Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии  

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

Белимов Андрей Алексеевич

взаимодействие ассоциативных бактерий и растений в зависимости от биотических и абиотических факторов

03.00.07 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Санкт-Петербург - 2008

Работа выполнена в Государственном научном учреждении

Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор,

академик Россельхозакадемии Тихонович Игорь Анатольевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор, чл.-корр. РАН Боронин Александр Михайлович

доктор биологических наук  Кравченко Лев Витальевич

доктор биологических наук,

профессор  Умаров Марат Мутагарович

Ведущая организация:

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН

(г. Саратов)

Защита состоится  ЕЕ. ЕЕЕЕЕЕЕ.. 2009 г. .. в ЕЕ.Ечас 

на заседании совета ДМ 212.232.07

по защите докторских и кандидатских диссертаций

при Санкт-Петербургском государственном университете

по адресу: 199034, г. Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9,

Биолого-почвенный факультет, ауд. ЕЕ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. А.М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан ЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕ2008 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета  Шарова Е.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность темы

Увеличение продуктивности сельскохозяйственных культур, эффективное и ограниченное использование удобрений и средств защиты растений, а также повышение устойчивости и адаптации растений к неблагоприятным агроклиматическим условиям и антропогенным воздействиям являются актуальными для сельского хозяйства, а также для решения экологических проблем и охраны окружающей среды. Данные вопросы привлекают внимание многих ученых, работающих в различных областях науки: растениеводстве, почвоведении, агрономии, агрохимии, экологии, микробиологии и других. Особенно важными для решения этих задач являются микробиологические подходы и приемы, которые основаны на использовании потенциала растений и почвенных микроорганизмов, и биологических механизмов взаимодействия компонентов растительно-микробных систем. Известно, что почвенные микроорганизмы активно взаимодействуют с растениями и могут оказывать как положительные, так и отрицательные эффекты на их рост и питание. В настоящее время накоплен большой материал о механизмах положительных воздействий ассоциативных ризосферных бактерий на растения. К таким механизмам относятся фиксация атмосферного азота, продуцирование биологически активных веществ, активизация потребления корнями питательных элементов, биоконтроль фитопатогенов и индуцирование системной устойчивости растений.

       Основываясь на знаниях о взаимодействии растительно-бактериальных ассоциаций и примерах улучшения роста и питания растений посредством инокуляции полезными формами микроорганизмов, нами была изучена роль некоторых биотических и абиотических факторов в растительно-бактериальных взаимодействиях и оценена возможность применения ассоциативных бактерий для повышения устойчивости растений к различным стрессовым факторам. Основными предпосылками проведенных исследований были следующие рассуждения. Во-первых, растения, находясь в неблагоприятных условиях среды или атакуемые патогенными микроорганизмами, нуждаются в дополнительных ресурсах питания и энергии, оптимизации гормонального статуса, и снижения интенсивности воздействия стрессоров. Во-вторых, перечисленные выше положительные эффекты ассоциативных бактерий затрагивают именно те процессы метаболизма растений и их взаимодействия с окружающей средой, которые нарушаются при стрессе. Поэтому логично предположить, что бактериальные эффекты потенциально ориентированы против негативных воздействий стрессоров и могут быть особенно важны для растений именно в неблагоприятных условиях. В-третьих, растительно-микробные ассоциации являются надорганизменными системами, обладающими новыми и уникальными качествами, и это может существенно влиять на адаптацию партнеров к стрессовым факторам и повышать уровень гомеостаза самой ассоциации.

Цели и задачи исследований

       Основной целью проведенных исследований являлось получение новых знаний о механизмах взаимодействия растений с полезными формами почвенных микроорганизмов в зависимости от биотических факторов, обусловленных активностью и взаимодействием ризосферных бактерий, и условий внешней среды, которые проявляются как абиотические стрессы. С одной стороны, представлялось важным оценить влияние внешних биотических и биотических факторов на взаимодействие растительно-бактериальных ассоциаций, а с другой стороны, изучить роль ассоциативных бактерий в адаптации растений к стрессам. Особое внимание уделялось изучению преимуществ, которые растения получают при образовании эффективных ассоциаций с полезными микроорганизмами для противостояния негативным воздействиям окружающей среды, и механизмов интеграции растений с микроорганизмами в ризосфере в зависимости от внешних условий. Получение таких знаний направлено на раскрытие значения микробных ассоциаций и взаимодействий бактерий в ризосфере для роста и питания растений, а также на обоснование и эффективное использование потенциала микроорганизмов в их способности повышать устойчивость растений к стрессовым факторам.

       Конкретные задачи исследований состояли в следующем:

  1. Изучить взаимодействие производственных штаммов ассоциативных бактерий в питательных средах и ризосфере, а также оценить их влияние на рост и питание растений при совместной интродукции на семена. Описать аддитивные эффекты и механизмы взаимодействия ассоциаций азотфиксирующих и фосфатмобилизующих штаммов с растениями.
  2. Выделить и охарактеризовать группу бактерий, доминирующих в ризосфере проростков растений, по их влиянию на рост растений и коллекционных штаммов ростстимулирующих бактерий. Оценить значение фактора взаимодействия производственных штаммов ассоциативных бактерий с аборигенной бактериальной микрофлорой ризосферы ячменя.
  3. На основе принципа популяционного доминирования бактерий в ризосфере проростков провести селекцию эффективных ростстимулирующих штаммов. Рассмотреть колонизирующую активность интродуцируемых штаммов как фактор, влияющий на эффективности инокуляции.
  4. Выделить и изучить штаммы бактерий, активно колонизирующие ризосферу гороха и горчицы сарептской и обладающих АЦК-деаминазной активностью, которая рассматривается как важный механизм стимуляции роста растений в стрессовых условиях.
  5. Изучить влияние производственных штаммов и вновь выделенных АЦК-утилизирующих штаммов на устойчивость растений к стрессу, вызванному тяжелыми металлами. Оценить воздействие бактерий на аккумуляцию токсичных и питательных элементов.
  6. Показать зависимость эффективности инокуляции бактериями, содержащими АЦК деаминазу, от обеспеченности растений питательными элементами. Изучить влияние уровня минерального питания растений на гомеостаз растительно-бактериальных ассоциаций.
  7. Оценить эффективность инокуляции ячменя производственными штаммами ассоциативных бактерий при стрессах, вызванных неблагоприятными почвенно-климатическими факторами, а именно экстремальными температурами, повышенной кислотностью почвы и засухой.
  8. Изучить роль фермента АЦК деаминазы в реакции растений гороха и томатов на инокуляцию АЦК-утилизирующими бактериями в условиях дефицита почвенной влаги.

Научная новизна

       В работе использованы оригинальные подходы для изучения взаимодействия штаммов ассоциативных бактерий друг с другом и с аборигенной ризосферной микрофлорой. С одной стороны это позволило экспериментально продемонстрировать важность популяционных отношений интродуцируемых бактерий для проявления их ростстимурирующих эффектов на растение, а с другой стороны дало новую информацию о причинах нестабильности эффектов интродуцентов или искажения ожидаемой реакции растения на инокуляцию. Впервые проведены детальные исследования поведения ассоциативных бактерий в ризосфере в стрессовых условиях, вызванных различными почвенно-климатическими факторами, что внесло вклад в понимание динамики интродуцируемых бактериальных популяций и роли партнеров в формировании растительно-бактериальных ассоциаций в зависимости от условий среды. Новизной обладают методические приемы селекции и результаты исследований ассоциативных бактерий, содержащих АЦК деаминазу. Изучение функционирования ассоциаций ризосферных бактерий с растениями в стрессовых условиях позволило получить уникальную информацию об устойчивости и механизмах интеграции компонентов таких растительно-микробных систем.

       Ниже перечислены наблюдения, закономерности или методические приемы, которые были установлены или разработаны в ходе исследований:

  1. Выявлена бинарная ассоциация производственных штаммов Azospirillum lipoferum 137 и Agrobacterium radiobacter 10, в которой азоспириллы активнее фиксируют азот и лучше приживаются на корнях растений. Впервые показано, что проявление симбиотических свойств партнеров ассоциации азотфиксирующих и фосфатмобилизирующих бактерий в ризосфере может быть важным механизмом усиления положительного эффекта интродуцентов на рост растений.
  2. Впервые, с использованием метода изотопной индикации, установлено, что фосфатмобилизующие бактерии способны улучшать фосфорное питание растений за счет активизации поглощения фосфорного удобрения. Получены оригинальные результаты показавшие, что проявление аддитивного эффекта совместной инокуляции растений бактериями Az. lipoferum 137 и Ag. radiobacter 10 связано с индивидуальными особенностями механизмов воздействия этих штаммов на азотное и фосфорное питание растения. Образование данной растительно-бактериальной системы приводит к повышению коэффициента использования растениями азотного и фосфорного удобрения.
  3. Впервые изучена динамика численности производственных штаммов ростстимулирующих бактерий в ризосфере различных сельскохозяйственных культур и почве. Показано, что штаммы активно колонизируют корни в различных почвенно-климатических условиях, в том числе при выращивании растений на загрязненных и кислых почвах, а также в условиях засухи. Обнаружены индивидуальные особенности штаммов, обусловленные генетическим контролем способности интродуцентов поддерживать численность популяции в ризосфере на определенном уровне.
  4. Получены оригинальные данные о важности взаимодействия интродуцируемых штаммов с аборигенной бактериальной микрофлорой ризосферы растений. Впервые выделена и охарактеризована ассоциация ростстимулирующего интродуцента с фитопатогенным видом бактерий и описана способность биоконтрольных интродуцентов ингибировать активность полезных форм аборигенных бактерий.
  5. Предложен метод селекции эффективных штаммов ростстимулирующих бактерий, обладающих высокой степенью ассоциативности, которая проявляется в их способности активно колонизировать корни проростков растений в нестерильной почве. Были изучены свойства и влияние на растения представителей сообществ культурабельных бактерий, доминирующих на корнях проростков ячменя, гороха и горчицы сатептской при выращивании растений на различных почвах, в том числе на загрязненных металлами почвах, на осадках сточных вод и горных отвалах. В результате исследований отселектированы штаммы с высоким потенциалом колонизации ризосферы, которые не уступают производственным штаммам по ростстимулирующей активности.
  6. Впервые выделены и детально охарактеризованы устойчивые к тяжелым металлам ростстимулирующие бактерии, содержащие фермент АЦК деаминазу и колонизирующие ризосферу проростков растений, выращенных на загрязненных почвах. У большинства видов выделенных нами бактерий присутствие АЦК деаминазы ранее не было описано.
  7. Впервые показано, что производственные штаммы ризобактерий и выделенные в ходе работы АЦК-утилизирующие бактерии повышают устойчивость инокулированных растений к токсичности кадмия и свинца. Важным механизмом ростстимулирующего эффекта бактерий на растения в присутствие тяжелых металлов является их способность поддерживать нормальное минеральное питание растений, и этим противодействовать негативному действию токсикантов.
  8. Проведены оригинальные исследования о зависимости взаимодействия АЦК-утилизирующих бактерий с растениями от уровня минерального питания. Показано, что ростстимулирующий эффект бактерий может нивелироваться при дефиците фосфора и избытке азота в среде.
  9. Экспериментально обоснована способность производственных штаммов ассоциативных бактерий повышать устойчивость инокулированных растений к негативному действию стрессов, вызванных неблагоприятными почвенно-климатическими факторами, такими как экстремальные температуры, повышенная кислотность почвы и засуха.
  10. Впервые с помощью бактериального мутанта с пониженной активностью АЦК деаминазы и химических ингибиторов фитогормона этилена показана важная роль этого фермента в повышении устойчивости инокулированных растений к дефициту почвенной влаги.
  11. Впервые описано положительное действие бактерий, содержащих АЦК деаминазу, на образование симбиоза бобового растения с клубеньковыми бактериями при дефиците влаги. Совместная инокуляция гороха этими бактериями существенно повышала количество клубеньков на корнях, как в оптимальных, так и в стрессовых условиях, вызванных недостаточным увлажнением.
  12. Впервые изучен эффект бактериальной АЦК деаминазы на транспорт сигнальных молекул АЦК и абсцизовой кислоты (АБК) из корня в побег. Снижение концентрации АЦК и повышение концентрации АБК в ксилемном соке при инокуляции в условиях засухи указывает на индукцию бактериями системной устойчивости у растений.
  13. Впервые обнаружено стимулирующее воздействие АЦК-утилизирующих бактерий на развитие корневых волосков у инокулированных растений.

