Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
На правах рукописи
Тимохина Татьяна Харитоновна
ВРЕМЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ
03.02.03 - Микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Оренбург - 2011
Работа выполнена в ГОУ ВПО Тюменской государственной медицинской академии Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации и в Учреждении Российской академии наук Институте клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН
Научный консультант:
ЧленЦкорреспондент РАН, академик РАМН, Заслуженный деятель науки РФ, Бухарин Олег Валерьевич доктор медицинских наук, профессор
Официальные оппоненты:
Доктор медицинских наук, профессор Оренбургская государственная Чайникова Ирина Николаевна медицинская академия Доктор медицинских наук, профессор Тюменская государственная медицинская Жданова Екатерина Васильевна академия Заслуженный деятель науки РФ и РБ, док- тор медицинских наук, профессор Башкирский государственный Габидуллин Зайнулла Гайнулинович медицинский университет
Ведущая организация: ГОУ ВПО Челябинская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации
Защита состоится л 2011 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д. 208.066.03. при Оренбургской государственной медицинской академии по адресу: Россия, 460000, г. Оренбург, ул. Советская, д. 6, телефон:
(3532) 40-35-62, факс (3532) 77-24-59, e-mail: orgma@esoo.ru.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Оренбургской государственной медицинской академии Росздрава.
Автореферат разослан л 2011 г., автореферат и текст объявления размещены на официальном сайте Высшей аттестационной комиссии в сети Интернет л 2011 г.
Ученый секретарь диссертационного совета д. м. н., профессор Немцева Наталия Вячеславовна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы На современном этапе уделяется большое внимание изучению закономерностей осуществления процессов жизнедеятельности различных организмов во времени, что является таким же неотъемлемым свойством живой системы, как и их пространственное строение. Временная организация биологической системы определяется как совокупность упорядоченных изменений во времени, в том числе в виде биологических ритмов, ее структур и функций, иерархически взаимодействующих и согласованных между собой и с колебаниями условий внешней среды. Поэтому жизнедеятельность организмов, функционирование органов и систем, обмен веществ, энергии и информации в живых системах подчиняется закону биологической структурнофункциональной временной дискретности (Агаджанян Н.А. с соавт, 1998;
Комаров Ф.И. с соавт., 2000; Романов Ю.А., 2000, 2002; Halberg F., 1994, 2006).
Существование эндогенных циркадианных ритмов, наряду со стабильно выявляемыми ультрадианными циклическими процессами на всех уровнях организации эукариот не вызывает сомнений (Aschoff J., 1960; Dunlap J.C., 1999). Очевидно, что ультрадианные и инфрадианные составляющие являются неотъемлемыми в структуре биологических ритмов прокариот. Однако результаты исследований ритмических процессов у бактерий остаются единичными, несистематизированными, противоречивыми и требуют более тщательного изучения (Романов Ю.А.,1980; Загускин С.Л., 2006; Young M.W., Kay S.A., 2001; Johnson C.H., 2004; Min H. et. al., 2005; Soriano M.I. et.
al., 2010).
В изучении и формировании представлений о пространственновременной организации используют системный подход, позволяющий дать интегративную оценку ритмической структуры организма и выявить механизмы ее регуляции (Губин Г.Д., 2000; Романов Ю.А., 2002).
Оптимальный уровень функционирования любой живой системы обусловлен реализацией периодической программы, обеспечивающей необхо димую последовательность физиологических, метаболических и биохимических процессов и оптимальное соотношение ее параметров в каждый момент времени (Aschoff J., 1984). С этой точки зрения хронобиологический подход выступает одновременно и как методологический принцип и как методический прием (Губин Г.Д. с соавт. 2000).
К сожалению, отсутствуют сведения по суточной динамике важнейших физиологических характеристик патогенных свойств прокариот, включая госпитальные и музейные штаммы. Не изучен спектр чувствительности госпитальных изолятов к антимикробным препаратам с учетом индивидуальных особенностей их суточной динамики, что могло бы иметь значение для клинической практики. Открытым остается вопрос относительно изменений хроноструктуры физиологической активности биологических характеристик патогенных и условно-патогенных микроорганизмов под действием экзометаболитов ассоциативной микрофлоры. Не определена пространственновременная организация проявлений биологических свойств патогенов на популяционном уровне, что имеет важное значение для понимания механизмов адаптации микроорганизмов. Вышепоставленные вопросы требуют своего разрешения.
Цель и задачи исследования Цель исследования - изучение особенностей временной организации биологических свойств патогенных микроорганизмов и ее изменений под влиянием экзометаболитов ассоциативной микробиоты и антимикробных препаратов.
Для реализации этой цели были поставлены и решены следующие задачи:
1. Изучить суточную динамику пролиферативной, протеазной, каталазной, гемолитической, плазмокоагулазной, биопленкообразующей и антилизоцимной активности госпитальных изолятов S. aureus, P. aeruginosa, E.
coli.
2. Исследовать чувствительность госпитальных изолятов S. aureus, P. aeruginosa к антимикробным препаратам с учетом индивидуальных особенностей их суточной динамики.
3. Изучить изменения хроноинфраструктуры физиологической активности биологических свойств госпитальных изолятов S. aureus, E. coli, P. aeruginosa под действием экзометаболитов микробов-ассоциантов и антибиотиков в разное время суток.
4. Охарактеризовать на популяционном уровне фазовоамплитудную стабильность изучаемых показателей у госпитальных изолятов и музейных штаммов S. aureus, E. coli, P. aeruginosa для определения их пространственно-временной организации.
Новизна исследования Впервые проведены многофакторные исследования и представлен комплексный анализ особенностей хроноинфраструктуры биологических свойств популяций патогенных и условно-патогенных - госпитальных изолятов и музейных штаммов S. aureus, E. coli и P. aeruginosa в спектре ритмов высокой и средней частоты.
Применен метод косинор-анализа, адаптированный к микробиологическим исследованиям, позволяющий выявить спектральный состав ритмов в популяциях изучаемых прокариот и сформировать представление о временной организации госпитальных изолятов и музейных штаммов микроорганизмов (свидетельство РФ о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2009614932 от 10.09.2009, Бюл. № 4), что отражает стратегию распределения патогенных ресурсов микробной популяции во времени.
Доказано наличие как ультрадианных гармоник, так и циркадианных составляющих ритмов биологических свойств патогенных прокариот. У госпитальных изолятов S. aureus, E. coli и P. aeruginosa обнаружены в основном ультрадианные ритмы пролиферативной активности и факторов патогенности. Полученные результаты, расширяя теоретические представления о различных периодах физиологической активности биологических свойств патогенов в течение суток, позволили разработать способ дифференциации гос питальных изолятов S. aureus (патент РФ на изобретение № 2285258 от 10.10.2006 г., Бюл. № 28) и C. albicans (патент РФ на изобретение № 23197от 20.03.2008, Бюл. № 8) от музейных штаммов.
Обнаружена суточная динамика чувствительности к антимикробным препаратам на модели музейных штаммов и госпитальных изолятов S. aureus и P. aeruginosa. Выявлены периоды резистентности к антибиотикам у музейных (антибиотикочувствительных) штаммов и периоды чувствительности у госпитальных (антибиотикорезистентных) изолятов в течение суток.
Выявлено модулирующее влияние антимикробных препаратов на суточную динамику пролиферативной активности госпитальных изолятов и музейных штаммов S. aureus, E. coli и P. aeruginosa (патент РФ на изобретение № 2285257 от 10.10.2006, Бюл. № 28). Изменение хроноинфраструктуры их ритмов - свидетельство адаптационных возможностей микроорганизмов к изменяющимся условиям путем координации и регуляции собственных ритмометрических параметров и синхронизации их с внешними циклами.
Экспериментально продемонстрировано влияние экзометаболитов микробов-ассоциантов на суточную динамику показателей физиологической активности патогенов, обусловливающее десинхронизацию их ритмов.
Предложенный методический подход к изучению биологических свойств может быть использован в работе научно-исследовательских и практических лабораторий (акт внедрения № 03.1/3068 от 22.12.2010), а также использован в учебно-педагогическом процессе кафедр микробиологии и биологии (акты внедрения результатов диссертационной работы № 03.1/2842 от 16.11.2010 г; № 03.1/2884 от 22.11.2010).
Научно-практическая значимость Хронобиологические исследования определили новый методический подход к изучению временной организации проявления биологических свойств, как на уровне популяции, так и на уровне ассоциативных взаимоотношений прокариот. Выявленные биоритмы пролиферативной, протеазной, каталазной, гемолитической, плазмокоагулазной, пленкообразующей и антилизоцимной активности S. aureus, E. coli, P. aeruginosa, их лабильность под влиянием экзометаболитов ассоциативной микробиоты и антимикробных препаратов, последовательность и синхронность проявления в суточной динамике расширяют теоретические представления о биологии патогенных прокариот, их способности к адаптации в изменяющихся условиях среды.
Совокупность полученных данных о циркадианных и ультрадианных ритмах биологических свойств возбудителей позволяет обосновать положение о временной организации изучаемых патогенов и может быть использовано не только при определении различных биологических функций микроорганизмов, но и при обосновании их адаптивных реакций. Временная организация биологических свойств возбудителей инфекций, представляющая совокупность упорядоченных во времени изменений биоритмов, взаимодействующих и согласованных между собой под воздействием биотических и абиотических факторов, отражает адаптационные возможности патогенов и служит методическим ключом к изучению механизмов их регуляции.
