Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
Шевчук
Евгения Александровна
ЗАКОНОМЕРНОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ
МИКРОБОЦЕНОЗОВ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
СИМБИОНТОВ У НОВОРОЖДЕННЫХ В УСЛОВИЯХ
АКУШЕРСКО-ГИНЕКОЛОГИЧЕСКОГО СТАЦИОНАРА
03.02.03 Ц микробиология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Иркутск - 2012
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Читинская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Научный руководитель:
доктор медицинских наук,
профессор Примак Татьяна Дмитриевна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук Дубровина Валентина Ивановна (заведующая лабораторией патофизиологии ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора
доктор медицинских наук Козлова Ирина Валерьевна
(заведующая лабораторией молекулярной эпидемиологии и генетической диагностики Федерального государственного бюджетного учреждения Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека Сибирского отделения Российской академии медицинских наук)
Ведущая организация:
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Иркутский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Защита состоится л__ _______2012 г. в ___часов на заседании диссертационного Совета ДМ 001.038.01 Федерального государственного бюджетного учреждения Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека Сибирского отделения Российской академии медицинских наук по адресу: г. Иркутск, ул. К. Маркса, 3. Почтовый адрес: 664025, г. Иркутск, а/я 539.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека Сибирского отделения Российской академии медицинских наук
Автореферат разослан л____ ________ 2012 г.
Ученый секретарь
Диссертационного Совета,
кандидат медицинских наук Кулеш Дмитрий Владимирович
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. В последние годы во всех странах мира отмечается увеличение частоты госпитальных инфекций у новорожденных, особенно детей, находящихся в отделениях реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ), где концентрируются наиболее тяжелые больные с перинатальной патологией (Володин Н.Н.,2004; Дементьева Г.М. и соавт.,2007; Brito A.S.J.,2002; Nagata E.,2002; Stroll B.J., 2011). Показатель частоты внутрибольничных инфекций (ВБИ) у новорожденных согласно данным официальной статистики составляет в среднем 0,6 - 1%, однако, по результатам выборочных исследований ВБИ регистрируются у 15-18% новорожденных (Ковалева Е.П., Семина Н.А., 2002; Касихина С.А. и соавт., 2004; Kreymann K.G et al., 2007).
Первыми микроорганизмами, с которыми контактирует плод, являются бактерии, присутствующие в материнском организме. Идентичность условно-патогенной микрофлоры (УПМ) родовых путей матери и новорожденного доказана многими исследователями (Минасян В.С. и соавт., 2006; Беляева И.А. и соавт., 2007; Савченко Т.Н., 2011). Одновременно колонизация детей условно-патогенными микроорганизмами происходит при контакте с медицинским персоналом через руки, предметы и воздух родильного помещения (Коршунова Г.С., 2004; Егоричева С.Д. и соавт., 2005; Абаев Ю.К., 2006; Dellinger R.P. et al., 2004; Bellid L.L., Ohning B.L., 2006).
В этиологической структуре госпитальной инфекции новорожденных грамположительная флора составляет от 17 до 40% и представлена стафилококками и стрептококками. Причем роль S. aureus несколько снизилась, преобладают коагулазоотрицательные стафилококки (КОС) - S. epidermidis, S. warneri, а также Enterococcus faecalis и Enterococcus faecium. Грамотрицательная флора представлена E. coli, бактериями родов Klebsiella, Enterobacter, Proteus. Кроме того, наблюдается увеличение частоты инфекции новорожденных, обусловленной грибами рода Candida (Акимкин В.Г., 2003; Егоричева С.Д. и соавт., 2005; Самсыгина Г.А. и соавт., 2007; Любимова А.В. и соавт., 2010). Следовательно, условия отделений акушерско-гинекологического стационара, где находятся новорожденные, необходимо рассматривать с позиций специфической экологической системы.
В условиях экологического и социального неблагополучия, изменившейся иммунологической резистентности организма человека, нерационального использования значительного арсенала антибактериальных препаратов и антисептических средств наблюдается изменение этиологической структуры возбудителей современных гнойно-септических инфекций (ГСИ) (Воробьев А.А., 2002; Володин Н.Н., 2008; Oston S. et al., 2004). Профилактика ГСИ включает комплекс дезинфекционных мероприятий, направленных на уничтожение патогенных и условно-патогенных микроорганизмов на объектах в окружении пациента, при этом недостаточно учитывается специфика, закономерности бактериальной контаминации и перманентного реинфицирования новорожденных (Сидоренко С.В., 2003; Белобородов В.Б., 2005; Кафарская Л.И. и др., 2007; Донских Е.Е., 2010).
В свою очередь, представители нормальной микрофлоры составляют систему биологической защиты организма. Облигатная микрофлора и УПМ в составе различных биотопов в форме нормобиоценоза являются основополагающими компонентами саморегуляции, иммунологических реакций и неспецифической защиты организма (Грачева Н.М., Бондаренко В.М., 2009; Нилова Л.Ю., 2009; Kaibni M.N. et al., 2009).
В большинстве лечебных учреждений общее количество микроорганизмов в 1 м3 воздуха превышает существующие нормы (Милева О.И. и соавт., 2004). Оздоровительный эффект чистого природного воздуха состоит не только в отсутствии пыли, как главного источника микробов и бактерий. Воздух оздоравливается атмосферным электричеством, точнее его носителями - отрицательными аэроионами (ОАИ) (Чижевский А.Л., 1976, 1989, 1995; Партылов В.С., 2001; Колотова О.В., 2002; Ryushi T., 1998; Nakane H. Et al., 2002).
Метод аэроионификации может быть применен без дополнительных изысканий в операционных, перевязочных, палатах (инфекционных, родильных и др.), боксах микробиологических лабораторий (Лившиц М.Н., 1990; Скипетров В.П., 2005; Пакин В.Н., 2011; Dudley C. A., Moss R. L., 1999; Fletcher L.A. et al., 2007).