Практическая ценность

Исследования имеют важное практическое значение для развития экологически безопасного и ресурсосберегающего сельскохозяйственного производства и поиска путей решения ряда экологических проблем:

  1. Выделенные штаммы ростстимулирующих ассоциативных бактерий, которые являются активными колонизаторами корней и оказывают положительное действие на рост и минеральное питание растений, представляют собой ценный биологический ресурс для проведения прикладных исследований в земледелии. Штаммы АЦК-утилизирующих бактерий служат перспективными объектами для создания биопрепаратов нового типа, обладающих специализированным антистрессовым эффектом на растения и эффективных в неблагоприятных условиях, вызванных почвенно-климатическими и антропогенными факторами.
  2. Экспериментальные данные о воздействиях производственных штаммов на растения и колонизации ризосферы интродуцентами обосновывают возможности эффективного применения биопрепаратов в широком диапазоне варьирования почвенно-климатических факторов, а том числе при стрессах, вызванных экстремальными температурами, повышенной кислотностью почвы, засухой и токсичностью тяжелых металлов.
  3. Ряд наблюдений и выявленных закономерностей могут быть использованы в качестве практических рекомендаций для разработки и эффективному применению микробных биопрепаратов в сельском хозяйстве. Например, целесообразность использования комбинаций нескольких штаммов интродуцентов и селекции штаммов с высокой буферностью и эврибионтностью популяции, зависимость эффективности инокуляции АЦК-утилизирующими ризобактериями от уровня минерального питания растений, а также необходимость учета микробных взаимодействий в ризосфере при интерпретации данных о реакции растений на инокуляцию.
  4. Результаты исследований важны для создания устойчивых к стрессам и высокопродуктивных растительно-микробных ассоциаций и ризосферных микробных сообществ, используемых в технологиях фиторемедиации загрязненных почв и восстановления нарушенных экосистем.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на Республиканской научной конференции Симбиотрофные азотфиксаторы и их использование в сельском хозяйстве (Чернигов, 1987), на VIII Всесоюзном Баховском Коллоквиуме (Кобулети, 1988), на Всесоюзном совещании Проблема азота в интенсивном земледелии (Краснообск, 1990), на V Международном симпозиуме по несимбиотической азотфиксации (Florence, 1990), на Всесоюзных конференциях "Проблема азота в интенсивном земледелии" (Новосибирск, 1990) и "Микроорганизмы в сельском хозяйстве" (Пущино, 1992), на 9-м Баховском коллоквиуме (Москва, 1995), на Международных конференциях Nitrogen fixation with Non-Legumes (Giza, 1994), The 1-st European Nitrogen Fixation Confference (Szeget, 1994), "BIOTECHNOLOGY St.Petersburg' 94" (С.-Петербург, 1994), BNF Associated with Rice (Dhaka, 1994), The 6-th International Symposium AABNF (Herare, 1994), Workshop on Associative Interactions of NF Bacteria with Plants (Саратов, 1995), The 10-th International Congress Nitrogen Fixation: Fundamentals and Applications (С.-Петербург, 1995), BNF with Non-Legumes (Faisalabad, 1996), Роль России и Сибири в развитии экологии на пороге XXI века (Омск, 1997), The 3-rd European Nitrogen Fixation Conference (Lunteren, 1998), New Approaches and Techniques in Breeding Sustainable Fodder Crops and Amenity Grasses (С.-Петербург, 2000), Tagungsband of the German Botanical Society (Jena, 2000), Trace Elements in Medicine (С.-Петербург, 2002), The 11-th International MPMI Congress (С.-Петербург, 2003), The 4-th International Crop Science Congress (Brisbane, 2004), Irrigation of Horticultural Crops (Mildura, 2006), Annual Main Meeting of the Society for Experimental Biology (Glasgow, 2007), Abiotic stress in legumes (Tunis, 2007), и на Всероссийской конференции "Научные основы ведения агропромышленного производства в условиях крупных радиационных аварий" (Обнинск, 1996).

       Исследования проводились в лаборатории экологии симбиотических и ассоциативных ризобактерий ГНУ ВНИИСХМ. Автор представлял результаты на семинарах в Санкт-Петербургском Аграрном Университете, ИБФРМ РАН (Саратов), университетах городов Вюрцбурга и Белефельда (Германия), Ватерлоо (Канада), Тегерана (Иран), Хитоцубаши, Мацуяма, Кобе и Киото (Япония), Сассари (Италия) и Ланкастера (Великобритания). Часть исследований выполнена в сотрудничестве с вышеперечисленными организациями, а также с Сибирским НИИСХ (г. Омск), Краснодарским ВНИИСХ, НИИОЗМСХ и ВНИИ овощеводства (г. Тирасполь), ВНИИМЗ (г. Тверь) и Агрофизическим НИИ (г. Санкт-Петербург).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 58 печатных работ, из которых 11 статей в международных рецензируемых журналах, 9 статей в отечественных рецензируемых журналах, 12 статей в сборниках и трудах конференций, и 26 тезисов докладов на конференциях.

Структура и объем диссертации

       Диссертация состоит из введения, аналитического обзора литературы, описания объектов и методов исследований, изложения и обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, благодарностей, списка использованной литературы и списка публикаций по теме диссертации. Работа изложена на 356 страницах и включает 42 таблицы и 43 рисунка. Список литературы включает 543 наименования, в том числе 455 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Обзор литературы

       В аналитическом обзоре литературы излагаются современные представления о научных достижениях и проблемах относящихся к теме проведенных исследований, а именно: (1) ризосфере как зоне взаимодействия растений и микроорганизмов; (2) механизмах положительных эффектов ассоциативных бактерий на растения; (3) взаимодействию растений с бактериями, содержащими фермент 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат (АЦК) деаминазу (4) эффективности инокуляции растений смешанными культурами бактерий; (5) взаимодействию интродуцируемых бактерий с ризосферной микрофлорой; (6) колонизации корней ассоциативными бактериями; (7) устойчивости почвенных бактерий к неблагоприятным факторам среды; (8) взаимодействию ассоциативных бактерий и растений в стрессовых условиях.

2. Объекты и методы исследований

Основными объектами исследований являлись: (1) производственные штаммы ассоциативных ростстимулирующих бактерий Azospirillum lipoferum 137, Arthrobacter mysorens 7, Agrobacterium radiobacter 10 и Flavobacterium sp. Л30, на основе которых во ВНИИСХМ разработаны биопрепараты комплексного действия (Хотянович, 1991); (2) выделенные из ризосферы ячменя штаммы Arthrobacter sp. ДР12 и Sinorhizobium sp. ДР65 (Белимов и др., 1999); (3) выделенные из ризосферы гороха и горчицы сарептской штаммы, содержащие фермент 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат (АЦК) деаминазу (Табл. 4). Растительными объектами служили важные сельскохозяйственные культуры: ячмень, горох, рапс, томаты и горчица сарептская.

В работе предложены оригинальные среды для выделения и изучения свойств бактерий: среда РЕ на основе экстрактов растений (Belimov et al., 2001), среда SMC для селекции бактерий утилизирующих АЦК в качестве источника углерода (Belimov et al., 2005) и среда РТМ с пониженным образованием комплексных соединений тяжелых металлов (Белимов и др., 1998). Детально описан предложенный автором метод изоляции ризобактерий из ризосферы проростков растений. Штаммы идентифицировали методами секвенирования гена 16S рРНК (Bulat et al., 1998; Preisfeld et al. 2000) и нумерической таксономии (Hold et al., 1994; Звягинцев, 1991). Активность АЦК деаминазы у бактерий определяли биохимическими методами (Jacobson et al., 1994; Saleh and Glick, 2001). Продуцирование индолов бактериями определяли с помощью реактива Сальковского (Libbert and Risch, 1969). Нитрогеназную активность определяли ацетиленовым методом (Hardy et al., 1973; Умаров, 1986). Продуцирование этилена бактериями определяли методом газовой хроматографии, а продуцирование сидерофоров - колориметрически (Schwyn and Neilands, 1987). Цитокининовую активность определяли по методу Кулаевой (Кулаева, 1973). Содержание белка в бактериях определяли методом Брэдфорда (Bradford, 1976). Устойчивость бактерий к тяжелым металлам и алюминию, а также иммобилизацию кадмия бактериями изучали в периодических культурах по оригинальным методикам (Белимов и др., 1998, 2004). Бактериостатическую активность метаболитов бактерий изучали методом агаровых пластинок (Ковров и др., 1981). Дефектные по активности АЦК деаминазы мутанты V. paradoxus 5C-2M4 и P. brassicacearum Am3Т8-1 получали методом транспозонного мутагенеза с последующей отрицательной селекцией при росте клонов на средах с АЦК (Belimov et al., 2007). Динамику численности бактерий в ризосфере и почве определяли методом интродукции устойчивых к рифампицину и стрептомицину мутантов (Звягинцев 1991) и с помощью вариантов маркированных геном GFP (Suarez et al., 1997). Использовали различные гнотобиотические растительно-бактериальные системы: модифицированные ростовые мешочки по методу Глика (Glick et al., 1997), систему Возняковской с фильтровальной бумагой (Возняковская, 1969) и ее модификацию (Belimov et al., 2001), и оригинальную cистему с агарозной средой (не опубликовано). Влияние бактерий на устойчивость ячменя к Н+ и Al+3 оценивали в условиях гидропоники (Климашевский 1988).

