Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ На правах рукописи
Судницына Мария Викторовна
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МАЛОГО БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА HSPB6 С УНИВЕРСАЛЬНЫМ АДАПТЕРНЫМ БЕЛКОМ 14-3-3
03.01.04 - биохимия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва - 2012
Работа выполнена на кафедре биохимии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова.
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Гусев Николай Борисович
Официальные оппоненты:
Муронец Владимир Израилевич доктор биологических наук, профессор, Институт физико-химической биологии им. А.Н.
Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, зав. отделом биохимии животной клетки Воротников Александр Вячеславович кандидат биологических наук, Институт экспериментальной кардиологии Федерального государственного учреждения Российский кардиологический производственный комплекс Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, ведущий научный сотрудник
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук
Защита состоится 10 декабря 2012 года в 15 часов 30 мин на заседании диссертационного совета Д 501.001.71 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, биологический факультет Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, аудитория 389.
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан л___ ноября 2012 года.
Ученый секретарь диссертационного совета Медведева Марина Валерьевна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. В группу малых белков теплового шока объединяют белки с небольшой молекулярной массой от 12 до 43 кДа, обнаруженные во всех организмах от архей до млекопитающих [1, 2]. Общим свойством белков этой группы является наличие в их структуре так называемого -кристаллинового домена, расположенного в С-концевой части молекулы белка [3]. Этот домен имеет преимущественно -складчатую структуру и принимает участие в образовании димеров, которые являются строительными блоками при образовании крупных олигомерных комплексов, характерных для большинства малых белков теплового шока [4].
Основной функцией малых белков теплового шока является предотвращение агрегации частично денатурированных белков [1, 2, 4]. Связывая такие белки-субстраты, малые белки теплового шока способны передавать их либо на ATP-зависимые шапероны для последующего рефолдинга, либо ускорять процесс их протеолитической деградации в протеасомах или аутофагосомах [2, 5]. В настоящее время обнаружено 10 генов, кодирующих различные малые белки теплового шока человека [2, 4]. Одним из этих белков является малый белок теплового шока с кажущейся молекулярной массой 20 кДа, получивший обозначение HspB6 или Hsp20. Этот белок экспрессируется практически во всех тканях, особенно большие количества этого белка обнаружены в различных типах мышц [2, 6]. Как и все малые белки теплового шока, HspB6 обладает шапероноподобной активностью и связывает частично денатурированные белки, препятствуя их дальнейшей агрегации [7].
Помимо этого, HspB6 играет важную роль в регуляции расслабления гладкой мускулатуры, обладает кардиопротекторными свойствами, а также, вероятно, принимает участие в процессах агрегации тромбоцитов и регуляции инсулин-зависимого транспорта глюкозы в мышечных клетках [2, 8]. По крайней мере отчасти такая полифункциональность может быть обусловлена тем, что HspB6 является партнером универсального белка-адаптера 14-3-3, вовлеченного в регуляцию многочисленных и разнообразных внутриклеточных процессов [9, 10].
Белки семейства 14-3-3 найдены практически во всех эукариотических организмах, в организме человека экспрессируется 7 изоформ этого белка [11]. Эти белки представляют собой стабильные гомо- и гетеродимеры; считается, что димерная структура необходима для их эффективного функционирования [12]. Белки 14-3-3 преимущественно связывают ________________________________________________________________________________ Список сокращений: БСА - бычий сывороточный альбумин, МЭ - -меркаптоэтанол, ФМСФ - фенилметилсульфонилфторид, ЭДТА - этилендиаминтетраацетат, ATP - аденозинтрифосфат, cAMP - циклический аденозинмонофосфат, IgG - иммуноглобулины класса G, pHspB6 - фосфорилированный HspB6, SDS - додецилсульфат натрия, WT - белок дикого типа.
фосфорилированные белки-мишени и, таким образом, оказывают влияние на их активность, внутриклеточную локализацию и взаимодействие с другими партнерами. К настоящему времени описано более 300 потенциальных белков-мишеней 14-3-3 [13]. Взаимодействуя с таким большим количеством партнеров, 14-3-3 принимает участие во множестве различных процессов, таких как регуляция апоптоза, клеточного цикла, транскрипции, функционирования ионных каналов и переносчиков, организации цитоскелета [14]. 14-3-3 не только преимущественно взаимодействует с фосфорилированными белками-партнерами, но и сам может подвергаться фосфорилированию in vivo. Фосфорилирование Ser58, Ser184 и Thr232 может влиять на структуру и свойства 14-3-3, а также на его взаимодействие с белками-мишенями [15].
Запуск различных сигнальных каскадов в клетке приводит к активации циклонуклеотид-зависимых протеинкиназ, которые фосфорилируют HspB6 по остатку Ser16, окружение которого соответствует мотиву RXX(pS/pT)XP, узнаваемому 14-3-3 [16].
Фосфорилированный HspB6 приобретает способность взаимодействовать с 14-3-3.
Высказывается предположение, что взаимодействие HspB6 с 14-3-3 может лежать в основе механизма регуляции расслабления гладких мышц. Согласно гипотезе Брофи и соавт. [9, 17], фосфорилированный HspB6 способен вытеснять фосфорилированный кофилин из комплекса с 14-3-3. Освободившийся кофилин подвергается быстрому дефосфорилированию, активируется и способствует деполимеризации актина, что приводит к расслаблению гладких мышц. Учитывая тот факт, что концентрация HspB6 в мышцах достаточно высока, можно предположить, что фосфорилированный HspB6 может эффективно конкурировать со многими белками-партнерами 14-3-3 и тем самым опосредованно участвовать в регуляции многочисленных внутриклеточных процессов. В этой связи представлялось целесообразным провести подробное исследование взаимодействия HspB6 с 14-3-3, изучить влияние мутаций, имитирующих фосфорилирование 14-3-3, на его способность связывать HspB6, а также проанализировать влияние HspB6 на взаимодействие 14-3-3 с фосфорилированным кофилином.
Цель и задачи работы. Целью данной работы был подробный анализ взаимодействия HspB6 с 14-3-3 дикого типа, его мутантами, имитирующими фосфорилирование, а также мутантами, препятствующими димеризации. Помимо этого целью работы была проверка гипотезы о том, что HspB6 регулирует расслабление гладких мышц, вытесняя фосфорилированный кофилин из его комплекса с 14-3-3. В соответствии с этими целями были поставлены следующие задачи:
1. Используя различные методы, исследовать взаимодействие HspB6 c 14-3-3 дикого типа in vitro.