Исследование нормальной микрофлоры новорожденных, беременных и родильниц, изучение влияния аэроионов и пробиотиков на ее свойства позволяет расширить научные знания о профилактике ВБИ и разработать новые перспективные методы снижения уровня госпитального инфицирования в акушерско-гинекологических стационарах.
Цель: изучить закономерности становления микробиоценозов новорожденных во взаимосвязи с микробиотой матери и бактериальной обсемененностью объектов окружающей среды (ООС) в условиях акушерско-гинекологического стационара и определить влияние на выделенную микрофлору аэроионов в присутствии лактобактерий.
Для выполнения указанной цели поставлены следующие задачи:
- Изучить закономерности формирования, качественный и количественный состав микробиоценозов новорожденных в динамике в условиях детского отделения (ДО) и ОРИТ с оценкой антибиотикорезистентных свойств микроорганизмов.
- Исследовать микробные ассоциации цервикального канала беременных женщин, родильниц, объектов окружающей среды с определением антибиотикорезистентности выделенных штаммов микроорганизмов.
- Изучить влияние аэроионов в присутствии лактобактерий на антибиотикорезистентность условно-патогенных микроорганизмов, выделенных в условиях акушерско-гинекологического стационара.
- Разработать способ коррекции микроэкологических нарушений репродуктивного тракта женщин с применением аэроионов и пробиотических микроорганизмов.
Научная новизна и теоретическая значимость
Разработана концептуальная схема комплексного микроэкологического мониторинга новорожденных ДО и ОРИТ в период постнатальной адаптации, учитывающая колонизацию УПМ различных биотопов организма ребенка, матери и окружающей среды.
Показаны закономерности формирования микробиоценозов новорожденных по биотопам и дням жизни, характеризующиеся у детей ОРИТ в отличие от ДО постепенным заселением микробиологических локусов к 10-му дню жизни преимущественно грамположительными кокками с отставанием процесса контаминации биолокусов бифидобактериями и лактобактериями.
Впервые установлено изменение антибиотикорезистентности в виде увеличения зон подавления роста выделенных штаммов S. warneri антибактериальными средствами под влиянием потока ОАИ при участии лактобактерий, возможно, по механизму квантовой реакции, когда свободные электроны, присутствующие на молекулах кислорода, поглощаются молекулами антагонистических микробных клеток, и по принципу когерентности происходит распределение энергии в наиболее чувствительные структуры клеток (плазмиды, реактивные центры ферментных групп).
Предложен новый способ коррекции микробиоты репродуктивного тракта женщин с применением комплекса бифидобактерий и лактобактерий (Патент РФ № 2354368).
Практическая значимость работы
Проведенный микробиологический мониторинг микробных ассоциаций новорожденных, женщин, объектов ООС с определением антибиотикорезистентных свойств выделенных штаммов позволил создать базу данных с целью отслеживания циркуляции условно-патогенных и патогенных штаммов в условиях акушерско-гинекологического стационара.
Полученные результаты по влиянию отрицательных аэроионов при участии лактобактерий на культуральные и биологические свойства микроорганизмов, включая их антибиотикочувствительность, позволили предложить аэроионы в сочетании с лактобактериями ввиду их безопасности в ряд мер профилактики внутрибольничного инфицирования.
Материалы исследований позволили разработать новый эффективный и безопасный способ коррекции микроэкологических нарушений репродуктивного тракта женщин с применением пробиотических микроорганизмов.
Материалы диссертации использованы при:
- разработке и внедрении Патента РФ № 2354368 Способ лечения вульвовагинального кандидоза (Заявка № 2008103407, приоритет изобретения от 29 января 2008 г);
- внедрении в практику работы ООО Читинская медицинская компания (Акт внедрения результатов НИР от 11.05.2009);
- внедрении в практику работы Перинатального центра ГУЗ Краевая клиническая больница Забайкальского края (Акт о внедрении результатов НИР от 12.09.2010 г);
- организации и проведении учебного процесса на кафедре микробиологии с вирусологией и иммунологией ГОУ ВПО Читинская государственная медицинская академия (Акт о внедрении результатов НИР от 11.09.2009).
Положения, выносимые на защиту:
1. Установлены закономерности формирования микробиоценозов новорожденных ДО преимущественно первые трое суток, у детей ОРИТ постепенно к десятым суткам жизни. Состав микробных ассоциаций у новорожденных в ОРИТ в сравнении с группой детей ДО отличается преобладанием энтерококков и КОС, отсутствием в микробном пейзаже бифидобактерий и лактобактерий в связи с применением с первых часов жизни лечебно-диагностических манипуляций, химиотерапевтических средств и искусственного вскармливания.
2. Микробиоценоз половых путей женщин в третьем триместре беременности, представленный преимущественно лактобактериями и грамположительными кокками, в ранний послеродовый период характеризуется увеличением количества анаэробов, в других биотопах родильниц преобладают грамположительные кокковидные бактерии.
3. Обнаружено, что биотопы новорожденных, женщин и ООС содержат преимущественно КОС и энтерококки, значительная часть которых отличается антибиотикорезистентными свойствами, у родильниц достигая двух третей от числа выделенных грамположительных кокков.
4. Получены новые научные сведения о действии отрицательно заряженных аэроионов в присутствии лактобактерий in vitro с подавлением роста и размножения S. warneri, снижением антибиотикорезистентности микроба к ряду антибиотиков в два и более раз.
5. Предлагаемый комплексный метод коррекции микрофлоры половых путей родильниц имеет высокую эффективность (96,7%), безопасен и физиологичен, позволяет большинству женщин нормализовать микрофлору половых путей, способствует ее восстановлению после родов.