Были проведены вегетационные опыты, в большинстве которых семена инокулировали суспензиями 3-суточных культур бактерий в количестве 107 кл./семя одновременно с посевом. Семена поверхностно стерилизовали 30% Н2О2, этиловым спиртом, конц. H2SO4, или 5% Na-гипохлоритом, в зависимости от эксперимента. Как правило, использовали 5-кратную повторность вегетационных сосудов на вариант. В опытах с горохом использовали клубеньковые бактерии R. leguminosarum bv. viciae 1026. Полевые опыты проводили на базе Краснодарского НИИСХ, ВНИИМЗ (г. Тверь) и СибНИИСХ (г. Омск). Растения выращивали по стандартным технологиям, принятым в регионах проведения экспериментов. Использовали бактериальные препараты, которые приготавливали и применяли в соответствии с рекомендациями Хотяновича (1991). Условия проведения, время и дизайн опытов, а также характеристика почв подробно описаны в диссертации. Потребление растениями азотных удобрений изучали методом разведения изотопа 15N (Rennie and Rennie, 1983; Соколов, 1975). Поступление в растения фосфорных удобрений изучали с помощью изотопа 33Р (Соколов и Сердобольский, 1954). Содержание ортофосфата (Pi) в растениях определяли методом жидкостной хроматографии. Для изучения элементного состава растений и почв использовали методы Къельдаля, эмиссионной спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой, рентгено-флуоресцентного анализа, атомно-абсорбционной спектрофотометрии и пламенной фотометрии. Ксилемный сок из побегов гороха получали по методу Borel and Simonneau (2002), концентрацию АЦК определяли методом газовой хроматографии-массспектрометрии (Birkemeyer et al., 2003), а содержание АБК определяли методом радио-имуннного анализа (Quarrie et al., 1988).

Математические анализы выполнены с помощью программы STATISTICA V-6 (StatSoft, Inc. [1995], USA) в соответствии с рекомендациями Доспехова (1985), Лакина (1990) и Sokal and Sneath (1963).

3. Значение взаимодействия ассоциативных бактерий в ризосфере для эффективности инокуляции растений

3.1. Ассоциации интродуцируемых бактерий, обладающих аддитивным эффектом на питание и рост растений

Целью исследований являлось оценить влияние совместной интродукции производственных штаммов ризобактерий на растения и изучить взаимодействие интродуцентов как дополнительный фактор эффективности инокуляции. На первых этапах работы, результаты которой частично опубликованы (Белимов и Кожемяков, 1988; Белимов, 1990; Belimov et al., 1995), были использованы разные штаммы бактерий и их комбинации, а также различные виды растений. Наиболее интересные результаты были получены со штаммами Az. lipoferum 137 и Ag. radiobacter 10, которые были известны соответственно как азотфиксатор (Васюк, 1989) и мобилизатор фосфатов (Павлова и Горская, 1987). Установлено, что Ag. radiobacter 10 стимулирует нитрогеназную активность (Табл. 1) и рост штамма Az. lipoferum 137 при совместном  культивировании. Вероятными механизмами положительного

Таблица 1. Взаимодействие штаммов Az. lipoferum 137 и Ag. radiobacter 10, и их влияние на потребление ячменем азотного и фосфорного удобрений

Вариант опыта

Нитрогеназная активность

Накопление удобрений ячменем

Периодическая культура, нмоль С2Н4/ч/ 1 млн. азоспирилл

Ризосфера ячменя А, нмоль С2Н4/ч/

г корней

N удобренияБ,

мг N/сосуд

Р

удобренияВ,

имп. 33Р /мин/ сосуд х 1000

Без инокуляции

0

50 a

39 a

133 a

Az. lipoferum 137

2 a

63 a

58 bc

134 a

Ag. radiobacter 10

0

89 a

53 b

172 b

Смесь штаммов

12 b

205 b

64 c

228 c

А Измерения проводили в фазу выхода в трубку. Б Сумма зерна и соломы зрелых растений. В Побеги в фазу выхода в трубку. Разные латинские буквы указывают на существенное различие по критерию Фишера при Р < 0,05.

взаимодействия бактерий являлись потребление агробактериями избытка кислорода и стабилизация рН среды. Повышение нитрогеназной активности (Табл. 1) и приживаемости азоспирилл в ризосфере наблюдалось при инокуляции ячменя смесью штаммов. Оба штамма были способны активно колонизировать корни растений и поддерживать относительно высокую численность популяции (105106 кл./г корней) в течение всего периода вегетации растений. Инокуляция ячменя смесью Az. lipoferum 137 и Ag. radiobacter 10 оказывала максимальный эффект на массу зерна, а в некоторых случаях урожай был существенно выше по сравнению с вариантами инокуляций отдельными штаммами. У инокулированных растений повышались эффективность использования азотного удобрения (Табл. 1). Помимо способности Ag. radiobacter 10 растворять труднодоступные фосфаты, важную роль во взаимодействии этого штамма с растением играет стимуляция потребления фосфора из удобрений (Табл. 1). Однако Az. lipoferum 137 не влиял на фосфорное питание растений, и не являлся мобилизатором фосфатов (Белимов и др., 1999). Полученные данные указывают на различия в механизмах воздействия данных штаммов на растения, что приводит к аддитивному или синергическому эффекту на их питание и рост при совместной инокуляции. Результаты полевых опытов, в которых использовали биопрепараты на основе штаммов Az. lipoferum 137 (азоризин) и Ag. radiobacter 10 (агрофил), подтвердили более высокую эффективность инокуляции ячменя смесью штаммов (Рис. 1). Применение отдельных препаратов оказалось малоэффективным, за исключением достоверного увеличения урожая с. Темп на 12% при использовании агрофила в 1987 г. Обнаружена вариабельность реакции растений на инокуляцию в зависимости от сорта ячменя: максимальной отзывчивостью на инокуляцию обладал с. Темп, в то же время инокуляция с. Каскад оказалась неэффективной.

Рис. 1. Средние значения эффективности применения азоризина и агрофила для инокуляции ячменя в полевых опытах. Обозначения: () сорт Темп, среднее 2-х опытов 1987 и 1988 гг.; () сорт Каскад, среднее 2-х опытов 1989 г.; () сорт Циклон, среднее 3-х опытов 1988 и 1990 гг. Символ * означает существенное повышение урожая по критерию Фишера при Р < 0,05.

Наблюдаемые положительные взаимодействия между Az. lipoferum 137 и Ag. radiobacter 10 свидетельствуют об образовании бактериальной ассоциации, в которой азоспириллы не только активнее фиксируют азот, но и лучше приживаются в ризосфере. Находясь в таких ассоциациях, бактерии существенно повышали свой потенциал положительного воздействия на растение. Наряду с этим, совместная интродукция штаммов, дополняющих друг друга по своим ростстимулирующим свойствам, оказывает аддитивные и синэргические эффекты на рост и питание растений. В результате положительных микробных взаимодействий в ризосфере и интеграции эффектов образуется растительно-бактериальная система, которая обладает достаточной устойчивостью и стабильностью функционирования. Результаты исследований, включая полевые опыты, показывают целесообразность совместного использования биопрепаратов азоризина и агрофила.

3.2. Роль взаимодействия интродуцируемых бактерий с аборигенной микрофлорой ризосферы в реакции растений на инокуляцию

В первый этап исследований входило выделение и характеристика представителей аборигенных бактерий (ДР-бактерий) доминирующих в ризосфере проростков ячменя, выращенного на 8 различных почвах. Затем эти ДР-бактерии были использованы для изучения роли аборигенной микрофлоры в эффективности взаимодействия интродуцируемых популяций ризобактерий с растениями. Изучение влияния метаболитов ДР-бактерий (всего 115 штаммов) на рост 22-х коллекционных штаммов ассоциативных бактерий методом агаровых пластинок показало, что 55 ДР-бактерий полностью ингибировали рост хотя бы одного коллекционного штамма, 12 ДР-бактерий ингибировали рост большинства штаммов, а 6 ДР-бактерий полностью ингибировали рост всех коллекционных культур. Только 13 штаммов ДР-бактерий стимулировали рост 1-3 коллекционных культур, которыми, как правило, являлись Flavobacterium sp. Л30 или Ar. mysorens 7. Штаммы рода Azospirillum были наиболее чувствительны к метаболитам ДР-бактерий. Представители семейства энтеробактерий были сравнительно устойчивы и положительного влияния ДР-бактерий на их рост не обнаружено. Наиболее устойчивыми являлись штаммы, относящиеся к родам Agrobacterium, Arthrobacter и Flavobacterium. Эти результаты согласовывались с данными о выживаемости в почве двух коллекционных штаммов. Так, численность чувствительного штамма Az. lipoferum 137 была существенно выше при внесении в почву рифампицина, который препятствовал развитию аборигенных микроорганизмов. Однако добавление в почву рифампицина не оказало существенного влияния на выживаемость устойчивого к микробным метаболитам штамма Ar. mysorens 7. Среди ДР-бактерий был отобран штамм Cytophaga jonsonae Д1, метаболиты которого in vitro улучшали  рост  Az. lipoferum 137.  Динамика  нитрогеназной

Рис. 2. Взаимодействие Az. lipoferum 137 с C. jonsonae Д1 и их влияние на инокулированные растения ячменя сорта Темп. А - нитрогеназная активность Az. lipoferum 137 при культивировании в жидкой среде; Б - численность Az. lipoferum 137 в ризосфере ячменя; В - надземная масса растений в фазу выхода в трубку () и урожай зерна () растений ячменя. Варианты опыта на А и Б: чистая культура Az. lipoferum 137 (); смесь Az. lipoferum 137 и C. jonsonae Д1 (). Варианты инокуляции на В: без инокуляции (Контроль), Az. lipoferum 137 (137), C. jonsonae Д1 (Д1), смесь Az. lipoferum 137 и C. jonsonae Д1 (137+Д1). Вертикальные отрезки обозначают доверительный интервал при Р < 0,05.

активности у азоспирилл в присутствие C. jonsonae Д1 указывала на то, что бактерии образовывали устойчивую ассоциацию с высокой азотфиксирующей активностью (Рис. 2А). В вегетационном опыте C. jonsonae Д1 повысил также способность Az. lipoferum 137 колонизировать корни ячменя при совместной инокуляции (Рис. 2Б). Тем не менее, совместная инокуляция данными штаммами оказалась неэффективной из-за того, что C. jonsonae Д1 отрицательно повлиял на рост растений (Рис. 2В). Известно, что некоторые штаммы C. johnsonae являются фитопатогенными (Wells et al., 1998).

       Из 115 изолированных культур ДР-бактерий 18 изолятов ингибировали, а 10 изолятов стимулировали всхожесть семян ячменя. Методом агаровых пластинок было установлено, что метаболиты производственного штамма Flavobacterium sp. Л30, способного продуцировать антибиотик (Шенин и др., 1996), полностью подавляли рост всех штаммов ДР-бактерий. В вегетационном опыте некоторые штаммы ДР-бактерий повысили урожай зерна ячменя на 17-19% (Табл. 2). В то же время, при совместной инокуляции ДР-бактериями и Flavobacterium sp. Л30, положительного эффекта не обнаружено.

