Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии  

На правах рукописи

Яценко Екатерина Владимировна

ЗНАЧЕНИЕ РЕТИКУЛЯРНОГО ГИГАНТОКЛЕТОЧНОГО ЯДРА В ЦЕНТРАЛЬНЫХ МЕХАНИЗМАХ РЕГУЛЯЦИИ ДЫХАНИЯ

03.03.01 Ц физиология

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени

кандидата биологических наук

Ульяновск Ц 2012

Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Самарский государственный университет

Научный руководитель:  Заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор,

Меркулова Нина Андреевна

Официальные оппоненты:        доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой адаптивной физической культуры ФГБОУ ВПО Ульяновский государственный университет

Балыкин Михаил Васильевич

доктор биологических наук, профессор, декан естественно-географического факультета, заведующий кафедрой зоологии и анатомии, физиологии, безопасности жизнедеятельности человека ФГБОУ ВПО Поволжская государственная социально-гуманитарная академия
Попов Юрий Михайлович

Ведущая организация:  ФГБУН Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН

Защита состоится л2 ноября 2012 г. в  10 час. 00 мин. на заседании диссертационного совета Д 212.278.07 при ФГБОУ ВПО Ульяновский государственный университет по адресу: г. Ульяновск, ул. Набережная реки Свияги, д.106, корпус 1, ауд.703.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ульяновского государственного университета, а с авторефератом - на сайте ВУЗа и на сайте Высшей аттестационной комиссии при Министерстве образования и науки РФ

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 432017, г. Ульяновск, ул. Л. Толстого,
д. 42, Ульяновский государственный университет, управление научных исследований.

Автореферат разослан л___ октября 2012 года

Учёный секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук, доцент                                         С.В. Пантелеев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Благодаря исследованиям нескольких поколений отечественных и зарубежных физиологов в настоящее время общепринятым стало положение о том, что ведущая роль в регуляции дыхания принадлежит структурам бульбарного дыхательного центра (ДЦ). Однако, несмотря на это, в проблеме структурно-функциональной организации Д - имеется много дискуссионных вопросов, основным среди которых является вопрос - какие нейронные ядра входят в состав ДЦ? Обычно в состав Д - включают ядра содержащие нейроны, активность которых синхронна с фазами дыхательного цикла (Cергиевский и соавт, 1975; Bianchi et al., 1995;
Duffin, 2004; Сафонов, 2007; Onimaru et al., 2008 и др.).

В настоящее время подавляющее большинство авторов рассматривает Д - как совокупность дыхательных нейронов продолговатого мозга расположенных в пяти структурно-функциональных областях: дорзальная дыхательная группа, локализованная в вентролатеральной части n. tractus solitarius; вентральная дыхательная группа, ее каудальный отдел расположен в области n. retroambigualis, ростральный отдел в области n. ambiguous и n. retroambigualis; комплекс Бетцингера расположен в области n. retrofacialis; комплекс пре-Бетцингера располагается в ростральной части n. ambiguous, каудальнее n. retrofacialis и ростральнее n. lateralis reticularis (Richter at аl., 1983; Ballantyne at аl., 1984; Smith at аl., 1991; Сергиевский и соавт., 1993; Funk at аl., 1993; Schwarczacher at аl., 1995; Пятин и соавт., 1998; Михайлова, 2004; Бреслав, Ноздрачев, 2005; Инюшкин, 2006; Меркулова и соавт., 2007 Александрова и соавт., 2007; Миняев и соавт., 2007; Попов и соавт., 2007 и др). Однако нейроны, активность которых синхронна с фазами дыхания, выявлены и в других структурах головного мозга: ядро Келликера-Фузе, медиальное парабрахиальное ядро (Рitts, 1946; Темин, 1975; Ефимов и соавт., 1988; Rybak at аl., 1997; Сафонов, 2006; Onimaru at аl., 2009 и др.), ретикулярное гигантоклеточное ядро (ГКЯ) (Бродал, 1960; Киреева, 1981; Гордиевская, 1981; Якунин, 1987; Сергиевский и соавт., 1993; Dobbins et.al., 1994 и др.). Дискуссия о том рассматривать ли данные ядра частью ДЦ, или они только влияют на формирование паттерна и ритма дыхания в бульбарном Д - до настоящего времени не завершена.

Исследование механизмов нейрохимической организации Д - является одной из основных задач современной нейрофизиологии, анализ которой может иметь большое значение для поисков новых путей решения сложных и дискуссионных вопросов центрального механизма регуляции дыхания. Одним из таких является вопрос о роли ГКЯ в механизмах регуляции дыхания.

Характеризуя связи ГКЯ с областью продолговатого мозга, в особенности со структурами ДЦ, следует отметить, что ряд исследователей выявили обширные нервные проекции между ГКЯ и дыхательными ядрами: нейроны n. ambiguous, n. retroambigualis и n. tractus solitarius образуют прямые двусторонние моно-, олиго- и полисинаптические связи между собой и медиовентральной частью ГКЯ (Сергиевский и соавт., 1983; Samuel et al., 1986 и др.), кроме того, ГКЯ образует обширные связи с медиальной частью n. retrofacialis (Wang et al., 2002).