2. Проанализировать влияние мутаций, имитирующих фосфорилирование 14-3-3, на его способность связывать HspB6.
3. Исследовать взаимодействие HspB6 c мутантными формами 14-3-3, не способными образовывать димеры.
4. Изучить влияние фосфорилированного HspB6 на взаимодействие 14-3-3 с фосфорилированным кофилином.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Фосфорилирование протеинкиназой А резко увеличивает прочность взаимодействия HspB6 с 14-3-3 дикого типа, при этом образуется комплекс HspB6/14-3-3 со стехиометрией 1:2 или 2:2.
2. Мутации, имитирующие фосфорилирование, влияют на взаимодействие 14-3-3 с HspB6. При этом мутация S184E немного увеличивает, а мутация S58E значительно ослабляет взаимодействие 14-3-3 с фосфорилированным HspB6.
3. Мутации, предотвращающие димеризацию, не ослабляют взаимодействия 14-3-3 с HspB6. Образующийся комплекс HspB6/мономерный 14-3-3 имеет стехиометрию 1:1.
4. 14-3-3 не способен образовывать прочных комплексов с кофилином, фосфорилированным LIM-киназой.
Научная новизна и практическая ценность работы. Методами нативного электрофореза, химического сшивания, иммунопреципитации и гель-фильтрации исследовано взаимодействие фосфорилированного HspB6 с 14-3-3 дикого типа и его мутантными формами, имитирующими фосфорилирование по остаткам Ser58 (S58E), Ser1(S184E), Thr232 (T232E). Изучено взаимодействие фосфорилированного HspB6 с 12 мутантными формами 14-3-3 LAE1412QQR14 (WMW) и E5K5, LAE1412QQR(MMW), не способными к димеризации.
Установлено, что фосфорилированный HspB6 образует прочные комплексы с димером 14-3-3 дикого типа, стехиометрия которых составляет 1:2 или 2:2. Обнаружено, что мутации, имитирующие фосфорилирование 14-3-3, влияют на его взаимодействие с HspB6.
Мутация S184E немного увеличивает прочность комплекса 14-3-3 с HspB6, что является редким примером того, что фосфорилирование усиливает взаимодействие 14-3-3 с белкомпартнером. Мутация T232E немного ослабляет прочность взаимодействия 14-3-3 с HspB6, что согласуется с данными литературы, свидетельствующими о том, что фосфорилированный С-конец может конкурировать с белками-мишенями за связывание с субстрат-связывающим участком 14-3-3. Мутация S58E, приводящая к частичной диссоциации димеров и влияющая на структуру 14-3-3, ухудшает его взаимодействие с HspB6. Таким образом, регуляция взаимодействия HspB6 c 14-3-3 может осуществляться путем фосфорилирования 14-3-3.
Проанализировано связывание HspB6 с мутантными формами 14-3-3, не способными образовывать димеры. Установлено, что мономерные мутанты (так же как и белок дикого типа) избирательно взаимодействуют только с фосфорилированным HspB6, образуя прочные комплексы со стехиометрией 1:1.
Методами вестерн-блоттинга, нативного электрофореза, химического сшивания и гель-фильтрации установлено, что вне зависимости от фосфорилирования кофилин не способен взаимодействовать с 14-3-3. Установлено, что 14-3-3 не влияет на связывание кофилина с F- и G-актином. Таким образом, полученные данные опровергают высказанную в литературе гипотезу о том, что кофилин и 14-3-3 прочно взаимодействуют друг с другом и что фосфорилированный HspB6 может вытеснять кофилин из комплекса с 14-3-3 и, таким образом, регулировать расслабление гладких мышц. Тем не менее, представленные данные не исключают возможности опосредованного участия 14-3-3 и HspB6 в регуляции цитоскелета. Индуцированное действием гормонов увеличение концентрации фосфорилированного HspB6 в клетке может приводить к вытеснению из комплексов с 14-3-различных протеинкиназ (LIM-, TES-киназы) или протеинфосфатаз (Slingshot), участвующих в фосфорилировании/дефосфорилировании кофилина. Освободившиеся протеинкиназы/протеинфосфатазы могут влиять на степень фосфорилирования кофилина, следствием чего может стать реорганизация цитоскелета и последующее расслабление.
Исследования механизма действия фосфорилированного HspB6 на гладкую мускулатуру могут иметь важное практическое значение в сердечно-сосудистой хирургии и при разработке препаратов для лечения бронхиальной астмы.
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на международной конференции Biological motility: fundamental and applied science (Пущино 2012), на IV съезде биофизиков России (Нижний Новгород 2012).
Публикации. По материалам исследования опубликовано 4 печатные работы в рецензируемых журналах и 2 тезиса сообщений.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 119 страницах и включает рисунков и 3 таблицы.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования Выделение белков. HspB6, кофилин-1 и кофилин-2 человека, мутанты кофилина, имитирующие фосфорилирование (S3D), а также каталитический домен LIM-киназы экспрессировали в клетках E.coli штамма BL21(DE3)pLysS. Плазмиды, содержащие кДНК HspB6 и кофилинов, были любезно предоставлены к.б.н. А.С. Сейт-Неби. Мутантные формы кофилина были получены на основе кДНК белка дикого типа с помощью мутантных праймеров. Плазмида, несущая последовательность каталитического домена LIM-киназы, была любезно предоставлена доктором Г. Бокочем (Исследовательский институт Скриппс, Ла-Йолла, Калифорния, США). При выделении HspB6 использовали методы фракционирования сульфатом аммония, ионообменной хроматографии на Q-Sepharose и гидрофобной хроматографии на Phenyl-Sepharose. Очистку кофилина проводили с помощью фракционирования сульфатом аммония с последующей гель-фильтрацией на колонке Superdex 200. Частично очищенный каталитический домен LIM-киназы, содержащий последовательность из 8 гистидинов на С-конце, получали путем хроматографии бактериального лизата на колонке HisTrapHP. Рекомбинантный 14-3-3 дикого типа и его мутантные формы были любезно предоставлены к.б.н. Н.Н. Случанко. Рекомбинантная каталитическая субъединица протеинкиназы А была любезно предоставлена Е.В.
Мымриковым. Рекомбинантный каталитический фрагмент киназы PAK1 был любезно предоставлен к.б.н. А.Ю. Хапчаевым. Актин выделяли из ацетонового порошка из мышц кролика по методу Парди и Спудич [18].
