Иммунологические методы, основанные на взаимодействии антиген–антитело
Курсовой проект - Разное
Другие курсовые по предмету Разное
шприц.
Нагревают 1,5 г агара до полного расплавления в 100 мл веронал-ацетатного буфера на водяной бане и, охладив до 48С, смешивают в нужной пропорции с антисывороткой, подогретой до той же температуры. Смесь разливают по 2 мл на предметные стекла, расположенные строго горизонтально. Золь должен равномерно распределиться по поверхности стекла. Чтобы усилить сцепление геля со стеклом, рекомендуется предварительно покрыть стекло тонкой агаровой пленкой.
В пластинке геля вырезают лунки, рассчитанные на 2 мкл антигенного раствора каждая. После внесения антигена пластинки геля помещают во влажную камеру и проводят иммунодиффузию при комнатной температуре. Кольца преципитации можно измерять прямо на влажной пластинке. Если преципитаты видны недостаточно четко, то сначала элюируют непреципитировавшие белки в двух сменах 0,15 М раствора NaCl по 12 ч, затем гель высушивают и окрашивают красителями, например амидо-черным, и высушивают вновь.
Площадь, занимаемая преципитатом к концу диффузии, прямо пропорциональна исходной концентрации антигена в лунке. Для построения калибровочной кривой берут либо площадь преципитата как функцию концентрации антигена, либо логарифм диаметра преципитата как функцию логарифма концентрации антигена:
S=K*QAГ+S0,
где S площадь преципитата, включая S0, S0 площадь стартовой лунки и QAГ -- количество антигена.
Наклон К полученной прямой обратно пропорционален концентрации антител в геле. Уменьшив содержание антисыворотки в агаре, можно увеличить К. В результате возрастет диаметр преципитата, что повысит чувствительность и экономность метода. Оптимальная концентрация антисыворотки в геле зависит прежде всего от титра антител.
Результаты иммунодиффузии существенно не зависят от температуры. Опыт может быть поставлен при 4, 20 или 37С. Следует избегать только резких (более 5) колебаний температуры.
Необходимая продолжительность иммунодиффузии зависит от природы изучаемого антигена. Первый ориентировочный замер преципитатов можно сделать уже через 24 ч.
3.3. Оценка метода
В пределах своей чувствительности радиальная иммунодиффузия пригодна для количественного определения любого антигена, если имеются соответствующие моноспецифические антисыворотки и чистые или стандартные антигены, чтобы построить калибровочную кривую для данной системы.
При помощи этого метода чаще определяют белковые антигены, например белки сыворотки крови, цереброспинальной жидкости, секретов желез. Радиальная иммунодиффузия пригодна также для сравнительного качественного и количественного анализа иммунохимически близких белков.
4. Нефелометрия
4.1. Принцип метода
Раствор антигена смешивают с соответствующей моноспецифической антисывороткой и смесь инкубируют. При этом образуются иммунные агрегаты, способные рассеивать проходящий свет. Интенсивность рассеивания или поглощения проходящего света прямо пропорциональна количеству комплексов антиген-антитело, и ее можно измерять фотометрически.
Если объемы реагентов, разведение антисыворотки, время и температура инкубации постоянны и единственной переменной величиной является концентрация антигена, то последнюю можно определить по кривой экстинкции. Чтобы построить такую кривую, с антисывороткой инкубируют растворы антигена возрастающей концентрации. Сначала с увеличением концентрации антигена кривая экстинкции идет вверх, затем, после некоторого максимума, снижается. При постоянном количестве антител подъем концентрации антигена увеличивает не только количество, но и величину иммунных агрегатов. При оптимальном соотношении антигена и антител количество и размер иммунных агрегатов достигает максимума. Область оптимальных соотношений называют зоной эквивалентности. Дальнейший подъем концентрации антигена ведет к уменьшению агрегатов.
4.2. Проведение исследования
Реагенты и приборы
Забуференный фосфатами раствор NaCl. 11,9 г Na2HPO42H2O растворяют в 1000 мл 0,15 М раствора NaCl; 9,1 г KH2PO4 растворяют в 1000 мл 0,15 М раствора NaCl. Получается буфер с pH 7,5.
Моноспецифические антисыворотки.
Стандартные растворы. Используются стандартные сыворотки с известным содержанием белков или стандартные растворы, приготовленные из чистых белков.
Рабочий стандарт, если требуется определить содержание различных белков в сыворотке или сывороточных белков в других жидкостях организма.
Стандартные растворы, исследуемые образцы и антисыворотки разводят забуференным раствором NaCl с pH 7,5. Определение антигенов производят с кроличьими антисыворотками в разведении 1:5-1:20. Для построения кривой экстинкции сначала готовят серию разведений антигена от 0,5 до 10 мг на 100 мл. К последним разведениям стандартной сыворотки или раствора чистого белка прибавляют равный объем разбавленной антисыворотки, перемешивают и оставляют при комнатной температуре (20С) на 2 ч. После этого определяют экстинкцию растворов в проходящем свете при 450 нм в микрокювете с толщиной слоя 1 см против холостой пробы (буфер + антисыворотка). С исследуемым образцом поступают так же, как со стандартными растворами. Определяют его экстинкцию и по восходящей части кривой устанавливают концентрацию антигена. Если приходится исследовать мутные или окрашенные растворы антигенов, следует предварительно измерить их собственную экстинкцию, чтобы учесть ее при оценке результатов. Затем с учетом разведения исходного ?/p>