ГКЯ отличается многообразием нейротрансмиттеров. Его функции обеспечиваются многочисленными классическими нейромедиаторами и нейропептидами, а так же присутствующими здесь соответствующими рецепторами. Данные особенности обуславливают широкое участие ГКЯ в регуляции многих физиологических функций, в модуляции потоков информации, в регуляции функционального состояния ЦНС, в регуляции цикла сон-бодрствование (Holmesa et al., 1994), соматосенсорных и соматомоторных функций (Frank et al., 1983; Richard et al., 1990 и др.), оно оказывает влияние на дыхательные (Рitts, 1946; Christoрher et al., 1990; Kawahara et al., 1991; Martino et al., 2003 и др.) и сердечно-сосудистые переменные (Christoрher et al., 1989; Richard et al., 1990 и др.), вовлечено в механизмы обезболивания (Fletcher et al., 2006 и др.) и т.д.

Ряд исследователей, преимущественно в опытах на кошках, выявили наличие инспираторных мест (ИМ) и экспираторных мест (ЭМ) в ГКЯ (Рits et. al., 1939 и др.). Были выявлены так же инспираторные и экспираторные нейроны, преимущественно в медиовентральной части ГКЯ (Сергиевский и соавт., 1975; Чубаркин, 2006, 2007 и др.).

На основании данных о наличии в ГКЯ кошек респираторных мест, инспираторных и экспираторных нейронов, обильных связей данного ядра со структурами, традиционно относящимися к ДЦ, связями данного ядра с моторными ядрами дыхательных мышц и других данных, ряд исследователей высказали мнение, что ГКЯ является частью бульбарного Д - (Ройтбак 1959; Якунин, 1987; Сергиевский и соавт., 1993; Гордиевский, 2004 и др.). Однако как было отмечено выше, большинство современных исследователей данную точку зрения не поддерживают (Duffin, 2004; Onimaru et.al., 2008 и др.).

Дыхательные нейроны в ГКЯ были обнаружены и в экспериментах на крысах (Сергеев, 1982; Буданцев, 1983; Dobbins et.al., 1994). Однако авторы, объектом исследования которых были крысы, практически не рассматривали значение нейронов ГКЯ в формировании паттерна дыхания и ритмогенерирующей функции ДЦ, не выясняли нейрохимические аспекты регуляции дыхания ГКЯ.

Исходя из этого, сочли важным провести исследование значимости респираторных мест ГКЯ в центральных механизмах регуляции дыхания крыс. Решение поставленных вопросов возможно в какой-то степени внесет ясность в вопрос - есть ли основание рассматривать ГКЯ как шестой структурно-функциональный участок бульбарного Д - или респираторные места ГКЯ крыс только оказывают влияние на многообразные функции бульбарного ДЦ.

Цель исследования. Целью работы явилось изучение роли и значения ГКЯ в регуляции дыхания. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

0. 1. Проанализировать изменение показателей паттерна дыхания и
   биоэлектрической активности диафрагмы и наружных межреберных мышц (НММ) в условиях электростимуляции респираторных мест ГКЯ током различного напряжения и частоты.
1. 2. Проанализировать изменения паттерна дыхания и биоэлектрической активности инспираторных мышц в ответ на химическое разрушение нервных клеток респираторных мест ГКЯ с помощью микроинъекции L-глутамата.
2. 3. Выявить специфические особенности реакций паттерна дыхания
   и биоэлектрической активности инспираторных мышц на локальное введение в область ГКЯ донора оксида азота - нитропруссида натрия (НН) (10-4М).
3. 4. Выявить специфические особенности реакций паттерна дыхания
   и биоэлектрической активности инспираторных мышц на локальное введение в область ГКЯ гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК).
4. 5. Оценить роль и степень участия инспираторного и экспираторного мест ГКЯ в центральных механизмах регуляции дыхания.

Научная новизна работы. В настоящей работе экспериментально показано наличие инспираторного и экспираторного мест в ГКЯ крыс. Впервые проведено сравнительное исследование дыхательных эффектов, возникающих при локальной электростимуляции ИМ и ЭМ ГКЯ крыс широким диапазоном частот и напряжений стимулирующего тока. Выявлена зависимость респираторных эффектов от места воздействия и величины воздействующего стимула.

Экспериментально доказано участие оксида азота (NO) в регуляции дыхания на уровне ГКЯ. Установлены характер и зависимость изменений различных параметров паттерна дыхания и биоэлектрической активности НММ и диафрагмы от места микроинъекции НН и времени экспозиции вещества.

Экспериментально доказано участие ГАМК в регуляции дыхания на уровне ИМ и ЭМ ГКЯ.

Путем разрушения нервных клеток ИМ и ЭМ ГКЯ получены новые данные, характеризующие существенный вклад исследуемого ядра в регуляцию центральной респираторной активности.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные в исследовании результаты раскрывают принципиально новые стороны и механизмы участия ГКЯ в регуляции дыхания и являются важным вкладом в развитие представления о его роли в регуляции деятельности ДЦ. Выявленные в работе особенности влияния ГКЯ на паттерн дыхания и биоэлектрическую активность инспираторных мышц позволили установить многообразное участие данного ядра в формировании респираторного ритмогенеза и регуляции паттерна дыхания.

Полученные сведения о характере и особенностях реакций внешнего дыхания и биоэлектрической активности инспираторных мышц на микроинъекции различных биологически активных веществ в респираторно активные участки ГКЯ являются чрезвычайно важными для понимания механизмов регуляции дыхания на нейрохимическом уровне.