Таблица 2. Влияние Flavobacterium sp. Л30 на эффективность инокуляции ячменя ростстимулирующими ДР-бактериями

Вариант инокуляции

Урожай зерна, г / сосуд

Контроль

Flavobacterium sp. Л30

Без инокуляции

3,23

3,59

ДР24

3,79*

3,17

ДР25

3,79*

3,30

ДР46

3,82*

3,63

ДР84

3,84*

3,21

(*) Различие между вариантами существенно относительно контроля по критерию Фишера при Р < 0,05).

Результаты исследований показали, что интродуцируемые популяции ассоциативных бактерий вступают в сложные взаимодействия с бактериальной микрофлорой, колонизирующей ризосферу. Выживаемость и эффективность интродуцента зависят от его устойчивости к антагонистическому воздействию аборигенов. Образование ассоциации с фитопатогенами или ингибирование активности полезных аборигенных микроорганизмов приводит к ослаблению ростстимулирующего эффекта интродуцента и аборигенных бактерий, и этим искажает ожидаемую реакцию растений на инокуляцию.

3.3. Популяционное доминирование в ризосфере прорастающих семян как критерий селекции ростстимулирующих бактерий

       Нами предложено использовать способность бактерий активно колонизировать ризосферу прорастающих в нестерильной почве семян в качестве предварительного критерия для отбора высокоэффективных ростстимулирующих штаммов. Для реализации этого подхода были использованы два штамма ДР-бактерий Arthrobacter sp. ДР12. и Sinorhizobium sp. ДР65, которые повышали всхожесть и корнеобразование у семян ячменя, продуцировали ИУК, обладали цитокининовой и фосфат-мобилизирующей активностью, но не фиксировали азот, не имели бактериостатической активности и не утилизировали АЦК.

       В вегетационных опытах штамм Arthrobacter sp. ДР12 достоверно повысил количество зерен и урожай ячменя на 18-25% (Табл. 3). Положительное влияние Sinorhizobium sp. ДР65 на урожай зерна проявилось в эксперименте 1, при этом инокуляция увеличила также массу соломы относительно производственного штамма Flavobacterium sp. Л30. Изучаемые ДР-бактерии успешно реализуют свою высокую колонизирующую способность при интродукции на семена и поддерживают численность популяции в процессе вегетации на высоком уровне (Рис. 3). Сравнительные испытания эффективности ДР-бактерий в полевых условиях показали, что Arthrobacter sp. ДР12 повысил урожай зерна в двух опытах с ячменем сорта Абава на 6% и 12%, в одном из двух опытов с пшеницей сорта Омская-18 на 9%, и обеспечивал максимальный урожай зерна ячменя сорта Омский-88 и пшеницы сорта Омская-18. Использование биопрепаратов на основе Sinorhizobium sp. ДР65, а также флавобактерина или мизорина в полевых условиях оказалась неэффективной. Результаты показали, что Arthrobacter sp. ДР12 может быть рекомендован для создания ростстимулирующего биопрепарата.

Таблица 3. Влияние ассоциативных бактерий Arthrobacter sp. ДР12 и Sinorhizobium sp. ДР65 на урожай ячменя сорта Темп в вегетационных опытах

Варианты

инокуляции

Эксперимент 1

Эксперимент 2

Кол-во зерен,

шт/сосуд

Масса, г/сосуд

Кол-во зерен,

шт/сосуд

Масса, г/сосуд

Зерно

Солома

Зерно

Солома

Без инокуляции

66

3,2

3,7

64

2,8

5,5

Flavobacterium sp. Л30

74

3,6

4,1

83*

3,5*

5,8

Arthrobacter sp. ДР12

80*

4,0*

4,4

79*

3,3*

6,1

Sinorhizobium sp. ДР65

78*

3,9*

5,0*

72

3,1

5,5

(*) Различие между вариантами существенно относительно варианта без инокуляции по критерию Фишера при Р < 0,05.

       Были обобщены проведенные нами эксперименты по изучению динамики численности популяций производственных штаммов в ризосфере. Эти исследования доказали способность штаммов активно колонизировать ризосферу различных сельскохозяйственных культур в широком диапазоне почвенно-климатических условий. Показано, что активная колонизация корней является необходимым, но недостаточным условием для эффективного взаимодействия интродуцента с растением. Интродуценты, как правило, реализуют свой потенциал колонизации ризосферы, однако эффект бактерий на растение проявляется не всегда. Установлено, что независимо от вида растения и условий среды численность штаммов Ar. mysorens 7 и Ag. radiobacter 10 была выше по сравнению со штаммами Az. lipoferum 137 и Flavobacterium sp. Л30. Это указывает на ведущую роль генотипа бактерий в колонизации ризосферы и подтверждает важность селекции активных колонизаторов, сохраняющих это свойство в разнообразных условиях. Поэтому перспективным представляется поиск интродуцентов, обладающих высокой буферностью и популяционной эврибионтностью - качествами, способствующими активной колонизации ризосферы. Показана также относительная независимость численности интродуцента в ризосфере и реакции растений на инокуляцию, свидетельствуя о том, что способность растения использовать полезный потенциал интродуцируемых бактерий во многом зависит от генотипа растения.

Таким образом, селекция эффективных штаммов ассоциативных ростстимулирующих бактерий по признаку доминирования популяции в культурабельном бактериальном сообществе ризосферы прорастающих семян может быть весьма перспективна. Такой подход учитывает высокую конкурентоспособность микроорганизмов  в  процессе колонизации  корней

Рис. 3. Численность интродуцированных бактерий в ризосфере ячменя сорта Темп (эксперимент 2). Варианты опыта: Arthrobacter sp. ДР12 (); Sinorhizobium sp. ДР65 (); общая численность бактерий на среде без стрептомицина (). Вертикальные отрезки обозначают доверительный интервал при Р ≤ 0,05.

проростков в реальных условиях с учетом влияния комплекса биотических и абиотических факторов конкретной среды и генотипа растения. Впоследствии это дает возможность успешно интродуцировать полезную для растений популяцию примерно в ту же экологическую нишу, из которой она была первоначально изолирована. Это обосновывает высокую вероятность образования эффективной растительно-бактериальной ассоциации.

4. Роль ризобактерий, содержащих фермент АЦК деаминазу, в устойчивости растений к абиотическим стрессам

4.1. Выделение и характеристика устойчивых к кадмию ассоциативных бактерий содержащих фермент АЦК деаминазу

Исследования были инициированы важностью проблемы поиска новых путей повышения устойчивости растений к неблагоприятным условиям среды. В этой связи интересными являлись публикациями о том, что снижение уровня гормона этилена в корнях растений, опосредованное утилизацией бактериями аминокислоты АЦК с помощью фермента АЦК деаминазы, является одним из механизмов положительного растительно-микробного взаимодействия (Glick et al., 1994; Glick, 1995). Учитывая важную роль этилена в реакции растений на стрессовые факторы, представлялось перспективным выделить и изучить АЦК-утилизирующие бактерии, ассоциированные с корнями подверженных стрессу растений. В наших исследованиях стрессором послужили кадмий и другие тяжелые металлы, которые являются распространенными и высокотоксичными загрязнителями почв и индуцируют биосинтез стрессового этилена в растениях. Из ризосферы проростков горчицы сарептской и гороха выращенных на загрязненных почвах и осадках сточных вод были селектированы устойчивые к тяжелым металлам ростстимулирующие бактерии, содержащие АЦК деаминазу. В 1996 г. было выделено 22 АЦК-утилизирующих штамма с использованием питательных сред, содержащих АЦК в качестве единственного источника азота,  а в 2001 г. выделено 11 штаммов  на среде  с АЦК в качестве

Таблица 4. Характеристика штаммов содержащих фермент АЦК-деаминазу

Штамм

Активность АЦК-деаминазы,

нмоль α-КВ /мг/ч

Раство-рение фосфатовА, мм

Устойчи-вость к кадмиюБ,

мкM CdCl2

Achromobacter xylosoxidans Cm4

1,8

0 / 0 / 0

210 / 550

Pseudomonas brassicacearum Am3

11,7

6 / 2 / 10

240 / 500

Pseudomonas marginalis Dp1

12,9

3 / 4 / 2

210 / 500

Pseudomonas putida Am2

6,5

11 / 0 / 15

210 / 450

Pseudomonas putida Bm3

4,6

2 / 1 / 7

240 / 500

Pseudomonas sp. Dp2

11,5

11 / 1 / 12

210 / 450

Pseudomonas sp. Ep2

6,5

7 / 1 / 20

240 / 750

Rhodococcus sp. Fp2

10,0

0 / 0 / 0

600 / 1000

Variovorax paradoxus Ep1

8,6

0 / 0 / 0

400 / 950

Variovorax paradoxus 5C2

7,1

0 / 0 / 0

1400/3500

НСР (P 0.05)

2,1

3 / 1 / 4

- / -

(А) Указан диаметр зоны растворения фосфатов (Ca3(PO4)2 / FePO4 / Ca-фитат) вокруг колоний бактерий. (Б) Указаны минимальные ростингибирующие и летальные концентрации при культивировании на агаризованной среде.

Рис. 4. Эффект АЦК-утилизирующих бактерий и химических регуляторов этилена на длину корней проростков рапса в присутствие 300 мкМ CdCl2. Обозначения: К(Cd) - контроль без инокуляции; АВГ - 10 мкМ АВГ; Ag - 10 мкМ Ag2SO4; АЦК- 200 мкМ АЦК; ЕФ - 10 мкМ эфефона. Вертикальные отрезки обозначают стандартное отклонение.

единственного источника азота и углерода. Во всех использованных почвах присутствовали ассоциативные АЦК-утилизирующие бактерии. Все штаммы были идентифицированы и их свойства детально охарактеризованы. Штаммы относились к Pseudomonas brassicacearum, Ps. marginalis, Ps. oryzihabitans, Ps. putida и Pseudomonas sp., а также Achromobacter xylosoxidans, Acidovorax facilis, Bacillus pumilus, Rhodococcus sp. и Variovorax paradoxus. У большинства этих таксонов наличие АЦК деаминазы ранее не было описано. В настоящей диссертации представлена информация только о 10 штаммах (Табл. 4). Данные штаммы обладали высокой устойчивостью к тяжелым металлам, и многие из них растворяли труднодоступные фосфаты (Табл. 4). Штаммы Am2, Ep2 и 5C-2 продуцировали ИУК, но ни один из штаммов не продуцировал этилен и не обладал нитрогеназной активностью. Впервые показано, что АЦК-утилизиующие бактерии используют АЦК в качестве единственного источника углерода. Ростстимулирующая активность штаммов проявлялась в удлинении корней проростков горчицы сарептской и рапса, как в отсутствие, так и в присутствие кадмия в питательном растворе (Рис. 4). О важной роли АЦК деаминазы в способности бактерий стимулировать удлинение корней свидетельствуют результаты обработки растений аминоэтоксивинилглицином (АВГ, ингибитор АЦК синтазы), ионами серебра (конкурент за рецепторы этилена), АЦК (предшественник в биосинтезе этилена) и этефоном (генератор этилена) (Рис. 4). Производственные штаммы, не имеющие АЦК деаминазной активности, не влияли на длину корней.