Практическое значение исследований определяется разработкой хронобиологического метода изучения пролиферативной активности S. aureus и C. albicans, позволяющего дифференцировать госпитальные изоляты микроорганизмов на основе сравнительного анализа суточной динамики данного показателя возбудителей. Хронобиологические исследования позволили выявить различные периоды активности S. aureus, E. coli, P. aeruginosa, C. albicans и их чувствительность к антибиотикам в течение суток, что представляет интерес для разработки подходов антимикробных мероприятий.
Положения, выносимые на защиту:
1. Физиологические функции госпитальных изолятов и музейных штаммов имеют ультрадианную и циркадианную ритмичность, модифицирующуюся под действием биотических и абиотических факторов среды.
2. Амплитудно-фазовая оценка суточных ритмов биологических функций госпитальных изолятов и музейных штаммов - объективная индивидуальная характеристика патогенов.
3. Временная организация биологических свойств возбудителей госпитальных инфекций, представляющая совокупность упорядоченных из менений во времени биологических ритмов, взаимодействующих и согласованных между собой, как и изменения их спектрального состава под воздействием ассоциативной микробиоты и антимикробных препаратов - отражение адаптационных возможностей патогенов и методический ключ изучения механизмов их регуляции.
4. Использование метода косинор-анализа в изучении хронобиологической организации патогенов раскрывает стратегию распределения патогенных ресурсов микробной популяции во времени.
Апробация работы Материалы диссертации доложены и обсуждены на: V Всероссийской конференции Персистенция микроорганизмов (Оренбург, 2006); пятом Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва 2007); научной сессии, посвященной 10-летию Южно-Уральского научного центра РАМН Медицинская академическая наука - здоровью населения Урала (Челябинск, 2008); Всероссийской научно-практической конференции по медицинской микологии (Санкт-Петербург, 2008); совместном заседании Бюро отделения профилактической медицины Российской академии медицинских наук и президиума Южно-Уральского научного центра РАМН Профилактика профессиональных, экологически обусловленных и инфекционных заболеваний в Южно-Уральском регионе (Челябинск, 2009); заседании Тюменского филиала Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов, паразитологов (ВНПОЭМП), Тюмень, 2009; на XVIII Международной научной конференции Циклы природы и общества (Ставрополь, 2010).
Публикации По теме диссертации опубликовано 38 научных работ, из них 11 статей в журналах, рекомендованных ВАК. Получено 4 патента на изобретения и свидетельство на программу для ЭВМ.
Объем и структура диссертационной работы Диссертация изложена на 298 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, главу с описанием материалов и методов исследования, 3 главы собственных исследований, заключение, выводы и указатель литературы, включающий в себя 150 отечественных и 120 зарубежных источников. Иллюстрации представлены 50 таблицами и 72 рисунками.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования Для исследования биоритмов пролиферативной активности, факторов патогенности, персистенции и чувствительности бактерий к антибиотикам были использованы 13 моно- и ассоциированных изолятов (S. aureus, E. coli, P. aeruginosa и C. albicans), выделенных из клинического материала раневого отделяемого пациентов ожогового отделения, гнойной хирургии/реанимации ГЛПУ ТО ОКБ г. Тюмени и 7 музейных штаммов (S. aureus, E. coli, P. aeruginosa и C. albicans), полученных из американской коллекции типовых культур (АТСС) и государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А. Тарасевича. Выделение и идентификацию возбудителей проводили общепринятыми методами на основании морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических свойств в соответствии с приказом МЗ СССР № 535 от 22.04.1985 г. Изоляты S. aureus, E. coli и P. aeruginosa, выделенные из клинического материала, обладали множественной лекарственной устойчивостью.
Биоритмы пролиферативной активности S. aureus, E. coli и P. aeruginosa изучали многократно по разработанной нами методике проведения биоритмологического эксперимента и обработке данных, учитывающих особенности работы с микроорганизмами. Пролиферативная активность оценивалась по общему микробному числу (ОМЧ). Для исследований были получены 12- часовые культуры, что соответствовало началу стационарной фазы развития бактерий. Исследования проводили в течение суток с 3-часовым интервалом, начиная с 08.00 часов (патент РФ на изобретение Способ диагностики госпитальных штаммов № 2285258 от 10.10.2006 г. Бюл. № 28).
У микроорганизмов были изучены биологические свойства, включающие плазмокоагулазную (Меньшиков В.В., 2003), протеазную (Нетрусов А.И., 2005), каталазную (Бухарин О.В. с соавт., 2000), гемолитическую (Бухарин О.В. с соавт., 2006), антилизоцимную -АЛА (Бухарин О.В. с соавт., 1999), биопленкообразующую - БПО (O`Toole G., 2000) активности, а также изучали чувствительность к антибиотикам исследуемых культур с использованием тест систем MicroScan УPos Combo Type 41Ф (лDade Behring,USA) на бактериологическом анализаторе Autoscan (лBaxter, USA).
Влияние антибиотиков на биоритмы пролиферативной активности изучаемых микроорганизмов определяли, по стандартной методике серийных разведений, используя МПК препаратов (Меньшиков В.В., 2003; Кириллов Д.А., 2004).
Исследование биологических свойств изучаемых микроорганизмов в условиях межмикробных взаимодействий проводили при добавлении стерильных супернатантов микробов-ассоциантов в питательный бульон (Елагина Н.Н., 2001; Перунова Н.Б., 2003).
Результаты исследований получены на основе анализа суточной динамики биологических свойств госпитальных изолятов и музейных штаммов S.
aureus, E. coli, P. aeruginosa и C. albicans.
Статистическую обработку материалов и графическое изображение результатов осуществляли с использованием программ: Primer of Biostatics Version 4.03 by Stanton A. Glantz 1998, Microsoft Office Excel 2003. Определяли М - среднее арифметическое, - среднеквадратичное отклонение, m - средняя ошибка среднего арифметического, данные представляли по форме Мm или М. В случае соответствия сравниваемых выборок нормальному закону распределения (по 2) использовали t - критерий Стьюдента.
При определении регулирующего влияния экзометаболитов микросимбионтов и антимикробных препаратов, а также сравнении музейных и госпитальных изолятов бактерий достоверность различия сравниваемых выборок определяли непараметрическим методом статистической обработки: критерий Уилкоксона (W) применяли для связанных выборок, критерий МаннаУитни (Т) - для несвязанных выборок. Анализируемые различия считали достоверными при р<0,05. Для установления связи между параметрами ис пользовали корреляционный анализ по Спирмену (метод ранговой корреляции), относящийся к категории непараметрических, что позволило отказаться от предварительной оценки нормальности распределения сравниваемых признаков (Гланц С., 1999) Хронодизайн исследований подразумевал получение по каждой оцениваемой функции 8-ми измерений в сутки с 3-5-ти кратным повторением условий эксперимента. Данные были обработаны по методу наименьших квадратов (косинор-анализ) при заданной значимости достоверности p<0,(Nelson W. et al., 1979). Для каждого штамма впоследствии определены основные параметры ритмов с периодами Т=8, Т=12 и Т=24 часа: МЕЗОР (M) - среднее значение гармонической кривой наилучшей аппроксимации функции (косинусоиды), амплитуда ритма (A) - расстояние от экстремума до МЕЗОРа и акрофаза () - момент времени ожидаемого экстремума функции.
Для оценки амплитудно-фазовых характеристик экспериментальных серий была разработана и применена автоматизированная система Косиноранализ, адаптированная к микробиологическим исследованиям. С помощью прикладной графической программы Групповой косинор анализ построены доверительные эллипсы (свидетельство РФ о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2009614932 от 10.09.2009, Бюл. № 4).
Результаты исследований и их обсуждение На первом этапе исследований выявлено, что пролиферативная активность госпитальных изолятов и музейных штаммов S. aureus, E. coli, P. aeruginosa имеет суточную динамику, которая подвержена активной регуляции под воздействием экзометаболитов ассоциативной микробиоты и антимикробных препаратов.
Ритмометрический анализ временных параметров пролиферативной активности S. aureus показал, что для госпитальных изолятов S. aureus 2888, 2891 и 2305 характерна ультрадианная ритмичность. В доступном анализу спектре основными достоверными гармониками были ритмы с Т=12 и 8 ча сам, которые различались по своему удельному вкладу и основным параметрам - амплитудам и фазовому положению в суточном цикле (рис. 1). Для S.
aureus 2305, 2891 характерны 12-часовые периоды ритма пролиферативной активности, вклады которых в спектральном составе равны 44,0% и 17,8%, амплитуды - 31,43,9 КОЕ/мл и 25,48,9 КОЕ/мл, соответственно, (р<0,05).
Рис. 1 - Спектральный состав биоритмов пролиферативной активности S. aureus Примечание: по оси абсцисс - госпитальные изоляты (2305, 2888, 2891) и музейные штаммы (25923, 209); по оси ординат - вклад ритмов, %;
* - ритм достоверен (р <0,05) Для S. aureus 2888 достоверным был 8-часовой ритм с вкладом 74,6%, амплитудой 41,816,4 КОЕ/мл (р<0,05). Выявление ультрадианного ритма с различными гармониками в биологических исследованиях предполагает проявление нескольких акрофаз в течение суток. С учетом этого, акрофазы пролиферативной активности у S. aureus 2891 регистрировались в 08.09 и 20.часов, у S. aureus 2305 - в 09.16 и 21.00 часов, а у S. aureus 2888 - в 05.00;
14.00 и 23.00 часа.
