценивают по числу выросших колоний. /2551к/

 _Метаболическую активность фагоцитов . определяют после окраски

их 0,25%а раствором нитросинего тетразолия. В норме метахрома-

тично (диффузно и ва виде глыбок голубого цвета) окрашивается

15-18% нейтрофилов, при инфекциях их число величивается до 40%

и более. /2551к/

Показатели фагоцитоза снижаются при иммунодефицитах, повыша-

ются при благоприятном течении инфекции. /2551к/

 Оценка комплементарной активности

1)  Общая гемолитическая активность комплемента 0 должна быть

100 _+ .20% от ровня здоровых доноров.

Степень гемолиз можно определить фотометрически (с помощью

нефелометра, спектрофотометра, фотоколориметра) или визуально

путем сравнения интенсивности гемолиза в опытных пробирках со

стандартной шкалой лизированных эритроцитов. /2551к/

2) ровень отдельных компонентов 4 можно оценить по реагентам

 4(R)а по степени компенсации отсутствующего в них белка при до-

 4бавлении сыворотки больных. (R1 - cыворотка с дефицитом компо-

 4нента С1, 0

 4R2 - сыворотка с дефицитом компонента С2,

 4R3 - - " - С3,

 4R4 - - " - С4 и т.д.)

 _В сыворотке крови

С1q - 190 мг/л,

С1s - 120

С2а -а 30

С4а - 430

С3а -1300

С5а -а 75

С6а -а 60

С7а -а 55

С8а -а 60

С9а - 160

ф. Ра -а 25

ф. Ва - 240

С1-Inа - 180 мг/л. /2551к/

3) Выявление отдельных продуктов активации - С5а (по степени

грегации лейкоцитов), С4а, С3а, С3в, С2в-кинин и др.

4) Определение комплемент-связывающих рецепторов на лейкоци-

тах (CR1, CR2, CR3). /2551к/

 ОБЩАЯ ИММУНОГРАММА 0

 2┌─────── Специфическая защита ───────┐

│ │

Гуморальная Клеточная

- АТ - Тк

 Различают следующие степени иммунитета:

 51. полная восприимчивость инфекции (100% гибель);

 52. Слабый иммунитет;

 53. меренный иммунитет;

 54. сильный иммунитет (летальных случаев нет);

 55. полный иммунитет (абсолютная резистентность)./261/66/

 Широкая вариабельность показателей иммунитета, изменчивость

 5в течение года не всегда позволяет полно оценить картину систе-

 5мы иммунитета. /1677к/

 Вторичный ИО на экзогенные АГ не отражает состояния иммунной

 5системы. Для оценки иммунного статуса необходим информация о

 5первичных гуморальных или клеточныха реакцияха н антиген.

 5/7576/84/

 НОРМАЛЬНАЯ ИММУНОГРАММА

 Общее количество лейкоцитов - 4-9 0  2тыс./мкл

 Подсчет в камере Горяева (25 больших квадратов)

 5N х 4 х 20 (разведение) N х 1

 5L = ────────────────────────────────а = ─────────── = N х 200

 525 х 16 5

N должно быть от 20 (4 тыс.) до 40 (8 тыс.).

 Лейкоцитарная формула: 0 Размер

Нейтрофилов - 50-60% 10-12 мк

Эозинофилов - 3-5 12-17 мк

Базофилов - 0,5-1 10-12 мк

Моноцитов - 5-8 12-15 мк (тканевые - больше)

Лимфоцитов - 25-35% 7-8 мк малые; около 12 мк - большие

(тканевые лимфоциты - еще больше)

Эритроциты - 7 _+ .0,5 мк

Тромбоциты - 2(-4) мк

[ ПОЛ на стекле --- лимфоцитоз 0]

 Лимфоцитов от 25% (т.е. от 1 до 2250 мкл-1)

 5до 35% (т.е. от 1200 до 3 мкл-1).

 Подсчет абсолютного количества лимфоцитов у больного:

 Например, общее количество лейкоцитов - 5 тыс/мкл,

 5количество лимфоцитов в лейкоцитарной формуле - 20%

 5(=относительное количество лимфоцитов);

 Абсолютное количество - 20% от 5 тыс, т.е. 1 тысяча

 5в 1 мкл. Вывод: меньше нормы.

Количество лимфоцитов - 1800-3200 мкл 5-1 0, (800-3600 в мкл);

- 25-35%а (20-26%а /2551к/) всех лейкоцитов.

 _В крови В-лимфоцитов - 15% . /2338к/94/ (15-25%);а CD19+, CD22+,

CD72 5+ 0-клетки - 10-15% (В-клетки);

(CD72+ -клетки - 30-35%) - ???

 _Т-лимфоцитов - 60% ., из них Тх - 20% 1  0(CD4 5+ 0-клетки-36-42%)

Тs - 12% (CD8 5+ 0-клетки-28-35%

= Тs + Тк)

CD3 5+ 0-клетки - 55-70% (общие Т-лимфоциты)

 _О-лимфоцитов - 25% . /2338к/94/, (10%)

 _Т-лимфоциты .:

- CD 3 - 600-2500 (1-1400) мкл 5-1 0 (в среднем 1400);

- в тесте розеткообразующих клетока (Е-РОК)а Т 4общие 0а (=То)а 50-60 (50-70%, 40-90)% от общего количества лимфоцитов;

- CD2+, CD3+ - 70-85% /2551к/98/

- Та-лимфоциты (Т 4активные 0=Та) - 700-1100 мкл 5-1 0 или 25-35%;

Для выявления активированных Т-лимфоцитов определяют рецептора к ИЛ-2 (CD25), HLA DR-антигены и CD 71 (рецептор для

трансферрина).

 _Тх-лимфоциты . (CD4+) - 700-1100 мкл 5-1 0 (930);

- Теофиллин-резистентные Е-РКа (Тх)а - 50-63%.

- CD4+ - 35-48% /2551к/98/

При снижении Тх до 200 - СПИД апрогрессирует;

< 150 - присоединение вторичной инфекции (сепсис).

 _Тs-лимфоциты . (CD 8+) - 300-500 мкл 5-1 0 (500);

- CD8+ - 18-25%а /2551к/98/

= Теофиллин-чувствительные Е-РКа (Тs)а - 17-20%

Соотношение Тх/Тs (= CD4+/CD8+) - 2,0-2,5 (1,5-2,5$ 1,4-2,0);

- При СПДе соотношение меньшается до 0,04.

- При аутоиммунных и аллергических заболеваниях индекс больше 2,0. /2551к/98/

 _В-лимфоциты . (CD 19,CD22, CD72)- 350-500 (100-900;600-800) мкл 5-1

или 15-25 (10-30)% /?/а (в тесте В-РОК=ЕАС-РОК)

 _Иммуноглобулины сыворотки крови

- Ig Mа -а 1-2а (0,35-3; 0,2-2) г/л или мг/мл

- Ig Gа - 11-15 (8-13, до 20 - у пожилых лиц) г/л или мг/мл

- Ig Aа -а 1-3а (0,4-4,4; 1,4-3) г/л или мг/мл

У новорожденных ровень Ig G близок к материнскому, Ig M и Ig

A имеются в следовых концентрациях. К 4-6 месяцу ровень Ig G

падает до 5-6 г/л, затем величивается. При нормальном разви-

тии ровень иммуноглобулинов к 2 годам у детей близок величинам

их у взрослых. /2551к/98/

-  Разброс значений Ig E (0-386 кЕ/л) не позволяет рекомендовать

 4этот тест для диагностики атопии. /1676к/

При иммунодефицитах (ИД) ровень Ig снижается, при стиму-

ляции ИС и воспалении - повышается. /2551к/

Иммуноглобулины сыворотки крови

────────┬───────┬────────┬────────────────┬─────────┬──────────

Классы │ МЕ/мл мг/мл │ мг% а г/л │В слюне

────────┼───────┼────────┼────────────────┼─────────┼──────────

Ig G │130-160 11-15 │  1800-1800 (1200) 0│12,8 7+ 00,54│0,06 7+ 00,01

- Ig G1 │ │ │ │2,61-10,8│г/л

- Ig G2 │ │ │ │1,12-4,08│

- Ig G3 │ │ │ │0,22-2,88│

- Ig G4 │ │ │ │0,05-1,56│

Ig M │110-150│ 0,5-2,0│  1 60-200а (120) 0 │ 1,3 7+ 00,1 │0 г/л

Ig A │ 90-150а 1-3а │  1 90-450а (400) 0 │ 1,6 7+ 00,7 │0,03-0,4

│ │ │ │ │г/л

│ │ │ │ │= sIg A

 1Ig E  0│ 1  0│ 1  0│ 10,006-0,6(<0,5) 0 │ │

75,9 7+ 09,3 КИ/л │ │ │ │

 1Ig D  0│ 130,9 6+ 14,0  0│ 1 0,3-40 (3) 0 │ │

│ 1 МЕ/л-?│ 0 │ │ │

────────┴───────┴────────┴────────────────┴─────────┴──────────

Иммуноглобулины слюны /1652к и др./

───────────────────────────────────────────────────────────────

Классы │ МЕ/мл мг/мл │ мг% г/л │ КИ/л

───────────────────────────────────────────────────────────────

Ig G │ │0,06 7+ 00,01│

Ig M │ │0 │

Ig A │ │0,07 7+ 00,01│

sIg A │ │0,72 7+ 00,05│

───────────────────────────────────────────────────────────────

Определение ровня иммуноглобулинов не всегда полезно. Для

иммунной защиты имеет значение количество специфическиха анти-

тел, не общая концентрация иммуноглобулинов сыворотки.

Антитоксические и антимикробные антитела /1652к/

───────────────────┬─────────────────┬─────────────────────────

Виды антител │ по РПГ │ по РА

───────────────────┼─────────────────┼─────────────────────────

Дизентерийные │ │ 3,8 7+ 0а 0,5

- Зонне 21,2 7+ 0а 3,2 │

Коклюшные 716,2 7+ 0105,2 │ 90,2 7+ 0 64,4

Дифтерийные 362,9 7+ 0105,7 │ а43,0 7+ 0 16,1

Стафилококковые 969,7 7+ 0210,3 │ 238,6 7+ 0128,7

Столбнячные │ 1823,5 7+ 0211,1 │ 55,7 7+ 0 32,2

───────────────────┴─────────────────┴─────────────────────────

Будущее покажет, что конкретные числовые значения малоинфор-

мативны и подобный подход к оценке иммунного статус неверен.