4.2. Взаимодействие АЦК-утилизирующих бактерий с растениями в стрессовых условиях, вызванных токсичностью кадмия

       Результаты вегетационных опытов с рапсом показали, что штаммы P. brassicacearum Am3, P. putida Bm3 и P. marginalis Dp1 стимулировали развитие корней у растений, выращенных на незагрязненной почве. При внесении в почву кадмия (35 мг Cd/кг) положительное действие бактерий проявилось также и в повышении биомассы побегов. Однако инокуляция не влияла на содержание Cd в побегах рапса.

       В опыте №1 с горчицей сарептской штаммы P. brassicacearum Am3 и V. paradoxus 5C-2 увеличили массу побегов на необогащенной кадмием слабоокультуренной дерново-подзолистой почве. Однако при добавлении в почву кадмия (30 или 60 мг Cd/кг) эффект проявился только в стимуляции роста корней штаммом V. paradoxus 5C-2. Численность P. brassicacearum Am3 в ризосфере снижалась в ходе эксперимента, а при 60 мг Cd/кг популяция элиминировалась из зоны корней. Напротив, V. paradoxus 5C-2 интенсивно колонизировал корни в отсутствии и, особенно в присутствии Cd в почве. Инокуляция не влияла на содержание Cd в побегах горчицы. В опыте №2 горчицу выращивали в коммерческом компосте УPro-Mix BXФ и инокулировали штаммом V. paradoxus 5C-2. Добавление кадмия в компост (24 мг Cd/кг) приводило к ингибированию роста растений, но инокуляция снимала этот негативный эффект и существенно повышала содержание и вынос кадмия побегами (Табл. 5). Возможно, что различное влияние бактерий на аккумуляцию кадмия горчицей связаны со степенью его доступности для растений в дерновоподзолистой почве (после внесения в почву кадмий быстро переходил в нерастворимые формы) и в компосте (в компосте хелатирующие вещества поддерживали микроэлементы в растворенной форме). Можно предположить, что способность бактерий активизировать поступление кадмия в растения может проявляться при условии его высокой подвижности в ризосфере. Полученные результаты указывают на два важных момента в отношении проблемы повышения эффективности технологий фитоэкстракции металлов с использованием горчицы сарептской. Во-первых, необходимо активизировать поглощение корнями и/или повысить мобильность тяжелых металлов в ризосфере инокулированных растений. Во-вторых, при повышенном поступлении токсикантов в растения становится особенно актуальным поиск приемов стимуляции роста растений, в том числе основанных на взаимодействии растений с полезными микроорганизмами.

Таблица 5. Влияние инокуляции на рост и аккумуляцию кадмия побегами горчицы сарептской

Вариант опыта

Биомасса,

мг/сосуд

Содержание Cd,

мг/кг

Вынос Cd,

мкг/сосуд

Без Cd и инокуляции

489 a

не определяли

не определяли

Cd + без инокуляции

394 b

27 a

11 a

Cd + V. paradoxus 5C-2

438 a

59 b

26 b

Разные буквы указывают на различия по критерию Фишера (Р < 0,05).

Рис. 5. Влияние АЦК-утилизирующих бактерий на биомассу (А, В) и накопление элементов (Б, С) побегами гороха. (А) и (Б) - незагрязненная почва; (В) и (Г) - внесено 10 мг Cd/кг. (Б) и (В) - средние для 4-х генотипов гороха. Варианты: () P. brassicacearum Am3, () P. marginalis Dp1, () Rhodococcus sp. Fp2. (*) - существенный эффект инокуляции по критерию Фишера (Р < 0,05).

В вегетационном опыте с горохом инокуляция штаммами P. brassicacearum Am3 и P. marginalis Dp1 стимулировала рост корней, как на незагрязненной почве, так и при внесении кадмия. Положительный эффект бактерии оказали также на рост побегов (Рис. 5). Устойчивый к кадмию штамм Rhodococcus sp. Fp2 не стимулировал рост обработанного кадмием гороха. Это вероятно было связано с тем, что в модельных экспериментах кадмий полностью ингибировал АЦК-деаминазную активность этого штамма. Добавление Cd в почву приводило к снижению содержания питательных элементов в растениях. Эффект бактерий на элементный состав побегов существенно варьировал в зависимости от штамма, генотипа гороха и концентрации Cd в почве. Действие инокуляции в основном проявлялось в повышении содержания N, Ca и S, и в тенденции к снижению содержания P и Fe в побегах. Снижение содержания Cd происходило при инокуляции генотипа ВИР-1658 штаммами Dp1 и Fp2, генотипа ВИР-3429 штаммами Am3 и Dp1, и генотипа ВИР-4788 штаммом Fp2. У инокулированных растений повышалось накопление питательных элементов в побегах (Рис. 5). Rhodococcus sp. Fp2 потерял способность улучшать аккумуляцию растениями N, K, Ca и Fe в условиях загрязнения почвы кадмием. Наблюдаемое повышение накопления P, K, и Fe в побегах было вероятно опосредовано лучшим развитием корневой системы, а повышение аккумуляции N, S, и Ca, могло быть результатом мобилизации этих элементов в ризосфере и стимуляции процессов их ассимиляции и транспорта в побег. Полученные результаты свидетельствуют о том, что: (1) АЦК деаминаза играет важную роль в стимуляции роста растений в присутствие токсичного кадмия; (2) улучшение минерального питания гороха бактериями и эффект бактерий на биосинтез этилена в растении посредством АЦК деаминазы являются частично независимыми процессами; (2) снижение содержания Cd в побегах гороха не являлось причиной улучшения роста инокулированных растений, и не было связано с утилизацией АЦК бактериями.

4.3. Зависимость эффекта АЦК-утилизирующих бактерий от уровня минерального питания растений

       Интенсивность биосинтеза гормона этилена у растений зависит от концентрации и доступности питательных элементов. Поэтому мы предположили, что уровень минерального питания может быть важным фактором во взаимодействии АЦК-утилизирующих бактерий с растениями. Была проведена серия опытов с растениями рапса в условиях гидропоники при варьировании состава питательного раствора, в ходе которых выявлены следующие закономерности (Рис. 6А): (1) длина корней проростков уменьшалась с увеличением концентрации фосфора (K2HPO4) в растворе; (2) ростстимулирующий эффект ингибитора этилена (Ag+) и бактерий проявился только в присутствии фосфора (K2HPO4, Ca-фитат или CaHPO4); (3) при добавлении сульфата аммония стимулирующее действие бактерий исчезало, а эффект Ag+ сохранялся. Исключение калия из состава раствора не влияло на рост корней во всех вариантах опыта. Количество интродуцированных штаммов на корнях растений в присутствии и отсутствии фосфора было примерно одинаковым и составляло от 2,0 х 106 до 3,3 х 106 кл./мг, свидетельствуя о том, что рост бактерий не был ограничен дефицитом фосфора. Бактерии не влияли на концентрацию Pi в питательном растворе с фосфатами. Не обнаружено корреляции между фосфат-растворяющей активностью штаммов in vitro и их воздействием на корни или потреблением фосфора растениями. В присутствии K2HPO4 штаммы P. putida Bm3, A. xylosoxidans Cm4 и Pseudomonas sp. Dp2 снижали содержание (Pi), а обработка Ag+ уменьшила накопление Pi в побегах. Масса побегов отрицательно коррелировала с содержанием Pi (r = -0.40; P = 0.015; n = 24). Образование этилена в отсутствии фосфора снижалось и сопровождалось удлинением корней (Рис. 6Б). Снижение биосинтеза АЦК и этилена является адаптацией, направленной на поиск доступного источника фосфора за счет более развитой корневой системы (Rengel and Kordan, 1988). Инокуляция снижала количество выделяемого растениями этилена только в присутствии фосфора, при этом добавление сернокислого аммония в качестве дополнительного источника азота снижало бактериальный эффект. Вероятно, что при дефиците фосфора количество доступного для бактерий АЦК в прикорневой зоне уменьшалось, взаимодействие растительно-бактериальной ассоциации нарушалось, и это приводило к ослаблению положительного действия бактерий. Высокая концентрация аммония, более доступного источника азота, может ингибировать активность АЦК деаминазы (Jacobson et al., 1994). Поэтому сульфат аммония нивелировал только эффект бактерий, но не химического ингибитора этилена Ag+. Эти результаты являются оригинальным подтверждением участия АЦК деаминазы во взаимодействии бактерий с растениями. В вегетационных опытах положительный эффект бактерий на массу побегов рапса повышался примерно в два раза при внесении в почву фосфорных удобрений. Содержание питательных элементов (P, K, S, Mo, Zn и Ba) в побегах инокулированных растений не повышалось или понижалось (в зависимости от штамма интродуцента) и отрицательно коррелировало с биомассой побегов. Это указывало на то, что происходило разбавление концентрации элементов массой

Рис. 6. Реакция проростков рапса на инокуляцию АЦК-утилизирующими бактериями в зависимости от содержания фосфора и азота в питательном растворе. А - длина корня. Б - образование этилена. Варианты опыта: Норма, полный питательный раствор; -Р, раствор без фосфора; +NH4, дополнительно внесен 1 мМ (NH4)2SO4; 1, без инокуляции; 2, 10 мкМ Ag2SO4; 3, A. xylosoxidans Cm4; 4, Pseudomonas sp. Dp2. Вертикальными отрезками обозначены стандартные отклонения.

растений, а специфические эффекты бактерий на ассимиляцию питательных элементов не проявлялись. Таким образом, уровень фосфорного и азотного питания растений оказывает существенное влияние на реакцию растений на инокуляцию бактериями содержащими АЦК деаминазу. Стимуляция роста растения происходит при относительно высоком уровне гормона этилена, и при отсутствии факторов ингибирующих активность АЦК деаминазы.

4.4. Роль АЦК деаминазы в реакции растений на дефицит почвенной влаги

Инокуляция штаммом V. paradoxus 5C-2 и обработка ингибитором биосинтеза этилена (10 мкМ АВГ) стимулировали рост корней и побегов гороха сорта Sparkle в большей степени при недостаточном увлажнении почвы по сравнению с вариантами оптимального увлажнения. Ростстимулирующий эффект сопровождался повышением транспирации воды, пропорциональным массе побегов. Однако влияние мутанта V. paradoxus 5С-2M4, который имел активность АЦК деаминазы в 7 раз ниже дикого типа, на рост растений и транспирацию воды было несущественным.