Фосфорилирование белков проводили в буфере Ф, содержащем 20 мМ трис/HCl, мМ KH2PO4, pH 7,5, 3,5 мМ MgCl2, 14 мМ меркаптоэтанола (МЭ), 0,1 мМ фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ) и 0,1-0,15 мМ ATP, содержащей следовые количества [-32P]-ATP. В случае HspB6 реакцию начинали добавлением каталитической субъединицы протеинкиназы А и инкубировали реакционную смесь в течение 1 ч при 37С.
В случае кофилина каталитический домен LIM-киназы предварительно активировали в среде фосфорилирования с каталитическим фрагментом PAK-киназы, после чего начинали реакцию, внося кофилин и [-32P]-ATP, и инкубировали реакционную смесь в течение 2 ч при 37С. Для контроля включения радиоактивного фосфата во время инкубации отбирали аликвоты из реакционной среды, наносили их на фильтры Whatman 3MM, отмывали в 10% растворе трихлоруксусной кислоты и определяли радиоактивность на сцинтилляционном счетчике Rackbeta 1214 (LKB). Степень фосфорилирования HspB6 и кофилина составляла ~0.6-0.8 моль фосфата на моль белка.
Химическое сшивание проводили в буфере С (25 мМ трис/HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 14 мМ МЭ, 0,1 мМ ФМСФ), содержащем 0,05% глутарового альдегида. Пробы инкубировали 15 мин при 37С, после чего реакцию останавливали добавлением 4-кратного буфера для образцов, содержащего додецилсульфат натрия (SDS). Белковый состав проб анализировали методом SDS-электрофореза в градиентном 5-20% полиакриламидном геле. Окрашенные Кумасси R-250 гели сканировали и интенсивность пятен обсчитывали с помощью программы ImageJ. Высушенные гели подвергали авторадиографии.
Нативный электрофорез по методу Шауба и Перри [19] был использован для анализа взаимодействия HspB6 и кофилина с 14-3-3. В случае HspB6 и 14-3-3 буфер для образцов, разделяющий и концентрирующий гели, а также электродный буфер содержали 1 мМ MgCl2.
Смесь исследуемых белков наносили на 18% полиакриламидный гель и проводили электрофорез в течение 18 ч. В случае кофилина и 14-3-3 использовали 15% гель и электрофорез проводили в течение 2,5 ч. Для исследования взаимодействия кофилина с Gактином использовали метод нативного электрофореза [20]. Смесь G-актина, кофилина и 143-3 наносили на 10% полиакриламидный гель, содержащий 0,2 мМ ATP и 0,2 мМ CaCl2.
Электродный буфер также содержал 0,2 мМ ATP и 0,2 мМ CaCl2.
Гель-фильтрацию изолированных HspB6, 14-3-3 и кофилина, а также их смесей проводили на колонке Superdex 200 в буфере Г, содержащем 20 мМ трис/ацетат, pH 7,6, 1мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА, 14 мМ МЭ, 0,1 мМ ФМСФ. Полученные фракции анализировали методом SDS-электрофореза в 15% полиакриламидном геле. В случае если HspB6 или кофилин содержали радиоактивный фосфат, радиоактивность фракций определяли на сцинтилляционном счетчике Rackbeta 1214 (LKB). Для определения молекулярной массы образующихся комплексов колонку предварительно калибровали по белкам-стандартам с известной молекулярной массой.
Иммунопреципитацию комплексов HspB6 c 14-3-3 проводили с использованием моноклональных антител на HspB6 человека, предварительно иммобилизованных на BrCNактивированной сефарозе. Антитела были любезно предоставлены д.б.н. А.Г. Катрухой.
Иммобилизованные антитела добавляли к пробе, содержащей HspB6 и 14-3-3 в буфере И (мМ трис/ацетат, pH 7,6, 100 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА, 5 мМ МЭ, 0,1 мМ ФМСФ, 2 мг/мл БСА) и инкубировали в течение 30 мин при 25С при постоянном перемешивании. Сефарозу промывали несколько раз, осаждали центрифугированием и элюировали связавшиеся белки денатурирующим буфером для образцов, не содержащим МЭ. Сефарозу отделяли центрифугированием, а к полученным образцам добавляли МЭ и анализировали их состав методом SDS-электрофореза в 15% полиакриламидном геле. После окраски и отмывки гели подвергали количественному сканированию.
Метод наслаивания (overlay) использовали для анализа взаимодействия кофилина и HspB6 с 14-3-3, иммобилизованным на нитроцеллюлозной мембране. На мембрану наносили 1, 2 и 4 мкг 14-3-3 дикого типа. В первом случае мембраны инкубировали в буфере Т (20 мМ трис/HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 0,1% TWEEN20), содержащем 3% БСА и 0,4 мг/мл фосфорилированных в присутствии [-32P]-ATP кофилина или HspB6, в течение ночи при 4С. По окончании инкубации мембраны отмывали и подвергали авторадиографии. Во втором случае после сорбции 14-3-3 мембраны блокировали 5% раствором сухого молока, после чего инкубировали в течение ночи в буфере Т, содержащем 0,4 мг/мл фосфорилированного или нефосфорилированного кофилина. Мембраны отмывали и наличие кофилина на мембране определяли с помощью моноклональных антител на кофилин (Cell Signalling). Конъюгат вторичных антител с пероксидазой хрена был любезно предоставлен д.б.н. А.Г. Катрухой. Для детекции сигнала использовали набор Supersignal West Dura Extended Duration Substrate (Thermo Scientific).
Метод коседиментации использовали для анализа взаимодействия кофилина с Fактином. К предварительно полимеризованному актину добавляли кофилин и 14-3-3, инкубировали 30 мин при 25С и подвергали ультрацентрифугированию. Белковый состав осадка и супернатанта анализировали методом SDS-электрофореза. После окраски и отмывания проводили количественное денситометрирование гелей.
Результаты и их обсуждение Взаимодействие HspB6 с 14-3-3 и влияние мутаций, имитирующих фосфорилирование 14-3-3, на это взаимодействие Ранее в лаборатории Брофи [9] и в нашей группе [10] было установлено, что фосфорилированный малый белок теплового шока HspB6 является партнером 14-3-3.
Регуляция этого взаимодействия может осуществляться как посредством фосфорилирования HspB6, так и посредством фосфорилирования 14-3-3. Используя точечные мутации S58E, S184E, T232E, а также тройную мутацию 3Е, где все указанные остатки серина и треонина были заменены на глутамат, мы имитировали процесс фосфорилирования 14-3-3 и анализировали влияние этих мутаций на взаимодействие 14-3-3 с HspB6.