Ритмометрический анализ выявил у музейных штаммов S. aureus 259и 209-Р ведущий циркадианный ритм (околосуточный) пролиферативной активности с вкладом 56,1% и 38,4%, амплитудой 39,85,9 КОЕ/мл и 37,87,КОЕ/мл, соответственно, (р<0,05). Акрофазы обоих штаммов регистрировались около 22.30 часов.
Таким образом, пролиферативная активность музейных штаммов S. aureus имеет достоверные циркадианные ритмы с высокой амплитудой и акрофазой в одно и то же время, что свидетельствует о стабильности их свойств.
У госпитальных изолятов ведущим являлся ультрадианный ритм. По всей видимости, ультрадианные ритмы, как ритмы с высокочастотными гармониками, для госпитальных изолятов наиболее значимы при адаптации к меняющимся условиям макроорганизма. Преобладание тех или иных гармоник в хроноинфраструктуре явно выражено и, можно сказать, является типовым признаком изученных временных рядов пролиферативной активности данных штаммов.
Различия ритмометрических параметров пролиферативной активности музейных и госпитальных штаммов S. aureus, включая вклады циркадианных, ультрадианных ритмов и амплитуды, имеют значение для дифференциации госпитальных изолятов S. aureus (патент РФ на изобретение № 2285258 от 10.10.2006, Бюл. № 28).
При оценке временных параметров пролиферативной активности у госпитальных изолятов E. coli (2898, 2364, 2909, 2336) было определено, что ведущими ритмами являлись ультрадианные, а у музейных штаммов E. сoli (35218 и 25922) - циркадианные. Однако, у госпитального изолята 2898 помимо ультрадианного ритма (вклад 30,0%) дополнительно регистрировался достоверный циркадианный ритм (вклад 47,1%), а у музейного штамма 352дополнительно проявился ультрадианный ритм равнозначный по вкладу циркадианному ритму, вклад их составлял 20,8% и 21,8%, соответственно, (рис. 2).
Акрофазы ультрадианных ритмов госпитальных изолятов E. coli регистрировались в дневной и ночной периоды суток. У музейных штаммов ведущие циркадианные ритмы пролиферативной активности максимально проявлялись в вечернее время суток.
Ритмометрический анализ пролиферативной активности P. aeruginosa выявил у госпитальных изолятов и музейных штаммов ведущий ультрадиан ный ритм (р<0,05). Однако, в спектральном составе биоритмов P. aeruginosa 2898, 2345 и 9027 отмечался и достоверный циркадианный ритм (рис. 3).
Ультрадианные ритмы пролиферативной активности госпитальных изолятов P. аeruginosa 2364 и 2345 имели стабильные акрофазы в 11.00 и 23.00 часа, у изолятов P. аeruginosa 2889 и 2898 - в 08.00 и 20.00 часов. У музейных штаммов P. aeruginosa (27853 и 9027) акрофазы ультрадианных ритмов пролиферативной активности приходилось на 03.00 и 17.00 часов.
Таким образом, интегральная оценка хроноинфраструктуры пролиферативной активности госпитальных изолятов и музейных штаммов S. aureus, E. сoli, P. aeruginosa, позволяет сделать ряд обобщений. У госпитальных микроорганизмов ведущим ритмом являлся ультрадианный. По всей видимости, этот ритм c более высокими гармониками для госпитальных изолятов имеет важное значение в плане их адаптации к меняющимся условиям биотической и абиотической среды. В то же время, наличие циркадианных ритмов в спектральном составе прокариот одновременно с ультрадианными гармониками также усиливает адаптивные возможности популяции (следует Рис. 2. Спектральный состав биоритмов пролиферативной активности госпитальных изолятов и музейных штаммов E. coli.
Примечание: по оси абсцисс - госпитальные изоляты (2898, 2364, 2909, 2336) и музейные штаммы (35218, 25922); по оси ординат - вклад ритмов, % ;
* - ритм достоверен (р <0,05) Рис. 3 - Спектральный состав биоритмов пролиферативной активности госпитальных изолятов и музейных штаммов P. aeruginosa Примечание: по оси абсцисс - госпитальные изоляты (2364, 2889, 2898, 2345) и музейные штаммы (27853, 9027); по оси ординат - вклад ритмов, %;
* - ритм достоверен (р <0,05) учесть, что для макроорганизма циркадианный ритм - ведущий и является единственным генетически обусловленным в рассматриваемом нами спектральном диапазоне). Вот почему, появление околосуточных ритмов, с одной стороны, может быть обусловлено влиянием макроорганизма, как основной среды обитания для S. aureus, E. coli, P. aeruginosa. С другой стороны, обсуждается вопрос о циркадианности в проявлении ряда физиологических функций бактерий и формируется доказательная база, объясняющая наличие у прокариот генов, ответственных за околосуточные ритмы (Павлович Н.В. с соавт., 1991; Rogers L.A. et. al., 1930; Dvornyk V. et. al., 2005; Soriano M.I. et.
al., 2010).
Вместе с тем, выявлено, что микроорганизмы, выделенные в ассоциациях из ожоговой раны, проявляли сходные биологические ритмы. Так, для E. coli 2364 и P. aeruginosa 2364 были характерны 12-часовые ритмы пролиферативной активности с акрофазами в 11.00 и 23.00 часа. Для E. coli 2898 и P. aeruginosa 2898 характерны как 12-, так 24-часовые ритмы (р<0,05) и сов падение акрофаз. Вероятно, микроорганизмы одного биотопа подвержены одинаковым воздействиям со стороны окружающей среды (макроорганизма, ассоциативной микробиоты, абиотических факторов и др.), что и объясняет сходство их хронобиологических характеристик.
Для подтверждения вышесказанного, нами было изучено влияние микробных экзометаболитов на ритмические процессы физиологической активности биологических свойств возбудителей в бактериально - грибковых ассоциациях (рис. 4, 5).
Экспериментально доказано, что на хроноинфраструктуру пролиферативной активности S. aureus 2888 оказывали влияние метаболиты P.
аeruginosa и E. сoli, которые достоверно снижали мезор (W=30,0; р < 0,05), амплитуду, но не изменяли акрофазу. Вклад ультрадианного 12-часового ритма уменьшился в 3,9 раза, но увеличилась доля высокочастотных ультрадианных 8-часовых гармоник.
На пролиферативную активность E. сoli 2364 более активное воздействие оказывали экзометаболиты S. aureus и P. аeruginosa. В результате этого нивелировался циркадианный ритм и появилась дополнительная гармоника 8-часового ультрадианного ритма (вклады ритма 34,3%, 29,9%). Мезор и амплитуда не изменялись по сравнению с контролем (W=6,0; р>0,05), однако акрофаза смещалась с 10.00 на 05.00 часов.
Экзометаболиты S. aureus, E. coli, C. аlbicans стимулировали появление достоверного циркадианного ритма пролиферативной активности P.
аeruginosa 2364 (р<0,05), акрофаза изучаемого показателя смещалась с 01.часа на 11.00 часов, мезор и амплитуда достоверных различий не дали (W= - 10,0; р > 0,05).
Таким образом, результаты исследования позволили выявить, что у S.
aureus, E. coli, P. aeruginosa сохранялись ультрадианные ритмы пролиферативной активности под воздействием экзометаболитов микробовассоциантов, но дополнительно появлялись циркадианные ритмы изучаемого показателя. Появление дополнительных гармоник, на наш взгляд, способствует усилению адаптивных возможностей популяции.
S. aureus 28E. coli 231 - контроль 1 - контроль 2 - под действием экзометаболитов E. coli 2 - под действием экзометаболитов S. aureus 3 - под действием экзометаболитов P. aeruginosa 3 - под действием экзометаболитов P. aeruginosa 4 - под действием экзометаболитов C. albicans 4 - под действием экзометаболитов C. albicans P. aeruginosa 231 - контроль; 2 - под действием экзометаболитов S. aureus; 3 - под действием экзометаболитов E. coli; 4 - под действием экзометаболитов C. albicans Рис. 4 - Амплитудно-фазовая характеристика стабильности суточных ритмов пролиферативной активности возбудителей под воздействием экзометаболитов микробов-ассоциантов.
Примечание: местоположения доверительных эллипсов (контуры которых отграничивают область двухмерного пространства - амплитуд и фаз) отражают временную область проявления ультрадианного ритма по результатам популяционного косинор-анализа. По окружности - время суток, градусная мера суточного цикла, 24 часа = 360. По радиусу от центра - единицы измерения амплитуды - КОЕ/мл Рис. 5 - Спектральный состав биоритмов пролиферативной активности S. aureus (А), E. coli (Б), P. aeruginosa (В) под влиянием экзометаболитов микробов-ассоциантов.
Примечание: по оси абсцисс- возбудитель; по оси ординат- вклад ритмов, % -циркадианный ритм; -ультрадианный 12- часовой ритм;
- ультрадианный 8- часовой ритм; * - ритм достоверен (p<0.05).
Выявленный эффект изменения хроноинфраструктуры пролиферативной активности прокариот бактериально-грибковыми метаболитами отражает напряженность биологической системы, которая, по всей видимости, неизбежна в процессе формирования межмикробных взаимоотношений.
Учитывая, что при взаимодействии микроорганизмов с различными стрессовыми факторами возможны изменения численности популяции, стрессоустойчивости, факторов патогенности (Красильников А.П., 1994; Сузина Н.Е., 2001; Эль-Регистан Г.И., 2001; Ильинская О.Н., 2002; Бухарин О.В.