При выращивании гороха в условиях дефицита влаги до стадии полной спелости растения инокулированные V. paradoxus 5C-2 превосходили контрольные по количеству семян, массе семян и накоплению в них азота (Табл. 6). Содержание азота в семенах не изменялось, поэтому повышение накопления азота было обусловлено увеличением биомассы. При оптимальном режиме полива положительное действие V. paradoxus 5C-2 на рост растений проявилось только в виде тенденции. Инокуляция стимулировала образование клубеньков таким образом, что полностью снимала ингибирующий эффект засухи на клубенькообразование. Инокулированные растения образовывали дополнительные побеги и зацветали на 1-2 дня раньше контрольных. Образование дополнительных побегов приводило к затенению участков почвы вокруг растений, и это могло снижать потери влаги, испаряющейся с поверхности почвы. V. paradoxus 5C-2 активно колонизировал корни гороха во всех экспериментах при оптимальном и недостаточном увлажнении, а его численность в конце опытов была около 1 млн кл./г корней. В условиях дефицита влаги количество биомассы семян в расчете на 1 литр поливной воды было на 12% больше (Р=0,02) при инокуляции, свидетельствуя о повышении эффективности использования воды растениями.

Таблица 6. Эффект V. paradoxus 5C-2 на рост и азотфиксирующий симбиоз гороха сорта Sparkle в зависимости от уровня увлажнения почвы

Вариант полива и инокуляции

Кол-во семян,

шт/растение

Масса семян,

г/растение

Накопление N в семенах,

мг/растение

Кол-во клубеньков,

шт/растение

70% ПВ

Штамм 1026А

11 a

3,3 ab

139 ab

38 a

Штаммы 1026 и 5C-2

14 a

3,9 a

156 a

54 b

40% ПВ

Штамм 1026

7 b

2,1 c

79 c

13 c

Штаммы 1026 и 5C-2

11 a

2,9 b

117 b

40 ab

АРастения инокулировали R. leguminosarum bv. viciae 1026. Разные латинские буквы указывают на существенные различия (критерий Фишера, Р < 0,05).

Дефицит влаги приводил к повышению содержания АЦК и АБК в ксилемном соке растений (Рис. 7А). При недостаточном увлажнении наблюдалось снижение концентрации АЦК у обработанных АВГ и инокулированных растений. Это наблюдение имеет большое значение для понимания механизма воздействия АЦК-утилизирующих бактерий, поскольку указывает на то, что АЦК деаминаза вызывает не только локальные эффекты на корни, но может индуцировать системную устойчивость. Содержание АБК, основной сигнальной молекулы в реакции растения на засуху, также повышалось при дефиците влаги, свидетельствуя о развитии стрессовой реакции (Рис. 7Б). Инокуляция диким типом V. paradoxus 5C-2 и его мутантом 5С-2М4 не повлияла на концентрацию АБК по отношению к соответствующим контролям. Однако наиболее заметное повышение АБК при дефиците влаги происходило у растений, инокулированных диким типом V. paradoxus 5C-2, вероятно в результате более быстрой ассимиляции ограниченного ресурса поливной воды. Это указывает на то, что передаваемый посредством АБК сигнал, может ограничивать ростстимулирующее и антистрессовое воздействие АЦК-утизирующих бактерий. С другой стороны высокая концентрация АБК могла ограничивать потери воды листьями за счет транспирации.

Рис. 7. Содержание АЦК (А) и АБК (Б) в ксилемном соке гороха в зависимости от инокуляции и режима увлажнения почвы. Варианты: () контроль; () АВГ на (А) или мутант М4 на (Б); () дикий тип V. paradoxus 5C-2. Вертикальными отрезками обозначены ошибки средних. Разные латинские буквы указывают на существенные различия (критерий Фишера, Р < 0,05).

В вегетационном опыте с карликовым сортом томатов MicroTom растения выращивали в узких, но объемных (диаметр 10 см; 10 кг компоста) пластиковых колоннах, что позволяло вырастить их до фазы зрелых плодов при полном прекращении полива в начале вегетации. При поддержании полива инокуляция V. paradoxus 5C-2 не оказала существенного эффекта на массу плодов. В условиях засухи масса плодов снизилась в 6 раз, но урожай инокулированных растений был на 30% выше относительно контроля, что свидетельствовало о повышении эффективности использования воды растениями. Численность интродуцента в ризосфере составляла около 5 млн. кл./г корней, при этом прекращение полива не изменяло его колонизирующую способность. Используя агарозную гнотобиотическую систему, было установлено, что V. paradoxus 5C-2, P brassicacearum Am3 и его мутант Am3T8-1, имевший активность АЦК деаминазы в 37 раз ниже дикого типа, стимулируют удлинение корневых волосков у томатов. Микроскопирование показало, что маркированные GFP бактерии интенсивно колонизируют корневые волоски. Стимуляция развития корневых волосков может вносить вклад в улучшение водного питания инокулированных растений, однако этот эффект не зависит от активности АЦК деаминазы бактерий.

5. Взаимодействие производственных штаммов ассоциативных бактерий с растениями в зависимости от агроклиматических факторов

5.1. Экстремальные температуры среды

       Штаммы Az. lipoferum 137, Ar. mysorens 7, Ag. radiobacter 10 и Flavobacterium sp. Л30 используются во многих регионах, которые существенно различаются по температурному режиму. В связи с этим, представлялось важным изучить, как температура влияет на эффективность инокуляции растений данными бактериями. Для этого были проведены вегетационные опыты, в которых инокулированные растения ячменя выращивали в климатических камерах, имитируя оптимальное (+18оС), холодное (+14оС) и жаркое (+23оС) лето. Ar. mysorens 7 повысил массу зерна не только при оптимальной, но и при пониженной температуре, при этом эффект составил соответственно +17% и +25%. Положительный эффект от штамма Ag. radiobacter 10 был существенен только при пониженной или повышенной температурах. При повышенной температуре отмечена тенденция увеличения массы зерна при инокуляции Az. lipoferum 137 и Flavobacterium sp. Л30 на 9% и 12%, однако, разница с контролем была несущественной. В среднем для всех испытанных штаммов реакция растений на инокуляцию была выше при экстремальных температурах. Поддержание пониженной и повышенной температур приводило к существенному снижению массы зерна растений, свидетельствуя о том, что растения были подвержены сильному стрессу. Температура культивирования растений не влияла на численность интродуцированных бактерий в ризосфере в фазы всходов и кущения. В дальнейшем численность Ag. radiobacter 10 и Flavobacterium sp. Л30 была выше при имитации жаркого лета, но снижалась при имитации холодного лета. Активная колонизация корней во всех режимах указывает на способность бактерий легко адаптироваться к различным температурам и поддерживать численность популяции относительно стабильной. Вероятно, что повышение реакции растений на инокуляцию при неблагоприятных температурах связано не с популяционными эффектами температуры на бактерии, а с изменением их активности и метаболизма, которые могут быть зависимы от самого растения.

5.2. Повышенная кислотность почвы

При культивировании на питательной среде штамм Ar. mysorens 7 был наиболее устойчив к подкислению среды и нормально развивался при рН=4,5. Ингибирование роста Ag. radiobacter 10 и Flavobacterium sp. Л30 наблюдалось при рН=5,04,5. Сильное ингибирование роста наиболее чувствительного штамма Az. lipoferum 137 происходило уже при рН=5,0. При рН=6,5 все штаммы обладали относительно высокой устойчивостью к ионам Al+3. Однако при подкислении среды (рН=4,5) токсичность алюминия существенно повышалась, и рост бактерий прекращался при концентрации 3040 мг Al+3/л.

В условиях гидропоники при создании стрессовых условий (рН=4,5 и добавлении 5 мг/л Al+3) инокуляция стимулировала рост корней проростков различных сортов ячменя примерно на 1525%. Однако в оптимальных условиях (рН=5,8 без добавления Al+3), ассоциативные бактерии не оказали влияния  на  рост  корней. В вегетационных опытах использовали  кислые

Рис. 8. Взаимодействие ячменя Целинный-5 с Az. lipoferum 137 в зависимости от рН почвы. (А) - эффект бактерий на урожай зерна (г/сосуд) и накопление азота в зерне (мг N/сосуд). Численность интродуцента в ризосфере (Б) и в почве без растений (В). Обозначения: рН почвы 6,1 (, ) или 5,0 (, ). (*) означает существенную разницу с контролем по критерию Фишера (Р<0,05). Вертикальные отрезки обозначают ошибку средних.

дерновоподзолистые почвы, кислотность которых изменяли добавлением мела. В опыте №1 с сортом Целинный-5 положительное действие на продуктивность растений ячменя проявилось только при инокуляции Az. lipoferum 137 и Flavobacterium sp. Л30 в условиях слабокислой реакции почвы (рН=5,0), но не в нейтрализованной почве (рН=6,1) (Рис. 8А). Содержание свободного пролина в корнях инокулированных растений было в 4 раза ниже по сравнению с контрольными, свидетельствуя о способности бактерий понижать интенсивность стресса, вызываемого неблагоприятными условиями. Сравнение популяционных кривых бактерий полученных для ризосферы и почвы без растений позволило установить, что в слабокислой почве присутствие растения улучшало выживаемость Az. lipoferum 137 (Рис. 8Б, В) и Flavobacterium sp. Л30. Важно отметить, что именно эти штаммы стимулировали рост растений, свидетельствуя об образовании эффективных ассоциаций в данных условиях. Однако в опыте №2, когда рост растений был сильно ингибирован при рН почвы 4,5, инокуляция Az. lipoferum 137 или Ar. mysorens 7 снижала соответственно массу соломы или урожай зерна. Отрицательный эффект возможно связан с утилизацией бактериями органических кислот, выделяемых корнями для хелатирования алюминия (Foy and Lee, 1987), и повышением его подвижности в ризосфере.

5.3. Дефицит почвенной влаги

Расчет средних значений прибавок массы зерна в серии вегетационных опытов показал, что инокуляция всеми штаммами была более эффективной в условиях дефицита влаги в почве (Рис. 9А). Вероятно, что целый ряд известных механизмов действия бактерий на растения мог быть вовлечен в наблюдаемый эффект. Стимуляция роста корней бактериями могла быть исключительно важна при засухе, поскольку лучшее развитие корневой системы обеспечивает растение дополнительной влагой. Биологическая азотфиксация и улучшение минерального питания инокулированных растений могло снижать возникающий дефицит и ограниченный транспорт питательных элементов. Продуцирование бактериями ауксинов, антагонистов стрессового фитогормона АБК, могло ослаблять процессы, останавливающие рост растения в условиях дефицита влаги. Режим увлажнения почвы существенно повлиял на выживаемость бактерий в ризосфере растений: численность всех штаммов в середине и в конце вегетации поддерживалась на более высоком уровне при недостатке почвенной влаги. Сравнение популяционных кривых выживаемости бактерий  в  почве  без  растений  и  в  ризосфере  показало,  что  при дефиците

Рис. 9. Взаимодействие ячменя Целинный-5 с ассоциативными бактериями в зависимости от влажности почвы. (А) - эффект бактерий на урожай зерна (г/сосуд). Штаммы: А-137 - Az. lipoferum 137, А-7 - Ar. mysorens 7, А-10 - Ag. radiobacter 10 и Л30 - Flavobacterium sp. Л30. Римскими цифрами обозначено количество проведенных опытов, а арабскими цифрами обозначено количество опытов с достоверной прибавкой урожая (критерий Фишера, Р<0,05). Численность Az. lipoferum 137 в ризосфере (Б) и в почве без растений (В). Обозначения: влажность почвы 60% ПВ (, ) или 30% ПВ (, ). Вертикальные отрезки обозначают ошибку средних.