В работе получены данные, которые, в определенной степени, позволяют прогнозировать характер возможных изменений дыхания при нарушении функционирования ГКЯ, а так же могут быть полезны в поисках механизмов восстановления респираторного ритма при нарушениях дыхания центрального генеза.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В ГКЯ крыс присутствуют инспираторное и экспираторное места, кратковременная электростимуляция которых приводит к обрыву вдоха при воздействии на экспираторное место и выдоха в случае электростимуляции инспираторного места.
2. окальная электростимуляция током различных частот и напряжений инспираторного места ГКЯ оказывает стимулирующее действие на паттерн дыхания и активность инспираторных мышц. Стимуляция электрическим током экспираторного места ГКЯ производит противоположный эффект.
3. Воздействие токсических доз L-глутамата оказывает существенное влияние на дыхание вплоть до его остановки. Разрушение нейронов инспираторного места ГКЯ токсическими дозами глутамата, сопровождается торможением дыхания. Разрушение нейронов экспираторного места ГКЯ сопровождается противоположными реакциями внешнего дыхания и активности инспираторных мышц.
4. Оксид азота на уровне ГКЯ принимает участие в регуляции дыхания. Микроинъекции донора оксида азота, нитропруссида натрия в респираторные места ГКЯ, приводят к выраженным изменениям паттерна дыхания и активности инспираторных мышц. Характер эффектов в большей степени зависит от места воздействия и времени прошедшего после микроинъекции.
5. Микроинъекции ГАМК в инспираторное место ГКЯ сопровождаются угнетением дыхания. ГАМК на уровне экспираторного места действует на дыхание противоположным образом. Воздействие ГАМК на инспираторное и экспираторное места не сопровождается изменениями длительности дыхательного цикла и частоты дыхания.
6. Респираторные места ГКЯ одни из важнейших структур, участвующих в формировании ритма и паттерна дыхания, наряду с другими традиционно признанными структурно-функциональными участками ДЦ.

Апробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены на следующих научных конференциях: VI Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 50-летию открытия А. М. Уголевым мембранного пищеварения Механизмы функционирования висцеральных систем, (Санкт-Петербург, 2008 год); XI Всероссийской школе-семинаре с международным участием Экспериментальная и клиническая физиология дыхания, (Санкт-Петербург, 2010); XXXIV, XXXV и XXXVI научных конференциях молодых ученых и специалистов Самарского государственного университета (Самара, 2009, 2010, 2011); конференции молодых ученых Механизмы адаптации физиологических систем организма к факторам среды, посвященной 85-летию со дня основания Института физиологии им. И.П. Павлова РАН (Санкт-Петербург, 2010 год); XXI съезде физиологического общества имени И.П. Павлова (г. Калуга 2010); расширенном заседании кафедры физиологии человека и животных, Самарского государственного университета (Самара, 2012).

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 138 страницах машинописного текста, содержит 9 таблиц и 56 рисунков. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов, списка литературы (83 отечественных и 149 зарубежных источников).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Эксперименты производились на взрослых нелинейных крысах обоего пола массой 250 - 280 граммов. Животных наркотизировали уретаном (1,5 г/кг внутрибрюшинно). В работе было использовано 96 животных. Все наблюдения проводились в строгом соответствии с нормами и правилами этического отношения к лабораторным животным (Буреш и соав., 1991). К операции приступали через 30 мин после введения уретана, когда наркоз достигал необходимой глубины. В ходе операционной подготовки проводилась трахеотомия. После трахеотомии животное переворачивали дорсальной поверхностью тела вверх и помещали в стереотаксическую установку СЭЖ-3, модифицированную для работы с мелкими животными. Голову животного жестко фиксировали в головодержателе. Рассекали кожу, мягкие ткани и удаляли надкостницу с костей черепа. Для доступа к инспираторным и экспираторным местам ГКЯ над исследуемыми структурами согласно стереотаксическому атласу мозга крысы (Рaxinos, Watson., 1997) при помощи шаровидного бора высверливали трепанационные отверстия, координаты структур указаны в таблице 1. Кровотечение останавливали при помощи гемостатической губки. Поверхность продолговатого мозга во избежание подсыхания и переохлаждения периодически омывали подогретой искусственной цереброспинальной жидкостью (Mitchell et al., 1963).                                                                                

Таблица 1

Исследуемые участки ГКЯ	Координаты положения структуры относительно bregma (мм) (Рaxinos, Watson., 1997)
	Р	L	V
ИМ	-11,8	0,5	9,2
ЭМ	-11	0,9	9,2

Паттерн дыхания регистрировали при помощи спирографической методики. Для регистрации спирограммы использовали электронный спирограф с манометрическим датчиком давления. Выходной сигнал через аналого-цифровой преобразователь поступал на USB-порт компьютера и визуально отображался программой Рower Graрh. Оцифрованные сигналы обрабатывались в программе Microsoft Excel. Во всех экспериментах животные дышали атмосферным воздухом. Для регистрации электромиограммы (ЭМГ) диафрагмы осуществляли абдоминальный доступ к этой мышце и вводили в нее пару стальных игольчатых электродов. Вторую пару электродов вводили в НММ в VI-VIII межреберье с правой стороны тела животных. Сигнал с электродов поступал на двухканальный усилитель биопотенциалов, преобразовывался аналого-цифровым преобразователем и визуально отображался на экране компьютера с помощью программы Рower Graрh. Оцифрованные сигналы с вышеуказанного прибора обрабатывались в программе Microsoft Excel. Для изучения динамики дыхательных реакций записи спирограмм осуществляли до микроинъекции, затем в течении 30-и минут, на фоне микроинъекции НН, ГАМК и 150 мин. на фоне микроинъекции глутамата, а так же до и во время нанесения электрического стимула. На полученных ЭМГ определяли максимальную амплитуду осцилляций (мВ; отн. ед.) в залпах активности инспираторных мышц, продолжительность залповой активности (с) и длительность межзалпового интервала (с) (Бреслав, Глебовский, 1981). На полученных спирограммах оценивали дыхательный объем (ДО, мл), общую продолжительность дыхательного цикла (ТТ, с), длительность его инспираторной (Ti, с) и экспираторной (Te, с) фаз, а также долю вдоха в дыхательном цикле (Ti/ТТ). Частоту дыхания (ЧД, мин-1) определяли согласно формуле ЧД=60/Тt. Минутный объем дыхания (МОД, мл/мин) рассчитывали по формуле МОД=ЧДДО (Бреслав, 1984; Глебовский, 1994).