с соавт., 2002; Иванова Е.Б., 2004), мы предприняли попытку изучить влияние антимикробных препаратов на биоритмы пролиферативной активности госпитальных изолятов и музейных штаммов S. aureus и P. aeruginosa.
Под воздействием суббактериостатических концентраций гентамицина у музейного штамма S. aureus (гентамицинчувствительный) изменились ритмометрические параметры пролиферативной активности: уменьшился вклад циркадианного ритма (в 2,5 раза), появился ультрадианный ритм с акрофазой в 14.00 часов (вклад 16,1%), снизились мезор (в 8 раз) и амплитуда (в 5 раз), т.е. наблюдалась десинхронизация. Изменения биоритмов пролиферативной активности музейного штамма S. aureus свидетельствуют о снижении адаптационных возможностей микроба и, возможно, о необратимых изменениях, в дальнейшем приводящих культуру к гибели.
У госпитального изолята S. aureus (гентамицинрезистентного) достоверных изменений при таком же режиме воздействия гентамицином не выявлено (р>0,05). Отсутствие изменений может быть использовано для дифференциации госпитальных изолятов от музейных штаммов (Патент РФ на изобретение № 2285257 от 10.10.2006, Бюл. № 28).
Под действием суббактериостатических концентраций ванкомицина на пролиферативную активность S. aureus (все штаммы ванкомицинчувствительные) было установлено изменение ритмометрических показателей, как у музейного штамма, так и у госпитального изолята (W = -34; -30, соответственно, р<0,05). Увеличивалось среднесуточное значение пролиферативной активности почти в 3 раза (с 107,03,2 КОЕ/мл до 298,57,4 КОЕ/мл и с 126,42,3 КОЕ/мл до 354,53,8 КОЕ/мл, соответственно). У музейного штамма появлялся ультрадианный ритм, акрофаза пролиферативной активности музейного штамма смещалась с ночного периода на утро, у госпитального изолята акрофаза роста отмечалась в 14.00 и 20.00 часов, в отличие от контроля с максимумами в 5.00; 14.00 и 23.00 часа. У обоих штаммов отмечено сильное увеличение амплитуды циркадианного ритма (у музейного - с 26,6 КОЕ/мл до 87,6 КОЕ/мл; у госпитального - с 14,2 КОЕ/мл до 130,КОЕ/мл), что свидетельствовало о значительном адаптивном напряжении после стрессового воздействия ванкомицина.
У музейного штамма и госпитального изолята P. aeruginosa также было выявлено изменение ритмометрических показателей пролиферативной активности под влиянием суббактериостатических концентраций ципрофлоксацина (W =28,0 и 36,0, соответственно; р<0,05). Уменьшилось среднесуточное значение показателя у музейного штамма по сравнению с контролем в раза (с 143,44,7 КОЕ/мл до 45,99,1 КОЕ/мл) и у госпитального - в 7 раз (с 211,914,2 КОЕ/мл до 30,61,7 КОЕ/мл). Амплитуды ритмов под воздействием антибиотика изменялись значительно. У музейного штамма появился дополнительно циркадианный ритм пролиферативной активности (вклад - 46,0%) и акрофаза сместилась с 02.00 часов на 11.00 часов. У госпитального изолята произошло нивелирование ультрадианного ритма, но увеличился вклад циркадианного ритма на 28% и акрофаза сместилась с 14.08 часов на 17.52 часов. Изменения, зарегистрированные у обоих штаммов P. aeruginosa под воздействием ципрофлоксацина также свидетельствовали об адаптивном напряжении, что, в конечном итоге, может приводить к десинхронозу и гибели патогенов. Вышеизложенные результаты свидетельствуют об эффективности воздействия на антибиотикочувствительные штаммы патогенов суббактеристатических концентраций антибиотиков, что может быть рассмотрено как один из подходов рациональной антимикробной терапии.
На следующем этапе работы была изучена суточная динамика функциональных показателей, отражающих патогенные свойства S. aureus, P. aerugi nosa и E. coli (плазмокоагулазная, протеазная, каталазная, гемолитическая активность) и влияние на нее экзометаболитов ассоциативной микробиоты.
В результате проведенных исследований обнаружено, что музейные штаммы S. aureus 25923 и 209-Р характеризовались достоверным циркадианным ритмом плазмокоагулазной активности с акрофазой в 11.00 часов, минимальная активность наблюдалась в вечерние и ночные часы -17.00 и 23.часа. У госпитальных изолятов, напротив, отмечался ультрадианный ритм с акрофазами в 02.00 и 14.00 часов.
У музейного штамма S. aureus 25923 обнаружены циркадианные и ультрадианные ритмы протеазной, каталазной и гемолитической активности с акрофазами, соответственно, в 05.00; 11.00 и 23.00 часа. Максимальная активность изучаемых патогенных факторов равнялась 4,10,2 мг/минмл; 6,20,мкмоль/мин и 20,10,2%, соответственно.
Госпитальный штамм S. aureus 2888 проявлял протеазную активность в циркадианном ритме, максимальные показатели фермента (0,74 0,мг/минмл) регистрировали в 21.30 час (рис. 6).
Среднесуточное значение показателя равнялось 0,4 0,1 мг/минмл, что было в 6,5 раз ниже среднесуточного значения протеазной активности музейного штамма (Т= 36,0; р<0,05). Под воздействием экзометаболитов E. coli количество фермента увеличилось в 10 раз (W = -36,0; р<0,05) и в 4 раза - под влиянием экзометаболитов P. aeruginosa (W = - 22,0; р<0,05); в спектральном составе появились ультрадианные ритмы.
Активность каталазы S. aureus 2888 проявлялась как в ультрадианных, так и в циркадианных ритмах, максимальные значения фермента (4,480,мкмоль/мин) выявляли в 03.52 часа, мезор - 3,10,1 мкмоль/мин и не отличался от показателя музейного штамма (Т=58,0; р>0,05). Под воздействием экзометаболитов P. aeruginosa и C. albicans мезор каталазной активности снизился в 1,7 раза (W = 28,0; р<0,05) и в 2,2 раза (W = 36,0; р<0,05), соответственно. Экзометаболиты E. coli сместили акрофазу каталазной активности S.
aureus на 11.00 часов, а экзометаболиты C. albicans - на 20.30 часов.
Гемолитическая активность Протеазная активность Каталазная активность S. aureus E. coli P. aeruginosa Рис. 6 - Амплитудно-фазовая характеристика патогенных свойств госпитальных изолятов под влиянием экзометаболитов ассоциативной микробиоты.
Примечание: 1-контроли; S. aureus +метаболиты: 2 - E. coli, 3 - P. aeruginosa, 4 - C. albicans; E. coli+метаболиты: 2 - S. aureus, 3 - P. aeruginosa, 4 - C. albicans; P. aeruginosa +метаболиты: 2 - S. aureus, 3 - E. coli, 4 - C. albicans Для гемолитической активности S. aureus 2888 был характерен ведущий ультрадианный ритм с 8-часовым периодом, акрофазы этих ритмов совпадали с пролиферативной активностью и были зафиксированы около 03.00;
11.00 и 19.00 часов. Среднесуточная активность показателя (4,70,6%) в раза ниже по сравнению с гемолитической активностью музейного штамма (Т=96,0; р<0,05). Следует отметить, что хронобиологический подход позволил выявить динамику гемолитической активности у госпитального изолята S. аureus типированного традиционным бактериологическим методом как негемолитический вариант, что открывает перспективы для выявления нестабильно экспрессируемых биологических свойств атипичных штаммов.
Под влияние метаболитов P. aeruginosa гемолитическая активность S. aureus увеличилась в 2,7 раза (W = - 36,0; р<0,05).
У музейного штамма E. coli 35218 выявлены: циркадианные ритмы протеазной и гемолитической активности с акрофазами в 07.52 и 17.00 часов и среднесуточными значениями - 0,19 0,04 мг/минмл и 10,70,3%, соответственно. Активность каталазы проявлялась в ультрадианном ритме, мезор - 0,70,02 мкмоль/мин, акрофаза наблюдалась на 08.04 часов, максимальная активность - 2,32 0,01 мкмоль/мин.
У госпитального изолята E. coli 2364 активность протеазы проявлялась также в циркадианном ритме с акрофазой в 00.20 часов. Под воздействием экзометаболитов S. aureus и C. albicans циркадианный ритм протеазной активности изменялся на ультрадианный ритм. Акрофаза смещалась на утреннее и вечернее время.
Ведущий ритм каталазной активности госпитального изолята E. coli - ультрадианный (12-часовой). Среднесуточная активность (2,110,мкмоль/мин) в 2,6 раза выше активности музейного штамма, акрофаза регистрировалась в 10.48 часов. Под воздействием экзометаболитов 12-часовой ритм госпитального изолята сохранялся, но дополнительно формировался более высокочастотный 8-часовой ритм. Среднесуточная активность, амплитуда и акрофаза не изменялись под воздействием бактериальных метаболитов. Однако, метаболиты C. albicans снижали среднесуточную активность фермента и 1,5 раза (W = 24,0; р<0,05) и способствовали появлению дополнительно циркадианного ритма.