Апробация результатов исследования
Основные положения работы и материалы исследований были доложены и обсуждены на:
- Областной межведомственной конференции Всероссийской научной конференции Современные проблемы науки и образования (Москва, 2006);
- IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения РФ (Москва, 2007);
- Краевой научно-практической конференции, посвященной 85-летию Государственной санитарно-эпидемиологической службы РФ (Чита, 2007);
- Международной научно-практической конференции Состояние и перспективы специализированной медицинской помощи (Улан-Удэ, 2007);
- Международной научно-практической конференции, посвященной 30-летию детской инфекционной больницы №4 г. Тулы Третьи Тульские педиатрические чтения (Тула, 2007);
- IX Тихоокеанской конференции Актуальные проблемы экспериментальной, профилактической и клинической медицины (Владивосток, 2008);
- Всероссийской научной конференции Теоретические основы эпидемиологии, современные профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний (Санкт-Петербург, 2008);
- V Scientific Conference Present-day problems of experimental and clinical medicine (Thailand, 2008);
- VIII Конгрессе детских инфекционистов России Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики (Москва, 2009);
- Региональной научно-практической конференции, посвященной 75-летию санитарной службы Забайкальского края (Чита, 2010);
- 14th International Congress on Infectious diseases (Miami, 2010);
- Научной конференции Этиологические, эпидемиологические и клинические аспекты инфекционных болезней (Иркутск, 2010);
- Межрегиональном семинаре Научные и практические аспекты дисбиозов (Иркутск, 2011).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 18 печатных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 2 монографии и патент РФ.
ичное участие автора осуществлялось на всех этапах работы и заключалось в выполнении всех микробиологических исследований, статистической обработке результатов, анализе полученных данных, в обобщении и оформлении результатов.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов, общего заключения и выводов, включает 42 таблицы, 35 рисунков и список литературы, содержащий 187 источников, в том числе 134 отечественных и 53 зарубежных.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы, объем и методы исследования
Микробиологический мониторинг включал бактериологическое исследование биологического материала 70 новорожденных ОРИТ, 50 новорожденных ДО, 60 беременных женщин и 64 родильниц. У новорожденных исследовались ротоглотка - 1, 3, 7 сутки, кожа подмышечных впадин и пупочная ранка - 3, 5 сутки, кал на наличие УПМ - 5, 10 сутки. Материалом для микробиологических исследований беременных и родильниц явилось отделяемое цервикального канала. Изучали контаминацию предметов ухода, обихода, медицинского оборудования и инструментария, рук медицинского персонала, специализированной одежды и обсеменение воздуха (Табл.1).
Таблица 1
Объем выполненных исследований
Наименование исследований | Количество исследований |
Микробиологические исследования новорожденных | 880 |
Микробиологические исследования микробиоты женщин | 256 |
Бактериологические исследования ООС | 3125 |
Исследование штаммов выделенных культур: - биохимическая идентификация - определение антибиотикорезистентности | 1801 1530 |
Исследование влияния ОАИ на стафилококки in vitro: - на ростовые свойства - на антибиотикорезистентность | 17 17 |
При проведении исследований за основу были взяты положения, представленные в Клинико-организационном руководстве по организации работы акушерского стационара на основе новых технологий родовспоможения и инфекционного контроля в рамках проекта Мать и дитя (IBP MCH, 2003 г).
Отбор проб из объектов окружающей среды осуществляли методом исследования смывов, посевов материала на стерильность. Воздух исследовали седиментационным методом на общее микробное число (ОМЧ), наличие золотистого стафилококка и плесневых грибов.
Посев биологического материала от пациентов проводили на готовые коммерческие питательные среды и среды, приготовленные в условиях лаборатории клинической микробиологии. Для выделения анаэробных микроорганизмов использовали анаэростат (bioMerieux), эксикатор со свечой и питательные среды - Блаурокк, лактоагар, кровяно-анаэробный бактериологический агар (КАБА). Для идентификации штаммов использовали стандартные тест-системы StaphyTest, StreptoTest, EnteroTest и AnaeroTest (LaChema, Чехия). Выделенные чистые культуры стафилококков идентифицировали по 22 тестам: плазмокоагуллаза, лецитоветилаза, гемолизин, уреаза, аргинин, орнитин, бетта-галактозидаза, бетта-гиалуронидаза, эскулин, нитраты, фосфатаза, галактоза, сахароза, трегалоза, маннитол, ксилоза, мальтоза, манноза, лактоза, ацетоин, цитохромоксидаза, пирролидонилариламинидаза.
Выделенные штаммы стафилококков, стрептококков, энтеробактерий тестировали на чувствительность к 18 антибиотикам на основании МУ 4.2.1890-04 Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам диско-диффузионным методом (ДДМ) в соответствии со стандартами Национального комитета по клиническим лабораторным стандартам (NCCLS, США). Дополнительно идентификацию микроорганизмов и определение минимальных подавляющих концентраций (МПК) проводили с применением автоматического микробиологического анализатора VITEC 2 Compact 30 (bio Merieux Inc., США). Использовали показатель МПК90 - МПК антибиотика эффективного для 90% исследуемых штаммов в единицах мг/л.
Для проверки качества питательной среды, дисков и правильности методики постановки всех этапов определяли чувствительность контрольных штаммов микроорганизмов. Выбор референтных штаммов для проведения контроля качества определяли видом исследуемого микроорганизма: E. faecalis ATCC 29212; E. coli ATCC 25922; S. aureus ATCC 25923.
17 штаммов S. warneri, выделенных от новорожденных, женщин и ООС и обладающих антибиотикорезистентными свойствами, выращивали на питательной среде, приготовленной с добавлением бактерий рода Lactobacillus, а также эти культуры подвергали воздействию аэроионов.
