Исследование процесса физиологической адаптации бактерий к тяжёлой воде
Статья - Иностранные языки
Другие статьи по предмету Иностранные языки
ля фирмы Merck (Германия) в системах растворителей: изопропанол-аммиак, (7:3) (A) для аминокислот и н-бутанол-уксусная кислота-вода, (2:1:1), (Б) для инозина.
Определение содержания глюкозы в культуральной жидкости проводили глюкозооксидазным методом [24].
Секретируемые фенилаланин и инозин определяли на приборе Beckman DU-6 (США). Фенилаланин определяли при 540 нм в образцах культуральной жидкости, объёмом 10 мкл после обработки препаратов культуральной жидкости нингидрином, инозин - при 249 нм в образцах культуральной жидкости, объёмом 20 мкл.
Аминокислотный анализ гидролизатов суммарных белков биомассы проводили на приборе Biotronic LC 5001 (ФРГ); 230 x 3,2 мм; рабочее давление 50-60 атм; скорость подачи натрийцитратного буфера 18.5; нингидрина 9.25 мл/ч; детекция при 570 нм и 440 нм (для пролина).
Анализ углеводов осуществляли на жидкостном хроматографе Knauer (ФРГ), снабженным насосом Gilson (ФРГ) и рефрактометром Waters К 401 (ФРГ); неподвижная фаза: Separon NH2, 10 мкм; 10 x 250 мм; подвижная фаза: ацетонитрил-вода, (75:25); скорость подачи: 0.6 мл/мин.
Липиды анализировали на хроматографе Beckman Gold System (США), снабжённым насосом Model 166 (США) и детектором Model 126 (США); неподвижная фаза: Ultrasphere ODS 5 мкм; 4.6 x 250 мм; подвижная фаза: линейный градиент 5 мМ KH2PO4-ацетонитрил; 100% в течении 50 мин; скорость подачи: 0.5 мл/мин; детекция при 210 нм.
Уровни включения дейтерия в аминокислоты белковых гидролизатов определяли методом масс-спектрометрии электронного удара в виде метиловых эфиров N-диметиламинонафталин-5-сульфонильных (дансильных) производных аминокислот на приборе MB-80A (Hitachi, Япония) при ионизирующем напряжении 70 эВ.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Адаптация облигатных метилотрофных бактерий M. flagellatum.
Для проведения адаптации к тяжёлой воде были использованы представители двух различных таксономических групп метилотрофных бактерий, взятых из коллекции ГОСНИИ Генетики: лейцинпродуцирующий штамм облигатных метилотрофных бактерий Methylobacilus flagellatum, ассимилирующий метанол по 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолазному варианту рибулозо-5-монофосфатного (РМФ) цикла фиксации углерода [25] и фенилаланинпродуцирующий штамм факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum, ассимилирующий метанол по РМФ-циклу фиксации углерода [26]. Для культивирования и адаптации данных штаммов метилотрофных бактерий использовали минимальные среды М9, содержащие в качестве источников дейтерия 2H2O и [U-2H]метанол. В зависимости от физиологической потребности того или иного штамма бактерий в углеродном субстрате использовали 0.5-2% концентрации метанола в ростовых средах. Для компенсации ауксотрофности по лейцину и изолейцину эти аминокислоты добавляли в ростовые среды в протонированном виде в концентрациях 10 мг/л. В обычных условиях культивирования на протонированных средах уровни накопления фенилаланина и лейцина в культуральных жидкостях штаммов-продуцентов достигали величины 0.8 и 1.0 г/л соответственно.
Табл. 1
Влияние изотопного состава среды на рост штамма M. flagellaum
Номер Компоненты среды, % Величина Выход Время
опыта лаг-фазы биомассы генер.
Н2О 2H2О метанол [U-2Н]метанол часы % от конт- часы
роля 199.001.0001001.1299.000.50.50.291.00.8399.0001.00.881.01.0449.549.51.002.476.01.4549.549.50.50.55.775.01.2649.549.501.06.770.01.3724.574.51.005.629.01.4
Для проведения адаптации был выбран ступенчатый режим увеличения концентрации 2H2О в ростовых средах в присутствии 0.5-1% метанола/[U-2H]метанола , так как мы предположили, что постепенное привыкание организма к дейтерию будет оказывать благоприятный эффект на параметры роста и общее самочувствие культуры (табл. 1). При этом штамм M. flagellatum обнаружил повышенную чувствительность к 2H2O: ингибирование скорости роста бактерий наблюдалось при концентрации 2H2О в среде 74.5%, в то время как [U-2H]метанол не оказывал существенного влияния на скорость роста культуры. Так, на среде, содержащей 74.5% 2H2О выход микробной биомассы составил 29%, что в 3.4 раза ниже, чем в контрольных экспериментах, когда использовали обычную воду и метанол (табл. 1, опыт 1), в то время как выход микробной биомассы на водной среде с 1% [U-2H]метанолом был снижен всего лишь в 1.2 раза. В связи с тем, что роста бактерий на более высокой концентрации 2H2O достичь не удалось в дальнейших экспериментах использовали биомассу M. flagellatum, полученную со среды, содержащей 74.5% 2H2О.
Адаптация факультативных метилотрофных бактерий B. methylicum.
Попытки адаптировать штамм B. methylicum к росту на максимально дейтерированной среде при сохранении способности к биосинтезу фенилаланина привели к положительному результату. К данному штамму метилотрофных бактерий был применён специальный подход по адаптации, который заключался в серии из нескольких адаптационных пассажей исходной культуры на твёрдых агаризованных средах с 2% [U-2H]метанолом при ступенчатом увеличении концентрации тяжёлой воды в них (от 0 до 98% 2H2О), как показано в табл. 2. При этом последовательно отбирали отдельные колонии, выросшие на средах, содержащих дейтерий. Затем их пересевали на среды с большей степенью дейтерированности, включая среду с 98% 2H2О (степень выживаемости бактерий на конечной максимально дейтерированной среде составила не более 50%). За ходом адаптации следили по изменениям продолж