Гемолитическая активность госпитального изолята E. coli без воздействия экзометаболитов и под воздействием проявлялась в цирка-, и ультрадианном ритмах. Среднесуточный уровень активности гемолизинов (72,1 2,02%) снижался под воздействием экзометаболитов P. aeruginosa на 48,6% (W = 36,0; р<0,05) и на 64% (W = 36,0; р<0,05) под воздействием экзометаболитов C. albicans. Регистрировалось смещение акрофазы гемолитической активности под влиянием всех изучаемых экзометаболитов.
У музейного штамма P. aeruginosa 27853 активность протеазы и каталазы проявлялась в циркадианном ритме с акрофазами в 23.32 и 21.04 час, со среднесуточными значениями ферментов - 0,170,03 мг/минмл и 1,640,мкмоль/мин. Для гемолитической активности музейного штамма P. aeruginosa характерен ультрадианный ритм с акрофазой в 11.48 часов и среднесуточным значением - 5,08 0,21%.
У госпитального изолята P. aeruginosa 2364 активность протеазы проявлялась в циркадианном ритме, как и у S. aureus и E. coli. Среднесуточные показатели активности фермента находились на уровне 1,16 0,19 мг/минмл и не отличались от показателей музейных штаммов. Наиболее активное воздействие на суточную динамику протеазы оказывали метаболиты E. coli, которые в 2,5 раза повышали ее активность (W = - 36,0; р<0,05). Акрофаза (22.48 часа) не изменялась под воздействием метаболитов. Примечателен факт сходства ритмов активности протеазы P. aeruginosa и E. coli, выделенных из одного биотопа. Эти возбудители проявляли протеазную активность в едином циркадианном ритме. По всей видимости, согласованность ритмов по этим позициям в условиях пребывания в одном биотопе для них биологически обоснована.
Каталазная активность P. aeruginosa проявлялась в циркадианном ритме, с акрофазой в 07.00 часов. Среднесуточный уровень фермента (4,33 0,мкмоль/мин) в 2,5 раза выше уровня музейного штамма. Под воздействием метаболитов E. coli и C.albicans активность фермента увеличилась в 1,7 раза (W = - 36,0; р<0,05) и в 1,3 раза (W = - 34,0; р<0,05), соответственно, а акрофаза сместилась на ночной период суток. В дополнение к ведущему циркадианному ритму под воздействием метаболитов S. aureus и E. coli появлялись ультрадианные 8-часовые гармоники.
Гемолитическая активность P. aeruginosa проявлялась в циркадианном ритме, вклад которого в спектре ритмов был явно доминирующим (76,3%).
Среднесуточная активность соответствовала 13,58 0,6%. Акрофазу регистрировали в 01.20 час. Под воздействием экзометаболитов E. coli гемолитическая активность P. aeruginosa возрастала на 8,1% и на 24,9% - под воздействием экзометаболитов C. albicans (W = - 30,0; р<0,05), а также появлялся ультрадианный ритм данного свойства.
Для выявления согласованности различных функций S. aureus, P. aeruginosa и E. coli, обеспечивающих их приспособление к различным условиям обитания мы провели корреляционный анализ между пролиферативной активностью и патогенными характеристиками. У музейного штамма S. aureus показатели пролиферативной активности положительно коррелировали с гемолитической активностью (r = 0,38; р<0,05), но отрицательно - с каталазной активность (r = - 0,58; р<0,05) и протеазной активностью (r = - 0,60; р<0,05).
Иначе говоря, в период минимальной пролиферативной активности стафилококков продукция ферментов (протеазы и каталазы) была максимально выражена, что может способствовать выживанию патогенов в организме человека. С увеличением пролиферативной активности максимальных значений достигала продукция повреждающих факторов - гемолизинов. У госпитального изолята S. aureus выявлена положительная корреляция пролиферативной активности с каталазной активностью (r = 0,57; р<0,05). С протеазной и гемолитической активностью достоверной корреляции нет (r = - 0,07; р>0,и r = - 0,3; р>0,05, соответственно), но в период минимальной пролиферативной активности наблюдали увеличение продукции протеазы и гемолизинов.
У музейного штамма E. coli обнаружена обратная корреляция показателей пролиферативной активности с протеолитической активностью (r = - 0,5;
р<0,05) и отсутствие связи с каталазной и гемолитической активностью (r = - 0,1; р>0,05 и r = - 0,1; р>0,05, соответственно). У госпитального изолята E.
coli выявлена обратная корреляция показателей пролиферативной активности с протеазной и каталазной активностью (r = - 0,4; р<0,05 и r = - 0,6; р<0,05, соответственно) и сильная прямая связь с гемолитической активностью (r = 0,7; р<0,05).
У музейного штамма P. aeruginosa не обнаружена достоверная корреляция между пролиферативной активностью и факторами патогенности (р>0,05). У госпитального изолята выявлена корреляция только с гемолитической активностью (r = - 0,4; р>0,05).
Полученные экспериментальные данные подтверждают, что при интенсивном функционировании той или иной системы активность многих других систем снижается: в одной и той же клетке адаптивная интенсификация синтеза одних ферментов обязательно сопровождается ингибированием продукции других. Это означает, что организму свойственна способность экономии материальных и энергетических ресурсов и максимальная концентрация их на главном участке развертывания приспособительной реакции в определенный временной период (Лукомская К.А., 1987; Комаров Ф.И., 2000).
Проведенные исследования суточной динамики чувствительности S. aureus к некоторым антибиотикам позволили обнаружить различные МПК (минимальная подавляющая концентрация) антибиотиков в отношении музейного штамма S. aureus 25923. Максимальная чувствительность к большинству изученных антибиотиков (амоксиклав, имипенем, ванкомицин, гентамицин, рифампицин, тетрациклин, клиндамицин) зарегистрирована в раннее утреннее время - 05.00 часов и вечернее время - 20.00; 23.00 часа. Были выявлены периоды повышения МПК антибиотиков и приближение этих значений к показателям резистентности в утреннее и дневное время - 08.00;
11.00; 14.00 часов.
У госпитального изолята S. aureus 2888 была отмечена динамика чувствительности только к следующим антибиотикам: линезолид, цефалотин, гатифлоксацин, моксифлоксацин, синерцид. МПК линезолида, цефалотина, выявлена в 02.00 и 05.00 часов, МПК моксифлоксацина наблюдалась в 05.00;
20.00 и 23.00 часа, МПК гатифлоксацина - на всем протяжении суточного ритма, кроме 02.00 и 08.00 часов, МПК синерцида выявлена в 02.00; 05.00 и 23.00 часа. Следовательно, у госпитального изолята, напротив, были отмечены периоды чувствительности к антибиотикам в течение суток, но только к ванкомицину на всем протяжении суточного периода возбудитель проявлял стабильную чувствительность.
Хронобиологический подход позволил выявить периоды резистентности к антибиотикам у музейных (чувствительных к препаратам) штаммов S. aureus и периоды чувствительности у госпитальных (антибиотикорезистентных) изолятов в течение суток, что может иметь значение для дальнейших исследований в направлении рационального применения антимикробных препаратов.
Биологические ритмы персистентных свойств S. aureus, E. coli, P. aeruginosa изучали по их способности формировать биопленки (биопленкообразующая способность - БПО), проявлять антилизоцимную активность (АЛА), а также изучали влияние экзометаболитов ассоциативной микробиоты на суточную динамику этих факторов.
Способность к образованию биопленок S. aureus характеризовалась циркадианным (вклад ритма - 46,6%, акрофаза - в 17.16 часов) и ультрадианным 8-часовым ритмом (вклад ритма - 46,9%, акрофазы - в 06.00, 14.00 и 23.часов), мезор равнялся 0,330,01 ед. OD, амплитуды ритмов были одинаковы (0,080,02 ед. OD). Под влиянием экзометаболитов E. coli, P. aeruginosa, C.
albicans сохранился только циркадианный ритм, а экзометаболиты P. aeruginosa снижали еще и амплитуду в 2 раза. Изменение мезора и акрофазы не отмечалось.
Ведущим ритмом БПО активности E. coli являлся ультрадианный 12часовой ритм, с акрофазами в 11.00 и 23.00 часа, мезором - 0,280,01 ед. OD и амплитудой - 0,050,01 ед. OD. Под влиянием экзометаболитов S. aureus, P. aeruginosa, появлялись дополнительно 8-часовые гармоники с акрофазой в раннее утреннее время (с 04.00 - 05.00 часов).
Ритм БПО активности P. aeruginosa характеризовался ультрадианными 8-часовыми гармониками, мезор равнялся 0,340,01ед. OD, амплитуда - 0,030,01 ед. OD, акрофаза регистрировалась около 06.00, 14.00 и 23.00 часов. Под влиянием экзометаболитов S. aureus, E. coli, C. albicans в спектральном составе появился дополнительно стабильный циркадианный ритм с возрастанием амплитуды в 2-3 раза. В то же время экзометаболиты C. albicans нивелировали ультрадианный ритм и достоверно снижали мезор (W = 36,0;
р<0,05). Акрофазы изучаемого показателя синхронизированы во времени и проявлялись у циркадианного ритма около 19.00 часов, у ультрадианного - около 06.00, 14.00 и 23.00 часов.
Корреляционный анализ позволил выявить только у P. aeruginosa наличие отрицательной корреляции между пролиферативной активностью и способностью образовывать биопленки (r = - 0,67; р<0,05).