Для электростимуляции ГКЯ применяли биполярный микроэлектрод, покрытый изолирующим слоем на всём протяжении, кроме кончика, диаметр которого составлял около 20 мкм. Введение микроэлектрода в изучаемую структуру осуществляли согласно стереотаксическим координатам атласа мозга крысы (Рaxinos, Watson., 1997). Микроэлектрод подключали к универсальному электростимулятору УЭС-1М. Для раздражения использовали электрический ток частотой 50 Гц и 100 Гц и напряжением 1 В, 3 В, 5 В, 7 В. Время действия тока 5с. Координаты электростимуляции определяли исходя из данных литературы и реакций дыхания на кратковременное раздражение током пороговой величины. Электростимуляция током порогового значения во время выдоха структуры ГКЯ, координаты которой составляли Р - 11,8 мм; L - 0,5 мм; V - 9,2 мм относительно bregma, прекращала выдох и вызывала вдох. Эта структура была названа инспираторным местом ГКЯ. Электростимуляция током порогового значения во время вдоха структуры ГКЯ, координаты которой составляли Р - 11 мм; L - 0,9 мм; V - 9,2 мм относительно bregma, прекращала вдох и вызывала выдох. Эта структура была названа экспираторным местом. Термин место был введен нами для обозначения ограниченного участка структуры ГКЯ, вовлекаемого в состояние возбуждения при локальной электростимуляции или микроинъекции биологически активного вещества (Киреева 1981; Гордиевская, 1981; Якунин, 1987; Сергиевский и соавт., 1993).

В части экспериментов на поперечных срезах ствола мозга проводили гистологический контроль локализации точек электростимуляции и микроинъекции по методу Елисеева и соавт. (1967). Для этого по окончании опыта мозг фиксировали в течение 3 суток в 4% растворе формалина, после чего на неокрашенных поперечных срезах ствола мозга определяли локализацию кончика стимулирующего электрода или микропипетки.

В работе проводились микроинъекции: нитропруссида натрия (10-4 М);
L-глутамата (1М) и ГАМК (10-3М). Растворы вводили в мозг с помощью микрошприца МШ-1 через стеклянную микропипетку с диаметром кончика 20-30 мкм, укрепленную на игле шприца. Вещества растворяли в искусственной цереброспинальной жидкости и вводили в объеме 0,2 мкл. Микропипетку в соответствии со стереотаксическими координатами вводили в исследуемые структуры и удерживали там в течение всего опыта во избежание распространения вещества вверх по треку. В контрольных опытах по аналогичной методике инъецировали искусственную цереброспинальную жидкость в том же объеме.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программного пакета SigmaStat 3.5 (Jandel Scientific, USA) с использованием теста ANOVA, тестов DunnettТs-, Tukey, парного t-теста Стьюдента. Все данные представлены как средние арифметические значения стандартные ошибки среднего. Статистически значимыми считались изменения со значениями р<0,05 (*р <0,05, **р <0,01, ***р <0,001).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изменения паттерна дыхания и активности инспираторных мышц при электростимуляции инспираторного и экспираторного мест ретикулярного гигантоклеточного ядра

Прежде всего, следует отметить, что нам удалось определить координаты мест ГКЯ, раздражение которых у крысы, аналогично подобным местам у кошек, всегда сопровождалось строго определенными реакциями дыхания. Обрывом вдоха и началом выдоха, если раздражалось ЭМ и прекращением выдоха и началом вдоха в результате стимуляции током ИМ (рис. 1). В дальнейшем найденные нами ИМ и ЭМ исследовались методом электростимуляции током различной частоты и напряжения.

Рис.а1. Спирограмма (1) и ЭМГ диафрагмы (2), и НММ (3) до, во время и после кратковременной стимуляции током пороговой величины ЭМ ГКЯ (А) и ИМ ГКЯ (В) (время начала и окончания стимуляции, здесь и на рисунках далее, обозначены стрелками).

В ходе экспериментов установлено, что электростимуляции исследуемых структур приводили к выраженным изменениям респираторных показателей и активности инспираторных мышц. Характер респираторных ответов зависит от места воздействия и параметров электрического тока. Следует отметить, что частотные показатели раздражающего стимула большее влияние оказывают на объемные показатели дыхания. Изменения напряжения электрического тока в большей степени затрагивают частотно-временные показатели дыхания и активности инспираторных мышц. В ряде наблюдений эффекты раздражения респираторных мест ГКЯ носили противоположный характер.

Основным эффектом раздражения ИМ является стимуляция дыхания, о чем свидетельствовало увеличение продолжительности инспираторной фазы (+25а%, р<0,001), возрастание объемных показателей дыхания, усиление электроактивности диафрагмы и НММ на +21% (р<0,01) и +17% (р<0,05) соответственно (рис. 2). Время экспирации напротив, уменьшает свои значения, при стимуляции электрическим током, с максимальным значением в 20а% (р<0,01). ЧД в результате перераспределения длительности инспирации и экспирации остается без изменения. Однако доля вдоха в дыхательном цикле увеличивается значительно (+23% , р<0,001).