Для исследования взаимодействия двух белков мы использовали метод химического сшивания. Исследуемые белки инкубировали с глутаровым альдегидом и анализировали состав проб методом SDS-электрофореза. Если обработке глутаровым альдегидом подвергались изолированные белки, то на электрофореграмме удавалось выявить полосы, соответствующие мономерам и димерам HspB6 (рис.1А, дорожка 1) и мономерам и димерам 14-3-3 (рис.1А, дорожка 2). Указанные полосы были обнаружены и в случае, когда химическому сшиванию подвергали смесь нефосфорилированного HspB6 и 14-3-3 данные не представлены). Эти результаты полностью согласуются с данными литературы и свидетельствуют о том, что нефосфорилированный HspB6 не взаимодействует с 14-3-3. Если сшиванию глутаровым альдегидом подвергали смесь фосфорилированного HspB6 и различных форм 14-3-3, то на электрофореграммах удавалось выявить три дополнительные полосы (рис.1А, дорожки 3-7). В том случае, если в опыте использовался HspB6, фосфорилированный в присутствии [-32P]ATP, оказалось, что все три указанных дополнительных полосы содержат радиоактивный фосфат. Кроме того, появление указанных полос коррелировало с уменьшением интенсивности полосы димера Рис.1. Химическое сшивание 14-3-3. Все эти данные позволили заключить, фосфорилированного HspB6 и различных форм 14-3-3. А. Электрофореграмма сшитых что указанные полосы действительно глутаровым альдегидом изолированного HspB(1), изолированного 14-3-3 (2), смесей соответствуют комплексам, образованным фосфорилированного HspB6 c 14-3-3 дикого типа (3) и с его мутантами S58E (4), S184E (5), T232E фосфорилированным HspB6 и 14-3-3.
(6), 3E (7). Стрелками указано положение Определив кажущиеся молекулярные мономеров и димеров HspB6 и 14-3-3, а также сшитых комплексов и маркеров молекулярных массы сшитых комплексов и зная масс. Б. Суммарные интенсивности зон комплексов со стехиометрией 14-3-3/HspB6 2:1 и кажущиеся молекулярные массы HspB6 и 142:2.
3-3, можно сделать предварительное заключение о стехиометрии образующихся комплексов. Полоса с кажущейся молекулярной массой 48 кДа, вероятно, соответствует комплексу, образованному мономером HspB6 и мономером 14-3-3. Интенсивность этой полосы не зависела от мутаций, имитирующих фосфорилирование 14-3-3. Полосы с кажущимися молекулярными массами 80 и 100 кДа, по всей видимости, соответствуют комплексам, образованным мономером HspB6 и димером 143-3 и димером HspB6 и димером 14-3-3, соответственно. Интенсивность этих полос, а также сумма интенсивностей этих двух полос зависела от мутаций 14-3-3, имитирующих фосфорилирование (рис.1Б). Оказалось, что суммарная интенсивность двух указанных полос уменьшается в ряду S184E>WTT232E>3E>S58E. Представленные данные означают, что мутация S184E увеличивает, а мутация S58E уменьшает вероятность сшивания 14-3-3 с фосфорилированным HspB6.
Сходные результаты были получены при использовании метода нативного электрофореза. При проведении нативного электрофореза при щелочных значениях рН кислые белки (такие как HspB6 и 14-3-3) несут значительный отрицательный заряд, что ведет к дестабилизации взаимодействия между ними. Вероятно, именно поэтому мы не смогли выявить образования комплексов между 14-3-3 и фосфорилированным HspB6 в немодифицированной системе Шауба-Перри.
Если нативный электрофорез проводили в присутствии 1 мМ MgCl2, то на гелях удавалось выявить полосы, электрофоретическая подвижность которых отличалась от подвижности полос изолированного 14-3-3 (рис.2, дорожки 1-5) Рис.2. Нативный электрофорез изолированного 14или изолированного фосфорилированного 3-3 дикого типа (1), его мутантов S58E (2), S184E (3), T232E (4), 3E (5), изолированного HspB6, мигрирующего, по-видимому, в двух фосфорилированного HspB6 (6) и смесей фосфорилированного HspB6 c 14-3-3 дикого типа конформациях (рис.2, дорожка 6). Появление (7) и с его мутантами S58E (8), S184E (9), T232E (10), 3E (11). Стрелками помечено положение указанных полос сопровождалось изолированных белков и образующихся ослаблением интенсивности полос, комплексов.
соответствующих изолированным белкам (рис.2, дорожки 7-11), что позволяло предположить, что указанные полосы соответствуют комплексам, образованным двумя белками. Для подтверждения этого предположения указанные полосы вырезали из геля, экстрагировали из них белки и анализировали белковый состав методом SDS-электрофореза с последующей окраской серебром. Оказалось, что в составе полученного экстракта присутствовали как HspB6, так и 14-3-3 (данные не представлены), что позволяет утверждать, что указанные полосы действительно соответствуют комплексам, образованным HspB6 и 14-3-3. Как видно на рис.2, эти полосы обладают различной электрофоретической подвижностью, которая увеличивается в ряду S184E Это заключение было подтверждено методом иммунопреципитации. Фосфорилированный HspB6 инкубировали с 14-33 дикого типа или его точечными мутантами в присутствии моноклональных антител на HspB6, иммобилизованных на сефарозе. Аффинный сорбент тщательно отмывали, белки, связавшиеся Рис.3. Иммунопреципитация 14-3-3 дикого с сефарозой, элюировали буфером для образцов и типа (1) и его мутантов S58E (2), S184E (3), T232E (4) и 3E (5) с фосфорилированным состав проб анализировали методом SDSHspB6. Контроль на неспецифическую сорбцию 14-3-3 на сефарозе с электрофореза (рис.3). Как видно на рис.3, с HspBиммобилизованными антителами (6). Стрелками отмечено положение HspB6, 14связывается значительное количество 14-3-3-3, БСА, легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов и маркеров дикого типа и мутанта S184E, тогда как молекулярных масс. количество мутантов T232E, S58E и 3E, связавшихся с HspB6, заметно ниже. Интенсивность зоны 14-3-3, соосаждающегося с фосфорилированным HspB6, убывает в ряду S184E>WT>T232E>S58E3E. Стехиометрию комплексов, образующихся между фосфорилированным HspB6 и 14-33, анализировали методом гель-фильтрации. Вне зависимости от фосфорилирования изолированный HspB6 элюировался в виде симметричного пика с объемом элюции ~ 14,7 мл, а изолированный 14-3-3 - в виде пика с объемом элюции ~13,9 