Изучение АЛА показало наличие в спектральном составе всех госпитальных изолятов циркадианного ритма с акрофазами в утреннее и дневное время. У музейных штаммов наблюдалась гетерогенность ритмов с преобладанием в спектре ультрадианных гармоник и регистрация акрофаз в различные периоды суток. Влияние экзометаболитов ассоциативной микробиоты на АЛА возбудителей изучали на модели музейных штаммов. Под воздействием экзометаболитов у S. aureus появлялся достоверный циркадианный ритм, но амплитуда не изменялась. Однако под воздействием экзометаболитов P. aeruginosa и C. albicans акрофаза с ночного периода суток смещалась на утреннее и дневное время. Мезор показателя увеличивался под влиянием экзометаболитов E. coli (W = -24,0; р<0,05) и снижался под влиянием экзометаболитов C. albicans (W = 16,0; р<0,05).
Под влиянием экзометаболитов ультрадианные ритмы АЛА E. сoli изменялись на циркадианные, акрофазы которых регистрировались в вечернее и ночное время, амплитуда увеличивалась в 2-3 раза, а мезор снижался только при воздействии экзометаболитов C. albicans (W = 26,0; р<0,05).
Для P. aeruginosa была характерна гетерогенность ритмов, однако под влиянием экзометаболитов всех исследуемых штаммов ассоциативных мик роорганизмов ведущим оставался циркадианный ритм, а акрофаза, амплитуда и мезор оставались без изменения (р>0,05).
Таким образом, влияние экзометаболитов способствовало появлению у всех музейных штаммов возбудителей 24-часового ритма АЛА, что было свойственно только госпитальным изолятам. По всей видимости, это можно объяснить тем, что лизоцимная активность как один из факторов неспецифической резистентности макроорганизма проявляет циркадианную активность (Матияш И.Н.,1983), а способность микроорганизмов инактивировать лизоцим хозяина сформировалась в результате симбиотических отношений с макроорганизмом (Бухарин О.В.,1999). Из всех изучаемых микроорганизмов только для E. coli характерны изменения ритмометрических параметров АЛА, которые, вероятно, свидетельствовали также о напряжении механизмов адаптации и поиске биосистемой адекватной реакции на изменение условий функционирования.
Для выявления функциональной согласованности пролиферативной и антилизоцимной активности проведен корреляционный анализ, который показал обратную корреляцию у музейного штамма E. coli (r = - 0,47; р<0,05) и прямую связь этих показателей у госпитального изолята P. aeruginosa (r = 0,44; р<0,05). У остальных возбудителей корреляционная зависимость не выявлена.
Следовательно, обнаруженные изменения биологических ритмов пролиферативной, протеазной, каталазной, гемолитической, плазмокоагулазной, биопленкообразующей, антилизоцимной активности, чувствительности к антибиотикам госпитальных изолятов S. aureus, E. coli, P. aeruginosa под влиянием экзометаболитов ассоциативной микробиоты и антимикробных препаратов подтверждают мнение авторов (Агаджанян Н.А., 1998; Губин Г.Д., 1989; Смирнов В.М., 2002; Маркина В.В., Романов Ю.А., 2005), что данный факт отражает адаптационные возможности патогенов, т.к. биологический ритм все время подстраивается к новой среде обитания, чтобы дать организму максимальную возможность адаптироваться к окружающей среде путем синхронизации его собственных ритмов с внешними циклами.
Состояние временной организации госпитальных изолятов и музейных штаммов S. aureus, E. coli, P. aeruginosa представлено иллюстрацией амплитудно-фазовой стабильности суточных ритмов биологических свойств возбудителей (рис. 7).
У музейного штамма S. aureus 25923 в период минимальной пролиферативной активности - 06.00 - 13.00 часов продукция ферментов (протеазы, каталазы, плазмокоагулазы) была максимально выражена. Небольшая площадь их эллипсов свидетельствует о значительном постоянстве основных параметров ритма. С увеличением пролиферативной активности - 18.30 - 21.30 часов максимальных значений достигала продукция факторов адгезии и вирулентности - пленкообразующей и гемолитической активности. Показатель АЛА как фактор персистенции - ночного типа с акрофазой около 02.00 часов (с доверительным интервалом от 23.00 до 05.00 часов).
У госпитального изолята S. aureus 2888 зарегистрированы ультрадианные ритмы изучаемых показателей в отличие от циркадианных ритмов музейных штаммов. Учитывая, что у госпитального изолята S. aureus активность физиологических функций проявлялась с 12-часовым периодом, можно отметить, что пролиферативная, каталазная, протеазная и плазмокоагулазная активности относятся к ночному и дневному типам активности. АЛА и гемолитическая активность относятся к утреннему и вечернему типам ритмичности.
Временная организация биологических свойств грамнегативной микробиоты отличалась от таковой S. aureus. У музейных штаммов E. coli пролиферативная, гемолитическая и каталазная активности синхронизированы между собой и для них характерен дневной тип ритмичности. Их акрофазы отмечены соответственно в 14.30, 15.00 и 16.00 часов. Небольшая площадь эллипсов и относительно узкие доверительные интервалы их акрофаз указывают на высокую стабильность параметров их циркадианных ритмов.
Акрофаза АЛА была смещена на вечерние часы с максимумом около 20.00 часов. Четкая синхронность АЛА прослеживалась с биопленкообразующей актив-ностью. Акрофаза показателя протеазной активности имела S. aureus (госпитальный), Т=12 ч. S. aureus (музейный), Т=24 ч.
E. coli (госпитальный), Т=24 ч. E. coli (музейный), Т=24 ч.
P. aeruginosa (госпитальный), Т=24 ч. P. aeruginosa (музейный), Т=24 ч.
Рис. 7 - Сравнительная характеристика амплитудно-фазовой стабильности суточных ритмов биологических свойств возбудителей Примечание: 1 - пролиферация; 2 - протеаза; 3 - каталаза; 4 - гемолиз; 5АЛА; 6 - биоплнки; 7 - плазмокоагулаза утренний тип ритмичности с максимумом около 08.00 часов и доверительным интервалом в пределах 90 минут и находилась в полной противофазе к АЛА.
У госпитальных изолятов E. coli показатели пролиферативной и гемолитической активности сохраняли те же фазовые характеристики, которые присущи музейному штамму, но стабильность их ритмов несколько слабее, о чем можно судить по большим площадям их доверительных эллипсов. Акрофазы каталазы и протеазы по сравнению с музейными штаммами смещались на вечерние часы, претерпевали фазовую инверсию по отношению друг к другу.
Акрофаза АЛА госпитальных изолятов, напротив, сдвигалась в дневную область - 10.00 часов, тогда как у музейных штаммов пик активности регистрировался в вечерние часы. При этом в обоих случаях ритмы достаточно стабильны.
У музейных штаммов P. aeruginosa показатели пролиферативной и гемолитической активности синхронизированы между собой и имеют утренний тип ритмичности, их акрофазы приурочены, соответственно, к 09.00 и 07.часам. Показатели АЛА, биопленкообразующей, каталазной и протеазной активности также были синхронизированы между собой, но имели вечерненочной тип активности. Их акрофазы отмечались в 20.00 - 23.00 часа.
У госпитальных изолятов P. aeruginosa показатели пролиферативной и гемолитической активности синхронизированы между собой, как и у музейных штаммов, но акрофазы регистрировались в ночное время (02.00 часа).
Показатели протеазной активности сохраняли те же фазовые характеристики, что присущи музейным штаммам. Существенные различия при сравнительном анализе амплитудно-фазовых характеристик госпитальных изолятов и музейных штаммов касаются местоположения акрофаз показателей АЛА и каталазной активности, т.е. произошла смена утреннего типа ритмичности на вечерний.
Анализ амплитудно-фазовой стабильности выявил, что для всех изучаемых вариантов грамнегативной микробиоты, как условно-патогенных микроорганизмов, характерна синхронизация во времени и пространстве пролифе ративной активности с одним из основных факторов патогенности - гемолитической активностью. Для них также отмечены значительные временные интервалы отсутствия максимальной активности биологических свойств между временем проявления факторов агрессии и персистенции в суточном диапазоне.
Таким образом, метод косинор-анализа позволил выявить отличия хроноструктуры биоритмов госпитальных изолятов и музейных штаммов S. aureus, E. coli, P. aeruginosa. Последовательность проявлений биологической активности микроорганизмов в течение суток можно представить в виде следующих логических схем (рис. 8, 9, 10).
У музейного варианта S. aureus выявлена четкая последовательность экспрессии факторов адгезии и колонизации, вирулентности и персистенции, тогда как у госпитальных изолятов выявлена иная временная зависимость, которая, возможно, сформировалось под воздействием экзометаболитов микробов-ассоциантов и макроорганизма в целом.
Выявлено, что временной период проявления максимума пролиферативной активности и синхронизированного с ней максимума гемолитической активности одинаков, как у госпитальных изолятов, так и музейных штаммов E. coli, P. aeruginosa. Эта особенность отмечается только для грамнегативной микробиоты.
Стабильность акрофазы предопределяет устойчивость ритмического колебания во времени, ориентирует направление на разработку эффективных способов микробиологической диагностики и мер антимикробной профилактики.
Таким образом, анализ амплитудно-фазовых взаимоотношений между изучаемыми показателями выявил определенную последовательность проявления биологических свойств возбудителей и сформировал представление о пространственно-временной организации госпитальных изолятов и музейных штаммов патогенных микроорганизмов.