Опыт 1: КОС +лактобактерии
В 100 мл свежеприготовленной среды Мюллера-Хинтона для определения антибиотикорезистентности добавляли 12 мл биологически активной добавки Наринэ (БАД ТУ-9224-004-45448778-02), содержащей живые ацидофильные бактерии Lactobacillus acidophilus штамма N.V.Ep. 317/402 и разливали в чашки Петри. Готовили взвеси суточных культур S. warneri в физиологическом растворе хлорида натрия по стандарту мутности 5х108. На питательную среду засевали взвесь, затем на одну партию чашек накладывали диски с антибиотиками. Инкубировали при 37С 24 часа. Контролем служили две партии чашек: первая со средой Мюллера-Хинтона без добавок с нанесенной взвесью культуры S. warneri и дисками с антибиотиками, вторая - с этой же средой без добавок с нанесенной взвесью культуры S. warneri. Использовали следующий набор антибиотиков: оксациллин, амикацин, ванкомицин, цефтазидим, эритромицин и меропенем, как наиболее часто применяемые в условиях ОРИТ новорожденных. Через сутки инкубации оценивали антибиотикорезистентность ДДМ и определяли МПК90 на VITEC 2 Compact -30.МПК.
Опыт 2: КОС + аэроионы
Готовили взвеси культур аналогично опыт 1. Взвеси в количестве 1,0 мл засевали на питательный агар. Одну часть взвеси засевали по методу Голда (микробиологической петлей диаметром 2 мм на четыре сектора, после каждого сектора петлю прожигали) и помещали под ОАИ прибора Сферион (ООО Сьютиби, г. Новосибирск), который производит не менее 5х103 отрицательных ионов в 1 см3 воздуха. Время воздействия составило 60, 90 и 120 минут. Затем чашки инкубировали при 37С 24 часа, после чего определяли антибиотикорезистентность культур ДДМ и МПК на VITEC 2 Compact. Контролем служили чашки с посевом штаммов S. warneri без воздействия аэроионов. Другую часть взвеси разливали в стерильные чашки Петри по 1,0 мл и растирали шпателем, затем также помещали под поток отрицательно заряженных аэроионов на тоже время. Контрольная чашка со взвесью воздействию ОАИ не подвергалась и выдерживалась с такой же экспозицией и температурой.
Опыт 3: КОС + лактобактерии + аэроионы
Готовили питательную среду и взвеси аналогично опыту 1. Одну партию чашек с культурой и дисками и вторую партию с культурой без дисков помещали под чистый поток ОАИ. Время воздействия составило 90, 120 и 180 минут. Контролем служили чашки со средой Мюллера-Хинтона без добавок с нанесенной взвесью культур S. warneri и дисками с антибиотиками, вторая - без добавок с нанесенной взвесью культуры S. warneri, не подвергавшихся воздействию аэроионов. Через сутки инкубации оценивали антибиотикорезистентность ДДМ и определяли МПК на VITEC 2 Compact -30.МПК.
С целью нормализации выявленных изменений 30 женщинам была проведена коррекция микробиоты половых путей. Аэронификатор Сферион использовался для очистки и насыщения воздуха помещения ОАИ в течение дня. Применяли препараты пробиотического ряда: в первой фазе лечения бактериально-ферментный пробиотик с антибактериальной активностью Наринэ-ф-баланс с микроэлементами, содержащий лактобактерии Lactobacillus acidophilus штамма N.V.Ep. 317/402, ионы железа и цинка (БАД ТУ 9229-002-23571633-07); далее комплекс облигатных бактерий Биовестин-лакто, содержащий Bifidum adolescentis MC-4, Bifidum bifidum 792, Lactobacillus plantarum 8PA3, обладающих высокой антагонистической активностью в отношении условно-патогенных и патогенных микроорганизмов (БАД СГР №77.99.23.3.У.6097.6.05).
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета программы Statistica-5 и Exel. Проводилась проверка нормальности распределения количественных признаков при малом числе наблюдений с использованием W-критерия Шапиро-Уилка, основанная на регрессии порядковых статистик. Для оценки значимости различий при нормальном распределении количественных признаков использовали t-критерий Стьюдента для независимых выборок и для двух связанных между собой вариационных рядов, двусторонние доверительные интервалы; при ненормальном распределении количественных признаков использовали непараметрический критерий W- Вилкоксона, применяемый для сравнения выборок с попарно связанными вариантами. Наличие связей между показателями определяли, используя коэффициент корреляции Пирсона (r).
Выполненная работа не ущемляет права и не подвергает опасности благополучие субъектов исследования, осуществлена с информированного согласия пациентов согласно Приказу Министерства здравоохранения РФ №266 от 19.06.2003 г, соответствует этическим нормам Хельсинской декларации (2000).
Результаты исследований и их обсуждение
Процесс формирования микробиоценозов новорожденных ОРИТ и ДО отличался по целому ряду показателей. В 1-е сутки жизни микрофлора ротоглотки не выявлялась в 82,8 % в ОРИТ и в 50% случаев в ДО, к 3-м суткам отсутствие роста отмечалось у 34,2% в ОРИТ, в ДО в 100% случаев зев новорожденных был контаминирован. Заселение микрофлорой пупочного остатка и подмышечных впадин детей ОРИТ также происходило в более поздние сроки, чем в ДО. В составе микробного пейзажа ротоглотки новорожденных ОРИТ S. mitis, E. faecalis, S. haemolyticus, S. warneri присутствовали с первых дней жизни, преобладали штаммы S. haemolyticus (до 41,4%) и E. faecalis (до 17,1 %) (Табл. 2). Микроорганизмы ротоглотки новорожденных ДО были представлены S. mitis (до 76%) и Lactobacillus spp. (до 36%) (Табл. 3).