мл (рис.4А). Если на колонку наносили смесь нефосфорилированного HspB6 и 14-3-3, то на профиле элюции были выявлены только два пика с объемами элюции, полностью совпадающими с объемами элюции изолированных белков (данные не приведены). В том случае, если на колонку наносили смесь фосфорилированного HspB6 и 14-3-3, то на профиле элюции появлялся асимметричный пик с максимумом ~13,5 мл и небольшим плечом ~14,7 мл (рис.4А). Анализ белкового состава полученных фракций методом SDS-электрофореза показал, что в основном пике элюировался комплекс 14-3-3 и HspB6, а в плече - оставшийся несвязанным HspB6. Откалибровав колонку по белкам-стандартам, мы определили кажущиеся молекулярные массы изолированных белков и комплекса, образованного ими. Оказалось, что кажущаяся молекулярная масса изолированного 14-3-3, составляет ~85 кДа (что несколько больше ожидаемой молекулярной массы димера 14-3-3, равной 60 кДа), а молекулярная масса изолированного HspB6 составляет ~50 кДа (что соответствует молекулярной массе димера HspB6). Молекулярная масса комплекса, образованного двумя белками, составляет 110-120 кДа, что может соответствовать комплексу, состоящему из димера 14-3-3 и мономера HspB6 (85 кДа+25 кДа), либо комплексу, состоящему из димера 14-3-3 и димера HspB6 (85 кДа+50 кДа). Если на колонку наносили смесь HspB6 и S184E мутанта 14-3-3, то пик, соответствующий комплексу, сдвигался влево, в область больших молекулярных масс, а плечо, соответствующее свободному HspB6, уменьшалось по амплитуде (рис. 4Б). Это может свидетельствовать об образовании более прочного комплекса по сравнению с 14-3-дикого типа. В том случае, если на колонку наносили смесь HspB6 и мутантов S58E, T232E, 3E, то пик, соответствующий комплексу, сдвигался вправо, в сторону меньших молекулярных масс, а амплитуда плеча несколько возрастала (рис.4Б). Это свидетельствует об ослаблении взаимодействия HspB6 с указанными мутантами 14-3-3. К такому же заключению можно прийти, анализируя распределение радиоактивного фосфата, связанного с фосфорилированным HspB6, по профилю элюции. Если на колонку наносили смесь фосфорилированного HspB6 и S184E мутанта 14-3-3, то количество P в пике, соответствующем комплексу HspB6/14-3-3, было больше, чем количество P в пике, соответствующем изолированному HspB6. Соотношение указанных пиков менялось на противоположное, если на колонку наносили смесь фосфорилированного HspB6 и S58E, T232E или 3Е мутантов 14-3-3 (рис.4В). Измеряя Рис.4. Анализ взаимодействия фосфорилированного HspB6 с 14-3-3 методом радиоактивность в пике остающегося свободным гель-фильтрации. А. Профиль элюции изолированных 14-3-3 и фосфорилированного HspB6, или измеряя амплитуду пика HspB6 и эквимолярной смеси двух белков. Б. Профили элюции изолированного остающегося свободным HspB6, мы могли фосфорилированного HspB6 и его смеси с 143-3 дикого типа и его мутантами S58E и определить прочность комплексов, образуемых S184E. В. Распределение радиоактивности по фосфорилированным HspB6 с различными профилям элюции, представленным на панели Б. мутантами 14-3-3. Оказалось, что амплитуда пика свободного HspB6 возрастает в ряду S184E Данные литературы свидетельствуют о том, что фосфорилирование по остатку Serили мутации, имитирующие фосфорилирование этого участка, вызывают частичную диссоциацию димеров 14-3-3 [21, 22]. Кроме того, фосфорилирование этого остатка вызывает ослабление взаимодействия 14-3-3 с некоторыми белками-партнерами [23]. Полученные нами результаты также свидетельствуют о том, что мутация S58E значительно ослабляет взаимодействие 14-3-3 с фосфорилированным HspB6. Такой эффект мутации может быть вызван двумя причинами: частичным нарушением димерной структуры 14-3-или изменением структуры 14-3-3 вблизи амфипатической бороздки, обеспечивающей связывание белка-субстрата. Второе объяснение кажется нам более вероятным, поскольку в выбранных нами условиях S58E представлен преимущественно в виде димера, о чем свидетельствуют данные гель-фильтрации. Ser184 располагается в непосредственной близости от места связывания белковпартнеров 14-3-3 [24], и по данным литературы фосфорилирование этого остатка также может приводить к диссоциации комплексов 14-3-3 с некоторыми белками-партнерами [25]. В то же время, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что мутации, имитирующие фосфорилирование этого остатка, могут сопровождаться увеличением (а не уменьшением) прочности комплексов, образуемых 14-3-3 с одним из белков-партнеров. Если принять во внимание достаточно высокие концентрации HspB6 в некоторых клетках, то фосфорилирование 14-3-3 по Ser184 может вызвать быстрое вытеснение некоторых белковпартнеров 14-3-3 фосфорилированным HspB6. Как уже отмечалось, мутация T232E, расположенная в С-концевом участке 14-3-3, приводит к ослаблению взаимодействия 14-3-3 с фосфорилированным HspB6. Это может быть обусловлено конкуренцией между HspB6, взаимодействующим с субстратсвязывающим участком 14-3-3, и фосфорилированным С-концом, который также связывается в указанной области [26]. Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что мутации, имитирующие фосфорилирование 14-3-3, оказывают различное влияние на его взаимодействие с малым белком теплового шока HspB6. Взаимодействие малого белка теплового шока HspB6 с мутантными формами 14-3-3, не способными образовывать димеры Считается, что белки семейства 14-3-3 представлены в клетке в виде стабильных димеров, и при этом димерная структура обеспечивает как прочное связывания белковмишеней, так и эффективное функционирование белков семейства 14-3-3 [12]. Долгое время считалось, что мономеры 14-3-3 нестабильны, не способны прочно взаимодействовать с белками-мишенями и регулировать их активность. В то же время очевидно, что после синтеза на рибосоме в цитозоль на какое-то время освобождается мономер 14-3-3. Вероятно, именно наличие свободных мономеров делает возможным образование гетеродимеров 14-33. Кроме того, фосфорилирование Ser58 сопровождается частичной диссоциацией димеров и накоплением мономеров 14-3-3 [21]. Наконец, в последнее время появились данные об альтернативном сплайсинге, ведущем к появлению неспособных к димеризации мономерных форм 14-3-3, которые, по-видимому, способны выполнять некоторые функции димерных форм белка [27]. В связи с тем, что свойства мономеров 14-3-3 изучены достаточно поверхностно, представлялось целесообразным получить мономерные формы 14-3-3 и исследовать их взаимодействие с HspB6. В нашей лаборатории к.