S. aureus (госпиталь), T=12ч.
S. aureus (музей), T=24ч.
Пролиферация 00-01.30*-03.АЛА Каталаза 23.00-02.00*-05.01.00-02.00*-03.Плазмокоагулаза 01.00-02.00*-03.01.30ч.
Гемолизин 04.30-05.30*-06.01.00ч.
АЛА 05.30-06.00*-06.Каталаза 06.00-09.00*-12.03.30ч.
Протеаза 11.00-12.00*-13.Протеаза Плазмокоагулаза 10.00-11.00*-12.09.00-11.00*-13.Пролиферация 12.00-13.30*-15.Каталаза 13.00-14.00*-15.02.30ч.
Плазмокоагулаза 13.00-14.00*-15.Биопленка 01.30ч.
15.30-17.30*-19. Гемолизин Гемолизин 16.30-17.30*-18.18.00-19.00*-20. АЛА 17.30-18.00*-18.Пролиферация 18.30-20.00*-21.03.30ч.
01.30ч.
Протеаза 22.00-23.00*-24.АЛА Рис. 8 - Временная организация биологических свойств S. aureus Примечание: *- акрофаза показателя ночной тип утренний тип ночной тип утренне дневной тип дневной тип вечерний тип дневной и вечерний тип ночной тип E. coli (госпитальный), T=24 ч. E. coli (музей), T=24 ч.
Протеаза 22.30-00.30*-02.07.00ч.
06.00ч.
Протеаза 06.00-08.00*-10.АЛА 08.30-10.00*-11.03.00ч.
01.00ч.
Пролиферация Пролиферация 03.00ч.
13.00-14.30*-16.12.30-16.00*-19.Гемолизин 13.30-15.00*-17.Каталаза Гемолизин 14.00-16.00*-18.15.00-16.00*-17.АЛА 17.00-20.00*-23.Биопленка Каталаза 21.00-22.00*-23.19.30-21.30*-23.01.30ч.
Рис. 9 - Временная организация биологических свойств E. coli Примечание: *- акрофаза показателя P. aeruginosa (госпитальный), Т=24 ч.
P. aeruginosa (музей), Т=24 ч.
ночной тип дневной тип дневной тип дневной тип вечерне ночной тип дневной тип вечерне ночной тип Гемолизин 00.30-01.30*-02.02.00ч.
Пролиферация АЛА 00.00-02.00*-04.23.00-02.00*-05.01.30ч.
Гемолизин 03.00-07.00*-11. Каталаза 05.30-07.00*-08.Пролиферация АЛА 06.00-09.00*-12.09.00-10.00*-11.05.00ч.
10.30ч.
АЛА 17.00-20.00*-23.Биопленка 19.00-20.00*-21.Каталаза 20.00-21.00*-22.01.30ч.
Протеаза Протеаза 21.30-22.30*-23.22.00-23.30*-01.Рис. 10 - Временная организация биологических свойств P. aeruginosa Примечание: *- акрофаза показателя Проведенная работа позволила выделить три основных момента:
ночной тип ночной тип дневной тип утренний тип вечерний тип вечерний тип - Доказано наличие как циркадианных, так и ультрадианных ритмов биологических свойств у гетерогенных популяций патогенных и условнопатогенных прокариот.
- Выявлено модулирующее влияние экзометаболитов ассоциативной микробиоты и антимикробных препаратов на ритмические процессы биологических свойств патогенных и условно-патогенных прокариот.
- Исследование ритмичности физиологической активности биологических свойств патогенных и условно-патогенных прокариот с применением косинор-анализа позволило составить пространственно-временную характеристику их последовательности и согласованности.
Выводы:
1. Доказано наличие в спектральном составе ультрадианных и циркадианных ритмов изучаемых биологических свойств у госпитальных изолятов и музейных штаммов S. aureus, E. coli, P. aeruginosa.
2. Присутствие в спектральном составе изучаемых биологических свойств прокариот циркадианных ритмов одновременно с ультрадианными гармониками имеет важное значение для их адаптации к меняющимся условиям внешней среды.
3. Хронобиологический подход позволил выявить периоды резистентности к антибиотикам у музейных (чувствительных к препаратам) штаммов S. aureus и периоды чувствительности у госпитальных (антибиотикорезистентных) изолятов в течение суток.
4. Изменения хроноструктуры пролиферативной активности прокариот бактериально-грибковыми метаболитами - показатель межмикробных симбиотических взаимоотношений, отражающих формирование микросимбиоценозов.
5. На основании амплитудно-фазовой характеристики выявлена стабильность проявления биологических ритмов вирулентных свойств (протеаза, каталаза, гемолитическая активность) патогенных прокариот под влиянием экзометаболитов микробов-ассоциантов, тогда как персистентные свой ства (антилизоцимная и биопленкообразующая активность) проявляли лабильность в течение суток.
6. Формирование циркадианного ритма антилизоцимной активности изученных музейных штаммов под влиянием экзометаболитов госпитальных культур можно рассматривать как результат симбионтных отношений патогенов в микросимбиоценозе.
7. Использование метода косинор-анализа в изучении хронобиологической организации патогенов позволило сформировать представление о временной организации возбудителей (популяций) госпитальных инфекций.
Анализ амплитудно-фазовой стабильности выявил для всех изучаемых вариантов грамнегативной микробиоты синхронизацию во времени и пространстве пролиферативной активности с гемолитической активностью, а у госпитальных вариантов грампозитивных микроорганизмов - с плазмокоагулазной активностью.
8. Отмечены значительные временные интервалы отсутствия максимальной активности биологических свойств у грамнегативных патогенов между временем проявления факторов агрессии и персистенции в суточном диапазоне, что отражает перестройку метаболических процессов микробной популяции.
Список работ, опубликованных научных журналах, рекомендованных ВАК РФ 1. Этиология гнойных инфекций в Тюменской области по данным больничного стационара/ Т.Х. Тимохина, Р.М. Хохлявина, Л.Б. Козлов, И.В. Остапенко и соавт.// Клиническая лабораторная диагностика. - 2003. - №8. - С.
46-49.
2. Биоритмы пролиферативной активности музейных и госпитальных штаммов микроорганизмов/ Т.Х. Тимохина, Н.А. Курлович, В.В. Варницына, Э.А. Кашуба, Д.Г. Губин и соавт. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2007. - №4. - С. 3-5.
3. Суточные биоритмы антибиотикорезистентности, плазмокоагулазной и антилизоцимной активности Staphylococcus aureus/ Н.Б. Перунова, С.Б. Фадеев, Я.И. Паромова, Т.Х. Тимохина, С.Л. Галян, О.В.Бухарин // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2008. - №3. - С. 6-9.
4. Биоритмы антибиотикорезистентности микроорганизмов/ О.В. Бухарин, Н.Б. Перунова, С.Б. Фадеев, Т.Х. Тимохина и соавт. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2008. - №5. - С. 35-38.
5. Тимохина Т.Х. Динамика в течение суток отдельных факторов патогенности и персистентности Staphylococcus aureus под влиянием экзометаболитов ассоциативной микрофлоры // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2009. - № 4. - С. 15-18.
6. Биоритмы биологических свойств Staphylococcus aureus как фактор их адаптации при госпитальной инфекции/ Т.Х. Тимохина, В.В. Варницына, Я.И. Паромова, Н.А. Курлович и соавт. // Медицинская наука и образование Урала. - 2009. - № 3. - С. 118-119.
7. Оценка суточной динамики чувствительности к цефтриаксону и меропенему грамотрицательных возбудителей нозокомиальной хирургической инфекции/ С.Б. Фадеев, Н.Б. Перунова, Т.Х. Тимохина, Я.И. Паромова, О.В.
Бухарин // Медицинская наука и образование Урала. - 2009. - № 3. - С. 16-19.
8. Биологические свойства доминирующих микроорганизмов в отделениях хирургического профиля/ Т.Х. Тимохина, М.В. Николенко, Я.И. Паро мова, А.А. Барадулин // Медицинская наука и образование Урала. - 2010. - № 2. - С. 100-101.
9. Суточная динамика каталазной активности Candida albicans/ Т.Х. Тимохина, М.В. Николенко, В.В. Леонов, В.В. Варницына // Медицинская наука и образование Урала. - 2010. - № 4. - С. 60-62.
10. Суточная динамика темпа роста микроорганизмов в бактериальногрибковых ассоциациях/ Т.Х. Тимохина, М.В. Николенко // Медицинская наука и образование Урала. - 2010. - № 4. - С. 84-86.
11. Особенности временной организации биологических свойств госпитальных изолятов и музейных штаммов S.aureus, E. coli, P. aeruginosa/ Т.Х.
Тимохина, Д.Г. Губин// Медицинская наука и образование Урала. - 2011. - № 2. - С.
Публикации в других изданиях 12. Хронобиологические особенности Candida albicans/ Т.Х. Тимохина, М.В. Николенко, В.В. Варницына//Тезисы докладов научно-практической конференции по медицинской микологии. XI Кашкинские чтения. СанктПетербург, 2008. Проблемы медицинской микологии. - 2008. - Т.2. - №2. - С.
83.
13. Чувствительность Candida albicans, выделенных из различных биотопов, к антимикотическим препаратам/Т.Х. Тимохина, М.В. Николенко, В.В. Варницына и соавт.// Тезисы докладов научно-практической конференции по медицинской микологии. XI Кашкинские чтения. Санкт-Петербург, 2008. Проблемы медицинской микологии. - 2008. - Т.2. - №2. - С. 84.