Нормальное количество В-лимфоцитов может обеспечиваться совер-

шенно разными сочетаниями АГ-специализированныха клеток. Повы-

шенное количество Тх еще ничего не значит, если не хватает мак-

рофагов и т.д. Наоборот, малое число Тх может быть идеальным,

если снижены Тs. /2338к-5/ Иммунная система имеет территориаль-

ные особенности, поэтому показатели кровотока могут не отражать

процессы, происходящие в конкретном больном органе.а  Для ИС ха-

 5рактерна высокая мобильность, связанная с тем, что все ее глав-

 5ные компоненты практически всегда находятся (или рабочем) сос-

 5тоянии и определенный ровень активации, вероятно, является

 5нормальным состоянием ИС. В 1987г. Р.В.Петровым сформулирована

 5концепция иммунологических мобилей, сущность которой заключает-

 5ся в том, что под влиянием АГ-ых и неАГ-ых воздействий, непре-

 5рывно поступающих во внутреннюю среду организма или в нема воз-

 5никающих, Са постоянно меняета свой облик, постоянно меняет

 5уровни своих составных частей (Тх,Тs, контрсупрессоров и т.д.).

 Поступивший в организм АГ-ый стимул выводит из равновесия прак-

 5тически всю ИС, и она будет "возмущена" до тех пор, пока не пе-

 5рейдет в новое равновесное состояние. Это состояние сохраняется

 5лишь до тех пор, пока другой стимул не поступит или не возника-

 5ет в организме. А так как антигенные стимулы поступают в орга-

 5низм непрерывно, то очевидно, что ИС непрерывно меняется и на-

 5ходится в движении. В свете концепции иммунологических мобилей,

 5а также на многоступенчатом ровне регуляции иммунологических

 5процессова по-новому встает вопрос о нормативных параметрах ИС.

 5/2338к/94/ 0 В свете этих особенностей функционирования иммуните-

та возможны такие ситуации, когда развиваются изменения или на-

рушения в ИС, которые практически никогда не ведут к возникно-

вению иммунопатологических процессов, так как другие компоненты

этой системы берут на себя функции нарушенной структуры. Приме-

рома являются случаи селективного дефицита Ig A при полном от-

сутствии каких-либо иммунопатологических проявлений. /2338к/94/

С другой стороны, возможно наличие патологического процесса без

видимых нарушений в иммунной системе. /2338к/94/

 В 1987г. американский иммунолог R.Hong разработал трехэтап-

 5ную систему оценки ИС. 0а  Р.В.Петровым создан 2-этапный принцип

 5оценки иммунного статуса. 0

 _Выделяют 3 ровня иммунологических тестов .:

 31. Первый ровень. 0а Первыйа этап предназначен для выявления

"грубых" дефектов иммунитета с помощью ориентировочныха тестов.

- Определение лейкоцитарной формулы и общего количества лей-

коцитов в периферической крови.

- Подсчета относительного и абсолютного количеств Т-а и

В-лимфоцитов.

- Определение ровня иммуноглобулинов и их субклассов. Изме-

рение концентрации Ig G, Ig M, Ig A (дефицит Ig A может не соп-

ровождаться патологией. /2338к/94/)

- Оценка специфического гуморального ответ (иммунизация с

последующим определением ровня АТ).

- Оценка фагоцитарной активности лейкоцитов.

- Определение активности системы комплемента.

- Кожные тесты.

- Определение морфолог лимфоцитов.

- Рентгенография и рентгеноскопия лимфоидных органов.

 32. Второй ровень. 0а /6812/84/ Тесты 2 ровня обозначают как

налитические. К ним могут относиться практически всеа тесты,

позволяющие оценить функциональную активность клеток.

- Определение ровня цитокинов (фактора, ингибирующего миг-

рацию макрофагов /МИФ/, интерлейкинов, ФНО и др.) в крови и в

других биологических жидкостях.

- Анализа поверхностныха маркерова субпопуляций лимфоцитов

(CD-АГ)

-- субпопуляций Т-лимфоцитов (хелперы, супрессоры, эффекторы);

-- опредение поверхностных иммуноглобулинов различных

классов на В-лимфоцитах;

-- количественное определение ЕКК.

- Оценк развития клеточного и гуморального иммунного ответа.

- Определение функциональной активностиа клеток ИС

-- анализ пролиферативного ответа мононуклеарных клеток на

Т- и В-митогены и специфические антигены (реакция бласттранс-

формации на митогены: ФГА, Кон А, ЛПС, митоген лаконоса; на ми-

тогены в СКЛ),

-- оценка функциональной активности В-клеток (фенотип, по-

ликлональная активация, продукция иммуноглобулинов ва культуре

in vitro, антиген-специфическая стимуляция, иммунизация битыми

вирусными вакцинами, гемоцианином или бактериофагом ФХ 174),

-- анализ цитотоксичности (NK-клетки, Т-киллеры).

--- определение активности ЕКК;

--- оценка функциональной активности Т-клеток (фенотип,

поликлональная активация митогенами, антигенами в смешанной

культуре лимфоцитов /СКЛ/, тесты Т-хелперной и Т-супрессорной

ктивности, антиген-специфический ответ, цитотоксическая актив-

ность, кожные тесты ГЗТ на туберкулин, стрептокиназу, кандидин

и пр.);

-- оценк функциональной активности макрофагов (адгезии и

хемотаксиса, стадий фагоцитоза и его завершенности, внутрикле-

точной инактивация Staphylococcus aureus, тест кожного окна,

хемилюминесценции).

- Количественное определение отдельныха компонентова комплемента (субкомпонента С1q, С3, С6-С8).

- Оценк миграционной активности лейкоцитова (макрофагов,

нейтрофилов, лимфоцитов). Анализ молекул адгезии.

-- тест торможения миграции лейкоцитов на ФГА.

 5- Оценка HLA.

 33. Третий ровень.

- Генетический и цитологический анализ хромосомного материа-

ла.

- Определение ферментов лимфоцитов (аденозиндезаминаза, пи-

риннуклеозидфосфорилаза), ассоциированных с иммунодефицитами.

- Анализ смешанных клеточных культур с целью определения им-

муноглобулин-продуцирующей функции В-лимфоцитов.

- Гистохимический анализ лимфоидных органов.

Хорошо диагносцируются первичные (врожденные) иммунодефици-

ты, вторичные четко регистрируются при хронических патологичес-

ких состояниях.

В настоящееа время нет достаточно ниверсального набора тес-

тов для оценки первичных и вторичных иммунодефицитов. /6812/84/

Определение ровня иммуноглобулинов не всегда полезно. Для

иммунной защиты имеет значение количество специфическиха анти-

тел, не общая концентрация иммуноглобулинов сыворотки.

───────────────────────────────────────────────────────────────

 РАЗДЕЛЕНИЕ СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ

(для изучения функциональной активности,

определения HLA-АГ)

Принципы разделения:

По различным адгезивным способностяма (АГ-предентирующие

клетки - моноциты и В-лимфоциты адгезируют к твердым поверхнос-

тям):

- к стеклу (стеклянным бусам), клетки отделяют ота сорбента

встряхиванием),

- найлоновая вата в шприце (В-лимфоциты снимаюта 5-6-кратным

сдавлением ваты поршнем шприца)

- сефадекс.

 Аффинная хроматография 0а основан н избирательной сорбции

клеток различных субпопуляций к носителю, содержащему вещества,

ка которыма клетки данной субпопуляции имеют высокое сродство

(АГ, мембранные Ig, через "пришитые" FcR, белок А стафилокок-

ков, CR1).

-  Желатин смешивают с АГ, покрывают центрифужные пробирки +

 4суспензию лимфоцитов. С АГ связываются АОК --- нагрев до 37оС

 4выход АОК. 0

 4- Эритроциты нагружаюта белкома стафилококка + суспензия

 4лимфоцитов --- связывание зрелых В-лимфоцитов. Элюция гипотони-

 4ческим раствором или лизостафином.

 4- Монослой эритроцитов, нагруженных ИК + суспензия лимфоци-

 4тов. Свободные В-лимфоциты получают гипотоническим шоком.

 4- Через CR1 В-лимфоцитова (на сефарозе-С3)

- Аффинная хроматография н колонках с лектинами;а элюция

раствором углевода, по отношению к которому лектина специфичен

(отделение агглютинированных клеток центрифугированием). Связы-

вание лектина Helix pomatia Т-лимфоцитами н колонкеа (лектин

связывает обработанные нейраминидазой Т-лимфоциты); Клетки элю-

ируют N-ацетил-D-галактозамином.

Очищенные Т-лимфоциты можно получить путем отрицательной се-

лекции HLA-DR положительных клеток (т.е. В-лимфоцитов), разру-

шая их соответственно антисывороткой и комплементом.

Распределение Т- и В-лимфоцитов в организме

и их характеристика

──────────────────────┬───────────────────┬────────────────────

Показатель │ Т-лимфоциты │ В-лимфоциты

──────────────────────┼───────────────────┼────────────────────

Источник │Костный мозг │Костный мозг

Место формирования │Тимус │Красный костный мозг

│ │Группы лимфоидных

│ │фолликулов

 Распределение 0, % 1: 0 │ │

Красный костный мозга │ 0 │ 15

Тимус │ 100 (тимоциты) │ 0 (0,3)

ЛУ │ 60 (65) │ 20 (21)

Пейеровы бляшки │ 30 │ 60

Селезенк │ 30 (35) │ 60 (42)

Кровь │ 60 │ 20 (15)

Лимф │ 85 │ 15

│ │

Наличие АГ │ CD4+,CD8+ │ CD19+ и др.

│ │

HLA │ Iа класс │ I и II классов

─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ │ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ │ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─ ─

Локализация │ │

- в ЛУ │Паракортикальная │Центры размножения

│зона, │(зародышевые центры),

│перифолликулярноеа │медуллярные тяжи

│пространство │

- в селезенке │Белая пульпа, окру-│Красная пульпа,

│жающая артериолы │центры размножения

- в пейеровых │Перифолликулярная │Центр фолликула

бляшках │зон │

Рециркуляция │ │

в организме │Быстрая │Менее быстрая

Продолжительность │ │

жизни │Месяцы │Недели

│ │

Поверхность │Гладкая │Ворсинчатая

│ │

 Рецепторы к ЭБ 0 (Е-РОК)│ │

(эритроцитам барана=Е)│ + │ -

 Рецепторы к С3в 0 │ │

(ЕАС-РОК) │ - │ +

 2FcR  0│ 2 -  0│ 2 +

Стимуляция синтеза ДНК│ │

- митогены микробного происхождения │

- ЛПС Г- бактерий │ - │ +

- туберкулин │ - /?/ │ + /2551к/98/

- митогены животного происхождения │

- анти-Ig │ - │ +

- смешанная культур │

лимфоцитов (СКЛ) │ - │ + (АПК на HLA)

- митогены растительного происхождения (лектины)

- ФГ │ +(для Тs) │ - Кон │ +(для Тs) │  _- митоген лаконоса  .│ _ +  .│ _ +

 5- джекалин  0│ 5 +  0│ 5 связывает Ig A

│ │  5(используется для

│ │  5выделения В-клеток

│ │  5на колонке)

Связывание лектин │ │

Helix pomatia │ + │ │ │

Чувствительность │ │

к кортикостероидам │Высокая │Низкая (Л 496 0)

│ │

Функции 1.Участие в реакциях│1.АТ--образование

│ клеточного тип │2.Регуляция ИО

│ (Тк) (В-лимфоциты- АПК

2.Иммунорегуляторная = АГ-презентирую│ (Тх, Тs) щие клетки)

──────────────────────┴───────────────────┴────────────────────

3а. Д-лимфоциты -а двойные лимфоциты, несущие на своей поверхности маркеры Т- и В-лимфоцитов.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ

(количественный аспект; без разделения)

 5I. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ

 МЕТОДОМ МЕМБРАНОЙ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ /метод МИФ/

Анализ поверхностных маркеров субпопуляций лимфоцитов,

(хелперы, супрессоры, эффекторы).