б.н. Н.Н. Случанко провел мутирование нескольких аминокислотных последовательностей, участвующих в димеризации 14-3-3, и получил мутанты WMW с заменами 12LAE1412QQR14 и MMW с заменами E5K5, 12LAE1412QQR14. Анализ физико-химических свойств этих мутантов показал, что введенные мутации не влияют на вторичную или третичную структуру, но полностью предотвращают димеризацию в широком диапазоне концентраций белка. Получив мономерные формы 14-3-3, мы могли приступить к анализу их взаимодействия с HspB6. Используя метод химического сшивания, мы исследовали взаимодействие фосфорилированного и нефосфорилированного HspB6 с мутантами WMW и MMW. Изолированные белки или их смесь инкубировали с глутаровым альдегидом, после чего анализировали состав проб методом SDS-электрофореза. Как видно на рис.5 (дорожки 2, 3), если сшиванию подвергали смесь нефосфорилированного HspB6 и WMW или MMW мутантов 14-3-3, то на электрофореграмме удавалось выявить только полосы, соответствующие мономерам (20кДа) и димерам (40 кДа) HspB6 и мономерам (30 кДа) WMW или MMW. Таким образом, WMW и MMW мутанты, в отличие от белка дикого типа (рис.5 дорожка 1), не способны образовывать сшитые димеры. Кроме того, эти мутанты не способны взаимодействовать с нефосфорилированным HspB6. Если сшиванию глутаровым альдегидом подвергали фосфорилированный HspB6 и мономерные формы 14-33 (рис.5, дорожки 6, 7), то помимо упомянутых выше полос, на электрофореграмме можно было обнаружить одну дополнительную полосу с кажущейся молекулярной массой 50 кДа. Указанная молекулярная масса хорошо соответствует молекулярной массе сшитого комплекса, состоящего из мономера 143-3 и мономера HspB6. Таким образом, мономерные формы 14-3-3 специфически взаимодействуют с фосфорилированным Рис.5. Химическое сшивание изолированного HspB6 и образуют с ним только один тип HspB6 (4), смеси нефосфорилированного HspB6 с 143-3 дикого типа (1) и его WMW (2) и MMW (3) комплексов со стехиометрией 1:1. мутантами, а также смеси фосфорилированного Следует отметить, что при сшивании HspB6 с 14-3-3 дикого типа (5) и его WMW (6) и MMW (7) мутантами. Стрелками указано положение глутаровым альдегидом 14-3-3 дикого мономеров и димеров HspB6 и 14-3-3, образующихся комплексов и маркеров молекулярных масс. типа образует с фосфорилированным HspB6 три типа комплексов со стехиометрией HspB6/14-3-3 равной 1:1, 1:2 и 2:2 (рис.5, дорожка 5). Метод нативного электрофореза в модифицированной системе Шауба-Перри был также использован для анализа взаимодействия мономерных мутантов 14-3-3 с HspB6. Как видно на рис.6 (дорожки 1-3), изолированные мономерные мутанты и 14-3-3 дикого типа обладают различной электрофоретической подвижностью. Это связано с различием в их размерах (14-3-3WT - димер, WMW и MMW - мономеры) и зарядах, которые изменяются у мономерных форм вследствие внесенных мутаций. При нанесении на гель смеси фосфорилированного HspB6 и различных форм 14-3-3 (рис.6, дорожки 57), удавалось выявить диффузные полосы с более низкой электрофоретической подвижностью, чем подвижность изолированных белков. Кроме того, появление этих полос сопровождалось ослаблением интенсивности полос изолированных Рис.6. Нативный электрофорез изолированных 14-3-3 дикого типа (1), его белков. Эти данные вместе с ранее полученными WMW (2), MMW (3) мутантов, фосфорилированного HspB6 (4), а также результатами свидетельствуют о том, что смеси фосфорилированного HspB6 с 14-3-дикого типа (5) и его WMW (6) и MMW (7) указанные полосы соответствуют комплексам, мутантами. Стрелками показано положение изолированных белков и образующихся образованным фосфорилированным HspB6 и 14-3-комплексов. дикого типа (рис.6, дорожка 5), а также его мономерными WMW (рис.6, дорожка 6) и MMW (рис.6, дорожка 7) мутантами. Таким образом, метод нативного электрофореза позволил выявить образование комплексов между фосфорилированным HspB6 и 14-3-3 дикого типа и его мутантными формами, не способными образовывать димеры. Для независимого подтверждения полученных результатов был использован метод иммунопреципитации. Фосфорилированный HspB6 и связавшиеся с ним различные формы 14-3-3 осаждали из раствора с помощью моноклональных антител на HspB6, иммобилизованных на сефарозе. Белковый состав проб анализировали при помощи SDSэлектрофореза. Полученные электрофореграммы сканировали и определяли относительное количество различных форм 14-3-3, связавшихся с HspB6. При проведении расчетов учитывали количество 14-3-3, не специфически сорбировавшееся на сефарозе в присутствии нефосфорилированного HspB6. Оказалось, что количество мономерных форм 14-3-3, соосаждающихся с HspB6, в среднем в 2 раза меньше, чем количество 14-3-3 дикого типа. Это может быть связано с тем, что стехиометрия комплекса HspB6/14-3-3 дикого типа отличается от стехиометрии комплекса HspB6/мономерные мутанты 14-3-3. Для более полной характеристики образующихся комплексов был использован метод гель-фильтрации. Изолированные мономерные мутанты 14-3-3 элюировались в виде симметричного пика с объемом элюции ~15,3 мл, а изолированный HspB6 вне зависимости от фосфорилирования элюировался в виде пика с максимумом при ~14,7 мл (рис.7А). Если на колонку наносили смесь нефосфорилированного HspB6 и мономерных мутантов 14-3-3, то профиль элюции совпадал с суммой профилей элюции изолированных белков (данные не приведены). В то же время, eсли на колонку наносили смесь фосфорилированного HspB6 и одного из исследуемых мутантов, то на профиле элюции были выявлены два плохо разрешенных пика с объемами элюции ~14,3 мл и ~15,2 мл (рис.7А). По данным SDSэлектрофореза в первом пике элюируется комплекс, образованный HspB6 и мономерным мутантом 14-3-3, а второй пик содержит