Рис.а2. (А) Изменение ДО, ЧД и МОД (в процентах от исходного уровня) при раздражении ИМ ГКЯ электрическим током. Здесь и на рисунках далее звездочками обозначены статистически значимые изменения показателей относительно исходного уровня: *р<0,05; **р<0,01; *** р<0,001. # - статистически значимые различия эффектов от стимуляции током различной частоты: # р<0,05; ## р<0,01; ### р<0,001.

(В) Спирограмма (1) и ЭМГ диафрагмы (2) и НММ (3) до и во время стимуляции током 100 Гц и 5 В ЭМ ГКЯ. Обозначения те же, что на рис. 1.

Электростимуляция ЭМ ГКЯ сопровождается уменьшением объемных показателей (рис. 3; рис. 4) Амплитуда осцилляций в залпах активности диафрагмы и НММ уменьшается на -29 % (р<0,001) и -23 % (р<0,001) соответственно. Происходит увеличение длительности экспирации (+112а%, р<0,001)а, в сочетании с уменьшением длительности инспирации (-14а%, р<0,001).

Рис.а3. Спирограмма (1) и ЭМГ диафрагмы (2) и НММ (3) до и во время стимуляции током 100 Гц и 5 В ЭМ ГКЯ. Обозначения те же, что на рис. 1.

ЧД при этом претерпевает значительные изменения с отрицательным знаком, а доля вдоха в дыхательном цикле уменьшается на треть.

Рис.4. Изменения ДО, ЧД и МОД (в процентах от исходного уровня) при раздражении ЭМ ГКЯ электрическим током. Обозначения те же, что на рис.2.

Во всех случаях после отмены раздражения дыхание возобновлялось. Характерной особенностью вновь установившегося дыхания было повышение амплитудной характеристики первого после отмены раздражения вдоха. Что может быть связанно с возросшим в условиях редкого и неглубокого дыхания хеморецепторным стимулом.

Основываясь на результатах электростимуляции ИМ и ЭМ ГКЯ, можно сделать заключение, что расположение инспираторно-активного и экспираторно-активного мест ГКЯ крыс, в целом имеет сходство с расположением таковых мест у кошек, что так же совпадает с мнением Сергеева (1982), Fadi Xu et al., (2001). ЭМ располагается в дорсоростральной части ГКЯ, в то время как ИМ находится в медиовентральной части ядра.

Следует отметить, что кратковременная стимуляция ИМ и ЭМ инициирующая смену фаз дыхания вызывает вдох или выдох нормальной продолжительности. Это дает нам основание предположить, что кратковременная стимуляция током этих мест оказывает преимущественно воздействие на механизм обеспечивающий переключения фаз. Кроме того, чем ближе к началу вдоха или выдоха подавалось раздражение, тем большее напряжение тока приходилось использовать для переключения фаз, что согласуется с представлением о трехфазности дыхания - вдох, ранний выдох и поздний выдох (Euler, 1982, Alheid et al., 2008 и др.)

Длительная же стимуляция током большего напряжения (9В; 100Гц) ИМ и ЭМ крыс, аналогично такому же воздействию на респираторные места кошек (Кедер-Степанова, 1981), вызывает инспираторное апноэ (остановка дыхания на вдохе, сопровождающаяся сильной тонической активацией инспираторных мышц) в случае раздражения ИМ и экспираторное апноэ (остановка дыхания на выдохе, сопровождающаяся отсутствием активности инспираторных мышц) в случае раздражения ЭМ (рис. 5).

Рис.а5. ЭМГ диафрагмы (1) и НММ (2) до и во время стимуляции током 100Гц 9В ИМ ГКЯ (А) и ЭМ ГКЯ (В). Обозначения те же, что на рис. 1.

Полученные эффекты активации дыхания при стимуляции ИМ, в особенности увеличение длительности инспираторной фазы на фоне уменьшения длительности экспираторной фазы и противоположную реакцию дыхания при стимуляции ЭМ, можно объяснить с точки зрения существования четких антагонистических отношений между ИМ и ЭМ ГКЯ и противоположным классом дыхательных нейронов. Усилением активности большинства дыхательных нейронов соответствующего класса, угнетением активности нейронов противоположного класса и, возможно, рекрутированием молчащих дыхательных нейронов (Сергеев 1982; Чубаркин 2006, 2007). Следует кроме того отметить более выраженную реакцию на раздражение как ИМ так и ЭМ - диафрагмы по сравнению с НММ, что можно объяснить с точки зрения наличия обильных прямых связей бульбоспинальных нейронов респираторных мест ГКЯ c мотонейронами диафрагмы, показанные в работе E. G. Dobbins и J. L. Feldman (1994).

Результаты исследования свидетельствуют, что ИМ и ЭМ регулируют продолжительность обеих фаз дыхательного цикла, однако стимуляция ИМ оказывает большее влияние на длительности инспираторной фазы, а электростимуляция ЭМ в большей степени регулирует продолжительность экспираторной фазы.

2. Реакции паттерна дыхания и активности инспираторных мышц на химическое разрушение нейронов инспираторного и экспираторного мест ретикулярного гигантоклеточного ядра

Особый интерес представляют данные химического выключения нейронов ИМ и ЭМ ГКЯ. При воздействии токсических доз глутамата на ИМ ГКЯ происходит перераспределение продолжительности фаз дыхания - время инспирации уменьшается ( - 21 %, р<0,001), время экспирации увеличивается ( - 40 %, р<0,05), однако ЧД и длительность дыхательного цикла остаются практически неизменными. Объемные показатели дыхания так же меняются значительно - происходит уменьшение ДО (50 %, р<0,001) и МОД (52 %, р<0,001). Особое внимание привлекают изменения биоэлектрической активности инспираторных мышц. Амплитуда осцилляций в залпах активности диафрагмы заметно снижается (-29 %, р<0,01), но при этом активность НММ возрастает более чем в полтора раза (+56 %, р<0,001) (рис. 9). Результирующим эффектом разрушения нейронов ИМ ГКЯ в силу описанных выше изменений дыхания можно назвать торможение респираторной активности.