Таблица 2
Микробный пейзаж ротоглотки новорожденных ОРИТ по суткам жизни
Микроорганизмы | 1 сутки (n=70) | 3 сутки (n=70) | 7 сутки (n=70) | |||
абс. | % | абс. | % | абс. | % | |
S. mitis | 7 | 10,03,5 | 10 | 14,34,1 | 11 | 15,74,3 |
S. oralis | - | - | 3 | 4,32,4 | ||
S. warnerii | 2 | 2,81,9 | 4 | 5,72,7 | 6 | 8,63,3 |
S. haemolyticus | 2 | 2,81,9 | 24 | 34,25,6 | 29 | 41,45,9* |
S. epidermidis | 3 | 4,32,4 | ||||
E. faecalis | 3 | 4,32,4 | 9 | 12,83,9 | 12 | 17,14,5* |
E. faecium | 4 | 5,72,7 | ||||
K. pneumoniae | - | 2 | 2,81,9 | 2 | 2,81,9 | |
E. coli | - | 2 | 2,81,9 | 2 | 2,81,9 | |
Candida spp. | - | 3 | 4,32,4 | 5 | 7,13,0* | |
Примечание:* - статистически значимая разница между показателями встречаемости микроорганизмов по дням жизни, р < 0,05
Таблица 3
Микробный пейзаж ротоглотки новорожденных ДО по суткам жизни
Микроорганизмы | 1 сутки (n=50) | 3 сутки (n=50) | ||
абс | % | абс | % | |
S. mitis | 15 | 30,06,4 | 38 | 76,06,0* |
S. oralis | 2 | 4,02,7 | 8 | 16,05,1* |
S. haemolyticus | - | 8 | 16,05,1 | |
S. warneri | 2 | 4,02,7 | ||
Lactobacillus spp. | 8 | 16,05,1 | 18 | 36,06,7* |
Candida spp. | 8 | 16,05,1 | - | |
Примечание:* - статистически значимая разница между показателями встречаемости микроорганизмов по дням жизни, р < 0,05
актобактерии встречались только в зеве новорожденных ДО (36,0%; lg 4,40,8). Представители транзиторной микрофлоры были обнаружены только в микробиоценозе зева новорожденных ОРИТ: E. faecalis (12,8%; lg 3,40,68 КОЕ/мл), K. pneumoniae (2,8%; lg 2,50,5КОЕ/мл), E. coli (2,8%; lg2,50,5 КОЕ/мл), Candida spp. (4,3%; lg 4,50,5КОЕ/ мл). Обнаружена прямая корреляционная связь между количеством выделенных в пупочном остатке микроорганизмов у детей ОРИТ и ДО (r=0,5; р<0,05) (Табл. 4).
Таблица 4
Микробный пейзаж пупочного остатка у новорожденных на 3 сутки
Микроорганизмы | ОРИТ (n=70) | ДО (n=50) | ||
% | M m, lgКОЕ/мл | % | M m, lg КОЕ/мл | |
S. warneri | 7,13,0 | 4,750,25 | 18,05,4* | 1,750,25 |
S. haemolyticus | 4,32,4 | 4,00,5 | 70,06,4* | 2,00,5 |
S. epidermidis | - | - | 6,03,3 | 2,00,5 |
E. faecalis | 18,64,6 | 4,70,1 | ||
E. faecium | 4,32,4 | 4,70,1 | ||
Примечание:* - статистически значимая разница между удельным весом микроорганизмов в разные сроки, р < 0,05
Установлено, что с 1-х суток жизни кожа подмышечных впадин новорожденных обоих отделений не была стерильной. В ОРИТ к 3 суткам преобладали грамположительные кокки S. warneri (14,3%; lg 3,80,4 КОЕ/мл), S. haemolyticus (1,4%; lg 3,00 КОЕ/мл), S. epidermidis (10,0%; lg 4,30,6 КОЕ/мл), E. faecalis (14,3%; lg 3,80,4 КОЕ/мл). В ДО были обнаружены S. warneri (92,0%; 3,80,4 КОЕ/мл) и S. epidermidis (4,0%; lg 3,90,6 КОЕ/мл).
Микробиоценоз кишечника новорожденных ОРИТ характеризовался как дисбиотический, что было обусловлено отсутствием лакто - и бифидобактерий, а также кишечной палочки с нормальной ферментативной активностью. Микробный пейзаж кишечника детей обоих отделений по аэробному спектру совпадал и был представлен Enterococcus spp., КОС, Candida spp. Максимальных значений достигали штаммы E. faecalis (74,35,2 и 66,06,6%), из КОС - S. haemolyticus (20,04,7 и 42,06,9%). В ДО удельный вес анаэробных бактерий родов Bifidobacterium spp. и Lactobacillus spp. составил 12,04,5% и 8,03,8% соответственно. Плотность популяций резидентной микрофлоры наблюдалось в количестве lg 6,5-7,5КОЕ/мл.
Исследованные локусы новорожденных, находящихся в ОРИТ, были контаминированы преимущественно грамположительными кокками, заселение происходило постепенно. Локусы детей ДО с первых суток активно заселялись микрофлорой. Наиболее разнообразный микробный пейзаж наблюдался в локусах новорожденных ОРИТ после 3 суток жизни. У детей ДО микробный фон формировался с первых суток, содержал грамположительные кокки, а также лакто- и бифидобактерии.