оставшийся свободным мономер 14-3-3. Откалибровав колонку белками-стандартами с известными молекулярными массами, мы определили кажущуюся молекулярную массу комплекса и изолированных белков. Молекулярная масса WMW и MMW составила ~40 кДа, что сопоставимо с молекулярной массой мономера 14-3-3 (30 кДа). Молекулярная масса комплекса составила ~70 кДа. Учитывая то, что кажущаяся молекулярная масса димера HspB6 при гель-фильтрации составляет ~50 кДа, можно заключить, что комплекс с кажущейся молекулярной массой кДа состоит из мономера фосфорилированного HspB6 (~25 кДа) и мономера 14-3-3 (~кДа). Используя метод гель-фильтрации, мы попытались оценить константы диссоциации комплексов мономерных мутантов 14-3-3 с фосфорилированным HspB6 и сравнить их с константой диссоциации комплекса, образованного 14-3-3 дикого типа и HspB6. На колонку наносили пробы, содержащие фиксированную концентрацию фосфорилированного HspB6 и увеличивающиеся концентрации мутантов 143-3. Как видно на рис.7Б, увеличение концентрации 14-3-3 сопровождалось значительным увеличением амплитуды пика с максимумом ~15,2 мл, в котором элюируется свободный 14-3-3. Концентрацию свободного Рис.7. Исследование взаимодействия 14-3-3 определяли по амплитуде этого пика, фосфорилированного HspB6 с мономерным WMW мутантом 14-3-3. А. Профиль элюции используя предварительно построенный график изолированных HspB6, мутанта WMW и их зависимости амплитуды пика 14-3-3 от его эквимолярной смеси. Б. Профили элюции проб, содержащих фиксированную концентрацию концентрации в пробе, нанесенной на колонку. HspB6 и увеличивающиеся концентрации мутанта WMW. Зная концентрацию свободного 14-3-3 и общие концентрации 14-3-3 и HspB6 в пробе и принимая стехиометрию образующегося комплекса равной 1:1, строили график зависимости концентрации связанного 14-3-3 от концентрации свободного 14-3-3 и рассчитывали кажущуюся константу диссоциации. Определенные таким способом константы диссоциации составили 1,20,1 и 1,40,3 М для комплексов, образованных WMW и MMW мутантами, соответственно. Значение константы диссоциации для комплекса, образованного 14-3-3 дикого типа, полученное ранее в нашей лаборатории, составило 7,12,1 М. Таким образом, мономерные мутанты связываются с фосфорилированным HspB6 со сродством сопоставимым или даже несколько большим, чем 14-3-3 дикого типа. Суммируя этот раздел, можно заключить, что мономерные мутанты 14-3-специфически и с высоким сродством взаимодействуют с фосфорилированным HspB6. Образующиеся при этом комплексы имеют стехиометрию 1:1 и отличаются в этом отношении от комплексов HspB6/14-3-3 дикого типа, стехиометрия которых составляет 1:или 2:2. Взаимодействие 14-3-3 с кофилином и влияние HspB6 на это взаимодействие Известно, что фосфорилирование малого белка теплового шока HspBциклонуклеотид-зависимыми протеинкиназами коррелирует с расслаблением гладкой мускулатуры [28, 29]. Для объяснения этой корреляции было выдвинуто несколько гипотез. Согласно одной из наиболее популярных гипотез считалось, что фосфорилированный HspBвытесняет фосфорилированный кофилин из его комплекса с 14-3-3 [9, 17]. Освободившийся кофилин подвергается быстрому дефосфорилированию, активируется и вызывает деполимеризацию фибриллярного актина. Следствием этого является перестройка актинового цитоскелета и расслабление гладких мышц. Очевидно, что эта гипотеза основана на предположении, что фосфорилированный кофилин прочно взаимодействует с 14-3-3. Действительно, в ставшей классической работе Бокоча и соавт. [30] методом наслаивания (overlay) было установлено, что фосфорилированный кофилин прочно взаимодействует с 143-3. Мы попытались воспроизвести эти данные. Для этого кофилин-1 фосфорилировали активированной LIM-киназой, а HspBфосфорилировали cAMP-зависимой протеинкиназой в присутствии радиоактивной ATP. 14-3-3 наносили на нитроцеллюлозу и инкубировали в растворе, содержащем либо 20 М фосфорилированного HspB6, либо 20 М фосфорилированного кофилина. Мембрану Рис.8. Взаимодействие кофилина и тщательно отмывали от радиоактивных белков и HspB6 с 14-3-3, иммобилизованным на нитроцеллюлозной мембране. подвергали авторадиографии. При такой постановке Мембрану с иммобилизованным 14-3-(1-4 мкг) инкубировали в растворе, опыта оказалось, что оба фосфорилированных белка содержащем фосфорилированный радиоактивный кофилин (А) или одинаково эффективно связываются с фосфорилированный радиоактивный иммобилизованным 14-3-3 (рис. 8). На первый взгляд, HspB6 (Б), мембрану отмывали и подвергали авторадиографии. эти результаты хорошо согласуются с проверяемой нами гипотезой. Однако связывание кофилина наблюдалось только при высокой концентрации белка (20 М), что значительно превышает константу диссоциации комплекса кофилин/14-3-3 (60-100 нМ), приводимую в литературе [30]. Кроме того, оказалось, что связывание с 14-3-3 не зависит от фосфорилирования кофилина. Действительно, при инкубации иммобилизованного на нитроцеллюлозе 14-3-3 с фосфорилированным или нефосфорилированным кофилином с последующей окраской антителами на кофилин оказалось, что с мембраной связывается примерно равное количество обоих белков (данные не представлены). Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что как фосфорилированный, так и нефосфорилированный кофилин неспецифически взаимодействует с иммобилизованным на нитроцеллюлозе 14-3-3 с более низким сродством, чем указывалось в литературе. Для проверки этого заключения мы обратились к исследованию взаимодействия 14-3-3 и кофилина в растворе. Методы нативного электрофореза и химического сшивания позволяют выявить образование комплексов между фосфорилированным HspB6 и 14-3-3 (см. рис. 1, 2). Однако, используя эти методы, мы не смогли обнаружить формирование комплексов между 14-3-3 и фосфорилированными LIM-киназой кофилином-1 и кофилином-2 или мутантами S3D, имитирующим фосфорилирование кофилина (данные не представлены). Метод гель-фильтрации был также использован для анализа взаимодействия кофилина с 14-3-3. При гель-фильтрации изолированный кофилин-1 элюируется в виде симметричного пика с объемом элюции ~16,мл, а