Воздействие токсических доз глутамата на ЭМ ГКЯ сопровождается противоположными эффектами. Продолжительность инспираторной фазы дыхательного цикла несколько увеличивается (12 %, р<0,001), в то время как длительность экспирации значительно сокращается (35 %, р<0,001). Результатом подобных изменений является увеличение ЧД (17 %, р<0,001) и доли вдоха в дыхательном цикле (+ 33 %, р<0,001). Происходит увеличение объемных показателей дыхания и активности инспираторных мышц выражающееся в увеличении амплитуды осцилляций в залпах их биоэлектрической активности. Таким образом, в результате разрушения нейронов ЭМ ГКЯ происходит активация дыхания.

Исходя из вышесказанного, можно предположить, что ИМ ГКЯ в большей степени связанно с центрами диафрагмальных мышц. Так как его разрушение приводит к резкому падению активности данной инспираторной мышцы. В то же время происходит, по всей видимости, компенсаторная активация биоэлектрической активности НММ. Кроме того ИМ ГКЯ в большей степени оказывает влияние на объемные показатели дыхания оставляя частоту дыхания практически без изменения. Вероятно, ИМ ГКЯ обладает активирующим влиянием на дыхание, ограничение же этого влияния приводит к тормозному эффекту.

Разрушение нейронов ЭМ ГКЯ сопровождается активацией дыхания, что в купе с результатами электростимуляции, а так же данных литературы, дает основание предположить его активирующие влияние на экспираторные нейроны ДЦ. Кроме того ограничение модулирующего влияния ГКЯ оказывает действие как на объемные, так и на частотно-временные показатели респираторной активности.

Следует отметить, что продолжительное действие глутамата, по-видимому, разрушая большое количество нервных клеток исследуемого ядра, вызывало остановку дыхания.

3. Реакции паттерна дыхания и активности инспираторных мышц при микроинъекции нитропруссида натрия в инспираторное и экспираторное места ретикулярного гигантоклеточного ядра

При анализе участия ГКЯ в регуляции дыхания, важным является рассмотрение роли конкретных нейротрансмиттеров обеспечивающих такое участие. В ряде исследований было показано наличие синтазы NO в ядрах продолговатого мозга. В сравнительно большом количестве высокоактивная NO-синтаза обнаружена в нейронах ГКЯ крыс. Доля NO-нейронов в этом ядре достигает 42% (Черток и соавт., 2009) - 49,4 % (Бабич и соавт., 2010) от их общего количества. NO как объемный нейропередатчик охватывает целые группы нейронов и синапсов различной медиаторной принадлежности, обеспечивая их функциональное единство. Нами экспериментально доказано участие NO в регуляции дыхания на уровне ГКЯ. При этом особенности структурно-функциональной организации ГКЯ оказывают существенное влияние на результаты микроинъекции донора NO.

Микроинъекция донора NO - НН, как в ИМ, так и в ЭМ ГКЯ, сопровождается увеличением длительности инспираторной и экспираторной фаз и как следствие уменьшением ЧД (рис. 6; рис. 7). Изменения других показателей респираторной активности, определялись анатомо-физиологическими особенностями мест, в которых с помощью НН моделировали выделение NO. Микроинъекции НН на уровне ИМ приводят к увеличению активности диафрагмы на +26 % (р<0,05), активность НММ увеличивается на 19 % (р<0,05). ДО так же претерпевает изменения положительного знака (+21 %, р<0,05). На уровне ЭМ НН, напротив, угнетающим образом влияет на ДО (-17 % , р<0,001) и активности диафрагмы и НММ (-16 %, р<0,001).

Рис. 6. Изменения длительности инспираторной и экспираторной фаз (в процентах от исходного уровня) при микроинъекции НН в ИМ (А) и ЭМ (В) ГКЯ. Обозначения те же, что на рис. 2.

Рис.а7. Изменения ДО, ЧД и МОД (в процентах от исходного уровня) при микроинъекции НН в ИМ (А) и ЭМ (В) ГКЯ. Обозначения те же, что на рис.2.

Следует обратить внимание, что микроинъекции НН в ЭМ вызывали более выраженные изменения ряда показателей объема и ритма дыхания по сравнению с изменениями дыхания, вызванными микроинъекцией НН в ИМ ГКЯ. Данный факт позволяет высказать предположение, что NO-эргические нейроны неравномерно распределены в ГКЯ. В ЭМ, по-видимому, содержится большее количество NO-синтазы, нежели в ИМ. Это предположение поддерживается так же данными Бабич (2010) исследовавшей распределение NO-нейронов в некоторых ядрах продолговатого мозга. Согласно ее исследованиям в ГКЯ - максимальное количество NO-позитивных клеток располагается по границе с медиальной петлей, вестибулоспинальным трактом и ядром лицевого нерва, а в ростральной части ядра - по границе с мелкоклеточным ядром.

