Инфракрасная спектроскопия и спектроскопия кругового дихроизма. Методы определения вторичной структуры белков
Методическое пособие - Физика
Другие методички по предмету Физика
Однако, эксперименты показывают, что наилучшее воспроизведение формы спектра не всегда дает лучшие результаты. Более того, метод наименьших квадратов оказывается неустойчивым к экспериментальной ошибке, если число используемых в разложении базисных спектров превышает информационное содержание анализируемого спектра (для спектров в диапазоне 178-260 нм оно приблизительно равно пяти, а в диапазоне 190-260 нм - четырем).
Метод "регуляризации" [4] решает эту проблему с помощью "регуляризатора", который стабилизирует систему, оставляя ей при этом значительную гибкость. Метод "ортогональных спектров" [5,6] достигает устойчивости метода наименьших квадратов за счет использования только пяти ортогональных базисных спектров, построенных на основе исходного набора спектров базисных белков. Однако, поскольку базисные спектры построены на основе фиксированного набора спектров базисных белков, степень участия последних при воспроизведении анализируемого спектра также оказывается в некоторой мере фиксированной, а гибкость метода - крайне низкой.
Метод "выбора переменных", суть которого будет описана ниже, основан на методе "ортогональных спектров", но обладает значительной гибкостью, достигаемой за счет использования при построении ортогональных базисных спектров различных наборов базисных белков, выбираемых с помощью статистической процедуры "выбора переменных". Рассмотрим смысл этой процедуры более подробно.
Предсказание вторичной структуры белка по его спектру КД должно удовлетворять двум важным условиям:
- Величины содержания в белке рассматриваемых структурных элементов не должны быть отрицательными:
.
- Суммарное содержание в белке всех рассматриваемых типов структур должно быть равно единице (100%):
.
Второе условие является особенно важным при анализе конформационных изменений белка при денатурации или связывании каких-либо лигандов. Во всех методах, описанных выше, оба эти условия вводятся непосредственно в процедуру нахождения коэффициентов
с помощью метода наименьших квадратов. Однако такое ограничение на коэффициенты может весьма заметным образом исказить результаты этой процедуры.
Для преодоления подобных недостатков авторы рассматриваемого метода не пользуются условиями (1) и (2) и допускают существование отрицательных коэффициентов и отклонение их суммы от единицы. Появление подобных несоответствий свидетельствует о неуспехе метода и может быть объяснено наличием у некоторых базисных белков таких структурных форм, вкладов которых в спектр исследуемого белка не было обнаружено. Для избежания подобных ситуаций вводится процедура "выбора переменных", которая поочередно исключает белки из исходного базисного набора, а затем проводит вычисления с каждой из полученных комбинаций базисных белков, используя метод "ортогональных спектров". Эксперименты показали, что достоверность результатов значительно повышается по мере того, как сумма коэффициентов приближается к единице. Повышение точности анализа было достигнуто даже при анализе спектров в укороченном диапазоне (190-260 нм).
Поскольку заранее не известно, какие из базисных белков содержат элементы, отсутствующие у исследуемого белка, и спектры которых необходимо исключить из исходного набора для улучшения результатов, рассматриваются все возможные комбинации из исходного набора 16 базисных спектров. Эта процедура выполняется в следующем порядке. Сначала из исходного набора исключаются поочередно по три базисных спектра на каждом шаге, а ортогональные базисные спектры строятся на основе оставшихся 13 исходных базисных спектров. Сравнение результатов, полученных для различных наборов из 13 базисных белков, выявляет один или два белка, которые являлись причиной отклонений коэффициентов и их суммы от условий (1) и (2). Эти белки исключаются из исходного набора, и процедура повторяется до тех пор, пока не будут получены удовлетворительные результаты.
Критериями удовлетворительного решения, соответствующего оптимальному набору базисных спектров, являются следующие условия:
- Сумма коэффициентов
должна находиться в диапазоне от 0.96 до 1.05 (или, по крайней мере, от 0.90 до 1.10).
- Значение содержания произвольной структурной формы в исследуемом белке (
) должно быть выше - 0,05.
- Воспроизведение анализируемого спектра на основе выбранного набора базисных спектров должно быть лучше, чем при использовании полного их набора.
- Более предпочтительным является набор, содержащий большее число базисных спектров.
- Более предпочтительными являются те белки, спектры которых ближе к анализируемому спектру. На практике в большинстве случаев удовлетворительных результатов удается достичь при исключении из исходного набора всего трех или четырех белков, причем среднеквадратичная ошибка при воспроизведении анализируемого спектра составляет меньше 0.2 единицы . Если несколько наборов базисных белков оказываются удовлетворительными в одинаковой степени, то результаты, полученные на их основе, усредняются.
В заключение можно отметить, что метод "выбора переменных" является мощным средством анализа спектров КД белков в ситуациях, когда другие распространеннные методы дают заведомо неверные результаты.
Сравнение различных методов анализа спектров КД.Поскольку все методы анализа спектров КД имеют чисто эмпирический характер, каждый из них нуждается в экспериме?/p>