Болезнь Марека
Курсовой проект - Сельское хозяйство
Другие курсовые по предмету Сельское хозяйство
?е телец-включений.
Метод флуоресцирующих антител (РИФ)
В основе - взаимодействие специфических антител, меченных флуохромами с антигеном. Для мечения используются флуохромы, которые не изменяют основных свойств антител и их способности взаимодействовать с антигенами. Для постановки используются диагностические люминесцирующие сыворотки, содержащие меченные антитела.
Постановка реакции: 1) Прямой метод. На зафиксированный мазок наносят раствор флуохрома и окрашивают 25 минут при температуре 37 0 С во влажной камере (чашка Петри с фильтровальной бумагой, увлажнённой дистиллированной водой). Промывают водой, обрабатывают в фосфатно-буферном растворе для исключения неспецифического свечения.
) Непрямой метод. Ставится в 2 варианта: а) с использованием антивидовой люминесцирующей сыворотки. На первом этапе на зафиксированный мазок наносят иммунную нефлуоресцирующую сыворотку с антителами, специфичными к возбудителю. После контакта тщательно промывают препарат. На втором этапе наносят антивидовую люминесцирующую сыворотку со специфичными антителами к глобулинам первой сыворотки. Контакт. Тщательно промывают, высушивают, микроскопируют.
б) с использованием антикомплиментарной люминесцирующей сыворотки. На первом этапе на мазок наносят смесь комплимента и иммунной нефлуоресцирующей сыворотки, содержащей антитела, специфичные предполагаемому возбудителю. Контакт. Препарат промывают. На втором этапе наносят антикомплиментарную люминесцирующую сыворотку. Контакт, промывают, высушивают, микроскопируют.
Обнаружение телец-включений
По Романовскому-Гимзе азур-эозином. На приготовленный мазок наносят азур-эозин и окрашивают 10 минут. Тельца-включения при микроскопии будут фиолетового цвета, так как вирус болезни Марека ДНК-содержащий.
Применяют специальную окраску по Павловскому. Берут истечения из носовой полости, делают мазок, высушивают на воздухе, не фиксируют, на препарат наносят краску Павловского и окрашивают 10 минут, промывают водой, высушивают, микроскопируют. Цитоплазма эпителиальных клеток - бледно-розового цвета, ядро - фиолетового цвета. В ядре красного цвета тельца-включения.
6.2Вирусологические методы
Herpesvirus удаётся культивировать на однодневных цыплятах; на куриных эмбрионах; на хорионаллантоисной оболочке в виде плотных очагов; в клеточной культуре куриных эмбрионов с образованием микроскопических телец-включений.
Биопроба на цыплятах.
Биопробу на цыплятах проводят с целью определения патогенности возбудителя дифференциации заболевания от некоторых форм гиповитаминозов, лейкоза, а также при экспериментальном изучении болезни Марека.
Цыплят получают из хозяйств, благополучных по инфекционным болезням птиц, где не проводится вакцинация против болезни Марека.
Тридцать однодневных цыплят заражают двукратно с интервалом в 2 дня по 0,3-0,4 мл внутрибрюшинно. В контроле одновременно содержат в аналогичных условиях 10-15 незараженных цыплят такого же возраста.
За птицей ведут ежедневно наблюдение в течение 85-90 дней при диагностике острой, формы болезни Марека и до 120 дней - классической формы.
Оценку результатов биопробы проводят по комплексу признаков, учитывая клиническое проявление болезни у зараженных цыплят, наличие вирусспецифического антигена в эпителии перьевых фолликулов, специфических микроскопических изменений в тканях (через 3-8 недель), опухолевых поражений в органах и специфических изменений в нервах через 1-4 месяца.
Биопроба на куриных эмбрионах. Для заражения используют куриные эмбрионы из хозяйств, благополучных по инфекционным болезням птиц, где не проводят вакцинацию цыплят против болезни Марека.
В первом варианте заражают 11-12-дневные куриные эмбрионы в хориоаллантоисную оболочку. Эмбрионы, зараженные на хорионаллантоисную оболочку, инкубируют в течение 7-8 дней. Гибель их считают специфической через 72 ч после заражения. При положительной биопробе появляются пустулы и очаги пролиферации. Признаком инфицирования эмбрионов вирусом болезни Марека считают их гибель и образование на хорионаллантоисной оболочке серовато-белых пролиферативных очажков-бляшек размером до 3 мм в диаметре, увеличение селезенки и печени эмбриона. Для учета очажков-бляшек хорионаллантоисную оболочку помещают в чашку Петри, наполненную физиологическим раствором, несколько раз отмывают, расправляют и просматривают с помощью, лупы на титропляторе или под микроскопом.
Микро- и макроскопические бляшки и количество их на оболочке могут варьировать в зависимости от чувствительности куриных эмбрионов к вирусу болезни Марека и вирулентности штамма возбудителя.
Во втором варианте заражают 4-дневные эмбрионы в желточный мешок. В положительных случаях у 30% инфицированных эмбрионов через 12 - 14 дней на хорионаллантоисной оболочке развиваются пустулы. Гибель зародышей считается специфической с 8-9-го дня инкубации.
Выделение вируса на культуре клеток.
Для выделения вируса болезни Марека из патологического материала используют 24-48-часовую культуру первичнотрипсинизированных куриных фибробластов или 72-часовую культуру почек куриных эмбрионов или цыплят, которых готовят общепринятым методом и выращивают в стеклянных флаконах (матрасах) со смещенным горлом..
В качестве питательной среды для культивирования клеток используют гидролизат лактальбумина, среду Игла или Эрла, или среду № 199. В ростовую среду добавляют 10% сыворотки крупного рогат?/p>