Описанные выше эффекты возникающие при микроинъекции НН можно объяснить с позиции вовлечения NO в качестве месенджера в пространственные взаимоотношения между нейронами и способностью выступать в качестве объемного пространственного сигнала облегчающего высвобождение различных нейромедиаторов (Черток и соавт., 2009), а функции ГКЯ, как известно, обеспечиваются многочисленными как возбуждающими, так и тормозными нейромедиаторами и нейропептидами, (Rikard-Bell et al.,1990; Yeomans et al., 1990; Цырлин, 2003; Abe et al., 2003; Цырлин, 2003, Zhang et al., 2003 и др.). Учитывая результаты предыдущих экспериментов, можно предположить облегчающее влияние NO на активность ИМ и ЭМ оказывающих специфическое влияние на ДО и активность инспираторных мышц. Гетерогенность ГКЯ, особенности его синаптической организации, по-видимому, лежат в основе его интегративной функции.

4. Реакции паттерна дыхания и активности инспираторных мышц при микроинъекции гамма - аминомасляной кислоты в инспираторное и экспираторное места ретикулярного гигантоклеточного ядра

На уровне ГКЯ обнаружено широкое представительство ГАМК-эргической нейромедиаторной системы участвующей в механизмах обработки и передачи информации, в том числе и к Д - (Zhang et al., 2003, Syed I A Zaidi et al., 2006 и др.). В то же время показана высокая концентрация ГАМК и рецепторов к ней в пределах ДЦ, что предполагает участие данного нейромедиатора в организации дыхательного ритмогенеза (Hilaire et al., 1999; Alheid et al., 2008 и др.). Известно, что респираторные влияния сенсомоторной коры мозга, мозжечка, а так же структур экстрапирамидной системы реализуются через ГКЯ. Данное ядро, с известной долей вероятности, можно рассматривать как коллектор многообразной афферентации, которая поступает к Д - от различных супрабульбарных отделов головного мозга (Меркулова и соавт., 2004; Зайнулин и соавт., 2007 и др.).

В экспериментах с микроинъекцией ГАМК нами показано, что результат активации ГАМК-эргических рецепторов ГКЯ существенным образом зависит от места инъекции. Воздействие данного нейромедиатора на ИМ сопровождается торможением дыхания, выражающимся в уменьшении продолжительности инспирации (-5%, р<0,001) на фоне увеличения длительности экспираторной фазы (10%, р<0,001), уменьшении доли вдоха (7%, р<0,001) в дыхательном цикле и уменьшении ДО и МОД. Микроинъекции ГАМК в ЭМ действуют на дыхание противоположным образом - происходит увеличение длительности инспирации (12 %; р<0,001) на фоне укорочения экспираторной фазы (15 %; р<0,001), увеличение доли вдоха (17 %; р<0,001), в дыхательном цикле и МОД (рис. 8). Воздействие ГАМК на ИМ и ЭМ не сопровождается достоверными изменениями длительности дыхательного цикла, ЧД, а так же амплитуды биоэлектрической активности инспираторных мышц.

Рис. 8. Изменения ДО, ЧД и МОД (в процентах от исходного уровня) при микроинъекции ГАМК в ИМ (А) и ЭМ (В) ГКЯ. Обозначения те же, что на рис.2.

По всей видимости, ГАМК на уровне ГКЯ оказывает влияние преимущественно на паттерн дыхания, оставляя дыхательный ритм без изменения. Возможный механизм подобных влияний таков. В норме ИМ ГКЯ оказывает возбуждающее действие на инспираторные нейроны Д - и тормозное действие на противоположный класс дыхательных нейронов. ГАМК-эргическая афферентация из супрабульбарных структур достигает ГКЯ, которое, в свою очередь, как реле передает информацию к ДЦ. Усиление ГАМК-эргического входа к ИМ ГКЯ, производит ограничение возбуждающего драйва к инспираторным нейронам ДЦ, что в свою очередь сопровождается торможением дыхания. Стимулирующий эффект на дыхание при воздействии ГАМК на ЭМ ГКЯ по-видимому связан с ограничением активирующего влияния, оказываемого этой частью ядра на экспираторные нейроны ДЦ.

Ввиду обширных связей данного ядра и широкого представительства, различных нейромедиаторных систем и рецепторов к ним (ГАМК, NO, CO, глутамат, соротонин и др.), ГКЯ можно рассматривать как коллектор многообразной афферентации, которая поступает к Д - от различных супрабульбарных отделов головного мозга (Меркулова и соавт., 2004; Зайнулин и соавт., 2007 и др.). Проведенный анализ значимости ГКЯ в регуляции дыхания позволяет высказать мнение, что респираторные места ГКЯ Ч одни из важнейших структур, участвующих в формировании ритма и паттерна дыхания, наряду с другими традиционно признанными структурно-функциональными участками Д - и являются исключительно важными для организации наиболее адекватного дыхания при самых разнообразных условия жизнедеятельности организма.

ВЫВОДЫ

1. Экспериментально доказано наличие в ГКЯ крыс инспираторного и экспираторного мест. Инспираторное место расположено в медио-вентральной части (11,8 мм каудальнее bregma, 0,5 мм латеральнее средней линии, на глубине 9,2 мм от поверхности черепа) экспираторное место в дорсо-ростральной части ГКЯ (11 мм каудальнее bregma, 0,9 мм латеральнее средней линии и 9,2 мм вглубь от поверхности черепа).
2. окальная электростимуляция инспираторного места ГКЯ оказывает стимулирующее действие на дыхание, выражающееся в увеличении длительности инспирации, объемных показателей дыхания и активности инспираторных мышц на фоне сокращения длительности экспирации. Стимуляция электрическим током экспираторного места ГКЯ производит противоположные эффекты. Выявлено, что частота электрического стимула большее влияние оказывает на изменения объемных показателей, напряжение - на изменение частотно-временных показателей дыхания.
3. Воздействие на ГКЯ токсических доз глутамата приводит к существенному изменению дыхания. Разрушение нейронов инспираторного места ГКЯ, вызывает сокращение длительности инспирации на фоне увеличения экспираторной фазы, уменьшение объемных показателей дыхания и активности диафрагмы. Разрушение нейронов экспираторного места ГКЯ сопровождается противоположными реакциями внешнего дыхания и активности инспираторных мышц. Продолжительное воздействие глутамата на ГКЯ приводит к остановке дыхания.
4. Оксид азота на уровне ГКЯ принимает участие в регуляции дыхания, оказывая тормозное воздействие на механизм респираторного ритма. В то же время оксид азота на уровне инспираторного места ГКЯ, увеличивает объемные показатели внешнего дыхания и активности инспираторных мышц, на уровне экспираторного места оксид азота производит противоположные эффекты. Реакции дыхания на микроинъекции нитропруссида натрия в экспираторное место оказались более выраженными, что может свидетельствовать о неравномерном представительстве азотэргической нейромедиаторной системы в ГКЯ.
5. ГАМК на уровне респираторных мест ГКЯ не принимает участие в регуляции частоты дыхания, оказывая влияние только на его объемные показатели. ГАМК на уровне инспираторного места производит уменьшение объемных показателей дыхания, а на уровне экспираторного места напротив активацию вентиляции.
6. Респираторные места регулируют продолжительность обеих фаз дыхательного цикла. Инспираторное место оказывает активирующее влияние на одноименную фазу дыхания, тормозя фазу экспирации, а так же в большей степени регулирует объемные показатели дыхания. Экспираторное место напротив, активирует фазу экспирации и оказывает тормозное воздействие на инспираторную фазу, регулируя как объемную, так и ритмогенерирующую функции дыхания.
7. Инспираторное и экспираторное места ГКЯ вносят важный вклад в центральные механизмы регуляции дыхания, принимая участие в формировании его ритм- и паттерн- генерирующей функции.

Список публикаций по теме диссертации

Публикации в журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Яценко Е.В. Значение структурно-функциональных особенностей различных мест ретикулярного гигантоклеточного ядра в центральных механизмах регуляции дыхания // Вестник Самарского государственного университета. Естественнонаучная серия. 2011. №2(83). С. 250-257.
2. Меркулова Н.А., Мочайкина Е.В. (Яценко Е.В.), Беляков В.И. Реакции инспираторных мышц на микроинъекции нитропруссида натрия в ретикулярное гигантоклеточное ядро // Вестник Тверского государственного университета. Серия: Биология и экология. 2008. №8. С. 33-39.

Публикации в других изданиях

3. Мочайкина Е.В. (Яценко Е.В.) Изменение биоэлектрической активности инспираторных мышц в условии микроинъекции нитропруссида натрия в гигантоклеточное ретикулярное ядро // XXXVIII научная конференция студентов: тезисы докладов. 2007. С. 58.

4. Меркулова Н.А., Мочайкина Е.В. (Яценко Е.В.) Изменение биоэлектрической активности инспираторных мышц в условии микроинъекции нитропруссида натрия в гигантоклеточное ретикулярное ядро // тезисы докладов V международной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика В.Н. Черниговского, "Механизмы функционирования висцеральных систем". С.-Пб, 2007. С. 201.

5. Беляков В.И., Пирожкова Т.А., Мочайкина Е.В. (Яценко Е.В.) Кардио-респираторная функция в условиях электрического и химического (L-глутаматом) раздражения фастигиального ядра мозжечка у крысы // Вестник Самарского государственного университета. Естественнонаучная серия. Биология. 2007. №8(58). С. 30-38.

6. Меркулова Н.А., Мочайкина Е.В. (Яценко Е.В.) Изменение биоэлектрической активности инспираторных мышц при микроинъекции нитропруссида натрия в гигантоклеточное ретикулярное ядро // VI Сибирский физиологический съезд: тезисы докладов. Барнаул, 2008. Т. 1. С. 107.

7. Мочайкина Е.В. (Яценко Е.В.) Изменение биоэлектрической активности инспираторных мышц при микроинъекции L-глутамата в ретикулярное гигантоклеточное ядро // XXXIX научная конференция студентов: тезисы докладов. 2008. С.83.

8. Меркулова Н.А. Мочайкина Е.В. (Яценко Е.В.) Значение ретикулярного гигантоклеточного ядра в центральных механизмах регуляции дыхания // Механизмы функционирования висцеральных систем: материалы VI Всероссийской конференции с международным участием, посв. 50-летию открытия А.М. Уголевым мембранного пищеварения. С.-Пб, 2008. - С.201.

9. Меркулова Н.А. Мочайкина Е.В. (Яценко Е.В.) Значение ретикулярного гигантоклеточного ядра в центральных механизмах регуляции дыхания // XXI съезд физиологического общества имени И.П. Павлова: материалы. М.- Калуга, 2010. С. 421.

10. Мочайкина Е.В. (Яценко Е.В.) Реакции дыхания на микроинъекции норадреналина и его антагониста - обзидана в ретикулярное гигантоклеточное ядро // Всероссийская конференция с международным участием Механизмы регуляции физиологических систем организма в процессе адаптации к условиям среды. С.-Пб, 2010. С.77.

Список сокращений

Д - - дыхательный центр

ГКЯ - ретикулярное гигантоклеточное ядро

ИМ - инспираторное место

ЭМ - экспираторное место

ГАМК - гамма - аминомасляная кислота

НН - нитропруссид натрия

ЭМГ - электромиограмма

НММ - наружные межреберные мышцы

ДО - дыхательный объем

МОД - минутный объем дыхания

ЧД - частота дыхания

Te - длительность экспирации

Ti - длительность инспирации

Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии