Химия наследственности. Нуклеиновые кислоты. ДНК. РНК. Репликация ДНК и передача наследственной информации
Информация - Химия
Другие материалы по предмету Химия
му же времени были разработаны методы выделения и очистки ДНК и РНК, так что исследование природы межмономерных связей проводилось с использованием чистых, хотя и сильно деградированных препаратов НК.
Первые сведения о типе межмономерной, или, как ее принято называть, межнуклеотидной связи были получены с помощью потенциометрического титрования. Эти сведения свидетельствовали о наличие как в РНК, так и в ДНК только одной гидроксильной группы у каждой фосфатной группы. На основании этого было сделано заключение, что НК содержит структурную единицу дизамещенной фосфорной кислоты.
Естественно было предположить, что фосфатные остатки сшивают нуклеозиды за iет двух своих гидроксилов, а один остается свободным. Оставалось выяснить, какие части нуклеозидных фрагментов участвуют в образовании связи с фосфатными группами.
Поскольку НК могут быть дезаминированы действием азотистой кислоты, очевидно, что аминогруппы пиримидиновых и пуриновых оснований не принимают участия в образовании межнуклеотидной связи. Помимо этого потенциометрическое титрование указывало, что и оксо(окси)-группы остатков гуанина и урацила, входящих в состав НК, свободны. На основании этих данных было сделано заключение о том, что межнуклеотидные связи образованы фосфатной группой и гидроксильными группами углеводных остатков (т. е. что они являются фосфодиэфирными), которые, следовательно, и являются ответственными за образование полимерной цепи (НК). Таким образом, то, что принято обычно называть межнуклеотидной связью, представляет собой по существу узел, включающий систему связей:
(где С первичный или вторичный атомы углерода остатка углевода). При гидролизе ДНК и РНК в зависимости от условий реакции, образуются нуклеотиды с разным положением фосфатного остатка:
Если предположить, что в НК все межнуклеотидные связи идентичны, то, очевидно, что они могут включать помимо фосфатного остатка только З-гидроксильную группу одного нуклеозидного звена и 5-гидроксильную группу другого нуклеозидного звена (3У-связь). В случае же их неравноценности в полимерной цепи ДНК могли бы одновременно существовать три типа связей: 35, 33 и 55. Для РНК за iет участия 2/-гидpoкcилыIoй группы число типов связи должно было быть еще больше.
Установить истинную природу межнуклеотидных связей в нативных ДНК и РНК удалось в результате направленного расщепления биополимеров с помощью химического и ферментативного гидролиза и последующего выделения и идентификации полученных при этом фрагментов.
6.1. Межнуклеотидная связь в ДНК
Химический гидролиз ДНК iелью установления природы межнуклеотидной связи оказался практически непригодным. ДНК не расщепляется при щелочных значениях рН, что хорошо согласуется с предположением о фосфодиэфирной природе межнуклеотидной связи. При обработке кислотой даже в мягких условиях ДНК расщепляется как по фосфодиэфирным, так и по N-гликозидным связям, образованным пуриновыми основаниями. Вследствие этого расщепление полимера протекает неоднозначно, но из продуктов кислотного гидролиза ДНК все же удалось выделить дифосфаты пиримидиновых дезоксинуклеозидов, которые оказались идентичными синтетическим 3,5-дифосфатам дезоксицитидина и дезокситимидина:
Здесь же важно отметить, что наличие этих соединений в продуктах деградации ДНК указывает на участие обеих гидроксильных групп, по крайней мере пиримидиновых мономерных компонентов, в образовании межнуклеотидной связи.
Более специфическим оказалось ферментативное расщепление ДНК. При обработке препаратов ДНК фосфодиэстеразой (ФДЭ) змеиного яда полимер практически полностью гидролизуется до дезоксинуклеозид-5-фосфатов, структура которых была установлена сравнением с соответствующими нуклеотидами, полученными встречным синтезом.
Эти данные свидетельствуют об участии 5-гидроксильных групп всех четырех дезоксинуклеозидов, входящих в состав ДНК, в образовании межнуклеотидной связи. Аналогично, но до 3-фосфатов дезоксинуклеозидов расщепляется ДНК в присутствии ФДЭ, выделенной из микрококков или из селезенки.
Из данных гидролиза ДНК фосфодиэстеразами различной специфичности становится очевидным, что связь нуклеозидных остатков в ДНК осуществляется фосфатной группой, которая одновременно этерифицирует гидроксильную группу у вторичного атома углерода (положение 3) одного нуклеозидного звена и гидроксильную группу у первичного атома углерода (положение 5) - другого нуклеотидного звена.
Таким образом, было убедительно доказано, что в ДНК межнуклеотидная связь осуществляется за iет фосфатной группы, а также 3- и 5-гидроксильных групп нуклеозидных остатков [(а) и (б) направления расщепления полинуклеотидной цепи ДНК фосфодиэстеразами соответственно змеиного яда и селезенки или микрококков]:
Предположение о возможности иного строения полимера с регулярно перемежающимися связями нуклеозидных остатков по типу 33 и 55 было отвергнуто, так как оно не удовлетворяло всем экспериментальным данным. Так, полимер такого типа не должен был бы полностью гидролизоваться (до мономеров) в присутствии ФДЭ змеиного яда, избирательно расщепляющей только алкиловые эфиры нуклеозид-5 фосфатов. То же можно сказать о ФДЭ селезенки, селективно гидролизирующей алкиловые эфиры нуклеозид-3-фосфатов.
6.2. Межнуклеотидная связь в РН