влаги более благоприятные условия для интродуцентов создаются на корнях растений по сравнению с почвой (Рис. 9 Б, В). Это указывает на активную роль растения в образовании ассоциаций с интродуцентамии и может служить аргументом в пользу того, что в условиях стресса растение ведет поиск дополнительных ресурсов, которые могут стать доступны ему благодаря активизации функций полезной ризосферной микрофлоры. Возможно также, что при дефиците влаги в ризосфере ослабевали конкурентные и антагонистические взаимодействия между интродуцируемыми штаммами и аборигенной микрофлорой, а внесение большого количества клеток интродуцента при инокуляции позволяло ему успешно конкурировать с аборигенными микробами, колонизирующая способность которых была снижена недостатком влаги.

5.4. Загрязнение почвы тяжелыми металлами

Целью данной работы являлось изучение возможности применения биопрепаратов ассоциативных бактерий на загрязненных почвах для получения качественной продукции растениеводства. При культивировании на питательных средах бактерии были устойчивы к относительно высоким концентрациям Pb, Cd, Cu, Ni и Zn, за исключением штамма Flavobacterium sp. Л30, который оказался высокочувствительным к Cd (Табл. 7).

Важным результатом стало обнаружение стимуляции продукции индолов у обработанных кадмием бактерий (Табл. 7). Устойчивые штаммы были способны активно сорбировать Cd при культивировании на питательной среде (Табл. 7), при этом максимальный коэффициент распределения Cd (соотношение концентраций Cd в клетках и среде) получено у Az. lipoferum 137 и равнялось 5000 500. В гидропонной культуре в присутствии кадмия все штаммы увеличили массу корней ячменя, а Ar. mysorens 7 повысил также массу побегов. В отсутствии кадмия бактериальный эффект выражался в повышении содержания питательных элементов (Р, К, Mg, Ca, Fe и Mn) в корнях и/или побегах. Кадмий ингибировал поступление питательных элементов в растения.

Таблица 7. Влияние кадмия на ассоциативные бактерии и их взаимодействие с растениями ячменя на загрязненной почве

Штамм

Устойчи-

вость к Cd / PbА, мМ

Эффект Cd на синтез ИУКБ, %

Сорбция Cd бакте-риями, мкг Cd/мг

Эффект бактерий на побеги ячменя:В

на массу,

%

на содер-жание Cd, %

Az. lipoferum 137

0,4 / 0,7

+ 28

7,8 1,0

+ 73*

- 19*

Ar. mysorens 7

0,6 / 1,0

+ 48

1,3 0,3

+ 57

- 9

Ag. radiobacter 10

0,5 / 0,8

+ 2

2,0 0,1

+ 72*

- 19*

Flavobacterium sp. Л30

<0,05/ 0,5

+ 50

н/о

+ 56

- 11*

АУказаны минимальные летальные концентрации металлов. БУказано соотношение интенсивности продуцирования ИУК (мкг/мг) в присутствии и отсутствии CdCl2 в питательной среде. ВРастения выращивали в почве обогащенной 75 мг Cd/кг. (*) Указывает на существенное влияние инокуляции (критерий Фишера, Р ≤ 0,05). (н/о) не определяли.

Эффект бактерий на элементный состав растений был сходным в присутствии и отсутствии Cd. Бактерии повышали накопление К, Mg, S, Fe, Mn и Zn в корнях, а также накопление P, K, S, Zn и Na в побегах, при этом воздействие разных штаммов на аккумуляцию элементов было сходным. В вегетационном опыте инокуляция ячменя стимулировала рост растений в присутствии токсичных концентраций кадмия в почве (Табл. 7). В побегах инокулированных растений содержание Cd снижалось (Табл. 7), но содержание питательных элементов (Р, К, S и Ca) в некоторых случаях повышалось. Все штаммы активно колонизировали корни ячменя на почве загрязненной свинцом или кадмием, за исключением Cd-чувствительного штамма Flavobacterium sp. Л30, который в середине вегетации не обнаруживался в ризосфере. В некоторых случаях численность других штаммов в ризосфере повышалась в присутствии тяжелых металлов, что вероятно было связано с конкурентными преимуществами устойчивых к металлам интродуцентов по отношению к аборигенной микрофлоре. Результаты трех полевых опытов показали, что применение биопрепаратов азоризина, мизорина, агрофила и флавобактерина проявлялось в повышении урожая зерна и активизации потребления растениями питательных элементов, таких как P, K, S и Ca. Известно, что эти элементы играют важную роль в процессах детоксикации тяжелых металлов растениями, однако токсичные металлы ингибируют ассимиляцию растениями питательных элементов. Результаты наших экспериментов свидетельствуют о способности инокулированнных растений более эффективно противодействовать отрицательному эффекту тяжелых металлов на усвоение питательных элементов, и это может быть важным механизмом положительного действия бактерий на устойчивость растений. Содержание Pb и Cd в зерне обработанных биопрепаратами растений не повышалось, а в отдельных случаях снижалось. Вероятными механизмами такого эффекта бактерий может быть иммобилизация металлов в ризосфере и активизация защитных реакций растений бактериальными биологически активными веществами. Результаты проведенных исследований показали, что биопрепараты на основе ассоциативных бактерий могут быть успешно применены для бактеризации ячменя в условиях загрязнения почвы свинцом и кадмием.

ВЫВОДЫ

1. Совместная инокуляция растений производственными штаммами Az. lipoferum 137 и Ag. radiobacter 10 превосходит по эффективности инокуляцию отдельными штаммами. Данные штаммы образуют ассоциацию в периодической культуре и при интродукции в ризосферу. Механизмами аддитивных и синергических эффектов смеси данных штаммов являются активизация и сбалансированность минерального питания растений за счет интенсивного поглощения азотных и фосфорных удобрений, а также повышенная азотфиксирующая активность и лучшая приживаемость Az. lipoferum 137 на корнях.

2. При интродукции на семена производственные штаммы Az. lipoferum 137, Ag. radiobacter 10, Ar. mysorens 7 и Flavobacterium sp. Л30 способны активно колонизировать корни различных видов и сортов сельскохозяйственных растений, выращиваемых в различных почвах и климатических условиях. Установлены детерминированные штаммом сходства популяционной динамики и различия в численности популяций на корнях инокулированных растений, что позволяют оценить экологическую пластичность и адаптационный потенциал ризобактериальных интродуцентов по таким характеристикам как буферность и эврибионтность популяций. Однако активная колонизация ризосферы ростостимулирующим штаммом не является достаточным условием реализации его положительного действия на растение.

3. Интродуцируемые ассоциативные бактерии активно вступают в конкурентные и в меньшей степени симбиотические взаимодействия с аборигенной почвенной микрофлорой. Приживаемость в ризосфере и эффективность инокуляции во многом зависит от устойчивости интродуцента к воздействию аборигенных микроорганизмов. Образование ассоциаций интродуцента с микрофлорой, ингибирующей рост растений, а также антагонизм интродуцента к полезным формам аборигенных бактерий искажает ожидаемую реакцию растений на инокуляцию.

4. Скрининг штаммов ассоциативных ростостимулирующих бактерий по признаку доминирования популяции в культурабельном бактериальном сообществе ризосферы прорастающих в почве семян является перспективным приемом для обнаружения интродуцентов с высокой колонизирующей способностью. Предложенный метод позволил селектировать высокоэффективные штаммы Arthrobacter sp. ДР12, Sinorhizobium sp. ДР65 и V. paradoxus 5C-2, которые обладают высокой колонизирующей активностью.

5. Во всех использованных нами почвах, отвалах горных пород и осадках сточных вод различного типа и географического положения присутствуют устойчивые к тяжелым металлам ростстимулирующие бактерии, содержащие фермент АЦК деаминазу и способные активно колонизировать корни прорастающих семян. Изолированные бактерии относятся к различным таксономическим группам, при этом впервые наличие АЦК деаминазы описано нами у видов Achromobacter xylosoxidans, Pseudomonas brassicacearum, Pseudomonas marginalis, Rhodococcus sp. и Variovorax paradoxus.

6. Инокуляция производственными штаммами и вновь выделенными ризобактериями, содержащими АЦК деаминазу, повышает устойчивость растений к токсичности тяжелых металлов, таких как кадмий и свинец. Степень антистрессового эффекта бактерий существенно варьирует в зависимости от штамма, генотипа растения и токсиканта. Важными механизмами ростостимулирующего эффекта бактерий в условиях токсичности тяжелых металлов являются: (1) стимуляция роста растений благодаря продуцированию бактериями ауксинов и снижению негативных этилен-зависимых реакций растения на стресс посредством АЦК деаминазной активности; (3) иммобилизации бактериями токсикантов в прикорневой зоне; (4) снижение ингибирующего действия металлов на потребление питательных элементов инокулированными растениями за счет стимуляции роста корней и активизации процессов ассимиляции или мобилизации элементов.

7. Инокуляция изучаемыми ассоциативными бактериями, как правило, не приводит к повышению содержания токсичных тяжелых металлов в растениях, а в некоторых случаях противодействует аккумуляции этих элементов в надземных органах. Для интенсификации процесса фитоэкстракции тяжелых металлов с помощью ассоциаций растений и ростстимулирующих бактерий необходимо разрабатывать дополнительные приемы и средства, направленные на мобилизацию металлов в ризосфере.

8. Уровень минерального питания растений оказывает существенное влияние на реакцию растений на инокуляцию бактериями содержащими АЦК деаминазу. Стимуляция роста растения происходит (1) в присутствии доступного фосфора, который обеспечивает высокий уровень гормона этилена в корнях, и (2) при отсутствии избытка доступного азота в виде аммония, который ингибирует активность фермента АЦК деаминазы, Дефицит фосфора для растений и избыток доступного азота для бактерий могут нарушать растительно-бактериальное взаимодействие, которое приводит к ограничению или нивелированию положительного действия АЦК-утилизирующих бактерий на растения.

9. Изучаемые штаммы АЦК-утилизирующих бактерий растворяют малодоступные фосфаты in vitro на питательных средах, однако не повышают потребление фосфора растениями из почвы. Поэтому роль мобилизации фосфатов данными бактериями в их ростостимулирующем эффекте на инокулированные растения несущественна.

10. Эффективность инокуляции ячменя производственными штаммами варьирует в зависимости от температуры среды, при этом положительный эффект бактерий на рост растений может быть достигнут при пониженных и повышенных температурах. Установлено, что для каждого из штаммов имеются особенности во взаимодействии с растением, обусловленные влиянием температуры. Популяции интродуцированных бактерий в ризосфере легко адаптируются к экстремальным температурам.

11. Производственные штаммы ассоциативных бактерий, за исключением Az. lipoferum 137, способны развиваться в кислой среде при рН=4,5 и устойчивы к относительно высоким концентрациям ионов Al+3. Направленность бактериального эффекта на рост растений в почвах с повышенной кислотностью существенно варьирует от положительной до отрицательной в зависимости от генотипа растения и, возможно, от особенностей реакции сортов на кислотный стресс.

12. Ассоциативные бактерии повышают адаптацию растений к стрессу, вызванному дефицитом влаги в почве, стимулируя рост корней и увеличивая доступ к дополнительным ресурсам находящейся в почве влаги. В этих условиях АЦК-утилизирующие бактерии способны стимулировать рост корней за счет регуляции уровня этилена. Снижение концентрации сигнальной молекулы АЦК в ксилемном соке инокулированных растений указывает на присутствие не только локального эффекта АЦК деаминазы на корни, но и на индукцию системного антистрессового эффекта. Концентрация гормона абсцизовой кислоты при этом остается высокой, что ограничивает потери воды листьями за счет транспирации.

13. Различия в популяционных кривых выживаемости производственных штаммов в ризосфере и почве, а также корреляция между численностью интродуцента и его эффектом на растения в зависимости от условий роста растений служат доказательствами активной роли растения в формировании ассоциаций с полезными формами ризобактерий при неблагоприятных условиях среды.

14. Инокуляция гороха АЦК-утилизирующими бактериями стимулирует образование азотфиксирующих клубеньков на корнях. Данный эффект в большей степени проявился в стрессовых условиях ингибирования клубенькообразования дефицитом влаги. Поэтому положительное действие ассоциативных бактерий, содержащих АЦК деаминазу, на симбиоз бобовых растений с клубеньковыми бактериями является важным механизмом их антистрессового эффекта.

15. Вероятность получения положительного ростостимулирующего эффекта от инокуляции ассоциативными бактериями выше в таких условиях, в которых рост растений лимитирован некоторыми биотическими или абиотическими факторами. При этом необходимыми условиями реализации ростостимулирующего эффекта являются устойчивость бактерий к данному фактору и способность бактерий противодействовать негативному проявлению этих факторов. Такое воздействие бактерий может быть направлено на регуляцию роста и метаболических процессов в растении, а также на благоприятные для растений изменения в окружающей растение среде.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Белимов А.А., Кожемяков А.П. Смешанные культуры азотфиксирующих бактерий и перспективы их использования в земледелии // Сельскохозяйственная биология. - 1992. № 5. - С. 77-87.
  2. Кожемяков А.П., Белимов А.А. Эффективность препаратов корневых диазотрофов при бактеризации ярового рапса // Агрохимия. - 1994. № 7-8. - С. 62-67.
  3. Белимов А.А., Поставская С.М., Хамова О.Ф., Кожемяков А.П., Кунакова А.М., Груздева Е.В. Приживаемость и эффективность корневых диазотрофов при инокуляции ячменя в зависимости от температуры и влажности почвы // Микробиология. - 1994. Т. 63. - С. 900-908.
  4. Белимов А.А., Иванчиков А.Ю., Воробьев Н.И. Роль доминирующей микрофлоры ризопланы ячменя во взаимодействии интродуцируемых диазотрофов с растением // Микробиология. - 1998. Т. 67. - С. 409-415.
  5. Белимов А.А., Кунакова А.М., Груздева Е.В. Влияние рН почвы на взаимодействие ассоциативных бактерий с ячменем // Микробиология. - 1998.  Т. 67. - С. 561-568.
  6. Белимов А.А., Серебренникова Н.В., Степанок В.В. Взаимодействие ассоциативных бактерий и эндомикоризного гриба с ячменем при совместной инокуляции // Микробиология. - 1999. Т. 68. - С. 122-126.
  7. Белимов А.А., Иванчиков А.Ю., Юдкин Л.Ю., Хамова О.Ф., Поставская С.М., Поползухина П.В., Шмакова А.А., Козлова Г.Я. Характеристика и интродукция новых штаммов ассоциативных ростстимулирующих бактерий, доминирующих в ризоплане проростков ячменя // Микробиология. - 1999. Т. 68. - С. 392-397.
  8. Тихонович И.А., Круглов Ю.В., Кожемяков А.П., Пароменская Л.Н., Белимов А.А., Борисов А.Ю. Микробиологические аспекты восстановления техногенно загрязненных почв и повышения качества сельскохозяйственной продукции // Достижения науки и техники АПК. - 2002. № 10. - С. 8-11.
  9. Белимов А.А., Кунакова А.М., Сафронова В.И., Степанок В.В., Юдкин Л.Ю., Алексеев Ю.В., Кожемяков А.П. Использование ассоциативных бактерий для инокуляции ячменя в условиях загрязнения почвы свинцом и кадмием // Микробиология. - 2004. Т. 73. - C. 118-125.
  10. Hontzeas N., Richardson A.O., Belimov A.A., Safronova V.I., Abu-Omar M.M., Glick B.R. Evidence for horizontal transfer of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase genes // Applied and Environmental Microbiology. - 2005. Vol. 71. - P. 7556-7558.
  11. Belimov A.A., Dodd I.C., Safronova V.I., Hontzeas N., Davies W.J. Pseudomonas brassicacearum strain Am3 containing 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase can show both pathogenic and growth-promoting properties in its interaction with tomato // J.  Exp. Botany - 2007. Vol. 58. Ц  P. 1485-1495.
  1. Белимов А.А., Кожемяков А.П. Динамика нитрогеназной активности и продуктивность ячменя, инокулированного корневыми диазотрофами // Бюллетень ВНИИСХМ. - 1988. № 51. - С. 26-30.
  2. Иванов Н.С., Белимов А.А. Влияние фунгицидов на рост ассоциативных азотфиксаторов и эффективность инокуляции ими ячменя // Труды ВНИИСХМ. - 1989. Т. 59. - С. 92-96.
  3. Воробьев Н.И., Белимов А.А., Кожемяков А.П. Применение дисперсионного анализа в изучении механизма взаимодействия растений и корневых диазотрофов (программа для ЭВМ "Диана-3") // Бюллетень ВНИИСХМ. - 1989. № 52. - С. 6-12.
  4. Кожемяков А.П., Белимов А.А. Перспективы использования ассоциаций азотфиксирующих бактерий для инокуляции важнейших сельскохозяйственных культур // Труды ВНИИСХМ. - 1991. Т. 61. - С. 7-18.
  5. Belimov A.A., Kunakova A.M., Gruzdeva E.V., Vasilyeva N.D., Vorobyev N.I., Kojemyakov A.P., Khamova O.F., Postavskaya S.M., Sokova S.M. Relationship between survival rates of associative nitrogen fixers on roots and yield response of plants to inoculation // FEMS Microbiology Ecology. - 1995. Vol. 17. - P. 187-196.
  6. Belimov A.A., Kozhemyakov A.P., Chuvarliyeva G.V. Interaction between barley and mixed cultures of nitrogen fixing and phosphate solubilizing bacteria // Plant and Soil. - 1995. Vol. 173. - P. 29-37.
  7. Belimov A.A., Kunakova A.M., Alekseyeva E.G., Martsinkevitch O.N., Kojemyakov A.P. Survival of associative fitrogen fixers in rhizoplane as a criterion for estimation of their effect on the inoculated plants // УAzospirillum and related microorganismsФ. Eds: Fendric I. et al., NATO AS Series. - 1995. - P. 535-542.
  8. Belimov A.A., Kunakova A.M., Vasilyeva N.D., Kovatcheva T.S., Dritchko V.F., Kuzovatov S.N., Trushkina I.R., Alekeyev Y.V. Accumulation of radionuclides by associative bacteria and the uptake of 134Cs by the inoculated barley plants // УNitrogen Fixation with Non-LegumesФ. Eds: K.A. Malik et al., Kluw. Acad. Publ. - 1998, - P. 275-280.
  9. Belimov A.A., Dietz K.-J. Effect of associative bacteria on element composition of barley seedlings grown in solution culture at toxic cadmium concentrations // Microbiological Research. - 2000. Vol. 155. - P. 113-121.
  10. Belimov A.A., Safronova V.I., Sergeyeva T.A., Egorova T.N., Matveyeva V.A, Tsyganov V.E., Borisov A.Y., Tikhonovich I.A., Kluge C., Preisfeld A., Dietz K.-J., Stepanok V.V. Characterisation of plant growth-promoting rhizobacteria isolated from polluted soils and containing 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase // Canadian Journal of Microbiology. - 2001. Vol. 47. - P. 642-652.
  11. Belimov A.A., Safronova V.I., Mimura T. Response of spring rape to inoculation with plant growth-promoting rhizobacteria containing 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase depends on nutrient status of the plant // Canadian Journal of Microbiology. - 2002. Vol. 48. - P. 189-199.
  12. Dodd I.C., Belimov A.A., Sobeih W.Y., Safronova V.I., Grierson D., Davies W.J. Will modifying plant ethylene status improve plant productivity in water-limited environments? // Proc. 4th Int. Crop Sci. Congress. - 26 Sept.-1 Oct., Brisbane, Australia, 2004. - 6 p.,
  13. Belimov A.A., Hontzeas N., Safronova V.I., Demchinskaya S.V., Piluzza G., Bullitta S., Glick B.R. Cadmium-tolerant plant growth-promoting bacteria associated with the roots of Indian mustard (Brassica juncea L. Czern.) // Soil Biology and Biochemistry. - 2005. Vol. 37. - P. 241-250.
  14. Safronova V.I., Stepanok V.V., Engqvist G.L., Alekseyev Y.V., Belimov A.A. Root-associated bacteria containing 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase improve growth and nutrient uptake by pea genotypes cultivated in cadmium supplemented soil // Biology and Fertility of Soils. - 2006. Vol. 42. - P. 267-272.
  15. Dodd I.C., Davies W.J., Belimov A.A., Safronova V.I. Manipulation of soil:plant signalling networks to limit water use and sustain plant productivity during deficit irrigation - a review // Acta Horticulturae. -2008. Vol. 792. - P. 233-239.
  16. Belimov A.A., Dodd I.C., Hontzeas N., Theobald J.C., Safronova V.I., Davies W.J. Rhizosphere bacteria containing ACC deaminase increase yield of plants grown in drying soil via both local and systemic hormone signalling // New Phytologist. - 2008. (in Press).
  Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии