Реферат: Проблемы экстракорпорального оплодотворения

     ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ........................... 2
ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОЕ ОПЛОДОТВОРЕНИЕ.
ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ.....................  4
Показания к ЭКО........................ 5
ЭМБРИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРОГРАММЫ ЭКО И ПЭ....... 7
Культуральные среды....................            7
CO2-инкубатор......................... 8
Идентификация и оценка качества ооцитов...........9
Обработка спермы перед оплодотворением ооцитов in vitro.... 11
Оплодотворение ооцитов in vitro................ 12
     Оплодотворение Ц теоретические аспекты.............           13
Оценка качества эмбрионов...................           16
Стратегия переноса эмбрионов................            17
Техника переноса эмбрионов...................18
СТИМУЛЯЦИЯ СУПЕРОВУЛЯЦИИ В ПРОГРАММЕ ЭКО И ПЭ......  19
ОСНОВНЫЕ ПРОБЛЕМЫ, ВОЗНИКАЮЩИЕ ПРИ
ПРИМЕНЕНИИ ЭКО И ПЭ...................... 21
ЗАКЛЮЧЕНИЕ........................... 24
ЛИТЕРАТУРА............................ 25
     ВВЕДЕНИЕ
Среди методов лечения бесплодия можно условно выделить те, что нанправлены на
восстановление естественной фертильности супружеской пары и те, что
используют технику искусственного оплодотворения.
К первым относятся попытки лечения хронического воспалительного процесса в
малом тазу, хирургического и нехирургического восстановления проходимости
маточных труб, коррекция эндокринных расстройств и наруншенного
сперматогенеза. Ко вторым Ц внутриматочная инсеминация спернмой мужа или
донора, экстракорпоральное оплодотворение с последующим переносом эмбрионов в
матку матери в различных его вариантах.
До недавнего времени лечение трубного бесплодия исчерпывалось бесконечным
повторением трудоемких для врача и утомительных для больных
физиотерапевтических процедур и курсов гидротубаций в сочетании с
протинвовоспалительной терапией. Эффективность данного вида лечения в
отношеннии восстановления проходимости труб чрезвычайно низка, а последствия
в виде перерастяжения ампулярных отделов труб и потери их функциональной
способности достаточно серьезны, поскольку предопределяют бесперспективнность
последующего хирургического лечения.
Последнее также не оправдало ожиданий, возлагаемых на него специанлистами.
Так было показано, что при непроходимости ампулярных отделов маточных труб,
вызванной "внешними" факторами (спайками, например), часнтота наступления
беременности после реконструктивно-пластических операнций довольно велика и
составляет 20 - 70% (в зависимости от квалификации хирурга и степени
выраженности спаечного процесса).
При непроходимости же маточных труб в истмических отделах, связанной с
внутренним адгезивным слипчивым процессом, частота наступления беренменности
даже после микрохирургических операций составляет всего 0 - 5%. В то же время
эти операции, выполняемые путем чревосечения, достаточно травматичны и
сопряжены с определенным риском для больной. Поэтому, в последние годы
наблюдается тенденция к замене больших полостных операнций на малые,
"лапароскопические", т.е. выполняемые во время оперативной лапароскопии.
Наиболее распространенными операциями, выполняемыми во время лапароскопии, на
сегодняшний день являются: рассечение спаек с целью воснстановления
проходимости маточных труб, удаление небольших кист яичнинков и миоматозных
узлов, прижигание очагов эндометриоза, коагуляция поликистозных яичников и
даже удаление маточной трубы при внематочной беренменности.
Основным преимуществом оперативной лапароскопии перед большими полостными
операциями является значительно меньший риск как в отношении здоровья
больной, так и в отношении рецидива спаечного процесса, а также быстрота
возвращения больной к активной жизни.
Однако возможности оперативной лапароскопии ограничены. Выполнение больших
реконструктивных операций возможно только во время чревосечения.
Эффективность лечения бесплодия после таких операций весьма невелика.
Женщинам с сопутствующими эндокринными нарушениями, которым предстоит лечение
бесплодия путем пластической операции на маточных трунбах, необходима
предварительная гормональная коррекция, поскольку эффект подобной операции и
последующего восстановительного лечения нестойкий, связан с риском повторного
воспаления и рецидива непроходимости труб. В этой ситуации терять время на
нормализацию гормональных нарушений понсле операции нецелесообразно.
Несколько слов следует сказать о противовоспалительном лечении.
Как правило, трубно-перитонеальное бесплодие является следствием хронического
воспалительного процесса в малом тазу, возникшего в резульнтате банальной или
специфической (гонорея, хламидиоз) инфекции, нередко как осложнение аборта.
Однако противовоспалительное лечение не есть лечение бесплодия, но оно
необходимо во всех случаях, когда женщине предстоят внутриматочные
вмешательства, лечебные или диагностические: снимок матки и труб,
лапароскопия с введением в матку красящего вещества, внутриматочная
инсеминация, ЭКО и т.д. Во всех случаях предварительное
противовоспалительнное лечение позволяет избежать обострения воспалительного
процесса и убнрать факторы, снижающие вероятность наступления беременности и
выкидынша в том случае, когда она наступила.
Недостаточная эффективность методов, направленных на восстановленние
естественной фертильности человека в случаях трубного и трубно-
перитонеального бесплодия, стимулировала развитие методов искусственного
оплодотворения.
Последние годы отмечены стремительным ростом как числа самих ментодов
искусственного оплодотворения, так и объема их применения. Остановимся
вкратце на возможностях и эффективности каждого из этих методов, а также на
показаниях к их использованию.
Внутриматочная инсеминация (ИСМ) производится в тех случаях, конгда женщина
полностью здорова и трубы проходимы, а у мужа имеется сниженние
оплодотворяющей способности спермы, однако показатели ее таковы, что после
некоторых манипуляций она становится достаточной, чтобы оплодотвонрить
яйцеклетку после введения непосредственно в матку.
Кроме того, попытка ИСМ производится и при нормальных показателях спермы,
если установлена несовместимость супружеской пары, связанная с отрицательным
действием на сперматозоиды шеечной слизи. При этом денлается расчет на то,
что при ИСМ обходится "убийственный" для спермы фактор - шеечная слизь, так
как сперматозоиды вводят прямо в полость матки.
В тех случаях, когда сперма мужа совсем плоха или барьер несовместинмости
одолеть не удается, с согласия обоих супругов прибегают к оплодонтворению
спермой донора - ИСД. Техника ИСМ и ИСД одинакова.
В благоприятный для беременности день цикла, устанавливаемый по данным УЗИ,
РТ, характеру шеечной слизи, в матку женщины вводят предванрительно
обработанную сперму. Иногда попытку производят 2 - 3 раза в тенчение цикла.
Эффективность этой процедуры достаточно велика: при ИСМ она достигает 20 -
40%, при ИСД: 50 - 80% (максимальное число циклов, в которых целесообразно
предпринимать попытки, - 4).
Другой разновидностью искусственного оплодотворения является ГИФТ - перенос
яйцеклеток вместе со сперматозоидами в маточные трубы.
Суть его в следующем: у женщины берут одну или несколько яйцекленток, у мужа
сперму, смешивают их и вводят в маточную трубу. Условием успеха этой
процедуры является своевременность ее проведения, проходинмость и
полноценность маточных труб. То есть показания те же, что и при мужском
бесплодии или несовместимости супругов. Иногда прибегают к друнгому варианту
искусственного оплодотворения - переносу эмбриона (зигонты) в маточную трубу,
так называемую ЗИФТ. Считается, что при ЗИФТе вероятность наступления
беременности существенно выше. ГИФТ и ЗИФТ могут быть выполнены как во время
лапароскопии, так и под ультразвуковым контролем. В первом случае гаметы или
зиготы вводят в трубу со стороны брюшной полости, во втором - через шейку
матки. Как правило, ГИФТ и ЗИФТ совмещают с диагностической лапароскопией у
женщин с неясной формой бесплодия и проводят однократно.
Врачи, практикующие эти виды лечения бесплодия, отмечают их высонкую
эффективность - до 30%. Однако в нашей стране ГИФТ и ЗИФТ практиченски не
применяются.
Абсолютное женское бесплодие - отсутствие или стойкая непроходинмость
маточных труб являются показанием к экстракорпоральному оплодонтворению с
последующим переносом эмбрионов в матку матери (ЭКО).
                    ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОЕ ОПЛОДОТВОРЕНИЕ.                    
                          ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ.                          
ЭКО - истинная сенсация XX века в социальном, биологическом, религиозном и
моральном плане. Успешно начатая программа до настоящего времени активнно
обсуждается с различных позиции. Большинство ученных рассматривают ее как
блестящую возможность изунчения процесса оплодотворения у человека с помощью
современных методов исследования для создания фунданментальной теории этого
удивительного и неожиданно широко распространившегося клинического
экспенримента.
Исторически новое направление в лечении бесплондия Ц экстракорпоральное
оплодотворение яйцеклетнки (ЭКО) возникло в 1978 г. в Англии. Вначале метод ЭКО
и ПЭ применялся преимущественно в случаях бесплодия, обусловленного
непроходимостью или отнсутствием у женщин маточных труб. В таких случаях метод
предусматривает получение яйцеклеток из яичнника женщины, оплодотворение их in
vitro и перенос эмбриона в полость матки после нескольких его дробнлений in
vitro. Метод был разработан Р. Эдвардсом и П. Стептоу (Англия) и назван In
vitro fertilization and embryo transfer (IVF&ET). В русскоязычном варианте
название метода звучит следующим образом: экстранкорпоральное оплодотворение и
перенос эмбрионов в полость матки (ЭКО и ПЭ). В России этот метод впернвые был
внедрен в 1985 г. в НИИ акушерства и гиненкологии МЗ СССР под руководством Б.
В. Леонова и В. И. Кулакова. Рождение первого ребенка произошло в 1986 г. в
Центре охраны здоровья матери и ребенка МЗ СССР.
Программа ЭКО, конечно, имеет    длительную предысторию. Немецкий ученый К.
Semn (1982) считает началом этой программы открытие Г. Фолом в 1877 г.
феномена пенетрации мужской гаметы и яйцеклетку с последующим
оплодотворением. Однако вряд ли подобнное открытие было бы возможно, если бы
три столетия раньше Левенгук не открыл существования живых кленток. Вместе с
тем открытие Г. Фола стимулировало первую попытку экстракорпорального
оплодотворения яйнцеклеток крольчих и морских свинок S. L. Schenk (1878).
Попытки экстракорпорального оплодотворения яйцеклетнки человека начались с
1944 г.
J. Rock, M. Melkin культивировали ооцит человека и произвели ЭКО, приведшее к
развинтию двухклеточного эмбриона. В наше время этот метод получил настолько
широкое распространение, что давно уже перестанли подсчитывать число детей,
родившихся после ЭКО. Бурнный прогресс метода обусловлен успехами
фармакологии и эхоскопии, биохимии. Синтезированы агонисты рилизинг гормонов
в 50-100 раз более активные, чем эндогенные люлиберины, получены
высокоочищенные гонадотропные препараты, в том числе и обладающие
изолированным ФСГ действием. Это позволило стимулировать в яичнике
суперновуляцию Ц развитие сразу нескольких фолликулов, содернжащих
яйцеклетку. Внедрены в практику эхоскопические приборы с высокой разрешающей
способностью и оснащеннные влагалищными датчиками и инструменты для забора
яйцеклетки через свод влагалища под ультразвуковым коннтролем. Все это
облегчило проведение метода и привело к его распространению. Во многих
странах Европы и Америки ЭКО относят к рутинным методам лечения бесплодия.
Бурное обсуждение моральных, этических и юридических аснпектов ЭКО отошло в
прошлое. Допустимо и практикуется оплодотворение спермой донора, имплантация
лчужого эмнбриона, расширены возрастные границы ЭКО. Опубликованны случаи
рождения детей после ЭКО у женщин в возрасте старше 50 лет.
ЭКО и ПЭ достаточно сложны и требуют дорогостоящих оборудования, реактивов,
препаратов и, главное, - специнальных знаний. Все это привело к тому, что ЭКО
и ТЭ являются обособленной областью гинекологической практинки и выполняются
только специалистами.  Для практического гинеколога необходимы знания:
Х о показаниях к ЭКО,
Х о методах стимуляции суперовуляции,
Х о лечении возможных ее осложнений.
     
Рис.1. Схема лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения: 1
- яичник со множеством фолликулов - результат воздействия препаратов; 2 -
пункция яичников, получение яйцеклеток (в строго определенный момент); 3 -
соединение яйценклеток со специально подготовленными сперматозоидами; 4 -
культивирование в спенциальных условиях в течение 24 - 62 ч; 5 -
образовавшийся 4-клеточный эмбрион; 6 - перенос эмбрионов в полость матки.
Как видно из рис.1   метод состоит из следующих этапов:
1.      Уточнение характера и причин бесплодия;
2.      Назначение препаратов, стимулирующих рост нескольких фолликунлов -
индукция суперовуляции;
3.      Оценка ответа яичников на применение указанных препаратов при помощи
серии ультразвуковых и гормональных исследований - горнмональный и
ультразвуковой мониторинг.
4.      Определение момента, когда следует произвести пункцию фолликунлов
(как можно ближе ко времени естественной овуляции), что деланется при помощи
ультразвуковых исследований и определения коннцентрации гормонов в сыворотке
крови или моче;
5.      Пункция фолликулов, аспирация (отсасывание) их содержимого,
изнвлечение из него яйцеклеток, помещение их в специальную питантельную среду
и условия;
6.      Получение и подготовка сперматозоидов;
7.      Соединение яйцеклеток и сперматозоидов (инсеминация яйцеклеток) в
"пробирке" и помещение их в инкубатор на 24 - 42 часа;
8.      Перенос эмбрионов в матку матери;
9.      Назначение препаратов, поддерживающих имплантацию и развитие эмбрионов;
10.  Диагностика беременности;
11.  Ведение беременности и родов.
Таким образом, ЭКО представляет собой сложный многоступенчатый процесс. Он
требует назначения различных препаратов и многократной оценки состояния
женщины в течение цикла, в котором производится попытка ЭКО.
Успех ЭКО зависит от многих обстоятельств: реакции яичников женщинны на
примененные препараты - чем больше получено яйцеклеток, тем выше шанс
беременности; своевременности получения зрелых, способных к оплондотворению
яйцеклеток: техники выполнения пункции и переноса эмбрионнов; качества
спермы; условий культивирования гамет и эмбрионов и многих других факторов,
включая психологический настрой бесплодной супружеской пары.
     
ПОКАЗАНИЯ К ЭКО
Важный научно-практичесикий аспект программы ЭКО и ПЭ представляет изучение
патогенеза бесплодия.
Абсолютными показаниями являются трубное беснплодие вследствие непроходимости
или отсутствия маточнных труб. Относительные показания:
з         предшествовавшие оперативные вмешательства (пластинческие операции)
на маточных трубах у женщины в возрасте старше 30 лет, если после операции
прошло более года;
з         некоторые формы эндометриоза;
з         бесплодие неясного генеза;
з         иммунологическое бесплодие при постоянно высоком уровне
антиспермальных антител.
Существуют генетические критерии отбора для ЭКО. Ментод не рекомендуется при
гипоспадии, врожденных пороках сердца, шизофрении, аффективном психозе, при
наличии в семье детей с аутосомно-рецессивными заболеваниями, риск повторного
наследования которых достигает 25 %. Противонпоказаниями являются доминантно
наследуемые болезни.
Большое внимание уделяется дальнейшему изучению патогенеза, профилактике и
лечению синдрома гиперстимуляции яичников (СГЯ), представляющего собой
серьезное осложнение, возникающее при проведении стимуляции суперовуляции.
Важное значение в реализации программы ЭКО и ПЭ имеют исследования роли
эндокринных нарушений, их профилактика и коррекция.
В предварительном обследовании потенциальных пациентов программы ЭКО и ПЭ
необходимо уделять большое внимание исследованию содержимого цервикального
канала у женщины в целях диагностики инфекций, относящихнся к так называемой
группе TORCH-комплекса (трихомонады, краснуха, хламидии и др.). Должна
осуществнляться не только их диагностика, но и лечение. Лишь пациенты,
прошедшие соответствующую коррекцию, могут быть включены в программу ЭКО и
ПЭ.
Необходима также тщательная кольпоскопия для исключения новообразований шейки
матки.
За 2 Ц 3 мес. до ЭКО и ТЭ следует произвести тщательное обследование спермы,
бактериологическое исследование и посев.
Бесплодие у мужчин связано, как правило, с переннесенными ими
неспецифическими инфекционными заболеваниями (краснуха, корь), а также с
неправильнным лечением ряда заболеваний, передаваемых полонвым путем, а также
венерических (например, гононрея). Причиной бесплодия может быть крипторхизм.
Ряд вредных действий внешней среды, как бытового, так и промышленного
происхождения, может являтьнся причиной нарушения сперматогенеза.
                        ЭМБРИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ                         
                            ПРОГРАММЫ ЭКО И ПЭ                            
Эмбриологический этап программы ЭКО и ПЭ является одним из важнейших,
поскольку оценка качества ооцитов, их оплодотворение и кульнтивирование in
vitro до стадии преимплантационных эмбрионов во многом определяют ее успех.
Ключевым моментом этого этапа программы являетнся подбор адекватных
культуральных сред и условий культивирования, приближающихся к естественной
среде для преимплантационного развития.
                           КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СРЕДЫ                           
Культуральная среда для ЭКО должна быть макнсимально приближена по всем
параметрам к естестнвенным жидкостям, в которых ооциты и эмбрионы человека
находятся in vivo, т. е. маточных труб и матнки. После овуляции яйцеклетка
попадает в маточную трубу (ампулярный отдел), где и происходит
оплодонтворение. Затем зигота и впоследствии эмбрион перендвигается по трубе
в течение 4 - 5 дней, попадая в понлость матки на стадии морулы.
Практика показала, что многие среды, различаюнщиеся по составу, могут успешно
имитировать естенственную среду для ооцитов и эмбрионов человека. Однако
существует несколько основных харакнтеристик, которым должны отвечать
культуральные среды.
                                Уровень рН                                
Уровень рН среды обычно должен равняться 7,4, что соответствует рН крови.
Экспериментально было понказано, что такая кислотность оптимальна для
оплондотворения и преимплантационного развития эмбрионнов человека. В качестве
буферной системы обычнно используется бикарбонатный буфер в присутствии 5% CO
2 в атмосфере. Этот буфер был выбран главным образом потому, что он
соответствует физиологиченской буферной системе крови, а парциальное давление
CO2 в легких составляет 40 мм рт. ст., что соответствует 5%.
Для индикации уровня рН во многих средах иснпользуется цветной индикатор Ц
феноловый краснный, меняющий окраску с фиолетовой (через красную и оранжевую)
на желтую при закислении среды Ц изнменении рН с 8,0 до 6,5. При рН 7,4 среда
с таким индикатором приобретает характерный красно-ораннжевый цвет.
     
Осмолярность
Важной характеристикой среды является ее осмолярность, определяемая
концентрацией и константами диссоциации ее компонентов. Обычно осмолярность
равняется 285 мОсм/кг воды и соответствует таковой крови. Ооциты и эмбрионы
млекопитающих обычно культивируются в открытых системах с максимально
достижимой влажностью (80 - 90% в зависимости от модели CO2
-инкубатора), что предотвращает сильные колебания осмолярности в процессе
культивирования.
     
Качество воды
Основой любой культуральной среды является вода, качество которой во многом
определяет успех культинвирования. Для питательных сред используется вода,
полученная после двойной дистилляции, ультрафильнтрации либо деионизации. При
этом необходимо сонблюдение полной стерильности в процессе ее приготовнления
и хранения. Эндотоксины, выделяемые бактеринями, оставшимися в среде после ее
ультрафильтрации, могут оказать токсическое воздействие на эмбрионы.To же
может произойти и при попадании бактенрий в среду в процессе хранения.
     
Ионный состав
Ионный состав культуральных сред может сильно варьировать. Первые среды для
культивирования ооцитов и эмбрионов млекопитающих представляли сонбой
модификацию раствора Кребса. Они содержали ионы, необходимые для поддержания
жизни клеток Ц Na+, К+, Са2+, Mg2+,  
и , растворенные в
бикарбонатном буфере (НCO3). Также добавлялись антибионтики для
предотвращения бактериального заражения и источник белка в форме альбумина или
сыворотки. Наиболее часто в качестве источника белка используетнся бычий или
человеческий сывороточный альбумин, а также инактивированная человеческая
сыворотка. Примерами таких сред могут служить Ml6, Т6, HTF (человеческая
трубная жидкость), EBSS (сбалансированный солевой раствор Эрла) и др. Более
сложные по составу среды, такие, как Ham's F10 и F12, aМЕМ, М199, хотя и были
разработаны для тканевых культур, но могут использоваться и для культивирования
эмбнрионов различных видов млекопитающих.
Энергетическими субстратами для ооцитов и эмбнрионов млекопитающих в
культуральной среде обычнно служат пируват, лактат и глюкоза, причем
усвоенние глюкозы эмбрионы человека начинают лишь до прошествии нескольких
клеточных делений, а до этонго предпочтительным источником энергии служит
пинруват.
Добавление аминокислот во многие культуральные среды объясняется их
присутствием в жидкости яйценводов многих видов млекопитающих. Было показано,
что добавление глутамина в культуральную среду оканзывает положительное
влияние на развитие эмбрионнов многих видов млекопитающих. Однако при
введеннии в среду аминокислот надо иметь в виду, что не все они остаются
стабильны в условиях культивированния Ц при температуре 37С многие из них
разрушанются, образуя аммоний, который при накоплении в среде обладает
токсическим эффектом.
Специально для культивирования эмбрионов Menezo с соавт. была разработана
среда В2, гораздо более сложная по составу: помимо солей, она содержит
аминнокислоты, витамины, нуклеотиды, микроэлементы и - в ряде случаев Ц даже
жирные кислоты. Все эти среды применяются в практике ЭКО в разнличных
лабораториях. При том, что роль многих комнпонентов сложных сред до сих пор
не была убедительно показана, их применение дает хорошие результаты.
                         CO2-ИНКУБАТОР                         
Культивирование ооцитов и эмбрионов человека проводится в присутствии 5% CO
3 в воздухе при темнпературе 37
0,1