В процессе исследований цервикального канала беременных и родильниц выявлялась аэробная и анаэробная микрофлора. В обеих группах женщин выделялись анаэробы и грамположительные аэробные кокки. У беременных женщин в посевах преобладали бактерии рода Lactobacillus - 98,3%, у родильниц чаще высевались Bacteroides spp. - 53,0%. Исследования микробиоты ротоглотки, носа и грудного молока родильниц на третьи сутки после родов показали преобладание КОС во всех локусах. Обнаружена прямая корреляционная связь между показателями частоты встречаемости анаэробной и аэробной микрофлоры, выделенной из цервикального канала женщин до родов и в послеродовом периоде (r=0,56; р<0,01) (Табл.5).
Таблица 5
Характеристика микрофлоры цервикального канала беременных и родильниц
| Микроорганизмы | Беременные женщины (n=60) | Родильницы (n=34) | ||
% | M m, lgКОЕ/мл | % | M m, lgКОЕ/мл | |
S. warneri | 15,04,6 | 3,40,14 | 41,28,4* | 3,60,36 |
S. haemolyticus | 8,33,5 | 3,40,14 | - | |
S. epidermidis | 5,02,8 | 3,40,14 | 14,76,0 | 3,60,36 |
E. faecalis | 13,34,3 | 3,550,33 | - | |
E. coli с нормальной ферментативной активностью | 13,34,3 | 3,40,33 | 8,84,8 | 3,60,36 |
Candida spр. | 16,74,8 | 5,50,2 | 20,66,9 | 3,20,18 |
Lactobacillus spp. | 98,31,6* | 7,150,13 | 41,28,1 | 7,00,2 |
Bacteroides spp. | 5,02,8 | 3,30,3 | 53,08,5* | 3,40,12 |
Bifidobacterium spp. | 35,06,1 | 5,40,4 | 26,47,5 | 4,70,5 |
C. xerosis | 3,32,3 | 3,00 | - | |
Peptostreptococcus spp. | - | 5,9 | 3,00,3 | |
Примечание:* - статистически значимая разница между показателями удельного веса по группам микроорганизмов, р < 0,05
Спектр микроорганизмов, выделенных с ООС, был представлен в основном грамположительными кокками. КОС преимущественно выделялись с медицинского оборудования - 30,9%, специализированной одежды - 38,2%, предметов обихода - 37,6%. Энтерококки чаще выделялись со специализированной одежды персонала - 8,8%. Обнаружена прямая корреляционная связь между частотой высеваемости грамположительных кокков из различных локусов новорожденных обоих отделений и ООС (r=1,0; p<0,001); между частотой высеваемости КОС от женщин и от новорожденных (r=0,68; p<0,001); между частотой выделения КОС из подмышечных впадин детей и КОС из ООС (r=0,8; p<0,01); между частотой выделения КОС при исследовании пупочного остатка новорожденных и КОС из ООС (r=0,9; p<0,01).
Важным критерием при анализе эпидемиологической ситуации при ВБИ служит резистентность микроорганизмов. Проведено сравнение антибиотикограмм микроорганизмов, выделенных от новорожденных, от женщин и ООС. Резистентность КОС определяли к оксациллину, амикацину, ванкомицину, цефтазидину, эритромицину и меропенему. Из рода стафилококков исследовали часто встречающиеся штаммы S. warneri, S. epidermidis, S. haemolyticus. Сравнение резистентности к антибактериальным препаратам данных штаммов, выделенных от новорожденных ОРИТ и ДО, проводили по отдельным локусам. Установлено, что возбудители, выделенные с ООС, по уровню резистентности не отличались от таковых из биологических материалов. В структуре КОС, выделенных из биотопов беременных и родильниц, чаще резистентностью отличались штаммы родильниц (73,4%). В микробиоценозах биотопов новорожденных обоих отделений, женщин и ООС преобладали грамположительные кокки - S. warneri и E. faecalis. Во всех группах высевались штаммы S. warneri, обладавшие полирезистентностью, 17 из которых были использованы в серии экспериментальных исследований.
Опыт 1: КОС + лактобактерии
При изучении влияния лактобактерий на антибиотикорезистентные свойства штаммов S. warneri in vitro использовалась среда Мюллера-Хинтона с биологически активной добавкой. Контролем служила среда Мюллера-Хинтона без добавки. Зоны подавления роста с использованием ДДМ к ванкомицину увеличились с 18,32,6 мм на контрольных чашках до 19,01,6 мм на чашках с добавкой. К меропенему чувствительность выросла с 14,57,5 мм до 20,83,6 мм (p<0,05), к амикацину с 21,98,7 мм до 27,64,4 мм (р<0,01). Зоны подавления роста для оксациллина, эритромицина и цефтазидима остались без особых изменений (Рис. 1).
Обнаружены изменения МПК90 ванкомицина с 2 мг/л до 1 мг/л, меропенема с 16 до 8 мг/л, амикацина с 2 до 0,5мг/л. МПК оксациллина, эритромицина и цефтазидима составили 8 мг /л, 16 мг/л и 16 мг/л соответственно и в этой серии экспериментов не изменялись.
Рис.1. Изменение значений диаметров зон подавления роста (мм) под воздействием лактобактерий
Примечание: * - статистически значимая разница между зонами подавления роста до и после применения лактобактерий при р<0,05;
** - статистически значимая разница между зонами подавления роста до и после применения лактобактерий при р<0,01.
Опыт 2: КОС + аэроионы
В результате данного эксперимента через 60 и 90 минут воздействия аэроионами на засеянные культуры S. warneri изменений антибиотикорезистентности не выявлено. Микробное число на экспериментальных и на контрольных чашках при этих экспозициях было одинаково и составляло 9 lg (109) КОЕ. Через 120 минут воздействия аэроионами микробное число снизилось до 6 lg (106) КОЕ в 89% случаев. В течение эксперимента определяли антибиотикорезистентность анализируемых штаммов. Чувствительность к одним и тем же препаратам не отличалась в контроле и в результате воздействия потоком аэроионов.
Опыт 3: КОС + лактобактерии + аэроионы
Добавление в среду Мюллера-Хинтона взвеси лактобактерий с воздействием потока ОАИ в течение 90 и 120 минут вызывало незначительное снижение антибиотикорезистентности S. warneri. Однако наиболее существенные изменения антибиотикочувствительности штаммов S. warneri были получены при обработке потоком аэроионов в течение 180 мин. При данных условиях штаммы изменяли свою чувствительность к ряду антибиотиков; зона подавления роста вокруг диска с ванкомицином увеличилась с 18,32,6 мм до 22,73,0 мм (p<0,01), к меропенему с 14,57,5 мм до 27,03,3 мм (р<0,01), к амикацину с 21,98,7 до 27,16,4 мм (p<0,01), к оксациллину с 16,52,5 до 19,55,1 мм (p<0,05) (Рис. 2).
Рис. 2. Изменение значений диаметров зон подавления роста (мм) под воздействием аэроионов и лактобактерий
Примечание: *- статистически значимая разница между зонами подавления роста до и после применения ОАИ и лактобактерий при р<0,05;
** - статистически значимая разница между зонами подавления роста до и после применения ОАИ и лактобактерий при p<0,01.
Под влиянием потока отрицательно заряженных ионов с добавлением лактобактерий в питательный агар, штаммы S. warneri изменяли свою антибиотикорезистентность: зоны подавления роста увеличивались, МПК90 уменьшались. Обнаружены изменения МПК90 ванкомицина с 2 мг/л до 0,5 мг/л; меропенема с 16 мг/л до 4 мг/л; амикацина с 2 мг/л до 0,5 мг/л; оксациллина с 8 мг/л до 4 мг/л; МПК90 эритромицина и цефтазидима осталась без изменений (Табл. 6).
Вероятно, свойство антибиотикорезистентности, связанное большей частью с внехромосомными генами бактерий, снижается вследствие возникновения изменений в структурных единицах бактериальных плазмид или кодируемых ими ферментативных групп. Поэтому увеличение зон подавления роста выделенных штаммов S. warneri антибактериальными средствами под влиянием ОАИ при участии лактобактерий, возможно, происходит по механизму квантовой реакции с участием свободных электронов на фоне воздействия продуктов жизнедеятельности молочнокислых бактерий, обладающих природным антагонизмом в отношении стафилококков.
Таблица 6
Изменение антибиотикорезистентности штаммов S. warneri
| Антибиотики | Контроль МПК90 (мг/л) | Опыт 1: + лактобактерии | Опыт 2: + ОАИ | Опыт 3: + ОАИ + лактобактерии |
Ванкомицин | 2 | 1 | 0,5 | 0,5 |
Меропенем | 16 | 8 | 16 | 4 |
Амикацин | 2 | 0,5 | 2 | 0,5 |
Оксациллин | 8 | 8 | 4 | 4 |
Эритромицин | 16 | 16 | 16 | 16 |
Цефтазидим | 32 | 32 | 16 | 32 |
Таким образом, под влиянием потока отрицательно заряженных ионов и с добавлением лактобактерий в питательный агар штаммы S. warneri изменяли антибиотикорезистентные свойства: увеличивались зоны подавления роста при ДДМ, МПК90 снижалась в 92,2% проб. Безопасность и эффективность отрицательно заряженных аэроионов, их физиологичность и безусловное значение в деятельности живых организмов в соединении с облигатными симбионтами создают широкое поле возможностей их использования в профилактике внутрибольничного инфицирования, в первую очередь, рожениц, родильниц и новорожденных, при подготовке женщин к родам, в ОРИТ и ДО, особенно при условии применения антибактериальной терапии, возможно, и в других современных лечебно-профилактических учреждениях, где широко применяются химиотерапия и дезинфекция.
С целью нормализации микробиоты половых путей назначался бактериально-ферментный пробиотик Наринэ-ф-баланс по 5 мл 2 раза в день через рот, вагинально по 2 мл 2 раза в день орошением из шприца в течение 10 дней, затем пробиотик Биовестин-лакто вагинально орошением из шприца по 2 мл 1 раз в день в течение 7 дней. Микробиоценоз половых путей женщин, получивших комплексную терапию, значительно изменился (Табл.7).
Таблица 7
Микрофлора цервикального канала женщин в поздний послеродовый период
| Микроорганизмы | До коррекции, n=30 | В результате коррекции, n=30 | ||
абс | % | абс | % | |
S. warneri | 11 | 36,78,9 | 8 | 27,68,1 |
S. epidermidis | 16 | 53,39,1 | 26 | 89,75,5* |
E. coli | 9 | 30,08,3 | 1 | 3,43,3* |
Candida spp. | 30 | 100,0 | 4 | 13,86,2* |
Lactobacillus spp. | 2 | 6,74,5 | 28 | 96,53,3* |
Bifidobacterium spp. | - | - | 14 | 48,39,1* |
Bacteroides spp. | 4 | 13,36,1 | 8 | 27,68,1 |
Примечание: * - статистически значимая разница между содержанием микроорганизмов до и после применения пробиотиков, р < 0,05.
Таким образом, исследования симбионтов микробных ассоциаций новорожденных, беременных и родильниц, изучение влияния аэроионов и пробиотиков на их биологические свойства позволили расширить научные знания, разработать новые перспективные методы профилактики в условиях акушерско-гинекологического стационара. Изучив закономерности становления микробиоценозов новорожденных ДО и ОРИТ, их взаимосвязь с микробиотой матери и бактериальной обсемененностью ООС, стало возможным определить влияние на антибиотикорезистентность выделенных микроорганизмов ОАИ в присутствии лактобактерий, разработать метод коррекции микробиоты половых путей родильниц.
ВЫВОДЫ
- Микробиоценоз организма новорожденных начинает формироваться с ротоглоточного биотопа с первых суток жизни у детей ДО и третьих суток у новорожденных ОРИТ. У новорожденных ОРИТ к десятым суткам жизни определяются микробные ассоциации во всех биотопах, преобладают штаммы S. warneri (26,2%) и E. faecalis (32,16%), отсутствуют бифидо- и лактобактерии. У детей ДО к пятым суткам жизни происходит ассоциативное заселение всех биотопов с участием бифидо- и лактобактерий.
- Микробиоценозы половых путей беременных женщин и родильниц совпадают по видовому составу микроорганизмов, до родов в два раза чаще встречаются микробные ассоциации и преобладают лактобактерии (93,3% проб). В цервикальном канале родильниц значительно чаще встречаются бактероиды (53,0%), в других биотопах преобладают грамположительные кокки.
- Наиболее контаминированными объектами окружающей среды в ОРИТ, ДО и родовом блоке являются руки медицинского персонала (47,8%) и специализированная одежда (39,2%). Среди выделенных штаммов преобладают грамположительные кокковидные бактерии, среди них в трети случаев обнаруживается S. warneri.
- В различных биотопах новорожденных, беременных, родильниц и ООС преобладают грамположительные кокки - S. warneri, S. epidermidis, S. haemolyticus, E. faecalis, устойчивые к большинству применяемых в ОРИТ антибактериальных средств. Наибольшее количество резистентных штаммов выделено из биотопов родильниц (73,4%).
- Антибиотикорезистентность штаммов S. warneri, выделенных от новорожденных, женщин и ООС, в присутствии лактобактерий Lactobacillus acidophilus N.V.Ep. 317/402 к ряду антибиотиков (ванкомицин, меропенем, амикацин) снижается в среднем в два раза.
- Воздействие потока отрицательных аэроионов при экспозиции 120 минут приводит к снижению плотности популяции S. warneri с 8 lg (5х108) КОЕ до 6 lg (5х106) в 89% проб. Антибиотикорезистентность штаммов S. warneri при обработке потоком аэроионов с течение 180 минут в смеси с лактобактериями Lactobacillus acidophilus N.V.Ep. 317/402 снижается в среднем в четыре раза в 92,2% проб.
- Комплексный метод коррекции микрофлоры половых путей родильниц имеет высокую эффективность (96,7%), безопасен и физиологичен, позволяет большинству женщин нормализовать микрофлору половых путей, способствует ее восстановлению после родов.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Установленные закономерности формирования микробиоты новорожденных детского отделения и ОРИТ являются основой создания системы мер профилактики адаптационных нарушений у детей в условиях акушерско-гинекологического стационара.
2. Безопасность и эффективность отрицательно заряженных аэроионов, их физиологичность и безусловное значение в деятельности живых организмов в соединении с облигатными симбионтами создают широкое поле возможностей их использования в профилактике внутрибольничного инфицирования, в первую очередь, рожениц, родильниц и новорожденных, при подготовке женщин к родам, в ОРИТ и ДО, особенно при условии применения антибактериальной терапии, возможно, и в других современных лечебно-профилактических учреждениях, где широко применяются химиотерапия и дезинфекция.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:
- Шевчук Е.А. Анализ цитологических показателей и бактериальной колонизации секрета носоглотки при перинатальных повреждениях ЦНС у новорожденных / Е.А. Шевчук, Т.Д. Примак, Н.С. Туранова // Естествознание и гуманизм. - 2006. - Т.3, № 3. - С.49.
- Оценка инфекционной бактериолактии ав раннем и позднем послеродовом периодах / С.В. Калинина, Т.Д. Примак, Е.А. Шевчук // Естествознание и гуманизм. - 2006. - Т.3, № 4. - С. 81-82.
- Оценка микрофлоры организма здоровых женщин в дородовом и послеродовом периоде / С.В. Калинина, Б.С. Эрдынеева, Е.А. Шевчук, Т.Д. Примак // Сборник материалов международной научно-практической конференции: Третьи Тульские педиатрические чтения. - Тула, 2007. - С. 65-68.
- Шевчук Е.А. Цитологические и бактериальные показатели носоглотки детей / Е.А. Шевчук, Т.Д. Примак, Б.С. Эрдынеева // Материалы IX съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - Москва, 2007. - Т.2 . - С.315-316.
- Шевчук Е.А. Характеристика микробного биоценоза новорожденных и объектов окружающей среды / Е.А. Шевчук, Т.Д. Примак, Н.В. Кривошеева // Успехи современного естествознания. - 2007. - №4. - С. 96.
- Шевчук Е.А. Микробиологическое мониторирование в акушерском стационаре, как важный этап в организации эпидемиологического наблюдения / Е.А. Шевчук, Н.В. Кривошеева, И.Е. Мирхаева // Сборник статей, посвященный 85-летию санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации. - Чита, 2007. - С.171-172.
- Шевчук Е.А. Анализ данных эпидемиологического мониторинга в перинатальном центре / Е.А.Шевчук, Н.В. Кривошеева // Вестник российской военно-медицинской академии. - 2008. - № 2. - С.479.
- Шевчук Е.А. Действие аэроионов отрицательной полярности на микроорганизмы / Е.А. Шевчук, Б.С. Эрдынеева // Вестник Российского государственного медицинского университета: материалы III Международной (XII Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции. - Москва, 2008. - № 2. - С.348-349.
- A new method of treating staphylococcus carrier states / T.D. Primak, B.S. Erdyneeva, Eu.A. Shevchuk, S.V. Kalinina // European journal of natural history. - 2008. - № 1. - P.94-95.
10. Структурные и микр="no"> Ваш обозреватель не поддерживает встроенные рамки или он не настроен на их отображение.
GEUM RU