изолированный 14-3-3 - в виде пика с объемом элюции ~14 мл (рис.9А). Если на колонку наносили смесь исследуемых белков, то независимо от степени фосфорилирования кофилина профиль элюции полностью совпадал с алгебраической суммой профилей элюции изолированных белков (рис.9А). Аналогичный результат был получен, если гель-фильтрации подвергали смесь кофилина-1 и WMW мутанта 14-3-3, не способного образовывать димеры (рис.9Б). Рис.9. Исследование взаимодействие кофилина Согласно гипотезе Брофи и соавт. [9, 17] и 14-3-3 методом гель-фильтрации. А. Профиль фосфорилированный кофилин и элюции изолированного кофилина (точечная линия), изолированного 14-3-3 (пунктирная фосфорилированный HspB6 конкурируют линия) и их смеси (сплошная линия). Б. Профиль элюции изолированного кофилина между собой за связывание с 14-3-3. Мы (точечная линия), изолированного WMW мутанта 14-3-3 (пунктирная линия) и их смеси попытались проверить это предположение (сплошная линия). методом гель-фильтрации. Для этого мы исследовали влияние кофилина на образование комплекса 14-3-3 с HspB6. Как было показано ранее (см. рис.4А), смесь 14-3-3 и фосфорилированного HspB6 элюируется в виде асимметричного пика с объемом элюции ~13,5 мл. Передняя часть этого пика содержит комплекс фосфорилированного HspB6 и 14-3-3. Если в пробу до гель-фильтрации добавляли фосфорилированный кофилин-1, то ни положение указанного пика на профиле элюции, ни его амплитуда или белковый состав не изменялись, а добавленный кофилин элюировался в виде изолированного пика с объемом элюции ~16,5 мл (данные не представлены). Таким образом, полученные результаты позволяют заключить, что фосфорилированный кофилин и 14-3-3 не способны образовывать прочного комплекса в растворе. Рис.10. Исследование взаимодействия кофилина с F-актином в отсутствие и в присутствии 14-3-3 методом коседиментации. А. Доля нефосфорилированного кофилина, соосаждающегося с F-актином (Р) и остающегося в супернатанте (S) в отсутствие (белые столбики) и в присутствии (серые столбики) 14-3-3. Б. Доля фосфорилированного кофилина, соосаждающегося с F-актином (Р) и остающегося в супернатанте (S) в отсутствие (белые столбики) и в присутствии (серые столбики) 14-33. Цифрами под чертой обозначены суммарные концентрации кофилина в пробах. В литературе были указания на то, что 14-3-3 может частично предотвращать взаимодействие кофилина с F-актином [31]. Для проверки этого предположения был использован метод коседиментации, основанный на соосаждении фибриллярного актина и актин-связывающих белков. Как и следовало ожидать, нефосфорилированный кофилин-соосаждается с F-актином, причем количество кофилина в осадке возрастает с увеличением концентрации кофилина в пробе (рис.10А). В то же время фосфорилированный кофилин-1 не взаимодействует с F-актином и практически целиком остается в супернатанте после ультрацентрифугирования (рис.10Б). Добавление 14-3-3 в пробы не влияло на распределение кофилина между супернатантом и осадком, что свидетельствует об отсутствии конкуренции между 14-3-3 и актином за связывание кофилина. Используя метод нативного электрофореза [20], мы проанализировали Рис.11. Нативный электрофорез влияние 14-3-3 на взаимодействие кофилина-1 с изолированного кофилина (1), изолированного 14-3-3 (2), изолированного актина (3), смеси G-актином. Как видно на рис.11, изолированный актина и кофилина в трех разных 14-3-3 (рис.11, дорожка 2) и изолированный концентрациях (4-6), смеси актина и 14-3-3 в двух разных концентрациях (7, 8), смеси актин (рис.11, дорожка 3) обладают высокими актина, кофилина и 14-3-3 (9, 10). электрофоретическими подвижностями, в то время как кофилин, имеющий щелочную изоэлектрическую точку, практически не входит в гель (рис.11, дорожка 1). При нанесении на гель смеси кофилина и G-актина удавалось выявить полосы с промежуточной электрофоретической подвижностью, соответствующие комплексам, образованным двумя белками (рис.11, дорожки 4-6). Добавление 14-3-3 не влияло ни на интенсивность, ни на электрофоретическую подвижность этих полос (рис.11, дорожки 9, 10). Это свидетельствует о том, что 14-3-3 не оказывает существенного влияния на взаимодействие кофилина с Gактином. Данные, представленные в этом разделе, позволяют заключить, что вне зависимости от степени фосфорилирования кофилин слабо взаимодействует с 14-3-3. Используя методы химического сшивания, нативного электрофореза и гель-фильтрации, нам не удалось обнаружить образования прочных комплексов между кофилином и 14-3-3. При этом эти же методы убедительно свидетельствуют о том, что 14-3-3 прочно взаимодействует с HspB6. Кроме того, 14-3-3 не влияет на взаимодействие кофилина с F- и G-актином. Все эти факты исключают возможность того, что прямое взаимодействие кофилина и 14-3-3 может лежать в основе регуляции цитоскелета и регуляции сократительной активности гладкой мускулатуры. В то же время представленные данные не исключают возможности опосредованного участия HspB6 и 14-3-3 в реорганизации цитоскелета. Известно, что 14-3-образует комплексы с LIM- и TES-киназами [31, 32] и фосфатазой Slingshot [33], участвующими в фосфорилировании/дефосфорилировании кофилина. Представляется вероятным, что индуцированное действием гормонов повышение концентрации фосфорилированного HspB6 может привести к вытеснению указанных протеинкиназ/протеинфосфатаз из их комплексов с 14-3-3 и изменению степени фосфорилирования кофилина, что в свою очередь будет сопровождаться реорганизацией актинового цитоскелета и последующим расслаблением. ВЫВОДЫ 1. Установлено, что фосфорилированный cAMP-зависимой протеинкиназой HspBпрочно взаимодействует с 14-3-3; образующиеся комплексы HspB6/14-3-3 имеют стехиометрию 1:2 или 2:2. 2. Мутации, имитирующие фосфорилирование, влияют на связывание 14-3-3 с HspB6, при этом мутация S58E ослабляет, а мутация S184E увеличивает прочность образующегося комплекса. 3. Мутации, предотвращающие димеризацию, не влияют на способность 14-3-избирательно и с высоким сродством взаимодействовать с фосфорилированным HspB6; стехиометрия образующихся комплексов составляет 1:1. упным ценам.