14. Суточная динамика пролиферативной активности как способ индикации Candida albicans/ Т.Х. Тимохина, М.В. Николенко, В.В. Варницына// Иммунопатология, аллергология, инфектология. - 2009. - №1. - С. 30-31.
15. Влияние экзометаболитов грамотрицательной микрофлоры на формирование патогенного потенциала Candida albicans/ Т.Х. Тимохина, М.В.
Николенко, В.В. Леонов// Иммунопатология, аллергология, инфектология. - 2009. - №1. - С. 31-32.
16. Влияние экзометаболитов на пролиферативную активность Candida albicans/ Т.Х. Тимохина, М.В. Николенко, В.В. Варницына, В.В. Леонов// Тезисы докладов научно-практической конференции по медицинской микологии. XI Кашкинские чтения. Санкт-Петербург, 2009. Проблемы медицинской микологии.- 2009. - Т.11. - №2. - С. 116.
17. Оценка способности формировать биопленку грибами рода Candida, выделенных из различных источников/ В.В. Леонов, В.В. Варницына, Т.Х.
Тимохина, Я.И. Паромова, М.В. Николенко и соавт.// Тезисы докладов научно-практической конференции по медицинской микологии. XI Кашкинские чтения. Санкт-Петербург, 2009. Проблемы медицинской микологии.- 2009. - Т.11. - №2. - С. 91.
18. Этиология гнойных инфекций в хирургических стационарах Тюменской областной больницы/Т.Х. Тимохина, Р.М. Хохлявина, Л.Б. Козлов и соавт.//Научный вестник Тюменской медицинской академии. Материалы международного симпозиума. Медицина и охрана здоровья 2002. - Тюмень, 2002. - С. 105.
19. Цикличность пролиферативной активности микроорганизмов в современных условиях/ Т.Х. Тимохина, Н.А. Курлович, В.В. Варницына, Р.М.
Хохлявина и соавт.//Научный вестник Тюменской Государственной медицинской академии. - 2003. - №5-6. - С. 116-117.
20. Госпитальная инфекция: современные подходы к эпидемиологии, диагностике, лечению, профилактике/ Э.А. Кашуба, Н.А. Курлович, Г.И. Козинец, Т.Х. Тимохина и соавт.//Медицинская наука и образование Урала. - 2004. - №3-4. - С. 194.
21. Биоритмы пролиферативной активности микроорганизмов/Т.Х. Тимохина, В.В. Варницына, Н.А. Курлович, Я.И. Паромова//Материалы международной научной конференции Медико-биологические и экологические проблемы здоровья человека на севере. Сургут, 2004. - С. 364-366.
22.Суточная динамика биохимической активности музейных и госпитальных штаммов микроорганизмов под действием пероксимеда/ Я.И. Паро мова, С.Л. Галян, Т.Х. Тимохина, Н.А. Курлович и соавт.//Медицинская наука и образование Урала. - 2005. - №5. - С. 86.
23. Адаптивный потенциал Staphylococcus aureus при госпитальных инфекциях/ Т.Х. Тимохина, В.В. Варницына, Я.И. Паромова, Н.А. Курлович и соавт.// Медицинская наука и образование Урала. - 2006. - №2. - С. 94-103.
24. Адаптивный потенциал госпитальных штаммов Staphylococcus aureus/ Т.Х. Тимохина, В.В. Варницына, Я.И. Паромова, Н.Б. Перунова и соавт.// Материалы VI всеармейской международной конференции. Инфекции в хирургии мирного и военного времени. - М., 2006. - С. 3.
25. Пролиферативная активность и чувствительность к антимикробным препаратам Pseudomonas aeruginosa/ Э.А. Кашуба, Т.Х. Тимохина, В.В. Варницына, Я.И. Паромова и соавт.// Итоги и перспективы обеспечения эпидемического благополучия населения Российской Федерации. IX Съезд ВНПОЭМП. - М., 2007. - Т.2. - С. 242-243.
26. Этиологическая структура и антибиотикорезистентность основных возбудителей гнойно-воспалительных инфекций в хирургических отделениях многопрофильной клиники/ Р.М. Хохлявина, Р.Л. Хохлявин, Т.Х. Тимохина, Э.А. Кашуба и соавт.// Итоги и перспективы обеспечения эпидемического благополучия населения Российской Федерации. IX Съезд ВНПОЭМП. - М., 2007. - Т.2. - С. 83-84.
27. Хронобиологические особенности адаптивных свойств грибов рода Candida/ Т.Х. Тимохина, М.В. Николенко, В.В. Варницына, Н.А. Курлович и соавт.// Материалы V всероссийского конгресса по медицинской микологии.
Успехи медицинской микологии. - М., 2007. - Т.9. - С. 26-27.
28. Суточная динамика антилизоцимной активности грибов рода Candida/ О.В. Бухарин, Т.Х. Тимохина, Н.Б. Перунова, В.В. Варницына и соавт.//Материалы V всероссийского конгресса по медицинской микологии.
Успехи медицинской микологии. - М., 2007. - Т.10. - С. 48-49.
29. Хронобиологическая характеристика чувствительности к оксациллину Staphylococcus aureus - возбудителей абсцессов мягких тканей/ Б.С. Фадеев, Н.Б. Перунова, Т.Х. Тимохина, О.В. Бухарин// Актуальные вопросы про филактики, диагностики и терапии хирургических инфекций. ЦВДО Подмосковье. - 2007. - С. 139.
30. Особенности биологии грибов рода CANDIDA/ Т.Х. Тимохина, М.В. Николенко, Н.Б. Перунова и соавт.// Тезисы докладов II съезда по микологии. Москва, 2008. Современная микология в России. - 2008. - Т.2. - С.
280-281.
31. Характеристика временной организации штаммов Candida spp., выделенных из клинического материала/ Н.Б. Перунова, М.В. Николенко, В.В.
Варницына, М.В. Янина, Т.Х. Тимохина// Медицинская наука и образование Урала. - 2008. - №2/52. - С. 58-59.
32. Влияние экзометаболитов ассоциативной микрофлоры на временную организацию музейных штаммов Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa/ Т.Х. Тимохина, Я.И. Паромова, В.В. Леонов, Н.Б. Перунова и соавт.// Медицинская наука и образование Урала. - 2008. - №2/52. - С. 89-90.
33. Временная организация биологических свойств Staphylococcus aureus/Я.И. Паромова, В.В. Варницына, Н.А. Курлович, Н.Б. Перунова, С.Л.
Галян, Т.Х. Тимохина// Медицинская наука и образование Урала. - 2008. - №2/52. - С. 56-57.
34. Вычислительная система Групповой косинор-анализ/ А.Г. Санников, Т.Х. Тимохина, Н.А. Соколовский// Академический вестник. - Тюмень, 2010. - №2(12). - С. 146-149.
35. К вопросу о циркадианной и ультрадианной ритмичности у нефотосинтезирующих бактерий/ Д.Г. Губин, Т.Х. Тимохина, М.В. Николенко// Материалы XVIII международной конференции. Ставрополь, 2010. Циклы природы и общества. - 2010. - С. 106-108.
Изобретения по теме диссертации 1. Способ диагностики госпитальных штаммов: Патент РФ на изобретение № 2285258/ Э.А. Кашуба, Т.Х. Тимохина, Н.А. Курлович, Я.И. Паромова, В.В. Варницына, Р.М. Хохлявина, Д.Г. Губин, Л.Б. Козлов// Бюл., 2006. - №28.
2. Способ индикации госпитальных штаммов по биоритмам бактерий:
Патент РФ на изобретение №2285257/ Э.А. Кашуба, Т.Х. Тимохина, Н.А.
Курлович, Я.И. Паромова, В.В. Варницына, Р.М. Хохлявина, Д.Г. Губин, Л.Б.
Козлов// Бюл., 2006. - №28.
3. Способ индикации госпитальных штаммов стафилококков: Патент РФ на изобретение №2292398/ Э.А. Кашуба, Т.Х. Тимохина, Н.А. Курлович, Я.И. Паромова, В.В. Варницына, Р.М. Хохлявина, Л.Б. Козлов// Бюл., 2007. - №3.
4. Способ выявления Candida albicans по биоритмам: Патент РФ на изобретение №2319747/ Э.А. Кашуба, Т.Х. Тимохина, Н.А. Курлович, М.В. Николенко, В.В. Варницына, Я.И. Паромова Л.Б. Козлов, Н.Б.Перунова, Д.Г.
Губин, О.П.Тверскова// Бюл., 2008. - №8.
5. Автоматизированная система Косинор-анализа: Свидетельство РФ о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2009614932/ Т.Х.Тимохина, А.Г.Санников, В.В.Варницына, Н.А.Соколовский// Бюл., 2009. - №4.
Список сокращений:
АТСС - American Type Culture Collection (американская коллекция типовых культур) КОЕ - колониеобразующая единица ОМЧ - общее микробное число БПО - биоплнкообразование АЛА - антилизоцимная активность МПК - минимальная подавляющая концентрация r - коэффициент ранговой корреляции Спирмена T - критерий Манна-Уитни W - критерий Уилкоксона ТИМОХИНА ТАТЬЯНА ХАРИТОНОВНА ВРЕМЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Оригинал макет подготовлен в программе Word for Windows 20Подписано в печать 19. 05. 20011 г.
Формат 60*84/16. Усл.-печ. л. 2,0. Печать оперативная.
Бумага офсетная. Гарнитура Times.
Тираж 100 экз.