ЕКК (CD3- _CD56+ .),

В-клетки (СD19+)

Т-лимфоциты ( _ СD3+ . 0,CD56-) 1 - Образует комплекс с рецептором для АГ.

Тх - CD4+

Ts,Tk - CD8+.

Выделение лимфоцитов на фиколе --- мазок --- высушивание ---

фиксация --- обработка МАТ к определенному АГ --- обработка ан-

тисывороткой к МАТ (к Fc-фрагменту), меченых флюорохромом ---

микроскопия под люминисцентным микроскопом.

(Или в пробирке смешать суспензию лимфоцитов с МАТ --- мазок)

 _Определение субпопуляции лимфоцитов с помощью МАТ

(моноклональных антител) методом непрямой поверхностной

иммунофлуоресценции

Для постановки этой реакции в центрифужную стеклянную пробир-

ку вносята 500а тысяча лимфоцитов, выделенныха ва градиенте фи-

колл-верографин. К 30 мкл суспензии клеток добавляют 20 мкла го-

тового коммерческого раствора МАТ, осторожно перемешивали и ин-

кубировали в течение 30 минут при комнатнойа температуре. После

инкубации к лимфоцитам добавляли 1 мл раствора Хенкса, перемеши-

вали легким покачиванием пробирки и центрифугировали 2 - 3 мину-

ты при 1200 об./мин. Надосадочную жидкость осторожно сливали, а

оставшиеся капли среды бирали фильтровальными полосками.

В пробиркуа к отмытым клеткам вносят 20 мкл вторых (антимыши-

ных) антител, меченных ФИТЦ (FITC anti Mi), нежно перемешивают и

помещают в рефрижератор при 4 5о С на 30 минут. После реакции лим-

фоциты дважды отмывают раствором Хенкса и к осадку клеток добав-

ляют 50 мкл того же раствора, клетки ресуспендируют легким пока-

чиванием пробирки. Суспензию клеток переносят в лунки парафилма

на сухое предметное стекло, предварительно обработанное в 0,005%

растворе poly-L-lysine (Sigma), и инкубируют там ва течение 20

мин при комнатной температуре. После адгезии клеток к стеклу ос-

торожно полосками фильтровальной бумаги бирали среду иа вносили

по 20 мкл 50%-го раствора глицерина. При люминесцентной микрос-

копии использовали объектив микроскопа х90, окуляр х10. Оценку

реакции осуществляли по проценту светящихся клеток.

Характеристика моноклональных антител

в реакции непрямой поверхностной иммунофлуоресценции

──────────────┬ 5──────┬──────┬─────────────── 0┬──────────────────

Моноклональное│ Изотип Клон│ Молекулярная  0│ Специфичность

антитело │ 5 │ │ масса антигена 0│

──────────────┼ 5──────┼──────┼─────────────── 0┼───────────────────

DT-Anti-CD 3а │ 5IgG 2a│ICO 90│ 26,20,16 кД  0│Зрелые Т-лимфоциты

│ 5 │ │  0│

DT-Anti-CD 4а │ 5IgG 1 │ICO 86│ 56 кД  0│Зрелые Т-хелперы/

│ 5 │ │  0│ индукторы

│ 5 │ │  0│

DT-Anti-CD 8а │ 5IgG 1 │ICO 31│ 32 кД  0│Супрессорные/ цито│ 5 │ │  0│токсические (киллер│ 5 │ │  0│ные) лимфоциты

│ 5 │ │  0│

DT-Anti-CD 16 │ 5IgG 1 │ICO116а 50-65 кД  0│NK-клетки, грануло│ 5 │ │  0│лоциты, макрофаги

│ 5 │  0│

DT-Anti-CD 22 │ 5IgG M │ICO 91│ 140 кД  0│ В-лимфоциты

│ 5 │ │  0│

──────────────┴ 5──────┴──────┴─────────────── 0┴─────────────────────

 5II. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОТНОСИТЕЛЬНОГО КОЛИЧЕСТВА

 СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ МЕТОДОМ РОК

Подсчитать относительное количество Т- и В-лифоцитов в гото-

вых мазках. Сделать заключение о наличии иммунодефицита.

 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛИМФОЦИТОВ МЕТОДОМ РОК

В крови - 60-80% Е-РОК,

в лимфе - 95%,

в ЛУ - 65-70%,

в селезенке - 35-40%,

в тимусе - более 95%.

Данный тест - мера количества, не функциональной активнос-

ти клеток. /6504/90-?/

CD2 - рецептор для эритроцитов барана. При смешивании сус-

пензии лимфоцитова са эритроцитами барана последние приливают к

ним, образуя т.н. "розетку". Процент розеток с эритроцитами ба-

рана /ЭБ/ по отношению к общему количеству лимфоцитов, оценива-

емое при проведении микроскопии, отражает относительное число

 _Т-лимфоцитов (Т-РОК . = Т-розеткообразующая клетка).

- Теофиллин-резистентные Е-РКа (Тх)а - 50-63%.

- Теофиллин-чувствительные Е-РКа (Тs)а - 17-20%.

Количество Т-лимфоцитов (Е-РОК)

- в крови - 60 (80)%,

- в лимфе - 95%,

- в ЛУ - 65-70%,

- в селезенке - 35-40%,

- в тимусе - более 95%.

┌───┐ ┌───┐

CD2 4─ 0┤ 6  Т 6  0├ 4─ 0CD2 FcR 4─ 0┤ 6  В 6  0├ 4─ СR1

└───┘ └───┘

 _Определение Т-лимфоцитов . осуществляли с помощью розеткообра-

зования с эритроцитами барана (Е-РОК). С этой целью лимфоциты

человека, взвешенные в среде 199, в концентрации 2 х 10 56 0 в 1 мл

предварительно инкубировали с исследуемыми образцами полипепти-

дов в различной конечной концентрации при температуре 3С в те-

чение 1 часа. После инкубации к 0,1 мл взвеси лимфоцитов добав-

ляли 0,1 мл 1% взвеси отмытых эритроцитов барана, центрифугиро-

вали в течение 5 минут при 1 об/мин. После центрифугирования

осадок ресуспендировали и подсчитывали процент "активного"а ро-

зеткообразования Т-лимфоцитов с эритроцитами барана. Для опре-

деления общего числ Т-лимфоцитова лимфоцитарно-эритроцитарную

взвесь оставляли при температуре 4 5о С в течение 2-х часов, после

чего подсчитывали в камере Горяев процента розеткообразующих

клеток.

- Теофиллин-резистентные Е-РКа (Тх)а - 50-63%.

- Теофиллин-чувствительные Е-РКа (Тs)а - 17-20%.

 _Определение В-лимфоцитов . осуществляли с помощью розетко-

образования са эритроцитами барана, обработанными антителами и

комплементом. В этом случае также лимфоциты человека, взвешен-

ные в среде 199, в концентрации 2 х 10 56 0 в 1 мл предварительно

инкубировали с исследуемыми образцами полипептидов ва различной

конечной концентрации при температуреа 37 5о С в течение 1 часа.

После инкубации к 0,1 мл взвеси лимфоцитов добавляли 0,1 мла 1%

взвеси отмытыха эритроцитов барана, обработанных антителами и

комплементом,центрифугировали ва течение 5а минута при 1

об/мин. После центрифугирования и повторной инкубации при тем-

пературе 37 5о С в течение 30 мин. осадок ресуспендировали и подс-

читывали процент розеткообразующих клеток.

Рецептор к ЭБ имеется на тимоцитах, Т-лимфоцитах (в перифе-

рической крови - 60-79%а Е+ клеток), тромбоцитах, гранулоцитах.

Т-лимфоциты практически все без исключения связываются са ЭБ,

и в меньшй степени с эритроцитами козы, крысы, морской свинки и

кролика. При 45 5о 0 происходит обратимая трат рецепторова к ЭБ

Оптимальная температур - 4-18 5о С (При 37 5о 0 число розеток снижа-

ется до 20%). /6504/90-?/

 _В-лимфоциты ., имеющие FcR и рецепторы к С3-компоненту компле-

мента (CR1), образуют розетки с эритроцитами барана, обработан-

ными антителами к ним и сывороткой мыши (как источник компле-

мента). Также подсчитывается процент РКа по отношениюа к 100

лимфоцитам ( _В-РОК .).

В крови В-лимфоцитов - 15% (10-25%).

 Рецептор к ЭБ имеется на тимоцитах, Т-лимфоцитах (в перифе-

 5рической крови - 60-79%а Е+ клеток), тромбоцитах, гранулоцитах.

 Т-лимфоциты практически все без исключения связываются са ЭБ,

 5и в меньшей степени с эритроцитами козы, крысы, морской свинки

 5и кролика. При 45о происходит обратимая утрата рецепторов к ЭБ

 Оптимальная температура - 4-18оС (При 37о число розетока снижа-

 5ется до 20%). /6504/90-?/ 0

 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ

 СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ

Определение активности лимфоцитов - реакция БТЛ ва ответа на

митоген лаконоса. (функциональный аспект)

Др. функциональные тесты (экспрессия рецепторов к определен-

ным регуляторам и пр.)

 Определение HLA (по В-лимфоцитам 0,

имеющим и I, и II класс антигенов HLA 2)

К суспензииа лимфоцитова добавляют в 100 лунках по трафарету

МАТ к определенному HLA. В 6-12 лунках из 100 происходит обра-

зование ИК, которые выявляют последующим добавлением комплемен-

та (ксеногенной сыворотки). Под микроскопом определяют лунки с

разрушенными лимфоцитами. Если лимфоциты целы, то данного АГ у

человека нет.

 5[Из фракции лимфоцитов выделяется В-субпопуляция на нейлоно-

 5вой вате;а срывается с нейлона. HLA определяется по В-лимфоци-

 5там, т.к. на них имеется HLA и I, и II классов.] 0

 Из гепариновой крови человека выделяют лимфоциты (аналогично

 4методике определения РОК), раскапывают по 1 мкл в примерно 100

 4лунок планшетки. Ва каждую лунку добавляют МАТ (1 мкл) к соот-

 4ветствующему АГ и 1 мкл кроличьего комплемент (цельную сыво-

 4ротку). 1 час. 37о. Добавляют эозин, формалин. Планшетку ставят

 4под микроскоп и определяют лунки с деструктированными лимфоци-

 4тами, т.е. с АГ человека. Если в данную лунку добавлялись МАТ к

 А8 и у человека имеется HLA А8, то антитела связываются с лим-

 4фоцитом, т.е. образуется ИК, который активирует систему компле-

 4мента и МАК разрушает лимфоцит.

 ОЦЕНКА ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА

- Подсчет относительного и абсолютного  _количества . В-лимфоцитов.

- Развитие гуморального  _иммунного ответа

-- после иммунизации АГ-ом.

- Определение функциональной  _активности . В-клеток:

-- фенотип,

-- поликлональная активация - пролиферация мононуклеарных

клетока ва культуре клеток на среде 199 (реакция бласттрансформации на митогены: ЛПС, на митогены в СКЛ),

-- антиген-специфическая стимуляция (иммунизация битыми

вирусными вакцинами, гемоцианином или бактериофагом ФХ

174),

-- продукция иммуноглобулинов в культуре in vitro,

-- оценк  _миграционной активности . (с помощью миграция-ингибирующего фактора = МИФ).

- Определение медиаторова гуморального иммунного ответа в

крови и тканях ( _уровень ИЛ-1,2,6,4 .).

- Оценк функциональной  _активности Т-регуляторов . (фенотип,

поликлональная активация митогенами, тесты Т-хелперной и

Т-супрессорной активности, антиген-специфический ответ).

- Определение поверхностных иммуноглобулинов различных классов на В-лимфоцитах (МИФ и др.).

- Общий ровень (нормальные, анамнестические АТ) иммуноглобулинов ( _Ig М.G,A .);

 4-- ракетный электрофорез (ЭФ)

 4-- реакция преципитации (РП) по Манчини

 4-- РПГА.

-- ровень специфических АТ

--- определение титра АТ у больного к определенному инфицирующему агенту (прямая и развернутая РА, РСК):

столбнячных, дифтерийных, стафилококковых, коклюшных,

дизентерийных и др. антител.

- Определение морфолог лимфоцитов (должны быть шероховатыми)

МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ /259,2551к/

────────────────────────────────────┬─────────────────────────

Методы │Чувствительность методов

│(выявляемое количество

нтител, г/мл)

────────────────────────────────────┴─────────────────────────

РА (реакция агглютинации) 10 5-6 0-10 5-7

- сальмонелл 10 5-6

- пневмококков 10 5-2

РГА (реакция прямой гемагглютинации) 10 5-4

РПГА (реакция пассивной гемагглютинации) 10 5-7 0- 10 5-9

- Реакция Кумбс 10 5-7

Реакция когглютинации (Ко) 10 5-8 0-10 5-9

РП (реакция преципитации)

- в геле 10 5-2 0-10 5-3

- кольцепреципитация 10 5-3

- нефелометрия, турбидиметрия

- колориметрия (с реактивом Фолина)

- встречный иммуноэлектрофорез /ИЭФ/ 10 5-6 0-10 5-7

Реакция иммунофлюоресценции (ИФМ) 10 5-7

РЭМ 10 5-9  0и менее

РИМ 10 5-9  0и менее

Иммуноблоттинга (вестерн-блот) 10 5-7 0-10 5-9

РСК (реакция связывания комплемента) 10 5-6

Реакция иммунного лизис 10 5-8 0-10 5-9

РН (реакция нейтрализации) а10 5-4 0-10 5-6

Реакции анафилаксии, кожная проба

нейтрализации токсина (in vivo)

──────────────────────────────────────────────────────────────

 Выявлена негативная корреляция между Ig M и альфа-2-макрог-

 4лобулином (r=-0,85)а и максимальная позитивная корреляция

 4(r=0,87) между Ig M и, бета-2-гликопротеином и C3а-активатором

 4и церулоплазмином. Максимальному ровню Ig G соответствовали и

 4максимальные уровни других белков (комплемента, С1-инактивато-

 4ра, льфа-1-антитрипсина, альфа-2-макроглобулина и пр.), что да-

 4ло основание предположить наличие конституционных типов орга-

 4низма по белково-синтетической функции.

 Способы получения антител

 2I. Иммунизация (in vivo)

Иммунизация человека или животных с последующим получением

- цельной сыворотки

- гипериммунной сыворотки

- гамма-фракции (гамма-глобулинов)

Используют по жизненным показаниям.

Недостатки антисывороток:

Выделенная из крови сыворотка, сколько бы ее не очищали и ни

концентрировали, содержит набор различных антител. Поэтому ее

называют поликлональной. Лишь небольшая часть антител направле-

на против специфичных антигенных детерминант, а остальные реа-

гируют с самыми разными антигенами. Этим объясняются многочис-

ленные "перекрестные" положительные реакции, которые приводят к

ошибочным диагнозам.

Еще один серьезный недостаток:а для получения антител каждый

раз необходимо заново иммунизировать животных и очищать выде-

ленную сыворотку. Это стоит немалых денег.

 Этапы получения антисывороток

 31. Иммунизация

Один объема антигена смешивают с 3 объемами полного адъюванта

Фрейнда и тщательно перемешивают. Полученнуюа эмульсию вводят

внутрикожно по 0,1мл в 10 точек спины, расположенных по 5 в ряд

на расстоянии 2 см по обе стороны ота позвоночника. Общая доза

иммуногена равна 10-100 мкг на кролика. Иммунизируют 6 кроликов

массой по 2 кг. Через 8-10 недель проводят пробное кровопуска-

ние. Приа удовлетворительном акачестве антисыворотки последова-

тельно проводят до 3 кровопусканий, после чего кроликам дают от-

дохнуть в течение 1 месяца и затем делают следующие кровопуска-

ния. При неудовлетворительном качестве антисывороткиа проводят

вторичную иммунизацию, используя половинную дозу иммуногена в

неполном адъюванте Фрейнда. Иммунизируют подкожно в складку кожи

на шее. Через 10 суток делают пробное кровопускание и определяют

качество антисыворотки. При неудовлетворительном качестве инди-

видуальной антисыворотки иммунизируют новую группу кроликов или

животных другого вида. /6817/84/

 32. Адсорбция (очистка) 0 и тестирование

- высаливание (осаждение сульфатом натрия или сульфатома аммония)

- осаждение спиртом

- аффинной хроматографией

- обработкой полиэтиленгликолем

- каприловой кислотой

- выделение на белок А-сефарозе

 33. Фракционирование 0

 2II. MAT (in vitro).

Получение МАТ (гибридомная технология)

а) В-лимфоциты +а вирус Эпштейна-Барра --- быстро перестают

синтезировать АТ

б) В-лимфоциты + миеломная лимфоцитарная клетка --- гибридо-

ма (под действием ПГа).

МАТ с запрограммированной специфичснотью впервыеа получили

ргентинец Ц.Мильштейн (C.Milstein) и мюнхенец Г.Келера (G.Koh-

ler) /Nature. - 1975. - V.256. - P.495-497/, за что получили в

1978 году Нобелевскую премию. Ониа рассчитывали использовать

гибридомы лишь для изучения генетики антител, а результат при-

вел к подлинному буму.

В основу метода положен давно известный принцип гибридизации

(слияния) соматических, неполовых, клеток с последующим выделе-

нием и культивированием необходимого гибридного клона. Для сли-

яния используют клетки двух видов. Первые - плазмоцитомы (опу-

холевые плазмоциты)а иза линий, культивируемых в искусственных

условиях, in vitro. Как и все злокачественные клетки они интен-

сивно размножаются без всякого внешнего стимула. Другие клетки

- иммунные лимфоциты. Они несут в себе способность синтезиро-

вать и выделять необходимые антитела. Однако в пробирке эти

клетки существуют лишь несколько дней.

Образовавшийся при слиянииа двуха клетока гибрида наследует

признаки обоих "родителей".

Получение гибридом включает 6 основных этапов.

1. Иммунизация, многократное введение мышам или крысам анти-

гена, против которого необходимо получать антитела.

2. Слияние иммунных лимфоцитов селезенки животного с его же

опухолевыми клетками. Для соединения клеток используют обычно

полиэтиленгликоль, разрушающий поверхностиные мембраны и спо-

собствующий соединению клеток.

3. Отбор гибридов. Клетки культивируют в среде, содержащей

гипоксантин. Плазмоциты погибают из-за отсутствия фермента, его

разрушающего, а лимфоциты - просто потому, что не умеюта долго

поддерживать свое существование вне организма.

4. Скрининг, то есть отбор тех гибридных клеток, которые вы-

рабатывают антитела против антигена, использоваого для имму-

низации. Антиген прикрепляют к какому-либо носителю,например, к

пластиковым шарикам или пленке. Такой иммобилизованный антиген

обрабатывают культуральной жидкостью, в которой растут гибридо-

мы, затем наносят меченые антитела против мышиных или крыси-

ных гибридомных антител (их метят радиоктивными, флуоресцент-

ными или ферментными метками). Иными словами, проводят анализ

культуральной жидкости на присутствие антител к искомому анти-

гену. Если гибридомы производят антитела, то они осядут на ан-

тигене, к тем, в свою очередь, прикрепятся меченые антитела.

В результате метка соединится с антигеном на носителе иа зафик-

сируется.

5. Клонирование. Для этой цели несколько гибридных клеток

переносят на питательную среду таким образом, чтобы они росли

на достаточнома расстоянии друг от друга. Через несколько дней

вокруг каждой образуется колония дочерних клеток. Это и есть

гибридома. Клетки колонии снов разводят и помещают на пита-

тельную среду, чтобы строить новые колонии. Клонирование пов-

торяют 3-4 раза, после чего получается стойчивая и продуктив-

наялиния клеток.

6. Повторный скрининг и получение специфических моноклональ-

ных антител. Эти антитела можно выделить из питательной среды в

искусственных условиях или непосредственно из животных, приви-

тых гибридомными клетками (как и многие злокачественныеа опухо-

ли, гибридому можно прививать).

 _Преимущества МАТ .:

1. Главная особенность МАТ - чрезвычайная моноспецифичность

(против одной антигенной детерминанты)а и абсолютная однород-

ность.

2. Возможность многократного получения в течение длительного

времени (воспроизводимость).

3. Неограниченное количество получаемых антител.

3. По специфичности и чувствительности МАТ достигают значе-

ний, предельных для живой природы. Отсюда возможность использо-

вания для анализа антигенов не высокой степени чистоты.

К настоящему времени получены тысячи разнообразных МАТ.

МАТ предполагается использовать в лечебных целях в качестве

целенаправленных носителей, в состава которыха будута включены

токсины (рицин и пр.) или другие фармакологически активные пре-

параты. Такие конъюгаты можно использовать в химиотерапииа опу-

холей и при трансплантации органов и тканей (введением МАТ про-

тив ОКТ 4,8,11;а через 13 суток вырабатывались АТ н введенные

МАТ)./6815,6816/

 _Недостатки МАТ .:

1. Одна из проблем, связана с тем, что МАТ - продукты мыши-

ных гибридом. В настоящее время разрабатываются способы получе-

ния человеческих МАТ.

2. Реакции лишь с одной антигенной детерминантой и отсутс-

твие перекрестных реакций с другими детерминантами на одной мо-

лекуле антигена.  Недостаток МАТ - отсутствие преципитационных

 5свойств, ва связи с чем чаще всего в тестах используются смеси

 5моноклональных антител. 0

3. Возможность непредсказуемыха пекрестныха реакций с поли-

функциональными антигенными детерминантами.

4. Вследствие этого - низкий аффинитет МАТ.

 _Исследование влияния на антителообразование

 Для изучении влияния фармакопрепаратов на первичный иммунный

 5ответ животным вводят вещество (допустим, кордиалин в физиологи-

 5ческой дозе 0,15 мг/кг в течении 3а недель 3а раз ва неделю).

 Контрольная группа должна получать такое же количество физиоло-

 5гического раствора. Допустим, на 14-е сутки, после первого вве-

 5дения, животных иммунизируют эритроцитами барана в дозе 108 кле-

 5ток на мышь (внутрибрюшинно). На 20-е сутки эксперимента в реак-

 5цияха гемагглютинации и гемолиза можно определить титр гемагглю-

 5тининов и гемолизинов.

 В селезенке животных оценивают количество антителообразующих

 5клеток (АОК) по методу A.Cunningham (1965), сравнивая их коли-

 5чество в опыте и контроле. Коэффициент стимуляции антителообра-

 5зования в обеих серияха рассчитываюта по отношению количества

 АОК, приходящихся на 106 ядросодержащих клеток в опыте, к соот-

 5ветствующему количеству АОК в контроле.

 Литература: Зимина... Лабораторное дело. - 1984. - N 9.а -

 С.556. 0

 ОЦЕНКА КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА

- Подсчет относительного и абсолютного  _количества . Т-лимфоцитов. Персистирование высокиха количества CD8-клетока может

казывать на хроническую вирусную инфекцию. /1575к/90/ Количество СD4 5+ 0-клеток снижается при СПДе.

- Определение медиаторов клеточного иммунного ответа /ИО/ в

крови и тканях (ИЛ-2).

- Развитие клеточного  _иммунного ответа ..

- Определение функциональной  _активности . иммунокомпетентных

клеток:

-- оценка функциональной активности Т-клеток (фенотип, поликлональная активация митогенами, антигенами в смешаннойа культуре лимфоцитова /СКЛ/, тесты Т-хелперной и

Т-супрессорной активности, антиген-специфический ответ,

цитотоксическая активность, кожные тесты ГЗТ на туберкулин, стрептокиназу, кандидин и пр.),

-- пролиферация мононуклеарных клеток (реакция бласттрансформации на митогены:а ФГА, Кон А, митоген лаконоса /на

Т- и В-лимфоциты/),

-- тест торможения миграции лейкоцитов на ФГА.

- Определение ферментов лимфоцитов.

- Определение морфологии лимфоцитов.

 ВЫЯВЛЕНИЕ ИММУНОПАТОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ

Иммунопатологические состояния проявляются

- повышенной реактивностью

- сниженной реактивностью (иммунодефицитами).

Возможно сочетание данных состояний (в старости), разная ре-

кция на разные АГ. Поэтому данные два противоположных состоя-

ния можно лечить одними и теми же иммуномодуляторами (иунос-

тимуляторами).

 Иммунопатологические состояния проявляются развитием преиму-

 4щественно 4 основных синдромов:

 4- аллергического синдрома (ГНТ-1)

 4- аутоиммунного синдрома (ГНТ-2)

 4- инфекционного синдрома (ИД) │

 4- лимфопролиферативного синдрома (недостаточность │ИД

 4апоптоза-?) │

 ВЫЯВЛЕНИЕ ИММУНОДЕФИЦИТОВ

 5(+ см. ИД в лекции по иммунопатологии)

- Снижение функциональной активности лимфоцитов, моноцитов,

нейтрофилов

-- сниженный ровень антител.

- Снижение количества иммунокомпетентных клеток.

- Падение комплементарной активности.

- Сниженная реакция лимфоидных органов на инфекцию (незначительное величение ЛУ на локальный воспалительный очаг).

- Кожный тест с пирогеналом. Внутрикожно вводят пирогенал и

измеряют величину возникающей эритемы. При ее размере 4-10

мм диагносцируют нормальную реактивность. Значения, выходящие за рамки этих пределов, трактуются как сниженные или

повышенные. /1652к/

 Диагностика недостаточности

 Т-системы иммунитета

 Клиническая картина ─────а нет

 5│да

 5│

 Кожная реакция на туберкулин ───── нет

 5│отрицательная

 5│

 Индекс стимуляции лимфоцитов Кон А или ФГА ───── менее 15

 5│более 15 │

 5│ │

 Вспомогательные клетки ───── менее 400/мл ───────а нет

 5│более 400/мл │

 5│ │

 Соотношение лимфоцитов с CD 4/CD 8 ────────────── более 1

 5│менее 0,8

 5│

 Недостаточность Т-системы иммунитета

 ВЫЯВЛЕНИЕ СОСТОЯНИЯ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ

 Основным методом диагностики ГНТ является сбор "аллергологи-

 4ческого" анамнеза, основной задачей которого является выяснение

 4связи заболеваний с наследственной предрасположенностью и дейс-

 4твием аллергенов внешней среды.

 ГНТ 1 типа. Анамнеза отягощен и есть связь заболевания с ал 4лергенами.

 ГНТ 2 типа. То же, но связь не выявляется. Необходимо специ 4фическое обследование.

 ГНТ 3 типа. Анамнеза не отягощен и нет влияния аллергенов. В

 4обследовании аллергологов не нуждается.

 Обследование больных с ГНТ использует те же приемы и методы,

 4что и при других заболеваниях, т.е.

 4- общий осмотр,

 4- объективное обследование по органам и системам,

 4- специфическая лабораторная диагностика. /2300к/

 _Диагностика с использованием кожных проб ..

Время реакции

- при ГНТ 1 типа через 1-30 минут. Реакция обусловлена антителами класса Ig E.

- при ГНТ 3 типа реакция через 4-12 часов (с участием иммунных комплексов, содержащих Ig M, Ig G).

- при ГЗТ 4 тип (Тк) - через 24-48 часов.

 _ВЫЯВЛЕНИЕ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ I ТИПА

Основная черта аллергического статуса является чувствитель-

ность к аллергенам экзогенного происхождения.

Аллергологическое обследование включает 2 вида методов:

1. Провокационные тесты (кожные пробы).

2. Лабораторные методы.

- Выявление анафилатоксинов (профилактика анафилатоксическо-

го шока)

( Клиническая диагностика. 0)

В острый период аллергического заболевания специфические ме-

тоды отрицательные, использование аллергенова можета силить

обострение, поэтому специфическое обследование проводят в пери-

од ремиссии.

 Диагностические критерии аллергии

- наличие характерных анамнеза (наследственной предрасполо-

женности и пр.) и клинических проявлений

- пароксизмальное приступообразное течение и быстро наступа-

ющая ремиссия при элиминации аллергенов или провоцирующиха фак-

торов, наоборот, резкое их обострение при повторном воздействии.

- эозинофилия крови, мокроты, секретов и других биологичес-

ких жидкостей и выделений

- характерное поражениеа тканей при местном аллергическом

процессе

- положительные кожные пробы со специфическим аллергеном

- положительные провокационные тесты с аллергенами или при-

чинными факторами

- наличие в значительном количестве специфических Ig E-анти-

тел в сыворотке крови и секретах, величение ровня неспецифи-

ческих Ig E, выявление Ig G4, обнаружение пассивно-сенсибилизи-

рованных ТК, базофилов и других лейкоцитов (нейтрофилов)

- выявление аллерген-специфических лейкоцитов

- положительные провокационные тесты на медиаторы аллергии

(гистамин и др.)

- эффективность специфической и неспецифической антиаллерги-

ческой терапии (антигистаминные препараты, КС и др.). /2300к/

 Биологическая диагностика 0.

 Правила постановки кожных проб.

 4- Кожные пробы ставятся в период ремиссии (через 1-2 недели

 4после обострения). При этом должны быть в наличии

 4-- средства оказания неотложной помощи,

 4-- противошоковый набор.

 4- У аллергена должны отсутствовать токсические свойства, до 4за и объем минимальны.

 4- Перед постановкой пробы берут кровь для лабораторного исс 4ледования, так как возможна дисенсибилизация.

 4- Пробы не ставят с веществами, в ответ на которых был шок.

 4- Адекватный набор кожных проб и правильная последователь 4ность их применения (от менее чувствительной, но более бе 4зопасной /накожной/ к более чувствительныма /внутрикожной/

 4и опасной). /2300к/

 Противопоказания для проведения кожный проб 0.

 41. Острый периода аллергического или любого другого средней

 4степени тяжести или тяжелого заболевания.

 42. Во время беременности, кормления ребенка и в первые 2-3

 4дня менструального цикла.

 43. Присутствие бедительного анамнеза. /2300к/

 Интерпретация результатов кожных проб 0.

 _1. Ложноотрицательные бывают

 4- при гнетении кожной реакции на фоне прием антигистамин-

 4ных препаратов, бета-адреномиметиков, кортикостероидов, у детей

 4до года и пожилых людей (ИД),

 4- недостаточной чувствительности кожи (слабая фиксация ал-

 4лергена)

 4- при низкой концентрации аллергена

 4- при десенсибилизации на аллерген (при постояннома контакте

 4с ним). /2300к/

 _2. Ложноположительные реакции могут быть

 4- приа псевдоллергических реакциях, если вводимый препарат

 4обладает раздражающими свойствами

 4- при постановке проб в острый период аллергической реакции,

 4когда кожа повышенно реагирует на раздражитель

 4- при введении внутрикожно больших объемов растворов, вызы-

 4вающих дегрануляцию ТК от сдавливания тканей.

 4- при недостаточной частоте аллергена в наличии в нем приме-

 4си других веществ, вызывающих аллергическую реакцию. /2300к/

 Лабораторная диагностика 0.

 _1) Анализ крови

Важным признаком аллергии является эозинофилия (увеличение

на 2-4% от нормы или более 500 в 1 мкл крови).

 _Гиперэозинофилия . наблюдается также  4при паразитарных инвази-

 4ях, эозинофильных инфильтратах легкого и кишечника, коллагено-

 4зах, эозинофильных лейкозах, лимфогранулематозе, введении эст-

 4рогенов и андрогенов, блокаде бета-рецепторов. Глюкокортикосте-

 4роиды, наоборот, приводят к исчезновению эозинофилов. /2300к/ 0

 _2) Определение антител в сыворотке крови больных

 4- реакции преципитации, РНГА (РПГА).

 4- ИФМ (иммуно-флюоресцентный метод),

 4- Радио-аллергосорбентный тест. /2300к/

 4- Антиглобулиновые реакцииа (со специфическим аллергеном).

 4/2300к/

3 _) Определение гистамина .. Непрямой и прямой тест дегрануля-

ции базофилов и тучных клеток (ТК). /2300к/

4) Определение простагландинов,  _лейкотриенов .. /2300к/

5) Определение функционального состояния системы гипофиз-ко-

ра надпочечников. /2300к/

6) Реакция  _агрегации тромбоцитов .. /2300к/

а)  При лекарственной аллергии:

- скорение СОЭ

- лейкопения

- тромбоцитопения

- агранулоцитоз

- гемолитичиеская анемия. /2300к/

 1б) При бронхиальной астме

- в мокроте обнаруживаются кристаллы Шарко-Лейдена,

эозинофилия (в мокроте)

(без величения количества микробов). /2300к/

 5- рентгеноскопия, рентгенография, эндоскопический и эхогра-

 5фический методы диагностики. /2300к/

 Кожные пробы.

1)  _"Проба на эозинофилы" ..

Сравнивается число эозинофилов в капле крови, полученной из

очага кожной реакции и в симметричном частке нормальнойа кожи.

При увеличении иха числа в пораженном частке более чем на 10%

заболевание считается аллергическим. /2300к/

2) " _Проба на ТК . (тучные клетки)".

Дермографизм отражаета реактивность кожи, ее капилляров и

ВНС. Его оценивают на коже груди, живота или спины после прове-

дения нескольких полос тупым твердым предметом. Иногда исполь-

зуют специальные дермографы, позволяющие оценить силу надавли-

вания на кожу. Обычно через 15 секунд появляется эритема по ли-

нии надавливания, затем возникает отечность. В норме линия

надавливания слабая или меренная, красная быстро исчезает. р-

тикарный слой в виде отечных белых полос наблюдается при масто-

цитозе (пигментная крапивница), повышенной лабильности нервной

системы, некоторых аллергических заболеваниях (атопическом дер-

матите), появляется сразу послеа надавливания на кожу и может

сохраняться от 30 минут до суток, сопровождаться зудом. /2300к/

-  _Реакция Праустница-Кюстнера . - реакция пассивного переноса

сенсибилизации (переноса сывороткой крови здоровому человеку).

На первом этапе несенсибилизированному реципиенту вводята внут-

рикожно в предплечье 0,05-0,1мл сыворотки крови больного аллер-

гией в несколько точек на расстоянии не менее 6 см. Затем через

24-48 или 72 часа в эти места, также в частки введения анти-

сыворотки (самого реципиента) и разводящей жидкостиа (контроль)

делают внутрикожно разрешающую инъекцию аллерген по 0,02а мл

(на расстоянии 0,5-1 см от точки введения сыворотки). В одно из

мест введения сыворотки крови больного вместо аллерген вводят

его растворитель (контроль). Реакция возникает в случае взаимо-

действия антител введенной сыворотки крови больного иа аллерге-

на. Ее результат учитывют через 20 мин после иньекции аллерге-

на, так же как в/к пробу. Если использовать разведенную сыво-

ротку, то можно определить ее титр. Минимальное время, необхо-

димое для фиксации реагинов, составляет 3 ч. Однако в связи с

возможностью переноса вирусного гепатита и СПДа, также с на-

личием других методов диагностики в последнее время реакция т-

ратила свое значение. Более приемлемо ее применение в комбина-

ции "больной ребенок - реципиент один из родителей". Иногда ал-

лерген вводят не в/к, через рот (например, пищевой продукт).

3)  _Пробы на аллергены . (аллергические пробы). Недостатока -

добавочная аллергизация организма.

-- конъюнктивальные

-- назальные

-- ингаляционные

-- кожные (скарификационные, внутрикожные, пробы колом, накожные /капельные, аппликационные, компресные, электрофоретические/) /2300к/,

-- экспозиционные

-- подъязычные

-- пероральные (са регистрацией по изменению картины крови

/лейкопенические, тромбоцитопенические, эозинофилоцитопеничес-

кие/, по подавлению миграции лейкоцитов in vivo в коже или сли-

зистых, по изменению функции внешнего дыхания).

В основе провокационных тестов лежит специфическая вторичная

повышенная иммунная реакция на вводимый ва организма аллерген.

/2300к/

Различают аллерген-специфические и неспецифические провока-

ционные тесты.

-  _Специфические . основаны н вызове аллергической ответной

реакции шоковых тканей и органов к специфическима аллергенама и  5регистрация результатов этих реакций

 5по ряду показателей. 0 /2300к/

-  _Неспецифические . тесты позволяют выявить состояние гиперчувствительности различных тканей к медиаторам аллергической реакции (гистамину, АХ-ну, брадикинину, серотонину, простагландинам и другим) или неспецифическим раздражающим факторам (холод, физическая нагрузка и

др.). /2300к/

-- Ингаляционные c бронхоконстрикторами (са медиаторами

/гистамин, АХ, Pg F 42-альфа 0, брадикинин, серотонин/, с

неспецифическими раздражителями /холодный воздух, физическая нагрузка/). /2300к/

-- Ингаляционные с бронходилататорами (селективными стимуляторами бета-2-адренорецепторов /беротек/, с холинолитиками /атропин или атровен/, с ингибиторами фосфодиэстеразы /теофиллин, эуфиллин/, с медиаторами /Pgа E/).

/2300к/

-- Кожные неспецифические (с медиаторами /гистамин/, дермографизм). /2300к/

Количественные тесты казывают на степень чувствительности к

ллергену или фактору, качественные - на специфичность реак-

ции.

 _ Профилактика и лечение . 0 аллергий

Гипосенсибилизация более 70 лет является основой лечения ал-

лергий респираторного тракта.

 _1. Препараты, оказывающие действие на иммунную стадию

- Влияющие на процесс образования Ig E. /2275к/

-- повторное введениеа увеличивающихся доз аллергена (запуск синтеза Ig G ── 76 0 блокада АГ до подхода к ТК)

(получение чистыха индивидуальных аллергенов --- преры+- вистые повторные инъекции экстратов Га н адъювантах;

повышение интервалов между инъекциями)

-- введение per rectum (запуск пероральной толерантности)

 5-- индукция иммунологической толерантности (супрессией

 5синтез Ig E адъювантом Фрейнда;а переводом АГ в толе 5рантную форму, т.е. формирование клеток-супрессоров)

- Влияющие на связывание Ig E cа Fc(Е)-рецепторами. /2275к/

-- введение Fc-фрагмента Ig E

-- введение 1-валентного аллергена

-- введение анти-Ig E

-- модификация антигенных детерминант аллергена

 1- Регуляция гамма-ИФ-ом:а ИФ является прямыма антагонистом

 ИЛ-4 в ИЛ-4-индуцированной продукции Ig E. /2262к/98/

 1- Влияющие на синтез ИЛ-ов, участвующих в Ig E-ответе. /2275к/

 1-- ИЛ-10 (предотвращающего ИЛ-4-индуцированный синтеза Igа E

 1путем ингибиции вспомогательной функции моноцитов) 0. 1 /2262к/98/

 1-- ИЛ-12, регулирующего ровень секреции ИФ-гамма, ИЛ-4а и

 ИЛ-10 антигенспецифическими лимфоцитами. /2262к/98/

 1- ИЛ-8 селективно ингибирует Ig E-продукцию ПК-ми, индуциро-

 1ванными ИЛ-4-ом 0. 1 /2262к/98/

 _2. Препараты, оказывающие действие на патохимическую стадию.

- Стабилизаторы мембран клеток-мишеней аллергии. /2275к/

-- гормональная терапия (преднизолон и пр.),

-- препараты кетотифен, промогликат-? Nа --- стабилизация

мембраны ТК.

- Соединения, тормозящие активацию этих клеток (влияющие на

поступление и либерацию ионов кальция, на синтез и обмен медиа-

торов аллергии, на систему аденилатциклаза-цАМФ-фосфодижстера-

за). /2275к/

-- групп кромолинова (кромогликат натрия - интал) гнетает

освобождение медиаторов из ТК. /2275к/

 _3. Препараты, оказывающиеа действие на патофизиологическую

 _стадию. /2275к/

- Антагонисты медиаторова аллергии (гистамина, серотонина,

ЛТ-ов, ФАТ). /2275к/

-- антигистаминные средства (цетиризин = зиртек) /2275к/,

-- бронхолитики,

- Соединения, снижающие чувствительность эффекторных тканей

к аллергии (стимуляторы бета-адренорецепторов, альфа-адренобло-

каторы, ингибиторы М-холинорецепторов). /2275к/

4. Препараты, оказывающие действие одновременно на различные

стадии аллергического процесса -  _полифункциональные (глюкокор-

тикостероиды, кетотифен). /2275к/

 _ВЫЯВЛЕНИЕ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ II ТИПА

Аутоиммунными принято считать те заболевания, в основе кото-

рых лежит иммунная реакция на собственные антигены тканей и ор-

ганов.

 Причины и механизмы заболевания

- Измененные собственные АГ.

-- Индуцированный вирусами и другими агентамиа мутации и

модификации активности аутогенов - онкогенов, регулирующих продукцию цитокинов и их рецепторов.

- Нарушение барьеров "забарьерных органов" или физиологически изолированных АГ-ов.

- Нарушение распознавания "своего" и "чужого" (данные иммуногенетики).

-- Антигенная мимикрия аутоГ и АГ микробов.

- Активация аутоктивных клонов лимфоцитов

-- снижение функции клеток-супрессоров.

-- снижение апоптоза Тх, активирующих В-лимфоциты (CD5).

/2300к/

- Нарушение иммунологической сети идиотип-антиидиотип (выяв-

ление свободных антиидиотипических антител).

- Индукции экспрессии HLA DR-антигенов, их не имевших,

 Диагностика

Диагноз аутоиммунных заболеваний может быть поставлен на ос-

новании клинической картины заболевания, лабораторных показате-

лей.

 Критерии аутоиммунных заболеваний 0.

- Наличие четких доказательств частия АТ в поражении клеток

(наличие аутонтител различной специфичности),

- положительный клинический эффект от лечения иммуномодуляторами

- эффективность десенсибилизации. /2300к/

 Анализ крови 0:

- снижение Т-клеток (особенно Тs),

- величение числа В-лимфоцитов

- поликлональная гипер- или дис-иммуноглобулинемия

- ИК в крови

- снижение концентрации комплемента /? - ПОЛ/

(- определение ровня ИЛ-1, ИЛ-2, ФНО, лимфо- и цитокинов).

/2300к/

 Кожные пробы 0: (клеточные реакции)

 Экстракты аллогенных тканей в качестве антигенов малопригод-

 4ны, так как они могут стимулировать лимфоциты в результате гис-

 4тонесовместимости. К некоторым из них может наблюдаться сенси-

 4билизация (после переливания крови и пр.). Чтобы контролировать

 4активность лимфоцитов на аллоГ контрольные АГ должны быть при-

 4готовлены из другой ткани того же индивидуума. Если сенсибили-

 4зации к тому АГ нет, к опытному АГ есть, то только тогда мож-

 4но делать заключение о ее тканевой специфичности. /2300к/

 ГНТ 2-го типа осложняется ГЗТ.

 Лабораторная диагностика 0 (см. отд-е формы)

- Определение антител, связанных с клетками

 Температурные реакции

- Кожные неспецифические (холодовые, тепловые) пробы.

1) Протеины теплового шока (" _тепловая аллергия .")

 Протеины теплового шока (ПТШ) локализуются внутриклеточно и

 4на клеточной поверхности. В частности, иммуннуюа роль играет

 4пептид 180-188 (ПТШ65), индуцирующий Т-клеточный ответ, корре-

 4лировавший с тяжестью заболевания. /2289к/96/

 Иммунизация ПТШ65 может защитить мышь от индукции адъювант-

 4ного артрита. В артритных тканях мышей обнаружены пептиды ПТШ60

 4и ПТШ70, в крови - Т-клетки и антитела к ПТШ65. Ragno постули-

 4ровал существование механизма молекулярной мимикрии для инициа-

 4ции и пролонгации артрита. /2289к/

 ПТШ60 обнаруживаются на макрофагах, активированных гамма-ИФ

 4и альфа-ФНО. /2289к/

 Кожная проба 0: Пробирку с горячей водой (40-42 5о С) помещают на

10 минут на кожу внутренней поверхности предплечья. При положи-

тельной реакции через 15-20 минут наблюдается гиперемия, отек,

волдырь. /2300к/

2) " _Холодовая аллергия ."

 Кожная проба 0:а кусочека льд помещают на предплечье и через

10-20 минут на этом месте появляются волдыри при непереносимос-

ти холода. /2300к/

 Аутоиммунное заболевание щитовидной железы

 _1) Тиреоидит Хашимото.

 Лабораторная диагностика

 4- HLA B8 и DRS. /2300к/

 4- Аутонтитела против АГ к тиреоглобулину (РСК,ИФА,РПГА,РП,

 РИМ, латексный метод). /2300к/

 4- АТ против микросомных АГ и "второго коллоидного АГ"а (ис 4пользуют непрямую иммунофлуоренценцию на срезах щитовидной

 4железы./2300к/

 4- АТ протива основного белк микротрубочека -а тубулина.

 4/2300к/

 4- АТ против поверхности клеток эпителия. /2300к/

 4- Подавление тироксином миграции лимфоцитов. /2300к/

 4- Цитотоксическое действие лимфоцитов н различные клетки,

 4покрытые АГ-ом железы /2300к/ (Тк=4 тип ГЗТ-?).

 4- Повышено количество Тх2 типа с рецептором к ИЛ-2 ва крово 4токе. /2300к/

 4- Cоотношение Тха к Тsа (CD4/CD8)а повышено незначительно.

 4/2300к/

 _2) Тиреотоксикоз.

- АТ, стимулирующие гиперплазию эпителия.

- Стимулятор щитовидной железы (LATS).

- АТ, стимулирующие накопление в щитовидной железе коллоида

и цАМФ.

- АТ, ингибирующие связывание тиреотропин c рецепторами

клеток

- Снижение числа CD8-лимфоцитов и повышение соотношения Тх к

Тs (CD4/CD8). /2300к/

 _Сахарный диабет

 Инсулинзависимый сахарный диабет - аутоиммунное заболевание;

 5аутоиммунная реакция приводит к разрушению инсулино-продуцирую-

 5щих клеток. Больные имеют высокий риск развития других аутоим-

 5мунных заболеваний. Часто развивается поражение щитовидной же-

 5лезы - аутоиммунный тиреоидит или болезнь Грейвса. /2239к/95/ 0

 _1) Первый тип (инсулин-зависимый)

 Приобретая DR-АГ, бета-клетки становятся АПК (АГ-презентиру-

 4ющими клетками), запускающими ИО. Появление DR-АГ на бета-клет-

 4ках под влиянием ИФ, индуцируемого некоторыми вирусами или/и

 4стимуляция ими синтеза макрофагами ИЛ-1 и ФНО, повреждающих бе-

 4та-клетки. /2300к/

 Особую проблему представляет сенсибилизация больных к инсу-

 4лину животного происхождения (Ig G и Ig A).

 _2) 2-ой тип

 АТ к рецептору для инсулина /?/

 Лабораторная диагностика:

 4- Генетическая предрасположенность (HLA DR 3/4, и особенно

 4HLA DQ, А1 и HLA DQ, В1. /2300к/

 _Рассеянный склероз

- Ассоциирован с АГ HLA A3, B7, DR2. /2300к/

- Повышено содержание Ig в спинномозговойа жидкости (СМЖ),  _ АТ

 _ 2против белка миелина . 0 СМЖ и крови.

- Общее количество Т-лимфоцитов не меняется или снижено.

- Повышено количество В-лимфоцитов.

- Повышен ровень Тх (CD4+-лимфоцитов), ИЛ-2

- Снижено количество Тs, на которых в 3 раза повышено число бета-адренорецепторов.

- На моноцитах снижена экспрессия DR-АГ.

- В СМЖ обнаруживаются МИФ (миграции-ингибирующий фактор), ФНО,

гамма-ИФ. /2300к/

 _Миастения гравис

 2- Та протива АХ-ых рецепторов и АХЭ 0 (ацетилхолинэстеразы) -

 490% больных. /2300к/

 4- АТ против АГ скелетных мышщ.

 4- Имеется связь между АГ мышечной ткани и АГ вилочковой же-

 4лезы (тимуса). Тимэктомия приводита к клиническому лучшению

 4состояния больных /2300к/ - у 30%-?. АТ могут интенсивно взаи-

 4модействовать с комплексом тимопоэтин-АХ-ый рецептор (тимопоэ-

 4тин снижает нервно-мышечную передачу импульсов). /2300к-с.136/

 4- ровень Т-клеток нормальный, но снижается после тимэкто-

 4мии, хотя состояние больных лучшается.

 4- Супрессорная активность клеток умеренно меньшена.

 4- величена субпопуляция Т-клеток, имеющих СR1/?/-рецепторы.

 4- Снижен цитотоксическая активность ФГА (фитогемагглюти-

 4нин)-активированных Т-клеток. /2300к/

 Шизофрения

- аутоиммунная форма

 Антифосфолипидный синдром 0 (АФС)

(Синдром ПФА - противофосфолипидных антител)

──────────┬──────────────────────────────────────┬─────────────

Компоненты│ Патогенное действие │Лабораторные

гемостаза │ антифосфолипидных антитела │проявления

──────────┼──────────────────────────────────────┼─────────────

Сосудисто-│Взаимодействие с мембраной тромбоцитов│Тромбоцито-

тромбоци- │--- повышение адгезии к ЭК --- подав- │пения

тарный │ление выработки простациклина --- АТ │

│ │

Когуляци-│Торможение образования протромбинового│Повышение

онный │комплекса (фактора V+X+Ca+ФЛ), блокада│протромбино-

гемостаза │действия на протромбин │вого времени

│Повышение способности тромбина катали-│

│зировать образование свертка крови │

│ │

Противо-а │Снижение синтеза эндотелием тромбомо- │

свертываю-│дулина --- снижение активности белка С│

щая систе-│Подавление активности АТ-. │Снижение АТ-

м │ │

│ │

Фибриноли-│Ингибиция образования прекалликреина. │Замедление

тическая │Нарушение клиренса фибрина (активная │лизиса эугло-

систем │фаза фактора ХII + калликреин + ВМК). │булинов

│Снижение выделения активатора плазми- │

│ногена. │

──────────┴──────────────────────────────────────┴─────────────

 _Лабораторная диагностика:

- наличиеа антител к фосфолипидам /3609/ --- эффект антикогулянта (блокада образования протромбиназы). /3609/86/

- Та тип волчаночного величивают время рекальцификации в

присутствии различных видов фосфолипидов. /8/87/

- длинение протромбинового времени /3615/82/,

- длинениеа активированного (каолином) частичного тромбопластинового времени. /8001/89/

- снижение ровня белка S, снижение белка С /7/

 Фибринолитическая активность снижается. /3615/82/ Тормозится

 Хагеман-зависимый фибринолиз (Табл. 1) /определение каолин-за-

 5висимого фибринолиза по Ogston /3615-11/. /3615/82/

 Таблица 1.

 5───────────────────────────────────────────────────────────────

 Плазм Время лизиса (мин.)

 5───────────────────────────────────────────────────────────────

 Нормальный уровень 7-14 минут

 Врожденный дефицит прекалликреин более 120 минут

 Врожденный дефицит фактора ХII более 120 минут

 Больные СКВ 25,

 575,

 515 минут

 5───────────────────────────────────────────────────────────────

 Снижается уровень активатора плазминоген эндотелиальныха кле-

 5ток. /3615/82/

 _ВЫЯВЛЕНИЕ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ТИПА

 Лабораторная диагностика

- Реакции лизиса и повреждения лейкоцитов

- Определение ЦИК (повышенный ровень)

- Снижение ровня комплемент /с/

- Повышение титра АТ /с/

- повышение СРБ /с/

- ПОЛ /с/

 Определение ЦИК

(циркулирующих иммунных комплексов)

 _Значение теста .. Содержание ИК помогает в оценке и мониторин-

ге активности болезни при таких состояниях, как РА, СКВ. Опре-

деление АГ-специфических ИК может оказаться полезным при обсто-

ятельствах, когд свободные Та ва сыворотке неа выявляются.

/1575к/90/

 _Варианты методик

1) Биологический тест

- Тест гнетения ЕА-розеткообразования (FcR) лимфоцитов боль-

ных под влиянием 10-20%а аутологичной сыворотки (контроль сыво-

ротки доноров). Причем, данный тест более чувствителен, чем

другие методы.

- Реакция когглютинации (агглютинация стафилококков

сывороткой больных. /с/

- Агглютинация эритроцитов, покрытых белком А (FcR) золотис-

того стафилококка. /2300к/

- ЦИК выявляют с помощью клеток (тромбоцитов, клеток Райи),

имеющих Fc-рецепторы, которые связывают агрегированные Ig. ЦИК

угнетает связывание с FcR частиц, например, эритроцитов, покры-

тых агрегированных иммуноглобулинами или АТ-ми. /2300к/

2) С1q-cвязывающий тест

ИК= АГ+АТ

АТ=Fab+Fc

Fc + C1q, иммобилизованный на носителе (колонке с сефаро-

зой).

Пропускают сыворотку больного через колонку, промывают, сры-

вают (высокомолярным, "кислым" /рН 3/ и пр. раствором) лиганд и

измеряют элюат спектрофотометрически.

Недостаток: ЦИК кровотока, связанные с С1q, не сядут на колонку.

3)  _Осадочные реакции . (желательно с последующима определением

в осадке содержания антител /посадкой на колонку с C1q/).

Недостаток: в осадок выпадают все крупные комплексы плазмы

(обрывки мембран, фибрина, СРБ-лиганд, фибронектин-лиганда и

пр.). /с/

 4а) Водно-кислотные методы.

 4- Сыворотка смешивается с 10% ТХУ (трихлоруксусной кислотой)

 4в соотношении 1:0,5. Надосадок после центрифугирования измеря-

 4ется на спектрофотометре при длине волны 254нм. Экстинция менее

 40,24 ед. считается нормой. 10% ТХУ определяет (в конечной кон-

 4центрации 3,3%) осаждает белки с М. более 100 кД.

 4- Осаждение "ЦИК" дистиллированной водой, подкисленной о,М

 4раствором уксусной кислоты (рН 4,6).

 К 0,1 мл инактивированной сыворотки добавляют 2 мл охлажден-

 4ной до 4оС воды, перемешивают и центрифугируюта 30а минута при

 43 об./мин. (при 4оС). Осадок промывают подкисленной водой,

 4растворяют в 3 мл 0,Н NaOH и измеряюта количество белк при

 4280нм, т.е. количество ЦИК. /2300к/

 4б) Осаждение ПЭГ (полиэтиленгликолем)

 ПЭГ добавляется в определенное количество сыворотки, образу-

 4ется осадок, который растворяют в физрастворе и спектрофотомет-

 4рируют.

 43% ПЭГ - Норма - 23-124 (показания СФ)

 44% ПЭГ - Норма - 90-148

 4[4) Конглютининовый тест]

 45) АГ-специфические методы (послеа выделения специфических

 ЦИК) базируются на выявлении АГ-ов или АТ после диссоциации ЦИК

 4при рН 2,8-3,2 или путем обработки раствором мочевины, цистеина

 4и других веществ. /2300к-с.234/

 Коллагенозы

 5- иммунная патология диффузныха заболевания соединительных

 5тканей. Возможен врожденный волчаночный синдром (+ АТ к ДНК, +

 5врожденный порок сердца). Характерен дефицит С2.

 _ Патогенез

 В норме антинуклеарные, антицитоплазматические и антимито-

 5хондриальные антитела выявляются в высоком титре (> 1:160) у 1%

 5здоровых обследованных (уровень существенно повышается са воз-

 5растом). /2258к/

 Антисыворотки против нуклеарных АГ:

 5- WHO 66/233, WHO 4/80.

 5- Стандарты АГ -а AF#CDC ANA No1; AF/CDC No 3, N 4, N 8.

 _ Клиническая картина

 Клиническая картина СКВ характеризуется полиморфизмом. Долж-

 5но быть не менее 4 признаков.

 51. Недеформирующий артрит (80-90% больных).

 52. Наличие LE-клеток (70-90%).

 53. Цилиндроурия (15-50%), плеврит или перикардит (50-70%),

 54. Алопеция (облысение) - (40-70%)

 55. Эритема лица в форме бабочки (40% больных)

 56. Синдром Рейно (20-40%)

 57. Повышенная чувствительность к Ф лучам (30-40%).

 58. Дискоидная волчанка (20-30%)

 59. Изъязвление в полости рта или носоглотки (15-40% больных).

 510. Выраженная протеинурия (более 4 г/л), 15-30% больных.

 511. Психозы или судорожные припадки (10-20% больных).

 512. Гемолитическая анемия (15%),

 513. Лейкопения (ниже 4х109л-1) /40% больных/ или

 5тромбоцитопения (ниже 100 х109 л-1 (10% больных),

 5лимфопения.

 514. Положительная реакция Вассермана в течение 6 месяцева (АТ

 5к кардиолипину).

 _ Лабораторная диагностика

 5- снижение ровня Т-лимфоцитов, преимущественное гнетение

а Тs;

 5- снижение ИЛ-1 макрофагами и моноцитами, ИЛ-2

 5- меньшение нормальной концентрации в сыворотке крови С4а и

 С2 компонентов комплемента

 5- поликлональная активация В-системы

 5- повышение ровня Та Ig G1, G3.

 5- АТ к ДНК и АТ 2-го порядка (АТ к АТ)

 5- наличие АТ против определенных субпопуляций лимфоцитов

 5- связь с HLA гаплотипом А2, B7, В8, D3,

 5или с гаплотипом А11, B7, В35, DR2, DR3; рекомендуется

 5обследовать родственникова больного адля выявления ранних

 5форм заболевания. /2300к/

 Склеродермия

 5- Нарушение функции фибробластов (несовершенный коллаген)

 5- Антиядерные АТ (80% больных)

 5- антифосфолипидные АТ,

 5- АТ к Scl (70%)

 5- АТ к РНК-полимеразам, топоизомеразе ядер

 5- ревматоидный фактор (РФ) - антитела класса Ig M к Fc-фраг 5менту Ig G и Ig Е. /2300к/

 5- АТ против центромеры

 5- лимфоцитотоксины

 5- гипер-гамма-глобулинемия,

 5- ЦИК

 5- снижение ровня Т-лимфоцитов. /2300к/

 Синдром Шегрена

 Шегрен в 1933г. описал синдром, состоящий из трех основных

 5симптомов:

 51. сухого кератоконъюнктивита, │sicca-синдром

 5(ксерофтальмия-?) │

 52. ксеростомии, │

а 53. ревматоидного артрита. Ревматическое поражение начинается

 5раньше, к нему присоединяется поражение слюнных желез. /1407к/

 5+ синуситы,

 5+ сухость кожи,

 5+ анацидность,

 5+ цистит, пиелит,

 5+ анемия, СКВ, макроглобулинемия, полимиозит, склеродермия,

 5васкулит, узелковый периартериит, иммунный тиреоидит, иммунный

 5гемолиз и прочие аутоиммунные болезни. /1407к/

 Болезнь характеризуется разрушением железистого эпителия во

 5всем организме. /1407к/

 _ Этиология

 Аутоиммунный процесс. Органоспецифические аутонтитела про-

 5тив 0

 5- щитовидной железы,

 5- слизистой желудка,

 5- мышц,

 5- ревматоидный фактор (Ig G против Ig M),

 5- противоядерный фактор. /1407к/

 _ Патогенез

 В слюнных железах лимфоцитарная инфильтрация, в первую оче-

 5редь вокруг полосатых протоков. В эпителии протоков наблюдается

 5пролиферация лимфоцитов, эпителий ацинусов погибает (остаются

 5островки пролиферирующего эпителия). = доброкачественное лимфо-

 5эпителиальное поражение. Можета переходить в злокачественную

 5лимфосаркому. /1407к/ 0

 5- Лейкопения

 5- РФ (70-90%)

 5- антиядерные АТ (50-70% больных)

 5- АТ к АГ слюнных желез

 5- снижение Т-клетока и соотношения CD4/CD8=Тх/Тs (норма

 51,5-2,5). /2300к/

 _ Клиника

 5- Набухание слюнных желез,

 5- сухость во рту (в тяжелых случаях у больного полностью от-

 5сутствует слюна). В таком случае затруднено глотание.

 5- По всему телу прощупываются ЛУ, ревматические узлы.

 5- Депрессия. /1407к/

 _ Лечение

 5- кортикостероиды, дарные дозы преднизолона,

 5- витамин В12

 5- психо- и физиотерапия. /1407к/

 Узелковый периартериит

 _ Лабораторная диагностика

 5- Лейкоцитоз

 5- Гипо-гамма-глобулинемия

 5- Антинуклеарные АТ

 5- РФ

 5- АТ против кардиолипина

 5- HBs-АГ или его АТ (30% больных). /2300к/

 Ревматоидный артрит

 ИК --- активация комплемента.

 Ревматоидные зелки состоят из фибрина, лимфоцитов, макрофа-

 5гов.

 _ Лабораторная диагностика

 5- РФ = аутоТ (класса Ig M) к Fc-фрагменту Ig - ревматоидный

 5фактор (выявляются у 70-90% больных).

 5- величение СОЭ

 5- Повышение СРБ

 5- Повышение альфа-2-глобулинов, а затем и гамма-глобулинов.

 5- Анемия

 5- меренный лейкоцитоз

 5- Генетическая связь с HLA А11, DR4, DR53, DQ4.

 5- Наличие муциновыха преципитатова в синовиальной жидкости.

 5/2300к/

 5- меньшение количества лимфоцитов. /2300к/

 5- Повышается ровень бета-2-макроглобулин ва кровиа ва 2-5

 5раз. /2300к/

 _ВЫЯВЛЕНИЕ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ IV ТИПА

 Лабораторная диагностика

- Анализ крови и подсчет лимфоцитов. Количество Т-лимфоцитов

определяют по АГ и рецепторам.

- Рентгенологическое обследование вилочковой железы.

- Функциональную активность Т-лимфоцитов определяют по пролиферацииа (РБТЛ), образованию цитокинов, лимфокинов, а

также по цитотоксическим и регуляторным эффектам. /2300к/

- Подавление миграции лейкоцитов.

- Изменение прилипаемости лейкоцитов.

- Изменениеа розеткообразования Т-лимфоцитов с эритроцитами

барана.

- Кожные пробы

-- пробы с ФГА (оценивают по диаметру папул;а гиперемия не

определяется "работой" Тк-ов),

-- динитрохлорбензолом /ДНХБ/

--"мультитест" (набор распространенных АГ-ов). /2300к/

-- Кожный тест с пирогеналом

Внутрикожно вводят пирогенал и измеряют величину возникающей

эритемы. При ее размере 4-10 мм диагносцируют нормальную реак-

тивность. Значения, выходящие за рамки этих пределов, трактуют-

ся как сниженные или повышенные. /1652к/